WO2015022914A1 - 表面に反応性官能基を有するシリカ粒子及びその製造方法 - Google Patents

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WO2015022914A1
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silica particles
particle
particles
silica
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PCT/JP2014/070996
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昌貴 西田
信光 山中
三好　一富
大久保　典雄
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古河電気工業株式会社
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    • G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
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    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Definitions

  • the present invention relates to silica particles having a reactive functional group on the surface and a method for producing the same.
  • silica particles and zeolite particles used for adsorbents and catalysts porous silica particles and zeolite particles used for adsorbents and catalysts, carbon black used for pigments, metal oxide particles, inorganic compound particles, metal nanoparticles used for conductive materials, and resin reinforcing agents
  • the materials and applications of the fine particles such as silica particles are diverse.
  • Semiconductor nanoparticles, silica nanoparticles containing fluorescent dyes, and the like are expected to be used as new labeling particles, particularly in the field of biotechnology. Since silica nanoparticles containing a high concentration of dye also have a high molar extinction coefficient, they are expected to be applied as more sensitive labeling particles.
  • the labeling particles can be used as labeling reagents that can be used for detection, quantification, staining, etc. of target molecules by binding biomolecules (proteins, nucleic acids, etc.) capable of binding to specific target molecules to the surface. can do.
  • biomolecules proteins, nucleic acids, etc.
  • the labeling particles and the biomolecules are bonded by covalently bonding both via reactive functional groups present on the surface of the labeling particles. By using a covalent bond, a stronger and more stable labeled biomolecule can be obtained.
  • a reactive functional group is introduced to the surface of the silica particles
  • a technique is adopted in which the silane coupling agent having the functional group and the silica particles as the core are mixed in an acidic or basic aqueous solution.
  • the silane coupling agent is hydrolyzed by the water in the aqueous solution, and then a polycondensation reaction occurs with the hydroxyl groups on the surface of the silica particles to introduce reactive functional groups onto the surface of the silica particles.
  • this method it is inevitable that the silane coupling agents having reactive functional groups will undergo condensation polymerization.
  • a thick shell layer derived from the silane coupling agent having a reactive functional group is formed on the surface of the core particle, and many reactive functional groups are buried in the shell layer. That is, in the conventional method, introduction of the reactive functional group onto the particle surface has been inefficient.
  • the present invention provides nanometer-sized silica particles having thiol groups at a specific density on the surface, wherein silica particles having an increased proportion of thiol groups present on the particle surface in the total amount of thiol groups possessed by the particles.
  • the issue is to provide.
  • this invention makes it a subject to provide the biomolecule composite particle formed by a biomolecule couple
  • this invention makes it a subject to provide the immunochromatography method using the biomolecule composite particle which couple
  • this invention makes it a subject to provide the manufacturing method of the silica particle which can introduce
  • the present inventors disperse silica particles in an organic solvent with bound water on the surface and mix a silane coupling agent having a reactive functional group such as a thiol group in the organic solvent, It has been found that the reactive functional group can be efficiently introduced on the surface of silica particles. That is, since the hydrolysis and polycondensation reaction of the silane coupling agent proceed only on the particle surface due to the bound water, the polycondensation reaction between the silane coupling agents hardly occurs. It has been found that the thickness of the shell layer having a group can be greatly suppressed.
  • the object of the present invention has been achieved by the following means.
  • (B) The density of the thiol groups on the surface of the silica particles is 0.002 to 0.2 / nm 2 .
  • [2] The silica particle according to [1], wherein the silica particle contains a fluorescent or light-absorbing dye.
  • [3] The silica particle according to [1] or [2], wherein the thiol group is bonded to the surface of the silica particle via an alkylene group or an alkyleneoxy group.
  • [4] [1] A biomolecule composite particle obtained by binding a biomolecule to the surface of the silica particle according to any one of [1] to [3] via the thiol group.
  • [5] The biomolecule composite particle according to [4], wherein the biomolecule is an antibody or an antigen.
  • a method for producing silica particles having reactive functional groups other than hydroxy groups on the surface Including mixing silica particles having bound water on the surface and a silane coupling agent having a reactive functional group other than a hydroxy group in an organic solvent, and hydrolyzing the silane coupling agent with the bound water.
  • Production method [8]
  • the reactive functional group other than the hydroxy group is at least one selected from a thiol group, amino group, carboxy group, halogen atom, vinyl group, epoxy group, isocyanate group, and isothiocyanate group, in [7] The manufacturing method as described.
  • the silica particles of the present invention have thiol groups at a specific density on the surface, and the ratio of the thiol groups on the particle surface to the total amount of thiol groups in the particle is greatly increased.
  • the biomolecule composite particle of the present invention the biomolecule is bonded to the surface of the silica particle of the present invention via a thiol group, and nonspecific adsorption when used as an analytical reagent is effectively suppressed, and detection is performed. Sensitivity can be further increased.
  • the biomolecule composite particle of the present invention is used as a labeling reagent, and the target substance to which the biomolecule binds can be detected with high sensitivity. According to the production method of the present invention, a specific reactive functional group can be more efficiently introduced onto the surface of the silica particles.
  • FIG. 1A is a top view
  • FIG. 1B is a longitudinal sectional view.
  • the silica particle of the present invention is a silica particle having a particle size of 20 to 1000 nm, has thiol groups at a specific density on the surface thereof, and is present on the particle surface in the total amount of thiol groups of the particle.
  • the production method of the present invention comprises mixing silica particles having bound water on the surface and a silane coupling agent having a reactive functional group other than a hydroxy group in an organic solvent, and using the bound water on the surface of the silica particles. Hydrolyzing the silane coupling agent.
  • Silica particles having bound water on the surface are not particularly limited as long as they can undergo a polycondensation reaction with a silane coupling agent having a hydroxyl group on the surface and having a reactive functional group described below. Absent.
  • silica particles are used as a labeling reagent, a labeling substance such as a fluorescent or light-absorbing dye or a radioactive substance can be contained.
  • the core particle preferably contains a fluorescent or light-absorbing dye, and more preferably contains a fluorescent dye. A preferred embodiment of the core particle will be described
  • a core particle containing a fluorescent or light-absorbing dye is a product (fluorescent or light-absorbing dye) obtained by binding the dye and the silane coupling agent by covalent bond, ionic bond or other chemical bond or physical adsorption.
  • a product fluorescent or light-absorbing dye obtained by binding the dye and the silane coupling agent by covalent bond, ionic bond or other chemical bond or physical adsorption.
  • Organicsilane to which a dye is bonded, and this product and one or more silane compounds (siloxane components) are hydrolyzed and polycondensed in, for example, an ammonia water-containing solvent to form a siloxane bond.
  • not only the dye but also core particles containing other labeling substances such as radioactive substances can be prepared in the same manner using a silane coupling agent to which the labeling substance is bound.
