WO2012147774A1 - 生体分子を結合させた機能性分子含有シリカナノ粒子の製造方法 - Google Patents

生体分子を結合させた機能性分子含有シリカナノ粒子の製造方法 Download PDF

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functional
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英樹 會澤
大久保　典雄
昌貴 西田
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古河電気工業株式会社
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    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing functional molecule-containing silica nanoparticles in which biomolecules are bound to the surface.
  • porous silica particles or zeolite particles used for adsorbents, catalysts, etc., carbon black used for pigments, metal oxide particles, inorganic compound particles, metal nanoparticles used for conductive materials, reinforcing agents for resins Materials and uses of the above-mentioned fine particles, such as silica particles, are various.
  • semiconductor nanoparticles, silica nanoparticles containing a fluorescent dye and the like are expected to be applied as new particles for labeling, particularly in the field of biotechnology. Since silica nanoparticles containing a high concentration of dye also have a high molar absorption coefficient, their application as more sensitive labeling particles is expected.
  • the labeling particle is used as a labeling reagent that can be used for detection, quantification, staining and the like of a target molecule by binding a biomolecule (protein, nucleic acid, etc.) capable of binding to a specific target molecule to the surface thereof. can do.
  • a biomolecule protein, nucleic acid, etc.
  • silica nanoparticles containing functional molecules such as fluorescent dyes (hereinafter sometimes referred to as functional molecule-containing silica nanoparticles) are used as labeling particles, as a method of attaching biomolecules to the surface, hydrophobic
  • a method of binding by physical adsorption such as sexual interaction a method of coating the surface of a silica nanoparticle with a specific polymer, and then covalently bonding a functional group of the polymer to a functional group in a biomolecule. ing.
  • the present inventors show that the labeling reagent in which the functional molecule-containing silica nanoparticles and the biomolecules are physically adsorbed gradually dissociates from the functional molecule-containing silica nanoparticles with the passage of time, and as a result, the performance as a labeling reagent Focused on the tendency of Furthermore, the present inventors indicate that the labeling reagent in which the functional molecule-containing silica nanoparticles and the biomolecules are physically adsorbed is in the presence of a solid phase such as a substrate, a membrane, or a container having a higher affinity for biomolecules.
  • a solid phase such as a substrate, a membrane, or a container having a higher affinity for biomolecules.
  • biomolecules are peeled off from the functional molecule-containing silica nanoparticles and can not effectively exhibit the performance as a labeling reagent.
  • a labeling reagent is supported on a carrier such as a pad through a drying process like an immunochromatographic reagent
  • biomolecules are more easily bound to a carrier such as a pad, and conversely, functional molecule-containing silica nano It becomes easy to dissociate from the particles.
  • the present inventors in the labeling reagent in which the functional group possessed by the polymer coated on the functional molecule-containing silica nanoparticle and the functional group possessed by the biomolecule are covalently bonded, the biomolecule is the surface of the functional molecule-containing silica nanoparticle Although it is hard to peel off and may exist stably, it is also difficult to strictly control the amount of polymer to be coated, and as a result, it is also difficult to keep the quality of the labeling reagent prepared constant. . If the quality of the labeling reagent is not constant, the test result using the labeling reagent will also be inferior in reproducibility.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a functional molecule-containing silica nanoparticle in which biomolecules are firmly and stably bound with high reproducibility. Another object of the present invention is to provide functional molecule-containing silica nanoparticles in which biomolecules are firmly and stably bound. Another object of the present invention is to provide a colloid in which the functional molecule-containing silica nanoparticles to which the above-mentioned biomolecules are bound are dispersed in a dispersion medium. Another object of the present invention is to provide an analysis reagent containing functional molecule-containing silica nanoparticles to which the above-mentioned biomolecules are bound.
  • a silica nanoparticle having a ⁇ 1> functional molecule and having a thiol group on the surface, and a linker molecule having a maleimide group and a carboxyl group are allowed to coexist in an aprotic solvent, whereby the thiol group and the maleimide group are obtained.
  • a silica nanoparticle having a ⁇ 2> functional molecule and having a thiol group on the surface, and a linker molecule having a maleimide group and a carboxyl group are allowed to coexist in an aprotic solvent, whereby the thiol group and the maleimide group are obtained.
  • Forming a thioether bond between them to obtain a functional molecule-containing silica nanoparticle to which a linker molecule is bound A step of coexistence of the functional molecule-containing silica nanoparticle to which the linker molecule is bonded and carbodiimide in an aqueous solvent, and active esterification of the carboxyl group, and a biomolecule having an amino group in the aqueous solvent.
  • a method for producing a functional molecule-containing silica nanoparticle to which a biomolecule is bound comprising the step of coexistence and forming an amide bond between the active ester group and an amino group possessed by the biomolecule.
  • a silica nanoparticle having a ⁇ 3> functional molecule and having a thiol group on the surface, and a linker molecule having a maleimide group and an active ester group are allowed to coexist in an aprotic solvent, whereby the thiol group and the maleimide group are obtained.
  • a method for producing functional molecule-containing silica nanoparticles to which biomolecules are bound comprising the step of coexistence in an aqueous solvent and forming an amide bond between the active ester group and an amino group possessed by the biomolecule.
  • linker molecule is selected from the group consisting of maleimide acetic acid, 4-maleimidobutyric acid, 5-maleimido valeric acid, maleimidocaproic acid, and 3-maleimidobenzoic acid .
  • the ⁇ 5> linker molecule is a group consisting of N- (6-maleimido caproyloxy) succinimide, 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexanecarboxylic acid N-hydroxysuccinimide ester and N- (m-maleimidobenzoyloxy) succinimide
  • ⁇ 6> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, which comprises the following steps of preparing a silica nanoparticle having a functional group and having a thiol group on the surface:
  • a dispersion solution of core particles is prepared by mixing organoalkoxysilanes bonded with functional molecules and tetraalkoxysilane in a solvent containing ammonia water, forming core particles of silica containing the functional molecules in the solvent.
  • (iv) adding an organoalkoxysilane having a thiol group and TEOS to the dispersion obtained in the above step to form a shell layer on the core particle of silica.
  • ⁇ 7> aprotic solvent is dimethylformamide or dimethyl sulfoxide.
  • the manufacturing method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7>, wherein the average particle diameter of the functional molecule-containing silica nanoparticles to which a ⁇ 8> biomolecule is bound is 20 to 500 nm.
  • ⁇ 9> The molecule according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 8>, wherein the biomolecule is selected from the group consisting of a protein, a polyamino acid, a peptide, a nucleic acid, a peptide nucleic acid, a sugar, a sugar chain, a ligand, a receptor and an aptamer Production method.
  • the manufacturing method as described in ⁇ 8> whose ⁇ 10> biomolecule is an antibody or an antigen.
  • ⁇ 11> The method according to ⁇ 10>, wherein the antibody is selected from the group consisting of immunoglobulins, F (ab ′) 2 , Fab, chemically synthesized polyamino acids, recombinant proteins, and recombinant polyamino acids.
  • the production method according to ⁇ 13> wherein the amount of elemental sulfur in the silica nanoparticles containing a functional molecule and having a thiol group on the surface is 100 ppm to 10000 ppm with respect to the weight of the silica nanoparticles.
  • bonded by thioether bond, The carboxyl group or active ester group which this linker molecule has, and a biomolecule The functional molecule containing silica nanoparticle which the biomolecule which has the structure which the amino group which has has couple
  • Linker molecule is maleimidoacetic acid, 4-maleimidobutyric acid, 5-maleimido valeric acid, maleimidocaproic acid, 3-maleimidobenzoic acid, N- (6-maleimido caproyloxy) succinimide, 4- (N-maleimidomethyl )
  • the functional molecule-containing silica nanoparticles to which the biomolecule according to ⁇ 15> is selected from the group consisting of cyclohexanecarboxylic acid N-hydroxysuccinimide ester and N- (m-maleimidobenzoyloxy) succinimide.
  • ⁇ 17> Functional molecule-containing silica nanoparticles to which the biomolecule according to ⁇ 15> or ⁇ 16> is bound, wherein the average particle diameter is 20 to 500 nm.
  • the biomolecule is selected from the group consisting of a protein, a polyamino acid, a peptide, a nucleic acid, a peptide nucleic acid, a sugar, a sugar chain, a ligand, a receptor and an aptamer
  • Functional molecule-containing silica nanoparticles bound to biomolecules of ⁇ 19> A functional molecule-containing silica nanoparticle to which the biomolecule according to ⁇ 18> is bound, wherein the biomolecule is an antibody or an antigen.
  • ⁇ 20> The biomolecule according to ⁇ 19>, wherein the antibody is selected from the group consisting of immunoglobulins, F (ab ') 2 , Fab, chemically synthesized polyamino acids, recombinant proteins, and recombinant polyamino acids Functional molecule-containing silica nanoparticles.
  • the dispersion medium is a buffer solution.
  • the analytical reagent containing the functional molecule containing silica nanoparticle which the biomolecule in any one of ⁇ 23> ⁇ 15>- ⁇ 20> couple
  • the biomolecule is strongly bound to the surface by covalent bonding.
  • Functional molecule-containing silica nanoparticles can be obtained.
  • the amount of biomolecules corresponding to the amount of thiol groups on the surface of the functional molecule-containing silica nanoparticle can be bound, so that the amount of binding of biomolecules can be precisely controlled. it can.
  • the functional molecule-containing silica nanoparticles to which the biomolecules of the present invention are attached (hereinafter, may be simply referred to as the biomolecule-binding functional silica nanoparticles of the present invention) have biomolecules containing functional molecules via linker molecules. As it is strongly and stably bound to the silica nanoparticles by covalent bonds, dissociation of biomolecules from the functional molecule-containing silica nanoparticles is unlikely to occur. Thus, there is less change in performance over time in either the dry or dispersed state. In addition, by using as a labeling reagent, analysis with high sensitivity and excellent reproducibility and reliability is made possible.
  • the colloid of the present invention is formed by dispersing the biomolecule-bonded functional silica nanoparticles of the present invention with less time-dependent change in performance, and is excellent in storage stability.
  • the analysis reagent of the present invention contains, as a labeling reagent, the biomolecule-binding functional silica nanoparticle of the present invention with a small change in performance with time, and is excellent in the reproducibility and reliability of the analysis result.
  • FIG. 2 shows a top view and (b) shows a longitudinal sectional view.
  • silica nanoparticles containing functional molecules and having thiol groups on the surface are used.
  • the said silica nanoparticle is equipped with the performance as what is called a particle
  • a specific linker molecule is covalently bonded to the silica nanoparticle via the thiol group of the silica nanoparticle, and a biomolecule is further covalently bonded to another site of the linker molecule.
  • This is a method of obtaining functional molecule-containing silica nanoparticles in which an amount of biomolecules corresponding to the amount of thiol groups of silica particles is bound.
  • the functional molecule-containing silica nanoparticles to which a biomolecule obtained in this manner is bound can be used as a labeling reagent for analysis reagents such as various diagnostic reagents and test reagents.
  • the functional molecule contained in the functional molecule-containing silica nanoparticle is not particularly limited, and examples thereof include fluorescent molecules, light absorbing molecules, magnetic molecules, radioactive molecules, pH sensitive dye molecules and the like.
  • a functional molecule-containing silica nanoparticle is a product in which a functional molecule and a silane coupling agent coexist, and the functional molecule and the silane coupling agent are bound by covalent bond, ionic bond or other chemical bond or physical adsorption
  • the organosiloxane component can be prepared by condensation polymerization of this product with one or more silane compounds (siloxane components) to form a siloxane bond.
  • the silane compound (siloxane component) is not particularly limited.
  • TEOS tetraethoxysilane
  • MPS ⁇ -mercaptopropyltrimethoxysilane
  • APS ⁇ -mercaptopropyltriethoxysilane
  • 3-thiocyanatopropyltriethoxysilane 3-glycidyloxypropyltriethoxysilane, 3-isocyanatopropyltriethoxysilane, and 3- [2- (2-aminoethylamino) ethylamino] propyltriethoxysilane 1 type or 2 types or more selected from etc.