  • the core particles may be obtained simply by hydrolysis / condensation polymerization in an ammonia water-containing solvent using only the silane compound as a raw material.
  • ammonia water-containing solvent include, for example, about 28% ammonia water in a mixed solution in which water / ethanol has a volume ratio of 1/10 to 1/1, and an ammonia concentration of 0.2 to 3 wt%. Thus added solution can be used.
  • TEOS tetraalkoxysilane like tetraethoxysilane (TEOS) and tetramethoxysilane, Especially, TEOS can be used suitably.
  • N-hydroxysuccinimide (NHS) ester group N-hydroxysuccinimide (NHS) ester group
  • maleimide group isocyanate group
  • isothiocyanate group aldehyde group
  • aldehyde group paranitrophenyl group
  • a labeling substance having an active group such as a methyl group, an epoxy group, or a cyano group
  • a silane coupling agent having a functional group capable of reacting with these active groups for example, an amino group, a hydroxyl group, a thiol group. it can.
  • the labeling substance having an NHS ester group is a fluorescent molecule
  • 5- (and -6) -carboxytetramethylrhodamine-NHS ester (trade name, manufactured by Emp Biotech GmbH), represented by the following formula: DY550-NHS ester, and DY630-NHS ester represented by the following formula (both trade names, manufactured by Dyomics GmbH), and the like, but the present invention is not limited thereto. It is not something.
  • the labeling substance When the labeling substance has a succinimide group, it can be combined with a silane coupling agent having an amino group.
  • a silane coupling agent having an amino group include ⁇ -aminopropyltriethoxysilane (APS), 3- [2- (2-aminoethylamino) ethylamino] propyltriethoxysilane, 3- (2-amino And ethylamino) propyldimethoxymethylsilane and 3-aminopropyltrimethoxysilane.
  • APS can be preferably used.
  • the shape of the silica particles containing the labeling substance or not containing the labeling substance prepared as described above is preferably a sphere having a major axis / minor axis ratio of 2 or less.
  • the average particle size is preferably 1 to 950 nm, more preferably 18 to 495 nm, and even more preferably 28 to 298 nm.
  • the particle size means an average particle size. The average particle size is determined by calculating the total occupied area of the particles from the total projected area of 50 particles randomly selected from an image of a transmission electron microscope (TEM), a scanning electron microscope (SEM), etc.
  • the total of the occupied areas can be calculated as the diameter of the circle (average circle equivalent diameter) corresponding to the area obtained by dividing by the number of selected composite particles (50).
  • the average particle size does not include the particle size of secondary particles formed by aggregation of primary particles.
  • Silica nanoparticles having a desired average particle diameter can be obtained by ultrafiltration using an ultrafiltration membrane such as YM-10 and YM-100 (both trade names, manufactured by Millipore). It can also be obtained by performing centrifugation at an appropriate gravitational acceleration and collecting the supernatant or the precipitate.
  • the silica particles having bound water on the surface before introducing reactive functional groups other than hydroxy groups are preferably washed with water, an aqueous solution, an organic solvent, or a mixture thereof.
  • the washing operation is preferably performed by 1 to 3 cycles of dispersion of the silica particles in the washing solution, sedimentation of the silica particles by centrifugation, and removal of the supernatant.
  • the cleaning solution is not particularly limited, and examples thereof include water, aqueous solution, ethanol, propanol, pentanol, hexanol, hexanol, N, N-dimethylformamide, dimethyl sulfoxide and the like. Washing with water or aqueous solution to remove impurities and at the same time hold a sufficient amount of bound water on the surface of silica particles, then wash with hydrophilic organic solvent such as alcohol (preferably ethanol, propanol, pentanol, hexanol or hexanol) It is also preferable to obtain silica particles having bound water on the surface by removing excess moisture (free water) other than the bound water present on the surface of the silica particles.
  • hydrophilic organic solvent such as alcohol (preferably ethanol, propanol, pentanol, hexanol or hexanol)
  • the core particles formed in the ammonia water-containing solvent can be washed with a hydrophilic organic solvent to remove free water present on the surface of the silica particles, and silica particles having bound water on the surface can be obtained.
  • the functional group (I) is preferably at least one selected from a thiol group, an amino group, a carboxy group, a halogen group, a vinyl group, an epoxy group, an isocyanate group, and an isothiocyanate group. .
  • a reactive functional group By adopting such a reactive functional group, a biomolecule or the like can be bound via these reactive functional groups.
  • silica particles having bound water on the surface obtained above and a silane coupling agent having a functional group (I) are mixed in an organic solvent, and the silane coupling is performed with the bound water.
  • the silane coupling agent having the hydrolyzed functional group (I) is bonded to the surface of the silica nanoparticle by condensation polymerization of the hydroxy group at the hydrolysis site and the hydroxy group on the surface of the silica nanoparticle. Since water molecules are released by this condensation polymerization reaction, the amount of bound water does not change before and after the condensation polymerization reaction.
  • organic solvent examples include dimethyl sulfoxide, sulfolane, pyridine, N-methylpyrrolidone, N-cyclohexylpyrrolidone, N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, alcohol (preferably having 2 or more carbon atoms, more preferably carbon And alcohols having 3 to 10, more preferably 4 to 8 carbon atoms).
  • alcohol preferably having 2 or more carbon atoms, more preferably carbon And alcohols having 3 to 10, more preferably 4 to 8 carbon atoms.
  • those selected from N, N-dimethylformamide and alcohols having 4 to 8 carbon atoms are preferable
  • those selected from alcohols having 4 to 8 carbon atoms are more preferable
  • a solvent selected from pentanol, hexanol and heptanol is used. Further preferred.
  • the connection between the functional group (I) and the silicon atom is preferably via a linking group.
  • the linking group is preferably an alkylene group or an alkyleneoxy group.
  • the alkylene group or alkyleneoxy group preferably has 2 to 10 carbon atoms, more preferably 2 to 5 carbon atoms, and still more preferably 2 to 4 carbon atoms.
  • silane coupling agent having the functional group (I) examples include 3-mercaptopropyltrimethoxysilane, ⁇ -mercaptopropyltriethoxysilane, ⁇ -aminopropyltriethoxysilane (APS), 3-thiocyanato.
  • the polycondensation reaction between the silane coupling agents having the functional group (I) can be significantly suppressed.
  • the shell layer having the functional group (I) can be made thinner. This thinning of the shell layer suppresses non-specific adsorption of components and the like present in the specimen when silica particles are used as the labeled particles of the analysis reagent, and enables analysis with excellent sensitivity and accuracy.
  • the proportion of the core particles can be increased accordingly.
  • the amount of labeling substance (eg, dye) per particle can be increased, leading to a further increase in sensitivity when used as an analytical reagent.