  • TEOS can be suitably used.
  • thiol groups such as MPS
  • MPS can also be used as a silane compound used for condensation polymerization
  • a thiol group will exist in the surface of the functional molecule containing silica nanoparticle obtained. Therefore, in this case, the operation for introducing a thiol group to the surface of the functional molecule-containing silica nanoparticle described later does not necessarily need to be performed.
  • a functional molecule and a silane coupling agent are covalently bonded, for example, N-hydroxysuccinimide (NHS) ester group, maleimide group, isocyanate group, isothiocyanate group, aldehyde group, paranitrophenyl group, di-
  • the functional molecule having an NHS ester group for example, 5- (and -6) -carboxytetramethylrhodamine-NHS ester (trade name, manufactured by emp Biotech GmbH), DY550-NHS ester represented by the following formula
  • fluorescent dye compounds having an NHS ester group such as DY630-NHS ester (all trade names, manufactured by Dyomics GmbH) represented by the following formula.
  • silane coupling agents having an amino group include ⁇ -aminopropyltriethoxysilane (APS), 3- [2- (2-aminoethylamino) ethylamino] propyltriethoxysilane, 3- (2-amino) Ethylamino) propyldimethoxymethylsilane, 3-aminopropyltrimethoxysilane and the like can be mentioned, and among them, APS can be suitably used.
  • APS ⁇ -aminopropyltriethoxysilane
  • 3- (2-amino) Ethylamino) propyldimethoxymethylsilane 3-aminopropyltrimethoxysilane and the like can be mentioned, and among them, APS can be suitably used.
  • the shape of the functional molecule-containing silica nanoparticles prepared as described above is spherical with a ratio of major axis to minor axis of 2 or less.
  • the average particle size is preferably 1 to 1000 nm, more preferably 20 to 500 nm.
  • Silica nanoparticles having a desired average particle size can be obtained by ultrafiltration using an ultrafiltration membrane such as YM-10, YM-100 (all trade names, manufactured by Millipore). It can also be obtained by centrifuging at an appropriate gravity acceleration and recovering the supernatant or precipitate.
  • a thiol group to the surface of a silica nanoparticle can be obtained by a common method, for example, the method described in Journal of Colloid and Interface Science, 159, 150-157 (1993) or WO 2007/074722 A1. It can be adopted.
  • functional molecule-containing silica nanoparticles are dispersed in a mixed solvent of water and ethanol, and a silane compound having a thiol group (3-mercaptopropyltrimethoxysilane, 3-mercaptopropyltriethoxysilane, etc.) and aqueous ammonia are added.
  • the thiol group can be introduced to the surface of the functional molecule-containing silica nanoparticle by stirring.
  • the mixed solvent of water and ethanol preferably has a volume ratio of water / ethanol of 1/10 to 1/1.
  • the final concentration of the functional component-containing silica nanoparticles is preferably 0.1 to 2 wt%, and the amount of the silane compound having a thiol group to be added is 0.2 mmol relative to 1 g of the functional molecule-containing silica silica nanoparticles. It is preferable to set it as ⁇ 20 mmol.
  • ammonia water it is preferable to add 28% ammonia water so that the ammonia concentration becomes 0.2 to 2 wt%.
  • the above-mentioned thiol group introduction method is time-consuming and labor-intensive in order to carry out the thiol group introduction operation after preparing the functional molecule-containing silica nanoparticles to be the core, separating and washing this. Moreover, it is also difficult to introduce a desired amount of thiol group with high reproducibility. Usually, in order to introduce a thiol group with high reproducibility, a silane compound having a thiol group is sufficiently reacted. However, this sufficient reaction tends to increase the amount of thiol groups introduced to the surface of the functional molecule-containing silica nanoparticle, and as a result, the surface hydrophobicity is increased (that is, the absolute value of zeta potential is low).
  • a dispersion solution of core particles is prepared by mixing organoalkoxysilanes bonded with functional molecules and tetraalkoxysilane in a solvent containing ammonia water, forming core particles of silica containing the functional molecules in the solvent. And (iv) adding an organoalkoxysilane having a thiol group and TEOS to the dispersion obtained in the above step to form a shell layer on the core particle of silica.
  • the amount of thiol group introduced can be freely adjusted by adjusting the addition ratio of the above organoalkoxysilane having a thiol group and the above TEOS.
  • the introduction of the thiol group can be continuously performed from the preparation of the functional molecule-containing silica nanoparticles, the working time and labor are also greatly improved.
  • the absolute value of the zeta ( ⁇ ) potential of the functional molecule-containing silica nanoparticle into which a thiol group has been introduced is preferably 20 to 70 mV. In particles in which the absolute value of the zeta potential is in the above range, the aggregation is suppressed and the dispersibility is further enhanced.
  • the zeta potential can be measured using Zetasizer Nano (trade name, manufactured by Malvern), ELS-Z1 (trade name, manufactured by Otsuka Electronics), NICOMP 380ZLS (trade name, manufactured by IBC), or the like.
  • the amount of thiol groups on the surface of the functional molecule-containing silica nanoparticles can be measured by analyzing the amount of elemental sulfur by elemental analysis.
  • the content of sulfur element in the functional molecule-containing silica nanoparticle having a thiol group used in the present invention is preferably 100 ppm to 10000 ppm with respect to the weight of the functional molecule-containing silica nanoparticle having a thiol group.
  • the content of elemental sulfur is 100 ppm or less, the amount of biomolecules bound via the linker molecule is small, and it is difficult to sufficiently function as a labeling reagent.
  • the content of sulfur element is 10000 ppm or more, the amount of thiol groups present on the particle surface is too large, the hydrophobicity of the surface of the silica nanoparticles is enhanced, and nonspecific adsorption increase due to hydrophobic interaction, and particles It is easy to cause a decrease in the dispersibility of
  • the content of sulfur element in the functional molecule-containing silica nanoparticle having a thiol group used in the present invention is more preferably 100 ppm to 5000 ppm, and 200 ppm to 2000 ppm based on the weight of the functional molecule-containing silica nanoparticle having a thiol group. It is further preferred that
  • the content of the above sulfur element can be measured by a combustion method. Specifically, 5 to 50 ⁇ g of silica nanoparticles are put in a metal capsule such as a Ni capsule, and the amount of sulfur element can be measured by quantifying the amount of sulfur dioxide (SO 2 ) generated by burning.
  • SO 2 sulfur dioxide
  • the linker molecule used in the present invention is a molecule having a maleimide group and a carboxyl group or an active ester group in the molecule, and the maleimide group and the carboxyl group or the active ester group are saturated hydrocarbon, unsaturated hydrocarbon and It is preferable that it is a molecule linked via aromatic hydrocarbon.
  • the linker molecule having a maleimide group and a carboxyl group in the molecule include maleimide acetic acid, 4-maleimidobutyric acid, 5-maleimido valeric acid, maleimidocaproic acid, 3-maleimidobenzoic acid and the like.
  • Examples of the molecule having maleimide and an active ester group in the molecule include N- (6-maleimidocaproyloxy) succinimide, 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexanecarboxylic acid N-hydroxysuccinimide ester, and N- (m- Maleimidobenzoyloxy) succinimide and the like.
  • the molecular weight of the linker molecule is not particularly limited, but is preferably 150 to 5000 Da.
  • a thioether bond is formed between the maleimide group of the above-mentioned linker molecule and the thiol group introduced on the surface of the functional molecule-containing silica nanoparticle, and the functional molecule to which the linker molecule is bound Obtained silica nanoparticles.
  • the above reaction of the maleimide group with the thiol group is carried out in an aprotic solvent.
  • a protic solvent is used, the maleimide group reacts with the solvent molecule, and as a result, the reactivity with the thiol group decreases.
  • the aprotic solvent is not particularly limited as long as the silica nanoparticles can be dispersed therein, and examples thereof include N, N-dimethylformamide, dimethyl sulfoxide and the like.
  • the reaction between a maleimide group and a thiol group is often carried out using an aqueous solvent, inevitably, in order to prevent the decrease in the activity of biomolecules and the like.
  • the maleimide group may be reacted with the thiol group of the functional molecule-containing silica nanoparticle, and there is no need to react with the biomolecule, so the reaction between the maleimide group and the thiol group is aprotic It can be done very efficiently in a solvent.
  • the concentration of the functional molecule-containing silica nanoparticle having a thiol group in the aprotic solvent is preferably 0.05 to 2 mass%, and 1 mg of the functional molecule-containing silica nanoparticle having a thiol group is used.
  • 0.1 to 5 mg of linker molecules are reacted.
  • the reaction temperature is preferably 0 to 60 ° C., more preferably 0 to 40 ° C.
  • the reaction time is preferably 5 minutes or more, more preferably 5 to 120 minutes.
  • a functional molecule-containing silica nanoparticle to which a biomolecule is attached is produced.
  • the biomolecule is amide-bonded to the carboxyl group or the active ester group in the linker molecule through the amino group of the biomolecule.
  • the linker molecule has a carboxyl group, the carboxyl group is activated and esterified with carbodiimide, and this active ester group is reacted with the amino group of the biomolecule to form an amide bond.
  • the functional ester-containing silica nanoparticles to which the linker molecule is bound, the carbodiimide, and the biomolecule having an amino group are allowed to coexist in an aqueous solvent, and the active esterification reaction of the carboxyl group possessed by the linker molecule
  • the binding reaction between the active ester group and the amino group of the biomolecule may be simultaneously progressed, or the functional molecule-containing silica nanoparticle to which the linker molecule is bound and the carbodiimide are allowed to coexist in the aqueous solvent in advance,
  • the active esterifying reaction of the carboxyl group possessed by the linker molecule may be mixed in advance with the biomolecule having an amino group, and the reaction between the active ester group and the amino group possessed by the biomolecule may be carried out .
  • the active ester group include o-acylisourea.
  • this active ester group can be directly amide-bonded to the amino group in the biomolecule.
  • This binding reaction is also carried out in an aqueous solvent.
  • the biological molecule examples include protein molecules such as antigens and antibodies, polyamino acids, nucleic acid molecules such as DNA and RNA, peptide nucleic acids, sugars, sugar chains, ligands, receptors, peptides, aptamers, physiologically active substances and the like.
  • the antibody is a protein or polyamino acid that binds to a specific antigen, and an immunoglobulin, F (ab ') 2 or Fab obtained by degrading it, polyamino acid artificially chemically synthesized, or It contains a recombinant protein or a recombinant polyamino acid produced using E. coli, yeast or the like as an expression system.
  • the above ligand refers to a substance that specifically binds to a specific protein or the like (receptor), for example, a substrate that binds to an enzyme, a coenzyme, a modulator, a hormone, a neurotransmitter, etc.
  • the physiologically active substance is not limited to natural organic compounds, and includes artificially synthesized physiologically active compounds and environmental hormones.
  • the biological molecule can be used in the present invention as a biological molecule having an amino group. Further, even when the above-mentioned biomolecule does not have an amino group, it can be used in the present invention as a biomolecule having an amino group by artificially introducing an amino group.
  • the aqueous solvent is not particularly limited, but is preferably a buffer, and a common aqueous buffer such as a phosphate buffer, a boric acid buffer, or a carbonate buffer can be suitably used.
  • carbodiimide 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide can be used.
  • N-hydroxysuccinimide, sulfo N-hydroxysuccinimide and the like may be coexistent with carbodiimide, and the active ester group generated by carbodiimide may be derivatized to a more stable active ester group.
  • the reaction is carried out.
  • the reaction temperature is preferably 0 to 60 ° C., more preferably 10 to 40 ° C.
  • the reaction time is preferably 5 minutes or more, more preferably 5 to 600 minutes.
  • the amount of attached biomolecules can be measured by a conventional method.