  • the absolute value of the zeta ( ⁇ ) potential of the functional molecule-containing silica nanoparticles having the functional group (I) introduced therein is preferably 20 to 70 mV. Particles having an absolute value of the zeta potential within the above range are suppressed from agglomeration and further improved in dispersibility.
  • the zeta potential can be measured using, for example, Zeta Sizer Nano (trade name, manufactured by Malvern), ELS-Z1 (trade name, manufactured by Otsuka Electronics Co., Ltd.), NICOMP 380ZLS (trade name, manufactured by IBC).
  • the production method of the present invention can increase the proportion of the functional group (I) present on the particle surface in the total amount of the functional group (I) of the silica particle.
  • the shape of the silica particles having the functional group (I) on the surface prepared as described above is a sphere having a major axis / minor axis ratio of 2 or less.
  • the silica particles can be centrifuged in order to replace the solvent required for the surface modification.
  • the particle size average particle size
  • the particle size is preferably 1000 nm or less.
  • the particle size is preferably 20 to 1000 nm, more preferably 20 to 500 nm, and even more preferably 30 to 300 nm.
  • the functional group (I) is preferably a thiol group.
  • the silica particles obtained when the functional group (I) is a thiol group will be described below.
  • the functional group (I) is a thiol group, it exists on the surface of the silica particle with respect to the amount A of sulfur element in the silica particle having a thiol group (the number of sulfur elements derived from thiol per silica particle).
  • the ratio (B / A) of the amount B (number / particle) of the thiol group to be formed is preferably 0.10 to 0.60, more preferably 0.15 to 0.60, and More preferably, it is 20 to 0.60.
  • per particle (per particle) is a value obtained by dividing the amount of sulfur element or thiol group of a predetermined amount of silica particles by the number of particles (that is, an average value).
  • the number of particles of the predetermined amount of silica particles can be obtained by dividing the total mass of the predetermined amount of silica particles by the mass per silica particle.
  • the mass per silica particle can be calculated using the average volume of the silica particles and the specific gravity (2.0 g / cm 3 ) of the silica particles.
  • the average volume of the silica particles is obtained from the SEM photograph at a magnification of 10000 times by obtaining the particle size (average of major axis and minor axis) of a predetermined number (usually about 200) of individual silica particles in the field of view by using image processing.
  • the ratio (B / A) has the same meaning as the ratio of the weight of the sulfur element exposed on the surface of the silica particles to the total weight of the sulfur element of the silica particles.
  • the density of thiol groups on the surface of the silica particles is preferably 0.002 to 0.2 / nm 2 , and 0.002 to 0.1 / nm 2. Is more preferable. Further, it may be 0.002 to 0.05 pieces / nm 2 , 0.003 to 0.02 pieces / nm 2 , or 0.003 to 0.01.
  • the density of thiol groups on the surface of silica particles to 0.002 units / nm 2 or more, a sufficient amount of biomolecules can be bound, and for example, when applied to an immunoassay such as immunochromatography, the detection sensitivity is further increased. Can do.
  • grains can be effectively suppressed because the density of the thiol group in the silica particle surface shall be 0.2 piece / nm ⁇ 2 > or less. Further, when biomolecules are bound and used as an analysis reagent, nonspecific adsorption is further suppressed, and false positives are less likely to occur.
  • the functional group (I) is a thiol group and the core particle before introduction of the thiol group onto the particle surface has a sulfur element (for example, sulfur at the connecting portion between the dye and the silane coupling agent).
  • the amount of elemental sulfur in the core particles is not included in the amount of elemental sulfur A in the silica particles. That is, A is the total amount of sulfur elements present in the particles in the form of thiol groups. It is preferable that the core particle before the introduction of the thiol group to the particle surface does not have elemental sulfur.
  • the amount A of sulfur element in the silica particles having a thiol group on the surface can be measured by a combustion method. Specifically, the amount of elemental sulfur can be measured by placing 5 to 50 ⁇ g of silica nanoparticles in a metal capsule such as a Ni capsule and quantifying the amount of sulfur dioxide (SO 2 ) produced by combustion.
  • the amount B of thiol groups present on the particle surface can be measured using DNTB (5,5′-Dithiobis (2-nitrobenzoic acid)) as a reagent.
  • DNTB 5,5′-Dithiobis (2-nitrobenzoic acid)
  • the thiol group quantification method using DNTB is described in, for example, Archives of Biochemistry and Biophysics, 1959, vol.82, p.70.
  • thiol groups present on the particle surface can be determined from a calibration curve prepared using ⁇ -mercaptopropyltrimethoxysilane (MPS) as a standard substance.
  • MPS ⁇ -mercaptopropyltrimethoxysilane
  • Silica particles having a thiol group on the surface obtained by the production method of the present invention, can bind to a biomolecule through the thiol group to form a biomolecule composite particle.
  • the binding of biomolecules will be described later.
  • the functional group (I) of the silica particles is an amino group, a carboxy group, a vinyl group, an epoxy group, an isocyanate group or an isothiocyanate group
  • the surface of the silica particles to be obtained is a conventional method. Can bind biomolecules.
  • JP-A-2009-274923 amino group
  • JP-A-2009-162537 carboxy group
  • JP-A 2010-100542 epoxy group, isocyanate group
  • the silica particles of the present invention have a thiol group on the surface, (a) the particle size is 20 to 1000 nm, and (b) the density of the thiol groups on the particle surface is 0.002 to 0.2 particles / nm. And (c) the amount B of thiol groups present on the surface of the silica particles relative to the amount A of sulfur elements in the silica particles (the number of sulfur elements derived from thiol per silica particle) Particle) ratio (B / A) is 0.10 to 0.60.
  • the silica particles of the present invention usually have thiol groups homogeneously on the surface. There is no restriction
  • the preferred form of the silica particles of the present invention is the same as the preferred form of the silica particles obtained when a thiol group is employed as the functional group (I) in the production method of the present invention described above. Therefore, the particle size of the silica particles of the present invention is more preferably 20 to 500 nm, and further preferably 30 to 300 nm.
  • the density of thiol groups on the surface of the silica particles is preferably 0.002 to 0.1 / nm 2, may be 0.002 to 0.05 / nm 2 , and is 0.003 to 0.02 / nm 2. It may be nm 2 .
  • the ratio (B / A) is preferably 0.15 to 0.60, and more preferably 0.20 to 0.60.
  • the silica particles of the present invention need not contain a labeling substance, but preferably contain a labeling substance. By containing a labeling substance, it can be suitably used as a labeling reagent.
  • the labeling substance is preferably a fluorescent or light-absorbing dye, and more preferably a fluorescent dye.