  • a biomolecule when a biomolecule is a protein, it can be performed by quantifying with a general protein assay (for example, UV method, Lowry method, Bradford method).
  • a general protein assay for example, UV method, Lowry method, Bradford method.
  • the biomolecule when the biomolecule is a nucleic acid, it can be quantified by measuring the absorbance at 260 nm of the solution in which the nucleic acid is dissolved.
  • the functional molecule-containing silica nanoparticles to which biomolecules produced by the production method of the present invention are bonded preferably have an average particle diameter of 1 to 1000 nm, more preferably 20 to 500 nm.
  • the average particle size is obtained by imaging the occupied area of particles from the total projected area of 50 particles randomly selected from images such as transmission electron microscope (TEM), scanning electron microscope (SEM), etc. It is a value obtained by the apparatus and the average value (average equivalent circle diameter) of the diameters of the circles corresponding to the value obtained by dividing the total occupied area by the number (50) of the selected particles.
  • the average particle size does not include the particle size of secondary particles formed by aggregation of primary particles.
  • the variation coefficient of the particle size distribution of functional molecule-containing silica nanoparticles produced by the production method of the present invention is not particularly limited, but is preferably 10% or less, and 8% or less It is more preferable that
  • the amount of binding of the biomolecules is positively correlated with the amount of thiol groups introduced to the functional molecule-containing silica nanoparticles.
  • the amount of thiol group By controlling the introduction amount of the thiol group, it is possible to precisely control the binding amount of biomolecules.
  • the amount of thiol groups on the particle surface is constant, so functional molecule-containing silica nano always bound with a certain amount of biomolecules. Particles can be obtained.
  • the functional molecule-containing silica nanoparticle to which a biomolecule is bound is used for a desired detection test or analysis test, the variation of the output value (for example, fluorescence intensity) to be obtained can be significantly suppressed, and the quantitativeness and It becomes possible to conduct a highly reliable test.
  • the amount of binding of biomolecules can be estimated by measuring the amount of thiol groups on the surface of the functional molecule-containing silica nanoparticle. Therefore, by preparing a plurality of functional molecule-containing silica nanoparticles in which the amount of bonding of the thiol group is changed, it is possible to prepare functional molecule-containing silica nanoparticles in which a desired amount of biomolecules are bonded depending on the purpose.
  • an amino group is introduced on the surface of the functional molecule-containing silica nanoparticle instead of the thiol group, and the linker molecule is Another possible method is to covalently bond the active ester group having the amino group to the amino group, and further covalently bond the maleimide group of the linker molecule to the thiol group of the biomolecule.
  • functional molecule-containing silica nanoparticles having an amino group introduced to the surface are significantly aggregated and poorly practical.
  • the silica nanoparticles having an amino group on the surface are more hydrophobic than the silica nanoparticles having a thiol group on the surface.
  • the linker molecule one having a different carbon chain length or one containing an aromatic ring can be selected, and the surface of the functional molecule-containing silica nanoparticle can be selected by appropriately selecting the structure of the linker molecule. The activity of the binding biomolecule can be maximized.
  • the biomolecule-bonded functional silica nanoparticles of the present invention are particles that can be obtained by the above-mentioned production method of the present invention.
  • a structure in which a thiol group possessed by a silica nanoparticle containing a functional molecule and a maleimide group possessed by a linker molecule are linked by a thioether bond, a carboxyl group possessed by the linker molecule, and a biomolecule possess It has a structure in which an amino group is linked via an amide bond.
  • the functional molecule-containing silica nanoparticles having a thiol group, the linker molecule, and the biomolecule are the same as those described in the above-mentioned production method of the present invention.
  • the biomolecule-binding functional silica nanoparticle of the present invention can be used as a labeling reagent, and can be contained as a labeling reagent in various analysis reagents.
  • the labeling reagent consisting of the biomolecule-binding functional silica nanoparticles of the present invention is excellent in storage stability and difficult to reduce its performance, and the analysis result using the analysis reagent containing this is shown in the examples described later, The reproducibility is extremely high and the reliability is excellent.
  • the colloid of the present invention is obtained by dispersing the biomolecule-bound functional silica nanoparticles of the present invention in a dispersion medium.
  • the dispersion medium is not particularly limited as long as it can uniformly disperse the functional molecule-containing silica nanoparticles to which the biomolecules of the present invention are bonded, but a hydrophilic solvent is preferable.
  • a hydrophilic solvent include water, methanol, ethanol, a mixed solvent of water and methanol, a mixed solvent of water and ethanol, PBS (phosphate buffered saline), Tris buffer, HEPES buffer, etc.
  • any blocking such as polyethylene glycol (PEG), serum albumin (BSA), etc.
  • An agent may be contained.
  • preservatives such as sodium azide may be contained.
  • the functional molecule-containing silica nanoparticles to which the biomolecule of the present invention is bound are present stably, and can be stored for a long time without largely impairing the activity of the biomolecule.
  • the colloid of the present invention can be used as a labeling reagent solution. Moreover, it can be used for preparation of the labeled reagent contained in the analysis reagent.
  • the analysis reagent of the present invention comprises the biomolecule-binding functional silica nanoparticle of the present invention, and a detection reagent for detecting a target molecule that can be recognized by the biomolecule, a quantitative reagent for quantifying the target molecule, the target It is used as a separation reagent for separating a molecule, a collection reagent for isolating and recovering the target molecule, a labeling reagent for labeling the target molecule, and the like.
  • biomolecules and target molecules examples include, for example, a nucleic acid and a nucleic acid having a sequence complementary to the nucleic acid, an antibody and an antigen, an antigen and an antibody, an enzyme and a substrate, a receptor and a ligand, a ligand and a receptor, etc.
  • the analysis reagent of the present invention include, for example, an immunochromatographic device having a test strip in which the biomolecule-binding functional silica nanoparticle of the present invention is held on a conjugate pad.
  • a solution of 600 ⁇ L of the resulting 5- (and -6) -carboxyrhodamine 6G-APS complex was mixed with 140 mL of ethanol, 6.5 mL of TEOS (manufactured by Shin-Etsu Silicone Co., Ltd.), 20 mL of distilled water and 15 mL of 28 mass% ammonia water.
  • the reaction was carried out at room temperature for 24 hours.
  • the reaction solution was centrifuged at a gravity acceleration of 18,000 ⁇ g for 30 minutes, and the supernatant was removed.
  • This washing operation is further repeated twice to remove unreacted MPS, ammonia and the like contained in the dispersion of fluorescent molecule-containing silica nanoparticles having a thiol group, and fluorescent molecule-containing silica nanoparticles having a thiol group introduced (hereinafter referred to as thiol) Group-introduced fluorescent silica nanoparticles A.) were obtained.
  • Elemental analysis of sulfur elements Elemental analysis was performed using 20 mg of the above-described thiol group-introduced fluorescent silica nanoparticles A. As a result, the content of elemental sulfur in the thiol group-introduced fluorescent silica nanoparticles A was 374 ppm with respect to the total weight of the particles.
  • first fluorescent silica nanoparticles fluorescent molecule-containing silica nanoparticles
  • first fluorescent silica nanoparticle-containing solution 10 ⁇ L (45 ⁇ mol) of TEOS and 5.3 ⁇ L (53 nmol) of 5- (and -6) -carboxyrhodamine 6G-APS dissolved in DMF to a concentration of 10 mM are additionally added.
  • the solution was stirred at 40 ° C. for 30 minutes to obtain a solution containing particles in which a shell layer was further formed on the first fluorescent silica nanoparticles (hereinafter sometimes referred to as second fluorescent silica nanoparticles).
  • MPS / TEOS mixed solution a solution containing fluorescent molecule-containing silica nanoparticles (hereinafter referred to as “thiol group introduced fluorescent silica nanoparticles B”) having hydroxyl groups and mercaptopropyl groups in the surface layer was obtained.
  • fluorescent molecule-containing silica nanoparticles prepared by adding the MPS / TEOS mixed solution prepared under the mixing ratio of conditions 2 and 3 in Table 1 (hereinafter, thiol group-introduced fluorescent silica nanoparticles C, thiol group-introduced fluorescent silica nano A solution containing particles D) was also prepared.
  • the “addition amount of MPS with respect to the total addition amount of TEOS and MPS (TEOS + MPS)” in Table 1 indicates the total addition amount of MPS with respect to the total addition amount of TEOS and MPS added to the ammonia water containing solvent throughout the above steps.
  • the MPS / TEOS mixed solution was prepared immediately before the addition.
  • Elemental analysis of sulfur elements Elemental analysis was performed using 20 mg of each of the thiol group-introduced fluorescent silica nanoparticles B to D obtained under the conditions 1 to 3 respectively. As a result, the content of sulfur element is 319 ppm of thiol group-introduced fluorescent silica nanoparticles B, 682 ppm of thiol group-introduced fluorescent silica nanoparticles C, and 1401 ppm of thiol group-introduced fluorescent silica nanoparticles D with respect to the total weight of each particle. there were.
  • Example 1 Production of functional molecule-containing silica nanoparticles to which biomolecules are bound To 40 ⁇ L of a dispersion (concentration 25 mg / ml, dispersion medium: distilled water) of thiol group-introduced fluorescent silica nanoparticles A (average particle diameter 260 nm) prepared in Reference Example 1, 460 ⁇ L of DMF is added, and 10 minutes at 15000 ⁇ g gravity acceleration Centrifuged. The supernatant was removed, 500 ⁇ L of DMF was added and centrifuged, and the supernatant was removed. Again, 500 ⁇ L of DMF was added to disperse the thiol group-introduced fluorescent silica nanoparticles A.
  • a dispersion concentration 25 mg / ml, dispersion medium: distilled water
  • thiol group-introduced fluorescent silica nanoparticles A average particle diameter 260 nm
  • This colloid was used as a sample for protein determination.
  • Pierce BCA Protein Assay Kit manufactured by Thermo Fisher Scientific
  • the binding amount of the antibody was 42 mg per 1 g of the fluorescent molecule-containing silica nanoparticle to which the antibody was bound.
  • colloid A of the present invention a colloid in which the functional molecule-containing silica nanoparticles to which anti-Influenza A nuclear protein antibody is bound is dispersed (hereinafter referred to as colloid A of the present invention Got.).
  • Example 2 Production of functional molecule-containing silica nanoparticles to which biomolecules are bound-2 Using the thiol group-introduced silica nanoparticles B to D prepared in Reference Example 2, antibody binding treatment was carried out in the same manner as in Example 1 to obtain colloids in which the particles were dispersed.
  • the binding amount of the antibody per 1 g of the fluorescent molecule-containing silica nanoparticle to which the antibody is bound is 32 mg when the thiol group introduced silica nanoparticle B is used, and 48 mg when the thiol group introduced silica nanoparticle C is used When group introduced silica nanoparticles D were used, it was 55 mg.
  • colloids B to D of the present invention are obtained.
  • the supernatant was removed by centrifugation for 10 minutes at an acceleration of gravity of 15,000 ⁇ g.
  • 500 ⁇ l of 10 mM KH 2 PO 4 (pH 7.5) was added to disperse the particles, centrifuged for 10 minutes at an acceleration of gravity of 15,000 ⁇ g, and the supernatant was removed.
  • 400 ⁇ L of 10 mM KH 2 PO 4 (pH 7.5) is added to disperse the particles, and a colloid in which the functional molecule-containing silica nanoparticles to which the anti-influenza A nuclear protein antibody is adsorbed is dispersed (hereinafter referred to as comparative colloid E).
  • 400 ⁇ L of 2.5 mg / mL was obtained.
  • Test Example 1 Storage stability test For immunochromatography comprising a conjugate pad of the colloids A to D of the present invention prepared in Examples 1 and 2 and a comparative colloid E prepared and applied on a comparative example and dried. Test strips were made. The test strip was prepared by a conventional method. The structure of the produced test strip is shown in FIG. Immediately after, 7 and 14 days after the preparation of the test strip, the test was carried out using PBS (phosphate buffered saline) as a test solution. The test was carried out by dropping 100 ⁇ L of PBS onto the conjugate pad, and five each were performed.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the fluorescence intensity of the membrane is moved while moving the scanner from the conjugate pad side to the absorption pad side using a scanner that irradiates a laser diode as an excitation light source and receives fluorescence by a photodiode.
  • the distribution was measured, the intensity of the control line was evaluated from the fluorescence profile of the obtained membrane, and the change in the fluorescence intensity of the control line with respect to the elapsed time after producing the test strip was evaluated.
  • an antibody anti-mouse IgG antibody, manufactured by BIODESIGN International
  • Table 2 The results are shown in Table 2 below.
  • the reduction rate (%) of line intensity is calculated assuming that the fluorescence intensity of the test line when tested immediately after the test strip is 100%. For example, the reduction rate of 10% is the test strip. It means that it shows 90% fluorescence intensity, when the fluorescence intensity at the time of testing immediately after preparation is made into 100%.
  • the rate of decrease in line strength indicates the average value of five-fold measurement. Table 2 also shows the variation in fluorescence intensity (coefficient of variation) among the five-fold measurement.
  • the biomolecules are strongly bound to the surface of the functional molecule-containing silica nanoparticles, and as a result, the conjugate pad From the surface of the particles, in the process of drying at the time of preparation, biomolecules are less likely to come off from the surface of the particles, and in the process of dropping the test solution to the conjugate pad during testing and eluting the particles from the conjugate pad It reflects that the biomolecules are less likely to come off. The results also reflect that the biomolecules are less likely to detach from the surface of the functional molecule-containing silica nanoparticles, even if the particles are in dry contact with the conjugate pad or come into contact with the membrane during analysis. doing.
  • Example 3 Production of functional molecule-containing silica nanoparticles to which biomolecules are bound-3
  • An antibody (Fab Anti-MOUSE IgG (H & L) (GOAT) Antibody (Rockland Inc.)) made as an antibody using the thiol group-introduced fluorescent silica nanoparticles A prepared in Reference Example 1 as functional molecule-containing silica particles.
  • the silica particles and the antibody were bound in the same manner as in Example 1 using
  • the binding amount of the antibody was 36 mg per 1 g of the fluorescent molecule-containing silica nanoparticle to which the antibody was bound. Subsequently, the remaining colloid was stored at 4 ° C.
  • the binding amount of the antibody is 34 mg per 1 g of the fluorescent molecule-containing silica nanoparticles bound by the antibody.
  • the remaining colloid was stored at 4 ° C. for one month, and then centrifuged at 15,000 ⁇ g for 10 minutes to remove the supernatant.
  • 500 ⁇ l of 10 mM KH 2 PO 4 (pH 7.5) was added to disperse the particles, centrifuged for 10 minutes at an acceleration of gravity of 15,000 ⁇ g, and the supernatant was removed.
  • 10 mM KH 2 PO 4 (pH 7.5) was added again, and as a result of performing protein quantification using the colloid in which particles were dispersed as a sample, the binding amount of the antibody was 1 mg or less per 1 g of fluorescent molecule-containing silica nanoparticles bound by the antibody. there were.
  • test strip 1 test strip 2 sample pad 3 conjugate pad 4 antibody immobilized membrane 41 determination section (test line) 42 Control Line 5 Absorbent Pad 6 Backing Sheet

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Abstract

　機能性分子を含有し、表面にチオール基を有するシリカナノ粒子と、マレイミド基及びカルボキシル基を有するリンカー分子とを非プロトン性溶媒中に共存させ、これにより前記チオール基と前記マレイミド基との間でチオエーテル結合を形成させて、リンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子を得る工程、及び　前記のリンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子と、カルボジイミドと、アミノ基を有する生体分子とを水系溶媒中に共存させ、前記カルボジイミドにより活性エステル化された前記カルボキシル基と、前記生体分子が有するアミノ基との間でアミド結合を形成させる工程 を含む、生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子の製造方法。

Description

生体分子を結合させた機能性分子含有シリカナノ粒子の製造方法
　本発明は、表面に生体分子を結合させた機能性分子含有シリカナノ粒子の製造方法に関する。
　近年、数ｎｍ～１μｍ程度の微粒子が様々な分野に応用され、注目を集めている。例えば、吸着剤、触媒などに用いられる多孔質シリカ粒子やゼオライト粒子、顔料に用いられるカーボンブラック、金属酸化物粒子、無機化合物粒子、導電材料に使われる金属ナノ粒子、樹脂の補強剤に使われるシリカ粒子など、上記微粒子の材質および用途は多岐にわたる。また、半導体ナノ粒子や、蛍光色素を含むシリカナノ粒子等は、特にバイオテクノロジーの分野において、新たな標識用粒子としての応用が期待されている。高濃度の色素を含むシリカナノ粒子もまた、高いモル吸光係数を有することから、より高感度な標識用粒子としての応用が期待されている。
　上記標識用粒子は、特定の標的分子との結合能を有する生体分子（タンパク質や核酸等）をその表面に結合させることで、標的分子の検出、定量、染色等に利用可能な標識試薬として利用することができる。
　蛍光色素等の機能性分子を含有するシリカナノ粒子（以下、機能性分子含有シリカナノ粒子と呼ぶことがある。）を標識用粒子として用いる場合に、その表面への生体分子の結合方法としては、疎水性相互作用等の物理的な吸着で結合させる方法、シリカナノ粒子表面を特定の高分子でコーティングした後に、当該高分子の官能基と生体分子中の官能基とを共有結合させる方法等が知られている。後者においては、カチオン性の高分子とアニオン性の高分子を交互吸着法によってシリカナノ粒子に結合させ、当該高分子の官能基を介して生体分子を結合する方法、カルボキシル基などの官能基を有する多糖をシリカナノ粒子にコーティングし、当該多糖の官能基に生体分子を結合する方法等が知られている。
　本発明者らは、機能性分子含有シリカナノ粒子と生体分子とが物理吸着した標識試薬は、時間経過と共に徐々に生体分子が機能性分子含有シリカナノ粒子から解離し、その結果、標識試薬としての性能が低下しやすいことに着目した。さらに本発明者らは、機能性分子含有シリカナノ粒子と生体分子とが物理吸着した標識試薬は、生体分子とより親和性の高い基板、メンブレン、容器などの固相が存在すると、生体分子がこれらの固相とより高い親和力で結合し、その結果、生体分子が機能性分子含有シリカナノ粒子から引き剥がされ、標識試薬としての性能を効果的に発揮することができないことにも着目した。特に、イムノクロマト試薬のように、標識用試薬を、乾燥工程を経てパッド等の担体に担持させた形態において、生体分子はパッド等の担体とより強固に結合しやすく、逆に機能性分子含有シリカナノ粒子からは解離しやすくなる。
　また、本発明者らは、機能性分子含有シリカナノ粒子にコーティングした高分子が有する官能基と生体分子が有する官能基とを共有結合させた標識試薬では、生体分子は機能性分子含有シリカナノ粒子表面から剥れにくく安定に存在しうるものの、コーティングする高分子の量を厳密に制御することが難しく、その結果、調製される標識試薬の品質を一定に保つことが困難であることにも着目した。標識試薬の品質が一定しないと、該標識試薬を用いた検査結果も再現性に劣ることになる。
　本発明は、生体分子が強固かつ安定に結合した機能性分子含有シリカナノ粒子を高い再現性で得ることができる製造方法の提供を課題とする。
　また、本発明は、生体分子が強固かつ安定に結合している機能性分子含有シリカナノ粒子の提供を課題とする。
　また、本発明は、上記の生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子が分散媒中に分散してなるコロイドの提供を課題とする。
　また、本発明は、上記の生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子を含む分析試薬の提供を課題とする。
　本発明の課題は下記の手段により達成された。
＜１＞機能性分子を含有し、表面にチオール基を有するシリカナノ粒子と、マレイミド基及びカルボキシル基を有するリンカー分子とを非プロトン性溶媒中に共存させ、これにより前記チオール基と前記マレイミド基との間でチオエーテル結合を形成させて、リンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子を得る工程、及び
　前記のリンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子と、カルボジイミドと、アミノ基を有する生体分子とを水系溶媒中に共存させ、前記カルボジイミドにより活性エステル化された前記カルボキシル基と、前記生体分子が有するアミノ基との間でアミド結合を形成させる工程
を含む、生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子の製造方法。
＜２＞機能性分子を含有し、表面にチオール基を有するシリカナノ粒子と、マレイミド基及びカルボキシル基を有するリンカー分子とを非プロトン性溶媒中に共存させ、これにより前記チオール基と前記マレイミド基との間でチオエーテル結合を形成させて、リンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子を得る工程、
　前記のリンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子と、カルボジイミドとを水系溶媒中に共存させ、前記カルボキシル基を活性エステル化する工程、及び
　前記水系溶媒中に、さらにアミノ基を有する生体分子を共存させ、前記活性エステル基と、前記生体分子が有するアミノ基との間でアミド結合を形成させる工程
を含む、生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子の製造方法。
＜３＞機能性分子を含有し、表面にチオール基を有するシリカナノ粒子と、マレイミド基及び活性エステル基を有するリンカー分子とを非プロトン性溶媒中に共存させ、これにより前記チオール基と前記マレイミド基との間でチオエーテル結合を形成させて、リンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子を得る工程、及び
　前記のリンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子と、アミノ基を有する生体分子とを水系溶媒中に共存させ、前記活性エステル基と、前記生体分子が有するアミノ基との間でアミド結合を形成させる工程
を含む、生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子の製造方法。
＜４＞リンカー分子が、マレイミド酢酸、４－マレイミド酪酸、５－マレイミド吉草酸、マレイミドカプロン酸、及び３－マレイミド安息香酸からなる群から選ばれる、＜１＞又は＜２＞に記載の製造方法。