  • the dye is preferably contained in particles (core particles) before introducing a thiol group. That is, by preparing core particles containing a labeling substance and introducing a thiol group on the surface thereof by, for example, the production method of the present invention, the silica particles of the present invention containing the labeling substance can be obtained.
  • the preparation of the core particles is as described above.
  • the core particles preferably do not contain sulfur element.
  • the biomolecule composite particle of the present invention is a particle having a form in which a biomolecule is bonded via a thiol group on the surface of the silica particle of the present invention.
  • biomolecule there are no particular limitations on the biomolecule, and proteins, nucleic acids, sugars, and the like can be widely used.
  • biomolecules may be further chemically modified, and a part of the structure may be chemically modified.
  • a biomolecule has a specific binding ability with a desired target substance.
  • Examples of the combination of the biomolecule and the target substance include an antibody and its antigen, an antigen and its antibody, a nucleic acid (DNA, RNA, etc.) and a nucleic acid having a sequence complementary to the nucleic acid, a receptor and its ligand, a ligand and its Examples include receptors, lectins and sugar chains, aptamers and molecules that specifically bind to the aptamers, and the like.
  • the biomolecule is preferably an antibody or an antigen, more preferably an antibody.
  • the biomolecule composite particle of the present invention can be used as an immunoassay reagent for detecting an antigen.
  • the antibody include immunoglobulin (whole antibody), F (ab ′) 2 and Fab obtained by enzymatic degradation thereof, a heavy chain variable region (VH), and a light chain variable region (VL) as a linker.
  • ScFv and sc (Fv) 2 tandemly linked via a diabody consisting of two units where VH and VL are linked via a linker, artificially synthesized polyamino acids containing VH and VL, E. coli and Recombinant proteins or polyamino acids containing VH and VL produced using yeast or the like as an expression system are included. That is, in the present invention, the “antibody” means a molecule or unit having VH and VL, and its form is not limited as long as it has VH and VL.
  • the biomolecule is preferably bonded to the silica particle of the present invention by covalently bonding the thiol group present on the particle surface and the biomolecule.
  • the covalent bond can be performed by a conventional method.
  • the silica particles of the present invention and a linker molecule having a maleimide group and a carboxy group are allowed to coexist in an aprotic solvent, thereby forming a thioether bond between the thiol group on the particle surface and the maleimide group.
  • linker molecules are bound.
  • the silica particles to which the linker molecule is bonded, carbodiimide, and a biomolecule having an amino group are allowed to coexist in an aqueous solvent, and the biomolecule has the carboxy group that has been activated esterified with the carbodiimide.
  • An amide bond is formed with the amino group.
  • biomolecule composite particles formed by binding biomolecules via a thiol group can be obtained.
  • silica particles having a thiol group on the surface and a linker molecule having a maleimide group and an amino group coexist in a solvent, whereby a thioether is formed between the thiol group of the silica particle having a thiol group and the maleimide group.
  • a silica particle to which a linker molecule is bound is formed, and then the silica particle to which the linker molecule is bound, carbodiimide, and an antibody coexist in an aqueous solvent.
  • An amide bond may be formed between the antibody and the carboxy group of the antibody.
  • the biomolecule composite particles produced by the production method of the present invention preferably have a particle size (average particle size) of 20 to 1000 nm, more preferably 20 to 500 nm, and further preferably 30 to 300 nm. preferable.
  • an antibody or an antigen is used as a biomolecule, it can be used as a labeling reagent for various immunological tests (immunoassay).
  • the immunoassay can be applied as labeled particles such as immunochromatography, enzyme immunoassay (EIA, such as Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)), fluorescent immunoassay (FIA), radioimmunoassay (RIA) and the like.
  • EIA enzyme immunoassay
  • ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
  • FIA fluorescent immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • immunoagglutination a test method in which particles combined with antibodies or antigens and a sample are mixed and the particles are aggregated by an antigen-antibody reaction with the antigens or antibodies contained in the sample
  • immunoturbidimetry antibodies or antigens The bound particles and the specimen are mixed to form a precipitate of an antigen-antibody complex generated by an antigen-antibody reaction with the antigen or antibody contained in the specimen, the aggregate is irradiated with light, and the light irradiated by scattering
  • immuno-ratio brazing method antibody or antigen-bound particles and specimen are mixed, and the antigen or antibody contained in the specimen is mixed
  • CLEIA method a test method for quantifying an antigen or antibody contained in a specimen by forming an antigen-antibody complex produced by the antigen-antibody reaction of the sample, and measuring the light scattered by applying light to the dispersion of the complex
  • Luminescent enzyme immunoa a test method in which particles combined with antibodies or antigens and a sample are mixed
  • a luminescent reagent is added.
  • the present invention can also be used for an inspection method in which the amount of luminescence is measured to quantify a detection target.
  • the biomolecule composite particles of the present invention can also be used as labeled particles in flow cytometry and labeled particles in various biochips.
  • the immunochromatography method of the present invention is carried out using a specific test strip.
  • the test strip is (1)
  • a member (conjugate pad) (2) the conjugate pad, a membrane (capture antibody-immobilized membrane) on which an antibody for capturing a complex containing a target substance and a labeled antibody is immobilized, and (3) the capture antibody is immobilized.
  • the membrane and the absorbent pad have a structure in which the membrane and the absorbent pad are connected in series so that capillary action occurs.
  • the capture antibody molecule is an antibody that can bind to a site other than the site where the labeled antibody is bound on the target material in a complex containing the target material and the labeled antibody.
  • FIG. 1A is a plan view of a preferred embodiment of the test strip
  • FIG. 1B is a longitudinal sectional view of the test strip shown in FIG. 1A.
  • the test strip 1 preferably comprises a sample pad 2, a conjugate pad 3, a capture antibody-immobilized membrane 4, and an absorption pad 5.
  • Each of the above constituent members is preferably lined with a backing sheet 6 with an adhesive.
  • a determination section 41 in which an antibody for determining the presence or absence of a target substance, that is, positive / negative is determined, is provided.
  • the capture antibody-immobilized membrane 4 preferably includes a control line 42 on which molecules that bind to the labeled antibody are immobilized.
  • sample pad 2 is a constituent member that drops a liquid sample containing a target substance.
  • the conjugate pad 3 is a constituent member containing a labeled antibody, and a target substance contained in a liquid sample that has moved from the sample pad 2 by capillary action is combined with the labeled antibody in a liquid phase by a specific molecular recognition reaction. This is where the body begins to form.
  • the capture antibody-immobilized membrane 4 is a constituent member in which a solution containing the complex moves by capillary action, and a capture antibody-immobilized portion in which a complex containing a target substance and a labeled antibody is captured on the immobilized antibody (Determination unit).
  • the shape of the capture antibody immobilization part (determination part) in the membrane is not particularly limited as long as the capture antibody is locally immobilized, and examples thereof include a line shape, a circular shape, and a belt shape. Preferably, it is a line having a width of 0.5 to 1.5 mm.