＜５＞リンカー分子が、Ｎ－（６－マレイミドカプロイロキシ）スクシンイミド、４－（Ｎ－マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル及びＮ－（ｍ－マレイミドベンゾイルオキシ）スクシンイミドからなる群から選ばれる、＜３＞に記載の製造方法。
＜６＞機能性分子を含有し、表面にチオール基を有するシリカナノ粒子を調製するための下記工程を含む、＜１＞～＜５＞のいずれかに記載の製造方法：
　機能性分子が結合したオルガノアルコキシシランとテトラアルコキシシランとをアンモニア水含有溶媒中で混合し、該溶媒中に該機能性分子を含有するシリカのコア粒子を形成させて該コア粒子の分散液を得る工程、及び
　上記工程で得られた分散液に、チオール基を有するオルガノアルコキシシランとＴＥＯＳを添加して、シリカのコア粒子にシェル層を形成させる工程。
＜７＞非プロトン性溶媒が、ジメチルホルムアミド又はジメチルスルホキシドである、＜１＞～＜６＞のいずれかに記載の製造方法。
＜８＞生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子の平均粒径が２０～５００ｎｍである、＜１＞～＜７＞のいずれかに記載の製造方法。
＜９＞生体分子が、タンパク質、ポリアミノ酸、ペプチド、核酸、ペプチド核酸、糖、糖鎖、リガンド、受容体及びアプタマーからなる群から選ばれる、＜１＞～＜８＞のいずれかに記載の製造方法。
＜１０＞生体分子が抗体又は抗原である、＜８＞に記載の製造方法。
＜１１＞抗体が、免疫グロブリン、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、化学合成したポリアミノ酸、組換えタンパク質、及び組換えポリアミノ酸からなる群から選ばれる、＜１０＞に記載の製造方法。
＜１２＞機能性分子が、蛍光分子、吸光分子、磁性分子、放射性分子及びｐＨ感受性分子からなる群から選ばれる、＜１＞～＜１１＞のいずれかに記載の製造方法。
＜１３＞チオール基の量により生体分子の結合量が制御される、＜１＞～＜１２＞のいずれかに記載の製造方法。
＜１４＞機能性分子を含有し、表面にチオール基を有するシリカナノ粒子中の硫黄元素量が、該シリカナノ粒子の重量に対して１００ｐｐｍ～１００００ｐｐｍである、＜１３＞に記載の製造方法。
＜１５＞機能性分子を含有するシリカナノ粒子が有するチオール基と、リンカー分子が有するマレイミド基とが、チオエーテル結合により結合した構造、及び
　該リンカー分子が有するカルボキシル基又は活性エステル基と、生体分子が有するアミノ基とが、アミド結合により結合した構造
を有する、生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子。
＜１６＞リンカー分子が、マレイミド酢酸、４－マレイミド酪酸、５－マレイミド吉草酸、マレイミドカプロン酸、３－マレイミド安息香酸、Ｎ－（６－マレイミドカプロイロキシ）スクシンイミド、４－（Ｎ－マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル及びＮ－（ｍ－マレイミドベンゾイルオキシ）スクシンイミドからなる群から選ばれる、＜１５＞に記載の生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子。
＜１７＞平均粒径が２０～５００ｎｍである、＜１５＞又は＜１６＞に記載の生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子。
＜１８＞生体分子が、タンパク質、ポリアミノ酸、ペプチド、核酸、ぺプチド核酸、糖、糖鎖、リガンド、受容体及びアプタマーからなる群から選ばれる、＜１５＞～＜１７＞のいずれかに記載の生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子。
＜１９＞生体分子が抗体又は抗原である、＜１８＞に記載の生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子。
＜２０＞抗体が、免疫グロブリン、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、化学合成したポリアミノ酸、組換えタンパク質、及び組換えポリアミノ酸からなる群から選ばれる、＜１９＞に記載の生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子。
＜２１＞＜１５＞～＜２０＞のいずれかに記載の生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子が分散媒中に分散してなるコロイド。
＜２２＞分散媒が緩衝液である、＜２１＞に記載のコロイド。
＜２３＞＜１５＞～＜２０＞のいずれかに記載の生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子を含む分析試薬。
　本発明の、生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子の製造方法（以下、単に、本発明の製造方法と呼ぶことがある。）によれば、表面に生体分子が共有結合により強固に結合した機能性分子含有シリカナノ粒子を得ることができる。また、本発明の製造方法によれば、機能性分子含有シリカナノ粒子表面のチオール基の量に応じた量の生体分子を結合させることができるため、生体分子の結合量を精密に制御することができる。
　本発明の生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子（以下、単に、本発明の生体分子結合機能性シリカナノ粒子と呼ぶことがある。）は、生体分子がリンカー分子を介して機能性分子含有シリカナノ粒子と共有結合により強固かつ安定に結合しているため、機能性分子含有シリカナノ粒子からの生体分子の解離が生じにくい。したがって、乾燥及び分散状態のいずれにおいても性能の経時変化がより少ない。また、標識試薬として用いることで、高感度で再現性・信頼性に優れた分析を可能にする。
　本発明のコロイドは、性能の経時変化が少ない本発明の生体分子結合機能性シリカナノ粒子が分散してなり、保存安定性に優れる。
　本発明の分析試薬は、性能の経時変化が少ない本発明の生体分子結合機能性シリカナノ粒子を標識試薬として含有し、分析結果の再現性・信頼性に優れる。
　本発明の上記及び他の特徴及び利点は、適宜添付の図面を参照して、下記の記載からより明らかになるであろう。
シランカップリング剤としてＡＰＳ、シラン化合物としてＴＥＯＳを用いて機能性分子含有シリカ粒子を得る反応スキームを示す図である。 実施例で使用したテストストリップの構造を模式的に示した図である。図２中（ａ）は上面図、（ｂ）は縦断面図を示す。
　以下、本発明について、その好ましい実施態様に基づき詳細に説明する。
　本発明の製造方法には、機能性分子を含有し、かつ、表面にチオール基を有するシリカナノ粒子が用いられる。当該シリカナノ粒子は、いわゆる標識用粒子としての性能を備えたものである。本発明の製造方法は、上記シリカナノ粒子に、該シリカナノ粒子のチオール基を介して特定のリンカー分子を共有結合させ、さらに、該リンカー分子の別の部位に生体分子を共有結合させることで、上記シリカ粒子のチオール基の量に応じた量の生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子を得る方法である。こうして得られる生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子は、標識試薬として、各種診断試薬、検査試薬等の分析試薬に用いることができる。
　上記機能性分子含有シリカナノ粒子に含有される前記機能性分子に特に制限はないが、例えば、蛍光分子、吸光分子、磁性分子、放射性分子、ｐＨ感受性色素分子等が挙げられる。
　機能性分子含有シリカナノ粒子は、機能性分子とシランカップリング剤とを共存させ、共有結合、イオン結合その他の化学結合又は物理的吸着により機能性分子とシランカップリング剤とが結合した生成物（オルガノシロキサン成分）を得、この生成物と１種又は２種以上のシラン化合物（シロキサン成分）とを縮重合させてシロキサン結合を形成させることにより調製することができる。
　前記シラン化合物（シロキサン成分）に特に制限はなく、例えば、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）、γ-メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）、γ-メルカプトプロピルトリエトキシシラン、γ-アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、３－チオシアナトプロピルトリエトキシシラン、３－グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン、３－イソシアナトプロピルトリエトキシシラン、及び３－［２－（２－アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピルトリエトキシシラン等から選ばれる１種又は２種以上を用いることができる。中でも、ＴＥＯＳを好適に用いることができる。
　なお、縮重合に用いるシラン化合物としてＭＰＳ等のチオール基を有するものを使用することもでき、この場合には、得られる機能性分子含有シリカナノ粒子の表面にはチオール基が存在することになる。したがって、この場合には、後述する機能性分子含有シリカナノ粒子表面へのチオール基の導入操作は必ずしも行う必要はない。
　機能性分子とシランカップリング剤とを共有結合させる場合には、例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基、マレイミド基、イソシアナート基、イソチオシアナート基、アルデヒド基、パラニトロフェニル基、ジエトキシメチル基、エポキシ基、シアノ基等の活性基を有する機能性分子と、これらの活性基と反応しうる官能基（例えば、アミノ基、水酸基、チオール基等）を有するシランカップリング剤を用いることができる。
　ＮＨＳエステル基を有する機能性分子の具体例として、例えば５－（及び－６）－カルボキシテトラメチルローダミン－ＮＨＳエステル（商品名、ｅｍｐ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　ＧｍｂＨ社製）、下記式で表されるＤＹ５５０－ＮＨＳエステル、下記式で表されるＤＹ６３０－ＮＨＳエステル（いずれも商品名、Ｄｙｏｍｉｃｓ　ＧｍｂＨ社製）等のＮＨＳエステル基を有する蛍光色素化合物が挙げられる。
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　機能性分子がスクシンイミド基を有する場合には、アミノ基を有するシランカップリング剤と結合させることができる。アミノ基を有するシランカップリング剤の具体例として、γ-アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、３－［２－（２－アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピルトリエトキシシラン、３－（２－アミノエチルアミノ）プロピルジメトキシメチルシラン、３－アミノプロピルトリメトキシシラン等が挙げられるが、中でも、ＡＰＳを好適に用いることができる。
　上述のように調製される機能性分子含有シリカナノ粒子の形状は、長軸と短軸の比が２以下の球状である。また、平均粒径は１～１０００ｎｍであることが好ましく、２０～５００ｎｍであることがより好ましい。
　所望の平均粒径のシリカナノ粒子は、ＹＭ－１０、ＹＭ－１００（いずれも商品名、ミリポア社製）等の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行うことで得ることができる。また、適切な重力加速度で遠心分離を行い、上清又は沈殿を回収することで得ることもできる。
　続いて機能性分子含有シリカナノ粒子の表面にチオール基を導入する方法について説明する。
　シリカナノ粒子表面へのチオール基の導入は通常の方法により得ることができ、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｏｌｌｏｉｄ　ａｎｄ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５９，１５０－１５７（１９９３）や、国際公開２００７／０７４７２２Ａ１公報に記載される方法を採用することができる。
　例えば、機能性分子含有シリカナノ粒子を水とエタノールの混合溶媒に分散させ、チオール基を有するシラン化合物（３－メルカプトプロピルトリメトキシシラン、３－メルカプトプロピルトリエトキシシラン等）とアンモニア水とを添加して攪拌することで、機能性分子含有シリカナノ粒子の表面にチオール基を導入することができる。上記の水とエタノールの混合溶媒は水／エタノールが体積比で１／１０～１／１とすることが好ましい。また、機能成分含有シリカナノ粒子の最終濃度は０．１～２ｗｔ％とすることが好ましく、添加するチオール基を有するシラン化合物の量は、機能性分子含有シリカシリカナノ粒子１ｇに対して、０．２ｍｍｏｌ～２０ｍｍｏｌとすることが好ましい。また、アンモニア水の添加は、２８％アンモニア水を、アンモニア濃度が０．２～２ｗｔ％になるように加えることが好ましい。
　上記のチオール基導入方法は、コアとなる機能性分子含有シリカナノ粒子を調製し、これを分離洗浄してから、チオール基導入操作を行うために、時間と労力がかかる。また、チオール基を高い再現性で所望量導入することも難しい。通常は、高い再現性でチオール基を導入するために、チオール基を有するシラン化合物を十分に反応させる。しかし、この十分な反応は、機能性分子含有シリカナノ粒子表面に導入されるチオール基の量を増加させる傾向があり、その結果、表面の疎水性が上昇して（すなわちゼータ電位の絶対値が低くなり）粒子同士の凝集が生じやすくなってしまう。
　したがって、より簡便な方法で、しかもチオール基の導入量を自由に、かつ高い再現性で制御できる方法を用いて、チオール基を有する機能性分子含有シリカナノ粒子を調製することが好ましい。
　このような調製方法として、例えば以下の工程を含む方法が挙げられる。
　機能性分子が結合したオルガノアルコキシシランとテトラアルコキシシランとをアンモニア水含有溶媒中で混合し、該溶媒中に該機能性分子を含有するシリカのコア粒子を形成させて該コア粒子の分散液を得る工程、及び
　上記工程で得られた分散液に、チオール基を有するオルガノアルコキシシランとＴＥＯＳを添加して、シリカのコア粒子にシェル層を形成させる工程。
　上記のチオール基を有するオルガノアルコキシシランと上記ＴＥＯＳの添加割合を調節することで、導入されるチオール基の量を自由に調節することができる。
　上記工程を経る方法では、機能性分子含有シリカナノ粒子の調製からチオール基の導入を連続的に行うことができるため作業時間と労力も大幅に改善される。
　チオール基が導入された機能性分子含有シリカナノ粒子のゼータ（ζ）電位の絶対値は２０～７０ｍＶであることが好ましい。ゼータ電位の絶対値が上記範囲内である粒子は、凝集が抑制され、分散性がより高まる。
　ゼータ電位は、ゼータサイザーナノ（商品名、マルバーン社製）、ＥＬＳ－Ｚ１（商品名、大塚電子社製）、ＮＩＣＯＭＰ　３８０ＺＬＳ（商品名、ＩＢＣ社製）等を用いて測定することができる。
　機能性分子含有シリカナノ粒子表面のチオール基の量は、元素分析で硫黄元素の量を分析することで測定することができる。本発明に用いるチオール基を有する機能性分子含有シリカナノ粒子における硫黄元素の含有量は、チオール基を有する機能性分子含有シリカナノ粒子の重量に対して１００ｐｐｍ～１００００ｐｐｍであることが好ましい。硫黄元素の含有量が１００ｐｐｍ以下では、リンカー分子を介して結合する生体分子の量が少なく、標識試薬として十分に機能しにくい。また、硫黄元素の含有量が１００００ｐｐｍ以上では、粒子表面に存在するチオール基の量が多すぎて、シリカナノ粒子表面の疎水性が高まり、疎水性相互作用による非特異的な吸着の増加、及び粒子の分散性の低下が生じやすい。本発明に用いるチオール基を有する機能性分子含有シリカナノ粒子における硫黄元素の含有量は、チオール基を有する機能性分子含有シリカナノ粒子の重量に対して１００ｐｐｍ～５０００ｐｐｍであることがより好ましく、２００ｐｐｍ～２０００ｐｐｍであることがさらに好ましい。
　上記の硫黄元素の含有量は、燃焼法により測定することができる。
　具体的には、Ｎｉカプセル等の金属カプセルにシリカナノ粒子を５～５０μｇ入れ、燃焼させて生じる二酸化硫黄（ＳＯ２）の量を定量することで硫黄元素の量を測定することができる。
　本発明に用いるリンカー分子は、分子内にマレイミド基と、カルボキシル基又は活性エステル基とを有する分子であり、マレイミド基と、カルボキシル基又は活性エステル基とが、飽和炭化水素、不飽和炭化水素及び／又は芳香族炭化水素を介して連結している分子であることが好ましい。
　分子内にマレイミド基とカルボキシル基を有するリンカー分子としては、例えば、マレイミド酢酸、４－マレイミド酪酸、５－マレイミド吉草酸、マレイミドカプロン酸、３－マレイミド安息香酸などが挙げられる。
　分子内にマレイミドと活性エステル基を有する分子としては、例えば、Ｎ－（６－マレイミドカプロイロキシ）スクシンイミドや４－（Ｎ－マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ－（ｍ－マレイミドベンゾイルオキシ）スクシンイミドなどが挙げられる。
　リンカー分子の分子量は特に制限はないが、１５０～５０００Ｄａであることが好ましい。
　本発明の製造方法においては、まず、上記リンカー分子のマレイミド基と、機能性分子含有シリカナノ粒子の表面に導入されたチオール基との間にチオエーテル結合を形成させ、リンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子を得る。
　上記のマレイミド基とチオール基との反応は、非プロトン性溶媒中で行う。プロトン性溶媒を用いると、マレイミド基が溶媒分子と反応し、その結果チオール基との反応性が低下するためである。上記非プロトン性溶媒は、シリカナノ粒子が分散しうるものであれば制限はなく、例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドや、ジメチルスルホキシドなどが挙げられる。
　通常、生化学分野においては、マレイミド基とチオール基との反応は、生体分子等の活性低下を防ぐために、やむを得ず水系溶媒を用いて行われることが多い。しかし、本発明の製造方法では、マレイミド基は機能性分子含有シリカナノ粒子のチオール基と反応させればよく、生体分子と反応させる必要がないため、マレイミド基とチオール基との反応を非プロトン系溶媒中で極めて効率よく行わせることができる。
　上記反応においては、チオール基を有する機能性分子含有シリカナノ粒子の非プロトン性溶媒中における濃度は０．０５～２質量％とすることが好ましく、チオール基を有する機能性分子含有シリカナノ粒子１ｍｇに対し０．１～５ｍｇのリンカー分子を反応させることが好ましい。反応温度は０～６０℃であることが好ましく、０～４０℃であることがより好ましい。反応時間は５分以上が好ましく、５～１２０分であることがより好ましい。
　上記のように調製した、リンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子のリンカー部分に生体分子を結合することで、生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子が製造される。上記生体分子は、該生体分子が有するアミノ基を介して、リンカー分子中のカルボキシル基又は活性エステル基部分とアミド結合させる。
　リンカー分子がカルボキシル基を有する場合には、カルボジイミドにより当該カルボキシル基を活性エステル化し、この活性エステル基と生体分子のアミノ基とを反応させてアミド結合を形成させる。その際、リンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子と、カルボジイミドと、アミノ基を有する生体分子とを水系溶媒中に共存させて、該リンカー分子が有するカルボキシル基の活性エステル化反応と、該活性エステル基と生体分子が有するアミノ基との結合反応とを同時に進行させてもよいし、リンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子と、カルボジイミドとを水系溶媒中に予め共存させておき、該リンカー分子が有するカルボキシル基の活性エステル化反応を予め進行させた状態で、アミノ基を有する生体分子と混合し、該活性エステル基と生体分子が有するアミノ基との反応を行わせてもよい。
　上記活性エステル基としては、例えばｏ－アシルイソ尿素が挙げられる。
　一方、リンカー分子が活性エステル基を有する場合には、この活性エステル基をそのまま生体分子中のアミノ基とアミド結合させることができる。この結合反応も水系溶媒中で行われる。
　上記生体分子としては、抗原、抗体等のタンパク質分子やポリアミノ酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸分子、ペプチド核酸、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド、アプタマー、生理活性物質等が挙げられる。
　ここで、抗体とは、特定の抗原と結合するタンパク質やポリアミノ酸であり、免疫グロブリンや、それを分解して得られるＦ（ａｂ’）２やＦａｂ、人工的に化学合成したポリアミノ酸、あるいは大腸菌や酵母等を発現系として用いて作製された組換えタンパク質または組換えポリアミノ酸を含む。
　また、上記リガンドとは特定のタンパク質等（受容体）と特異的に結合する物質をいい、例えば、酵素に結合する基質、補酵素、調節因子、あるいはホルモン、神経伝達物質などをいい、低分子量の分子やイオンばかりでなく、高分子量の物質も含む。
　また生理活性物質とは天然有機化合物に限らず、人工的に合成された生理活性を有する化合物や環境ホルモン等を含む。
　上記生体分子が本来的にアミノ基を有している場合には、当該生体分子を、アミノ基を有する生体分子として本発明に用いることができる。また、上記生体分子がアミノ基を有さない場合であっても、人為的にアミノ基を導入することで、アミノ基を有する生体分子として本発明に用いることができる。
　上記水系溶媒に特に制限はないが、緩衝液であることが好ましく、リン酸緩衝液、ほう酸緩衝液、炭酸緩衝液等の通常の水系緩衝液を好適に用いることができる。
　上記カルボジイミドとしては、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなどを用いることができる。また、カルボジイミドと共に、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドやスルホＮ－ヒドロキシスクシンイミド等を共存させ、カルボジイミドにより生じた活性エステル基を、より安定な活性エステル基に誘導化してもよい。
　リンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子と生体分子とのアミド結合反応においては、リンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子１ｍｇに対して、アミノ基を有する生体分子を１０～５００μｇ共存させて反応を行わせることが好ましい。
　反応温度は０～６０℃であることが好ましく、１０～４０℃であることがより好ましい。また、反応時間は５分以上が好ましく、５～６００分であることがより好ましい。
　上述の工程を経ることにより、水系溶媒中に生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子が得られる。
　上記で得られた、生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子に残存する活性エステルの反応性を無くすために、さらに、ウシ血清アルブミンやカゼイン等を加えて混合しても良い。
　本発明の製造方法で製造された、生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子において、生体分子の結合量は通常の方法で測定することができる。例えば、生体分子がタンパク質である場合には、一般的なタンパク質定量法（例えば、ＵＶ法、Ｌｏｗｒｙ法、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法）で定量することで行うことができる。また、生体分子が核酸である場合には、核酸を溶解した液の２６０ｎｍの吸光度を測定することにより定量することができる。
　本発明の製造方法で製造された生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子は、平均粒径が１～１０００ｎｍであることが好ましく、２０～５００ｎｍであることがより好ましい。
　本発明において、平均粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）等の画像から無作為に選択した５０個の粒子の合計の投影面積から粒子の占有面積を画像処理装置によって求め、この合計の占有面積を、選択した粒子の個数（５０個）で割った値に相当する円の直径の平均値（平均円相当直径）を求めた値である。
　前記平均粒径は、一次粒子が凝集してなる二次粒子の粒径は含まない。
　本発明の製造方法で製造された、生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子の粒度分布の変動係数、いわゆるＣＶ値は特に制限はないが、１０％以下であることが好ましく、８％以下であることがより好ましい。
　本発明の製造方法で製造された、生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子においては、生体分子の結合量が、機能性分子含有シリカナノ粒子に導入されたチオール基の量と正の相関関係を示すため、チオール基の導入量を制御することで、生体分子の結合量を精密に制御することができる。例えば、特定の同じ条件で作製したチオール基を有する機能性分子含有シリカナノ粒子であれば、粒子表面のチオール基の量は一定であるから、常に一定量の生体分子を結合した機能性分子含有シリカナノ粒子を得ることができる。これにより、生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子を所望の検出試験や分析試験に用いた際に、得られる出力値（例えば蛍光強度）のばらつきを大幅に抑えることができ、定量性及び信頼性に優れた試験を行うことが可能となる。また、機能性分子含有シリカナノ粒子表面のチオール基の量を測定しておくことで、生体分子の結合量を見積もることができる。したがって、チオール基の結合量を変えた機能性分子含有シリカナノ粒子を複数作製しておけば、目的に応じて生体分子が所望量結合した機能性分子含有シリカナノ粒子を調製することができる。
　本発明の製造方法では、表面にチオール基を有する機能性分子含有シリカナノ粒子を用いるが、このチオール基を有する機能性分子含有シリカナノ粒子を用いることにより、はじめて生体分子と機能性分子含有シリカナノ粒子とを、マレイミド基と活性エステル基を用いた共結合反応により、極めて容易に、しかも均質に結合させることが可能になる。機能性分子含有シリカナノ粒子と生体分子とをリンカーを介して強固かつ安定に結合させる方法としては、例えば、機能性分子含有シリカナノ粒子の表面にチオール基ではなく、アミノ基を導入し、リンカー分子が有する活性エステル基と当該アミノ基を共有結合させ、さらにリンカー分子が有するマレイミド基と、生体分子が有するチオール基とを共有結合させる方法等も考えられる。しかし、実際には、表面にアミノ基を導入した機能性分子含有シリカナノ粒子は凝集が著しく、実用性に乏しい。これは、表面にチオール基を有するシリカナノ粒子に比べて、表面にアミノ基を有するシリカナノ粒子は、疎水性がより高まってしまうことが原因と考えられる。
　本発明の製造方法ではリンカー分子として炭素鎖の長さの異なるものや芳香環を含むものを選択することができ、リンカー分子の構造を適宜選択することによって、機能性分子含有シリカナノ粒子の表面に結合する生体分子の活性を最大限に引き出すことができる。リンカー分子の構造によって生体分子の活性が異なる理由は定かではないが、生体分子のリンカー分子と結合する部分と活性を示す部分がどのくらい離れているかといった点や、生体分子の親疎水性の度合いなどによって、最適なリンカー分子の構造が変わってくるものと考えられる。
　本発明の生体分子結合機能性シリカナノ粒子は、上述した本発明の製造方法により得られうる粒子である。具体的には、機能性分子を含有するシリカナノ粒子が有するチオール基と、リンカー分子が有するマレイミド基とが、チオエーテル結合により結合した構造、及び、該リンカー分子が有するカルボキシル基と、生体分子が有するアミノ基とが、アミド結合により結合した構造を有する。
　チオール基を有する機能性分子含有シリカナノ粒子、リンカー分子、生体分子は、上述の本発明の製造方法で説明したものと同義である。
　本発明の生体分子結合機能性シリカナノ粒子は、標識試薬として使用することができ、また、各種の分析試薬に標識試薬として含有させることができる。
　本発明の生体分子結合機能性シリカナノ粒子からなる標識試薬は、保存安定性に優れ、性能が低下しにくく、これを含む分析試薬を用いた分析結果は、後述する実施例に示されるように、再現性が極めて高く、信頼性に優れる。
　本発明のコロイドは、本発明の生体分子結合機能性シリカナノ粒子を分散媒中に分散してなる。
　上記分散媒に特に制限はなく、本発明の生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子を均一に分散するものであればよいが、親水性の溶媒であることが好ましい。親水性溶媒としては、例えば、水、メタノール、エタノール、水とメタノールの混合溶媒、水とエタノールの混合溶媒、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等の緩衝液が挙げられる。
　また、本発明の複合粒子コロイドには、生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子の非特異的吸着をさらに防止する観点から、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、血清アルブミン（ＢＳＡ）などの任意のブロッキング剤を含有させてもよい。また、アジ化ナトリウム等の防腐剤を含有させてもよい。
　本発明のコロイド中には、本発明の生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子が安定に存在しており、生体分子の活性を大きく損なうことなく長期保存することが可能である。
　本発明のコロイドは、標識試薬液として用いることができる。また、分析試薬に含まれる標識試薬の調製に用いることができる。
　本発明の分析試薬は、本発明の生体分子結合機能性シリカナノ粒子を含み、該生体分子が認識しうる標的分子を検出するための検出試薬、該標的分子を定量するための定量試薬、該標的分子を分離するための分離試薬、該標的分子を単離回収するための回収試薬、該標的分子を標識する標識試薬等として使用される。