  • the labeled antibody is concentrated in the capture antibody immobilization part (determination part).
  • the amount of the target substance can be qualitatively or quantitatively determined depending on the amount of the dye contained in the dye-containing silica particles such as a fluorescent signal.
  • the amount of capture antibody immobilized in the capture antibody immobilization section determines whether the shape is a line, 0.1 ⁇ g to 5 ⁇ g per unit length (cm) is preferable.
  • the immobilization method include a method in which a capture antibody solution is applied, dropped or sprayed and then dried and immobilized by physical adsorption.
  • the capture molecule may be directly immobilized on the membrane, or may be indirectly immobilized via another molecule.
  • blocking can be performed by dipping in a buffer solution containing a blocking agent such as albumin, casein, polyvinyl alcohol or the like for an appropriate period of time and then drying.
  • a blocking agent such as albumin, casein, polyvinyl alcohol or the like
  • examples of the commercially available blocking agent include skim milk (manufactured by DIFCO), 4% block ace (manufactured by Meiji Dairies), and the like.
  • the absorption pad 5 is a component for absorbing a solution that has moved through the membrane by capillary action and generating a constant flow.
  • each of these constituent members there are no particular restrictions on the material of each of these constituent members, and members commonly used in immunochromatographic test strips can be used.
  • glass such as Glass Fiber Conjugate Pad (trade name, manufactured by MILLIPORE) is used as the sample pad and conjugate pad.
  • a fiber pad is preferred, and the membrane is preferably a nitrocellulose membrane such as Hi-Flow Plus 120 membrane (trade name, manufactured by MILLIPORE).
  • the absorbent pad is preferably a cellulose membrane such as Cellulose Fiber Sample Pad (trade name, manufactured by MILLIPORE).
  • Examples of the backing sheet with an adhesive include AR9020 (trade name, manufactured by Adhesives Research).
  • the test strip is prepared by adjoining both ends of each member in order of the sample pad, the conjugate pad, the capture antibody-immobilized membrane, and the absorption pad in order to facilitate capillary action between the members. It can be produced by pasting on a member about 1 to 5 mm (preferably on a backing sheet).
  • a liquid sample that can contain a target substance is dropped onto the sample pad 2 of the test strip, so that the liquid sample that has passed through the sample pad 2 penetrates and contacts the conjugate pad 3 and is held by the conjugate pad 3.
  • the binding reaction between the labeled antibody and the target substance in the liquid sample starts.
  • the liquid sample is sequentially moved to the capture antibody-immobilized membrane 4 and the absorption pad 5 by capillary action while forming a complex containing the labeled antibody and the target substance by the binding reaction, and the target substance is contained in the sample. Is included, the labeled antibody is concentrated on the test line as described above.
  • the presence of the target substance can be detected by visually detecting the absorbance (plasmon resonance) of the dye contained in the concentrated labeled antibody or by detecting the fluorescence of the dye using a fluorescence detector.
  • detection is a concept including both qualitative detection and quantitative detection. The amount of the liquid sample to be dropped can be appropriately adjusted according to the configuration of the test strip.
  • the sample that can contain the target substance is not particularly limited, and examples include clinical specimens, food specimens, and environmental sampling specimens.
  • the clinical specimen include blood, plasma, serum, lymph, urine, saliva, pancreatic juice, gastric juice, sputum, body fluids such as swabs collected from mucous membranes such as nose and throat, and feces, but are not limited thereto. Any sample that can contain the target substance of interest can be used.
  • Examples of the food sample include liquid beverages, semi-solid foods, and solid foods.
  • Environmental sampling samples include natural samples such as soil, rivers and seawater, sampling samples by air samplers installed in production lines and clean rooms in factories, and wiped samples.
  • the sample is a liquid, it can be used in the method of the present invention as it is, and in the case of a semi-solid or solid material, it can be used in the present invention after being subjected to a treatment such as dilution or extraction.
  • the immunochromatography method of the present invention is preferably performed at a temperature of 5 to 40 ° C.
  • biomolecule composite particle of the present invention When the biomolecule composite particle of the present invention is used as a labeled antibody for immunochromatography, non-specific adsorption of components other than the target substance present in the sample to the labeled antibody is unlikely to occur. As a result, it is possible to perform analysis with higher sensitivity and higher accuracy.
  • Example 1 Preparation of pigmented silica particles having reactive functional groups on the surface Pigmented silica particles having thiol groups as reactive functional groups on the surface were prepared through the following steps (i) to (iv).
  • this ammonia water-containing organic solvent 0.86 volume% TEOS with respect to 100 volume% of the ammonia water-containing organic solvent, and 53 volume% carboxyrhodamine 6G-APS DMF solution with respect to 100 volume% of the TEOS, Were respectively added and stirred at a temperature of 40 ° C.
  • the carboxyrhodamine 6G-APS was obtained by reacting the carboxyrhodamine 6G-NHS ester with APS.
  • the concentration of carboxyrhodamine 6G-APS in the DMF solution was 10 mM.
  • the carboxyrhodamine 6G-APS and TEOS were added to the dispersion liquid of the pigment-containing silica particles formed in the step (i) and reacted at 40 ° C. for 30 minutes to form a shell layer.
  • the amount of carboxyrhodamine 6G-APS added is 67% by volume with respect to 100% by volume of carboxyrhodamine 6G-APS added in step (i), and the amount of TEOS added is in step (i). The amount was the same as the TEOS addition amount.
  • the second addition amount of carboxyrhodamine 6G-APS was 33% by volume relative to the addition amount of 100% by volume of carboxyrhodamine 6G-APS in step (i), and the addition amount of TEOS was also the same as in step (i).
  • the amount of TEOS added at 100% by volume was 33% by volume.
  • the dispersion of pigmented silica particles having two shell layers obtained in the above step (ii) was centrifuged (10000 rpm, 10 minutes) to precipitate the particles, and then the supernatant was immediately removed.
  • the resulting precipitate was redispersed in ethanol and centrifuged again (10000 rpm, 10 minutes) to settle the particles and then the supernatant was removed.
  • the pigmented silica particles having bound water on the surface obtained in the above step (iii) were redispersed in 3.5 mL of various solvents shown in Table 1 below (Conditions 1 to 5).
  • condition 1 is a comparative example
  • conditions 2 to 5 are examples of the present invention.
  • MPMS 3-mercaptopropyltrimethoxysilane
  • the input amount of MPMS is 33% by volume with respect to the total input amount of 100% by volume of TEOS and carboxyrhodamine 6G-APS in the above step (i) for the conditions 1 to 4, and the above step (i) for the condition 5.
  • the total input amount of TEOS and carboxyrhodamine 6G-APS at 100% was 10% by volume.
  • the mixture was centrifuged (10000 rpm, 10 minutes) to precipitate the particles, and the supernatant was immediately removed.
  • the resulting precipitate was redispersed in ethanol and centrifuged again (10000 rpm, 10 minutes) to precipitate the particles.
  • the same ethanol washing operation was further performed once to remove unreacted TEOS and the like. Subsequently, the washing operation was performed four times in the same manner as above except that distilled water was used in place of the ethanol to remove free dye and the like.
  • five kinds of thiol group-introduced dye-containing silica particles having different reaction solvents were obtained.
  • the density of thiol groups on the surface of the thiol group-introduced pigment-containing silica particles obtained under the above conditions 1 to 5 is 0.0033 / nm 2 , 0.0053 / nm 2 , 0.0071 / nm 2 in this order. , 0.0053 / nm 2 , 0.0071 / nm 2 .
  • B / A was remarkably increased in the thiol group-introduced dye-containing silica particles (conditions 2 to 5) prepared in the examples of the present invention. That is, in the thiol group-introduced dye-containing silica particles prepared in the present invention example, the shell layer formed by condensation polymerization of MPMS is the thiol group-introduced silica particle (condition 1) prepared in the comparative example. Compared to a shell layer formed by condensation polymerization of MPMS, it is much thinner. This result shows that a thiol group can be introduced to the particle surface very efficiently by polycondensing a silane coupling agent having a reactive functional group on the particle surface in an organic solvent.
  • Example 2 Introduction of antibody into dye-containing silica particles having thiol group 40 ⁇ L of a dispersion of thiol group-introduced dye-containing silica particles obtained in step (iv) (concentration 25 mg / mL, dispersion medium: distilled water) , 460 ⁇ L of DMF was added, and the mixture was centrifuged for 10 minutes at a gravitational acceleration of 15000 ⁇ g. The supernatant was removed, 500 ⁇ L of DMF was added and centrifuged, and the supernatant was removed. 500 ⁇ L of DMF was added again to disperse the thiol group-introduced fluorescent silica nanoparticles.
  • Test Example 1 Immunochromatographic test (rapid determination of influenza nucleoprotein) (Preparation of test strip for immunochromatography)
  • a test strip using the antibody-immobilized membrane was prepared by the following method. Contains 1 mg / mL of rabbit-derived anti-influenza A nucleoprotein antibody (polyclonal antibody, manufactured in-house) at a position approximately 6 mm from the end of the membrane (length: 25 mm, trade name: Hi-Flow Plus120 membrane, manufactured by MILLIPORE)
  • a solution ((50 mM KH 2 PO 4 , pH 7.0) + 5% sucrose) was applied at a coating amount of 0.75 ⁇ L / cm, and a test line for influenza A having a width of about 1 mm was provided.
  • a solution ((50 mM KH 2 PO 4 , pH 7.0) sugar free) containing 1 mg / mL of a goat-derived anti-mouse IgG antibody (AKP Goat anti-mouse IgG Antibody, manufactured by BioLegend) was added at 0.75 ⁇ L / A control line having a width of about 1 mm was provided. Then, it was dried at 50 ° C. for 30 minutes. The interval between the test line and the control line was 3 mm.
  • the antibody-immobilized membrane, sample pad (Glass Fiber Conjugate Pad (GFCP), manufactured by MILLIPORE), and absorption pad (Cellulose Fiber Sample Pad (CFSP), manufactured by MILLIPORE) are used as a backing sheet (trade name AR9020, manufactured by Adhesives Research). ) Assembled above.
  • the membrane was configured in such a direction that the test line for influenza A influenza was on the sample pad side and the control line was on the absorption pad side.
  • a detection unit comprising a light source, an optical filter, and a photomultiplier tube (PMT), the detection unit having a mechanism that linearly moves at a constant speed by a motor, and a recording mechanism that records the received light intensity of the PMT every 50 ⁇ sec.
  • the detection unit was prepared.
  • the detection unit is a laser diode having a light source of 532 nm.
  • the sample is irradiated with the laser diode, and the reflected light is transmitted through an optical filter that transmits only light having a wavelength of 550 nm or more, and then a photomultiplier tube (PMT). It has a mechanism to receive light.
  • a type A influenza nucleoprotein solution having the concentrations shown in Table 3 was prepared.
  • a mixed solution of 100 ⁇ L of this solution and 2 ⁇ L of a colloid (2.5 mg / mL) in which pigment-containing silica particles bound with the anti-influenza A nucleoprotein antibody were dispersed was dropped onto the sample pad portion of the test strip. After 15 minutes, a visual inspection was performed. Further, the fluorescence intensity of the test line measured by the detection device was quantified. The results are shown in Tables 3 and 4.
  • condition 2 to 6 When silica particles obtained by introducing thiol groups in an organic solvent are used (conditions 2 to 6), compared to when silica particles obtained by introducing thiol groups in a solvent containing water (condition 1) are used. In 5), the detection sensitivity in visual observation was improved (Table 3), and in fluorescence detection, the fluorescence intensity was higher and the detection sensitivity was excellent (Table 4).
  • Table 4 above shows the fluorescence intensity when the influenza intensity of the influenza A nucleoprotein is 0 ng / ml.
  • the present invention example Compared to the case of using pigment-containing silica particles bound with anti-type A influenza nucleoprotein antibody prepared using the thiol group-introduced pigment-containing silica particles of (Conditions 2 to 5), the influenza A nucleoprotein was 0 ng / The fluorescence intensity (background signal) in the case of ml was high.
  • the reason why excellent detection sensitivity was obtained when using the thiol group-introduced pigmented silica particles of the present invention example is as follows: 1) The MPMS shell layer is thin in the thiol group-introduced pigmented silica particles prepared in the present invention example ( In addition to the fact that the nonspecific adsorption of the biomolecule composite particles obtained from the above is suppressed and the background signal is lowered, 2) the introduced thiol group is not contained in the particles due to the thiol group solvation effect. It is considered that the antibody that is arranged outward and bound to this thiol group is likely to bind to the antigen. In particular, when silica particles obtained by introducing a thiol group in hexanol having strong hydrophobicity (Conditions 3 and 5), B / A can be further increased, and the improvement in detection sensitivity is more remarkable.