　上記生体分子と標的分子の組合わせの例として、例えば、核酸と該核酸に相補的な配列を有する核酸、抗体と抗原、抗原と抗体、酵素と基質、受容体とリガンド、リガンドと受容体等が挙げられる。
　本発明の分析試薬の具体例として、例えば、コンジュゲートパッドに本発明の生体分子結合機能性シリカナノ粒子が保持されたテストストリップを有するイムノクロマトグラフィー装置等が挙げられる。
　以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［参考例１］　チオール基を有する機能性分子含有シリカナノ粒子の調製－１
（機能性分子含有シリカナノ粒子の調製）
　機能性分子として蛍光分子であるカルボキシローダミン６Ｇを含有するシリカナノ粒子を調製した。
　５－（及び－６）－カルボキシローダミン６Ｇ・スクシンイミジルエステル（商品名、ｅｍｐ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　ＧｍｂＨ社製）３．１ｍｇを１ｍＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。ここに１．２μＬのＡＰＳ（信越シリコーン社製）を加え、室温（２３℃）で１時間反応を行い５－（及び－６）－カルボキシローダミン６Ｇ－ＡＰＳ複合体（５ｍＭ）を得た。
　得られた５－（及び－６）－カルボキシローダミン６Ｇ－ＡＰＳ複合体の溶液６００μＬと、エタノール１４０ｍＬ、ＴＥＯＳ（信越シリコーン社製）６．５ｍＬ、蒸留水２０ｍＬ及び２８質量％アンモニア水１５ｍＬを混合し、室温で２４時間反応を行った。
　反応液を１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿した機能性分子含有シリカナノ粒子に蒸留水を４ｍＬ加え、該粒子を分散させ、再度１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、蛍光分子含有シリカナノ粒子の分散液に含まれる未反応のＴＥＯＳやアンモニア等を除去し、平均粒径２７１ｎｍの蛍光分子含有シリカナノ粒子１．６５ｇを得た。収率約９４％。
（チオール基の導入）
　上記で得た粒子２０ｍｇを水／エタノール＝１／４の混合液１ｍＬに分散させた。これにＭＰＳ（和光純薬株式会社製）を２０μＬ加えた。続いて２８％アンモニア水５０μＬを加え、室温で４時間混合した。
　反応液を１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿したシリカナノ粒子に蒸留水を１ｍＬ加え、粒子を分散させ、再度１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、チオール基を有する蛍光分子含有シリカナノ粒子の分散液に含まれる未反応のＭＰＳやアンモニア等を除去し、チオール基が導入された蛍光分子含有シリカナノ粒子（以下、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａと呼ぶ。）を得た。
（硫黄元素の元素分析）
　上記のチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａ２０ｍｇを用いて元素分析を行った。その結果、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａ中の硫黄元素の含有量は、該粒子の全重量に対して３７４ｐｐｍであった。
［参考例２］　チオール基を有する機能性分子含有シリカナノ粒子の調製－２
　１４質量％のアンモニア水をエタノールで５倍希釈して３．５ｍＬのアンモニア水含有溶媒を調製した。該アンモニア水含有溶媒にＴＥＯＳ（信越シリコーン社製）３０μＬ（１３５μｍｏｌ）と、参考例１で調製した５－（及び－６）－カルボキシローダミン６Ｇ－ＡＰＳ複合体（５ｍＭ）３０μＬとを添加して、４０℃で３０分攪拌することで蛍光分子を含有するコア粒子が形成された溶液（以下、コア蛍光粒子含有溶液と呼ぶことがある。）を得た。
　上記コア蛍光粒子含有溶液に、ＴＥＯＳ（信越シリコーン社製）３０μＬ（１３５μｍｏｌ）と、１０ｍＭの濃度になるようにジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、和光純薬社製）に溶解した５－（及び－６）－カルボキシローダミン６Ｇ－ＡＰＳ１１μＬ（１１０ｎｍｏｌ）とを追添し、４０℃で３０分攪拌することでコア蛍光粒子にシェル層を形成させ、蛍光分子含有シリカナノ粒子（以下、第１蛍光シリカナノ粒子と呼ぶことがある。）を含む溶液を得た。
　上記第１蛍光シリカナノ粒子含有溶液にＴＥＯＳ１０μＬ（４５μｍｏｌ）と、１０ｍＭの濃度になるようにＤＭＦに溶解した５－（及び－６）－カルボキシローダミン６Ｇ－ＡＰＳ５．３μＬ（５３ｎｍｏｌ）とを追添し、４０℃で３０分攪拌して第１蛍光シリカナノ粒子にさらにシェル層を形成させた粒子（以下、第２蛍光シリカナノ粒子ということがある。）を含む溶液を得た。
　第２蛍光シリカナノ粒子の表面にメルカプトプロピル基を導入するために、上記第２シリカナノ粒子含有溶液に、表１の条件１の混合比で調製したＭＰＳ（和光純薬株式会社製）とＴＥＯＳの混合液（ＭＰＳ／ＴＥＯＳ混合液）２０μＬを追添した。室温で３０分攪拌することで、表層にヒドロキシル基とメルカプトプロピル基とを有する蛍光分子含有シリカナノ粒子（以下、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ｂと呼ぶ。）を含む溶液を得た。同様に、表１の条件２及び３の混合比で調製したＭＰＳ／ＴＥＯＳ混合液を添加して調製した蛍光分子含有シリカナノ粒子（以下、それぞれ、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ｃ、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ｄと呼ぶ。）を含む溶液も調製した。
　表１中「ＴＥＯＳとＭＰＳの総添加量（ＴＥＯＳ＋ＭＰＳ）に対するＭＰＳの添加量」とは、上記全工程を通してアンモニア水含有溶媒に添加したＴＥＯＳとＭＰＳの総添加量に対するＭＰＳの総添加量を示す。なお、ＭＰＳ／ＴＥＯＳ混合液は追添の直前に調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（硫黄元素の元素分析）
　条件１～３で得られたチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ｂ～Ｄをそれぞれ２０ｍｇ用いて元素分析を行った。その結果、硫黄元素の含有量は、それぞれの粒子の全重量に対して、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ｂが３１９ｐｐｍ、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ｃが６８２ｐｐｍ、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ｄが１４０１ｐｐｍであった。
［実施例１］　生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子の製造－１
　参考例１で作製したチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａ（平均粒径２６０ｎｍ）の分散液（濃度２５ｍｇ／ｍｌ、分散媒：蒸留水）４０μＬに、ＤＭＦ４６０μＬを加え、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離した。上清を除去し、ＤＭＦを５００μＬ加え遠心分離し、上清を除去した。再度ＤＭＦを５００μＬ加えチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａを分散させた。これにリンカー分子として３－マレイミド安息香酸を１ｍｇ加え、３０分混合することで、上記リンカー分子のマレイミド基とチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａのチオール基との間でチオエーテル結合を形成させた。
　この反応液を１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去後、蒸留水８４．０μＬを加え、粒子を分散させた。続いて、０．５Ｍ　ＭＥＳ（２－モルホリノエタンスルホン酸)（ｐＨ６．０）１００μＬ、５０ｍｇ／ｍＬ　ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）　２３０．４μＬ、１９．２ｍｇ／ｍＬ　ＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）７５μＬを加え混合した。これに抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体（６．２ｍｇ／ｍｌ、ＨｙＴｅｓｔ社製）を１０．６μＬ加え、１０分間混合した。
　１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。１０ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を４００μＬ加え、粒子を分散させた。続いて１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。再度１０ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を４００μＬ加え、粒子を分散させてコロイドを得た。
　このコロイドをサンプルとして、タンパク定量を行った。タンパク定量はＰｉｅｒｃｅＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。その結果、抗体の結合量は、抗体が結合した蛍光分子含有シリカナノ粒子１ｇあたり４２ｍｇであった。
　続いて上記コロイドに１０％ＢＳＡを１０μＬ加え１０分間混合した。１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。１０ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を５００μＬ加え、粒子を分散させ、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。再度１０ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を４００μＬ加え、粒子を分散させ、抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子が分散したコロイド（以下、本発明のコロイドＡと呼ぶ。）を得た。
［実施例２］　生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子の製造－２
　参考例２で調製したチオール基導入シリカナノ粒子Ｂ～Ｄを用いて、実施例１と同様の方法で抗体の結合処理を行い、粒子が分散した各コロイドを得た。タンパク定量の結果、抗体が結合した蛍光分子含有シリカナノ粒子１ｇあたりの抗体の結合量は、チオール基導入シリカナノ粒子Ｂを用いた場合は３２ｍｇ、チオール基導入シリカナノ粒子Ｃを用いた場合は４８ｍｇ、チオール基導入シリカナノ粒子Ｄを用いた場合は５５ｍｇであった。
　続いて、上記各コロイドに１０％ＢＳＡを１０μＬ加え１０分間混合した。１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。１０ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を５００μＬ加え、粒子を分散させ、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。再度１０ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を４００μＬ加え、粒子を分散させ、抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子が分散したコロイド（上記チオール基導入シリカナノ粒子Ｂ～Ｄに対応して、以下、本発明のコロイドＢ～Ｄと呼ぶ。）を得た。
［比較例１］　生体分子が吸着した機能性分子含有シリカナノ粒子の製造－１
　参考例１に記載のチオール基導入前の蛍光分子含有シリカナノ粒子（平均粒径２６０ｎｍ）の分散液（濃度２５ｍｇ／ｍｌ、分散媒：蒸留水）４０μＬに、１０ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）４４９．４μＬと、抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体（６．２ｍｇ／ｍｌ、ＨｙＴｅｓｔ社製）を１０．６μＬ加え、１０分間混合した。
　１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。１０ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を４００μＬ加え、粒子を分散させた。１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。再度１０ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を４００μＬ加え、粒子を分散させた。
　このコロイドをサンプルとして、タンパク定量を行った。タンパク定量はＰｉｅｒｃｅ　ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。その結果、抗体の結合量は抗体が吸着した蛍光分子含有シリカナノ粒子１ｇあたり３５ｍｇであった。
　続いて１０％ＢＳＡを１０μＬ加え１０分間混合した。１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。１０ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を５００μＬ加え、粒子を分散させ、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。再度１０ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を４００μＬ加え、粒子を分散させ、抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体が吸着した機能性分子含有シリカナノ粒子が分散したコロイド（以下、比較コロイドＥと呼ぶ。）２．５ｍｇ／ｍＬを４００μＬ得た。
［試験例１］　保存安定性試験
　実施例１及び２で作製した本発明のコロイドＡ～Ｄ、並びに比較例で作製した比較コロイドＥを塗布して乾燥させたコンジュゲートパッドを含むイムノクロマトグラフィー用のテストストリップを作製した。テストストリップの作製は常法により行った。作製したテストストリップの構造を図２に示す。
　テストストリップの作製直後、７日後、１４日後に、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を試験液として試験を実施した。試験はＰＢＳ１００μＬをコンジュゲートパッドに滴下することで行い、各５本ずつ実施した。試験液を滴下して３０分後、レーザダイオードを励起光源として照射しフォトダイオードで蛍光を受光するスキャナを使用して、コンジュゲートパッド側から吸収パッド側に前記スキャナを移動させながらメンブレンの蛍光強度分布を測定し、得られたメンブレンの蛍光プロファイルからコントロールラインの強度を評価し、テストストリップ作製後の経過時間に対するコントロールラインの蛍光強度の変化を評価した。なお、コントロールラインには、抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体に対して結合能を有する抗体（抗マウスＩｇＧ抗体、ＢＩＯＤＥＳＩＧＮ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）が固定化されている。