  • Test Strip 2 Sample Pad 3 Conjugate Pad 4 Antibody Immobilized Membrane 41 Judgment Unit (Test Line) 42 Control line 5 Absorption pad 6 Backing sheet

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Abstract

　チオール基を表面に有する、蛍光性又は吸光性の色素を含有するシリカ粒子であって、下記（ａ）及び（ｂ）を満たすシリカ粒子： （ａ）粒径が２０～１０００ｎｍである、 （ｂ）シリカ粒子表面における前記チオール基の密度が、０．００２～０．２個／ｎｍ２である、 （ｃ）シリカ粒子中の硫黄元素の量Ａ（シリカ粒子１個当たりのチオール由来の硫黄元素個数）に対する、該シリカ粒子の表面に存在するチオール基の量Ｂ（個／１粒子）の比（Ｂ／Ａ）が０．１０～０．６０である。

Description

表面に反応性官能基を有するシリカ粒子及びその製造方法
　本発明は、表面に反応性官能基を有するシリカ粒子及びその製造方法に関する。
　近年、数ｎｍ～１μｍ程度の微粒子が様々な分野に応用され、注目を集めている。例えば、吸着剤、触媒などに用いられる多孔質シリカ粒子やゼオライト粒子、顔料に用いられるカーボンブラック、金属酸化物粒子、無機化合物粒子、導電材料に使われる金属ナノ粒子、樹脂の補強剤に使われるシリカ粒子など、上記微粒子の材質および用途は多岐にわたる。また、半導体ナノ粒子や、蛍光色素を含むシリカナノ粒子等は、特にバイオテクノロジーの分野において、新たな標識用粒子としての応用が期待されている。高濃度の色素を含むシリカナノ粒子もまた、高いモル吸光係数を有することから、より高感度な標識用粒子としての応用が期待されている。
　上記標識用粒子は、特定の標的分子との結合能を有する生体分子（タンパク質や核酸等）をその表面に結合させることで、標的分子の検出、定量、染色等に利用可能な標識試薬として利用することができる。
　標識用粒子と生体分子との結合は、物理的な吸着による他、標識用粒子表面に存在する反応性官能基を介して両者を共有結合させることでも行われる。共有結合を利用することで、より強固で安定な標識生体分子が得られる。シリカ粒子の表面に反応性官能基を導入する方法としては、アンモニア水含有溶媒中でシリカのコア粒子表面に反応性官能基を有するオルガノアルコキシシランを縮重合させる方法が知られている（例えば特許文献１参照）。
特開２０１１－２２５３８１号公報
　シリカ粒子表面に反応性官能基を導入する際には、通常、当該官能基を有するシランカップリング剤と、コアとなるシリカ粒子とを、酸性又は塩基性の水溶液中で混合する手法がとられる。これにより、水溶液中の水分によってシランカップリング剤が加水分解され、続いてシリカ粒子表面の水酸基との間で縮重合反応が起こり、反応性官能基がシリカ粒子表面に導入される。しかし、この方法では、反応性官能基を有するシランカップリング剤同士が縮重合することを避けられない。そのため、コア粒子表面に、反応性官能基を有するシランカップリング剤に由来するシェル層が分厚く形成され、多くの反応性官能基がこのシェル層中に埋もれた状態となってしまう。すなわち従来の方法では、反応性官能基の粒子表面への導入は非効率なものであった。
　本発明は、表面にチオール基を特定の密度で有するナノメートルサイズのシリカ粒子であって、当該粒子が有するチオール基の総量に占める当該粒子表面に存在するチオール基の割合を高めたシリカ粒子を提供することを課題とする。
　また、本発明は、上記シリカ粒子表面に上記チオール基を介して生体分子が結合してなる生体分子複合粒子を提供することを課題とする。
　また、本発明は、生体分子として抗体又は抗原を結合させた生体分子複合粒子を用いたイムノクロマト方法を提供することを課題とする。
　さらに、本発明は、表面に特定の反応性官能基をより効率的に導入することができるシリカ粒子の製造方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、シリカ粒子を、その表面に結合水を有する状態で有機溶媒中に分散し、当該有機溶媒中にチオール基等の反応性官能基を有するシランカップリング剤を混合すると、このシリカ粒子表面に当該反応性官能基を効率的に導入できることを見い出した。すなわち、上記結合水によって、粒子表面でのみ上記シランカップリング剤の加水分解と縮重合反応が進行するため、上記シランカップリング剤同士の間の縮重合反応が生じにくく、その結果、反応性官能基を有するシェル層の厚みが大幅に抑えられることを見い出した。
　また、こうして得られたシリカ粒子の表面に、当該反応性官能基を介して生体分子を結合させて、イムノクロマト法等の標識試薬として用いると、当該標識試薬の非特異的吸着が抑えられてバックグラウンドシグナルが低下し、これによりシグナル／ノイズ比が大きくなり、より高感度の分析が行えることを見い出した。
　本発明はこれらの知見に基づき完成されるに至ったものである。
　本発明の課題は下記の手段により達成された。
〔１〕
　チオール基を表面に有するシリカ粒子であって、下記（ａ）及び（ｂ）を満たすシリカ粒子：
（ａ）粒径が２０～１０００ｎｍである、
（ｂ）シリカ粒子表面における前記チオール基の密度が、０．００２～０．２個／ｎｍ２である、
（ｃ）シリカ粒子中の硫黄元素の量Ａ（シリカ粒子１個当たりのチオール由来の硫黄元素個数）に対する、該シリカ粒子の表面に存在するチオール基の量Ｂ（個／１粒子）の比（Ｂ／Ａ）が０．１０～０．６０である。
〔２〕
　前記シリカ粒子が蛍光性又は吸光性の色素を含有する、〔１〕に記載のシリカ粒子。
〔３〕
　前記チオール基が、アルキレン基又はアルキレンオキシ基を介してシリカ粒子表面に結合している、〔１〕又は〔２〕に記載のシリカ粒子。
〔４〕
　〔１〕～〔３〕のいずれか一項に記載のシリカ粒子の表面に、前記チオール基を介して生体分子が結合してなる生体分子複合粒子。
〔５〕
　前記生体分子が抗体又は抗原である、〔４〕に記載の生体分子複合粒子。
〔６〕
　〔５〕に記載の生体分子複合粒子を用いたイムノクロマト方法。
〔７〕
　表面にヒドロキシ基以外の反応性官能基を有するシリカ粒子の製造方法であって、
　表面に結合水を有するシリカ粒子と、ヒドロキシ基以外の反応性官能基を有するシランカップリング剤とを有機溶媒中に混合し、該結合水により該シランカップリング剤を加水分解することを含む、製造方法。
〔８〕
　前記のヒドロキシ基以外の反応性官能基が、チオール基、アミノ基、カルボキシ基、ハロゲン原子、ビニル基、エポキシ基、イソシアネート基、及びイソチオシアネート基から選ばれる少なくとも１つである、〔７〕に記載の製造方法。
〔９〕
　前記有機溶媒が、極性非プロトン性溶媒又は炭素数２以上のアルコールである、〔７〕又は〔８〕のいずれか一項に記載の製造方法。
〔１０〕
　前記の表面に結合水を有するシリカ粒子が蛍光性又は吸光性の色素を含有する、〔７〕～〔９〕のいずれか一項に記載の製造方法。
〔１１〕