　結果を下記表２に示す。表２中、ライン強度の低下率（％）は、テストストリップ作製直後に試験した際のテストラインの蛍光強度を１００％として算出したものであり、例えば、低下率が１０％とは、テストストリップ作製直後に試験した際の蛍光強度を１００％としたときに９０％の蛍光強度を示すことを意味する。表２中、ライン強度の低下率は５重測定の平均値を示す。また、表２には、５重測定間の蛍光強度のバラツキ（変動係数）についても併せて示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表２に示すように、比較コロイドＥを塗布したコンジュゲートパッドを用いたテストストリップでは、作製直後のライン強度に比べて７日目で１４．２％、１４日目で２７．１％もライン強度が低下した。
　一方、本発明のコロイドＡ～Ｄを塗布したコンジュゲートパッドを用いたテストストリップでは、作製直後のライン強度に比べて１４日経過後であってもライン強度の低下率はわずか５％以下に抑えられていた。この結果は、本発明の製造方法で製造される生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子において、生体分子が機能性分子含有シリカナノ粒子表面に強固に結合しており、その結果、コンジュゲートパッド作製時の乾燥の工程で、粒子の表面から生体分子がより剥がれにくいことや、試験の際コンジュゲートパッドに試験液を滴下してコンジュゲートパッドから粒子が溶出される過程で、粒子の表面から生体分子がより剥がれにくいことを反映している。また、この結果は、たとえ当該粒子がコンジュゲートパッドと乾燥状態で接触していたり、分析中にメンブレンと接触したとしても、生体分子が機能性分子含有シリカナノ粒子表面からより剥れにくいことも反映している。
　また、表２の結果から、比較コロイドＥを塗布したコンジュゲートパッドを用いたテストストリップでは、測定間でのライン強度のバラツキが大きく、５重測定におけるライン強度の変動係数（ＣＶ）は、９．６～１１．９であった。一方、本発明のコロイドＡ～Ｄを塗布したコンジュゲートパッドを用いたテストストリップでは、５重測定におけるライン強度のＣＶは１．８～３．５と顕著に小さく、極めて良好な再現性が得られることがわかった。イムノクロマト試薬において、一構成要素に過ぎない標識試薬の構造を変えるだけで再現性がこれほど顕著に上昇することは、当業者の予測を超えるものである。
［実施例３］　生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子の製造－３
　機能性分子含有シリカ粒子として参考例１で作製したチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａを用い、抗体としてＦａｂ化した抗体（Ｆａｂ　Ａｎｔｉ－ＭＯＵＳＥ　ＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）（ＧＯＡＴ）Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ　Ｉｎｃ．社製））を用いて実施例１と同様の方法でシリカ粒子と抗体を結合させた。
　得られたコロイドをサンプルとしてタンパク定量を行った結果、抗体の結合量は、抗体が結合した蛍光分子含有シリカナノ粒子１ｇあたり３６ｍｇであった。
　続いて、残ったコロイドを４℃で１ヵ月保管した後、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。１０ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を５００μＬ加え、粒子を分散させ、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。再度１０ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を加え、粒子を分散させたコロイドをサンプルとしてタンパク定量を行った結果、抗体の結合量は、抗体が結合した蛍光分子含有シリカナノ粒子１ｇあたり３４ｍｇであった。
　このように、本発明の方法を用いることで、Ｆａｂ化した抗体であっても、蛍光分子含有シリカナノ粒子に十分な量を結合させることができた。さらに、この結合は長期保存しても極めて安定に維持されることも分かった。
［比較例２］　生体分子が吸着した機能性分子含有シリカナノ粒子の製造－２
　機能性分子含有シリカ粒子として参考例１で作製したチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａを用い、抗体としてＦａｂ化した抗体（Ｆａｂ　Ａｎｔｉ－ＭＯＵＳＥ　ＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）（ＧＯＡＴ）Ａｎｔｉｂｏｄｙ（１ｍｇ／ｍｌ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ　Ｉｎｃ．社製））を用いて、比較例１と同じ方法で、吸着で抗体を結合した。
　得られたコロイドをサンプルとして、タンパク定量を行った結果、抗体の結合量は、抗体が結合した蛍光分子含有シリカナノ粒子１ｇあたり６ｍｇであった。
　続いて、残ったコロイドを４℃で１ヵ月保管した後、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。１０ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を５００μＬ加え、粒子を分散させ、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。再度１０ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を加え、粒子を分散させたコロイドをサンプルとしてタンパク定量を行った結果、抗体の結合量は、抗体が結合した蛍光分子含有シリカナノ粒子１ｇあたり１ｍｇ以下であった。
　このように、Ｆａｂ化した抗体を蛍光分子含有シリカナノ粒子に吸着させても十分な量を吸着させることができなかった。さらに、Ｆａｂ化した抗体は蛍光分子含有シリカナノ粒子から外れやすく、長期保存も困難であることが分かった。
　本発明をその実施態様とともに説明したが、我々は特に指定しない限り我々の発明を説明のどの細部においても限定しようとするものではなく、添付の請求の範囲に示した発明の精神と範囲に反することなく幅広く解釈されるべきであると考える。
　本願は、2011年4月26日に日本国で特許出願された特願2011-97880に基づく優先権を主張するものであり、これはここに参照してその内容を本明細書の記載の一部として取り込む。
　１　　テストストリップ
　２　　サンプルパッド
　３　　コンジュゲートパッド
　４　　抗体固定化メンブレン
　４１　判定部（テストライン）
　４２　コントロールライン
　５　　吸収パッド
　６　　バッキングシート

Claims (23)

  1. 　機能性分子を含有し、表面にチオール基を有するシリカナノ粒子と、マレイミド基及びカルボキシル基を有するリンカー分子とを非プロトン性溶媒中に共存させ、これにより前記チオール基と前記マレイミド基との間でチオエーテル結合を形成させて、リンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子を得る工程、及び
    　前記のリンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子と、カルボジイミドと、アミノ基を有する生体分子とを水系溶媒中に共存させ、前記カルボジイミドにより活性エステル化された前記カルボキシル基と、前記生体分子が有するアミノ基との間でアミド結合を形成させる工程
    を含む、生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子の製造方法。
  2. 　機能性分子を含有し、表面にチオール基を有するシリカナノ粒子と、マレイミド基及びカルボキシル基を有するリンカー分子とを非プロトン性溶媒中に共存させ、これにより前記チオール基と前記マレイミド基との間でチオエーテル結合を形成させて、リンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子を得る工程、
    　前記のリンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子と、カルボジイミドとを水系溶媒中に共存させ、前記カルボキシル基を活性エステル化する工程、及び
    　前記水系溶媒中に、さらにアミノ基を有する生体分子を共存させ、前記活性エステル基と、前記生体分子が有するアミノ基との間でアミド結合を形成させる工程
    を含む、生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子の製造方法。
  3. 　機能性分子を含有し、表面にチオール基を有するシリカナノ粒子と、マレイミド基及び活性エステル基を有するリンカー分子とを非プロトン性溶媒中に共存させ、これにより前記チオール基と前記マレイミド基との間でチオエーテル結合を形成させて、リンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子を得る工程、及び
    　前記のリンカー分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子と、アミノ基を有する生体分子とを水系溶媒中に共存させ、前記活性エステル基と、前記生体分子が有するアミノ基との間でアミド結合を形成させる工程
    を含む、生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子の製造方法。
  4. 　リンカー分子が、マレイミド酢酸、４－マレイミド酪酸、５－マレイミド吉草酸、マレイミドカプロン酸、及び３－マレイミド安息香酸からなる群から選ばれる、請求項１又は２に記載の製造方法。
  5. 　リンカー分子が、Ｎ－（６－マレイミドカプロイロキシ）スクシンイミド、４－（Ｎ－マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル及びＮ－（ｍ－マレイミドベンゾイルオキシ）スクシンイミドからなる群から選ばれる、請求項３に記載の製造方法。
  6. 　機能性分子を含有し、表面にチオール基を有するシリカナノ粒子を調製するための下記工程を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の製造方法：
    　機能性分子が結合したオルガノアルコキシシランとテトラアルコキシシランとをアンモニア水含有溶媒中で混合し、該溶媒中に該機能性分子を含有するシリカのコア粒子を形成させて該コア粒子の分散液を得る工程、及び
    　上記工程で得られた分散液に、チオール基を有するオルガノアルコキシシランとＴＥＯＳを添加して、シリカのコア粒子にシェル層を形成させる工程。
  7. 　非プロトン性溶媒が、ジメチルホルムアミド又はジメチルスルホキシドである、請求項１～６のいずれか１項に記載の製造方法。
  8. 　生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子の平均粒径が２０～５００ｎｍである、請求項１～７のいずれか１項に記載の製造方法。
  9. 　生体分子が、タンパク質、ポリアミノ酸、ペプチド、核酸、ペプチド核酸、糖、糖鎖、リガンド、受容体、及びアプタマーからなる群から選ばれる、請求項１～８のいずれか１項に記載の製造方法。
  10. 　生体分子が抗体又は抗原である、請求項９に記載の製造方法。
  11. 　抗体が、免疫グロブリン、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、化学合成したポリアミノ酸、組換えタンパク質、及び組換えポリアミノ酸からなる群から選ばれる、請求項１０に記載の製造方法。
  12. 　機能性分子が、蛍光分子、吸光分子、磁性分子、放射性分子及びｐＨ感受性分子からなる群から選ばれる、請求項１～１１のいずれか１項に記載の製造方法。
  13. 　チオール基の量により生体分子の結合量が制御される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の製造方法。
  14. 　機能性分子を含有し、表面にチオール基を有するシリカナノ粒子中の硫黄元素量が、該シリカナノ粒子の重量に対して１００ｐｐｍ～１００００ｐｐｍである、請求項１３に記載の製造方法。
  15. 　機能性分子を含有するシリカナノ粒子が有するチオール基と、リンカー分子が有するマレイミド基とが、チオエーテル結合により結合した構造、及び
    　該リンカー分子が有するカルボキシル基又は活性エステル基と、生体分子が有するアミノ基とが、アミド結合により結合した構造
    を有する、生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子。
  16. 　リンカー分子が、マレイミド酢酸、４－マレイミド酪酸、５－マレイミド吉草酸、マレイミドカプロン酸、３－マレイミド安息香酸、Ｎ－（６－マレイミドカプロイロキシ）スクシンイミド、４－（Ｎ－マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル及びＮ－（ｍ－マレイミドベンゾイルオキシ）スクシンイミドからなる群から選ばれる、請求項１５に記載の生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子。
  17. 　平均粒径が２０～５００ｎｍである、請求項１５又は１６に記載の生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子。
  18. 　生体分子が、タンパク質、ポリアミノ酸、ペプチド、核酸、ペプチド核酸、糖、糖鎖、リガンド、受容体及びアプタマーからなる群から選ばれる、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子。
  19. 　生体分子が抗体又は抗原である、請求項１８に記載の生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子。
  20. 　抗体が、免疫グロブリン、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、化学合成したポリアミノ酸、組換えタンパク質、及び組換えポリアミノ酸からなる群から選ばれる、請求項１９に記載の生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子。
  21. 　請求項１５～２０のいずれか１項に記載の生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子が分散媒中に分散してなるコロイド。
  22. 　分散媒が緩衝液である、請求項２１に記載のコロイド。
  23. 　請求項１５～２０のいずれか１項に記載の生体分子が結合した機能性分子含有シリカナノ粒子を含む分析試薬。
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