　前記の表面に結合水を有するシリカ粒子が、前記シランカップリング剤との混合前に、親水性有機溶媒による洗浄処理が施されたものである、〔７〕～〔１０〕のいずれか一項に記載の製造方法。
　本発明のシリカ粒子は、表面にチオール基を特定の密度で有し、当該粒子が有するチオール基の総量に占める当該粒子表面のチオール基の割合が大幅に高められている。
　本発明の生体分子複合粒子は、本発明のシリカ粒子表面に、チオール基を介して生体分子が結合しており、分析試薬に用いた際の非特異的な吸着が効果的に抑えられ、検出感度をより高めることができる。
　本発明のイムノクロマト方法は、本発明の生体分子複合粒子が標識試薬として用いられ、生体分子が結合する標的物質を、高感度に検出することができる。
　本発明の製造方法によれば、シリカ粒子表面に特定の反応性官能基をより効率的に導入することができる。
　本発明の上記及び他の特徴及び利点は、適宜添付の図面を参照して、下記の記載からより明らかになるであろう。
実施例で用いたイムノクロマト装置のテストストリップの構造を模式的に示した図である。図１中（Ａ）は上面図、（Ｂ）は縦断面図を示す。
　本発明をその好ましい実施態様に基づき以下に詳細に説明する。
　本発明のシリカ粒子は、粒径が２０～１０００ｎｍのシリカ粒子であって、その表面にチオール基を特定の密度で有し、且つ、当該粒子が有するチオール基の総量中、当該粒子表面に存在するチオール基の比率が特定のレベルに高められている。
　また、本発明の製造方法は、表面に結合水を有するシリカ粒子と、ヒドロキシ基以外の反応性官能基を有するシランカップリング剤とを有機溶媒中に混合し、当該シリカ粒子表面の結合水により、当該シランカップリング剤を加水分解することを含む。
　まず最初に、本発明の製造方法の好ましい実施形態について以下に詳説する。
［本発明の製造方法］
（表面に結合水を有するシリカ粒子）
　表面に結合水を有するシリカ粒子（以下「コア粒子」ということがある。）は、表面にヒドロキシ基を有し、後述する反応性官能基を有するシランカップリング剤と縮重合反応できれば特に制限はない。シリカ粒子を標識試薬として用いる場合には、蛍光性又は吸光性の色素や放射性物質等の標識物質を含有させることができる。コア粒子は好ましくは蛍光性又は吸光性の色素を含有し、より好ましくは蛍光性色素を含有する。
　コア粒子の好ましい実施形態について説明する
　蛍光性又は吸光性の色素を含有するコア粒子は、当該色素とシランカップリング剤とを、共有結合、イオン結合その他の化学結合又は物理的吸着により結合させた生成物（蛍光性又は吸光性の色素が結合したオルガノアルコキシシラン）を得、この生成物と１種又は２種以上のシラン化合物（シロキサン成分）とを、例えばアンモニア水含有溶媒中で、加水分解・縮重合させてシロキサン結合を形成させることにより調製することができる。また、色素に限らず、放射性物質等の他の標識物質を含有するコア粒子についても、標識物質が結合したシランカップリング剤を用いて、同様にして調製することができる。
　また、シリカ粒子に標識物質を含有させない場合は、単に上記シラン化合物のみを原料として、アンモニア水含有溶媒中で、加水分解・縮重合させ、コア粒子を得ればよい。
　上記アンモニア水含有溶媒としては、例えば、水／エタノールを体積比で１／１０～１／１とした混合液に、例えば２８％程度のアンモニア水を、アンモニア濃度が０．２～３ｗｔ％になるように加えた溶液を用いることができる。
　前記シラン化合物（シロキサン成分）に特に制限はないが、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）やテトラメトキシシランのようなテトラアルコキシシランを用いることが好ましく、中でも、ＴＥＯＳを好適に用いることができる。
　標識物質とシランカップリング剤とを共有結合させる場合には、例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基、マレイミド基、イソシアナート基、イソチオシアナート基、アルデヒド基、パラニトロフェニル基、ジエトキシメチル基、エポキシ基、シアノ基等の活性基を有する標識物質と、これらの活性基と反応しうる官能基（例えば、アミノ基、水酸基、チオール基等）を有するシランカップリング剤を用いることができる。
　ＮＨＳエステル基を有する標識物質が蛍光分子である場合の好適な例としては、５－（及び－６）－カルボキシテトラメチルローダミン－ＮＨＳエステル（商品名、ｅｍｐ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　ＧｍｂＨ社製）、下記式で表されるＤＹ５５０－ＮＨＳエステル、下記式で表されるＤＹ６３０－ＮＨＳエステル（いずれも商品名、Ｄｙｏｍｉｃｓ　ＧｍｂＨ社製）等のＮＨＳエステル基を有する蛍光色素化合物が挙げられるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　標識物質がスクシンイミド基を有する場合には、アミノ基を有するシランカップリング剤と結合させることができる。アミノ基を有するシランカップリング剤の具体例として、γ-アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、３－［２－（２－アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピルトリエトキシシラン、３－（２－アミノエチルアミノ）プロピルジメトキシメチルシラン、３－アミノプロピルトリメトキシシラン等が挙げられる。中でも、ＡＰＳを好適に用いることができる。
　上述のように調製される、標識物質を含むあるいは標識物質不含のシリカ粒子の形状は、長軸と短軸の比が２以下の球状であることが好ましい。また、平均粒径は１～９５０ｎｍであることが好ましく、１８～４９５ｎｍであることがより好ましく、２８～２９８ｎｍであることがさらに好ましい。
　本明細書において、粒径は平均粒径を意味する。平均粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）等の画像から無作為に選択した５０個の粒子の合計の投影面積から粒子の占有面積の合計を画像処理装置によって求め、この占有面積の合計を、選択した複合粒子の個数（５０個）で割って得られる面積に相当する円の直径（平均円相当直径）として算出することができる。前記平均粒径は、一次粒子が凝集してなる二次粒子の粒径は含まない。
　所望の平均粒径のシリカナノ粒子は、ＹＭ－１０、ＹＭ－１００（いずれも商品名、ミリポア社製）等の限外ろ過膜を用いた限外ろ過により得ることができる。また、適切な重力加速度で遠心分離を行い、上清又は沈殿を回収することで得ることもできる。
　ヒドロキシ基以外の反応性官能基を導入する前の、表面に結合水を有するシリカ粒子は、水、水溶液もしくは有機溶媒又はこれらの混合液により洗浄しておくことも好ましい。また、水や水溶液を用いて洗浄することにより、不純物の除去と同時に粒子表面に十分な結合水を保持させることもできる。
　洗浄操作は具体的には、シリカ粒子の洗浄液中への分散、遠心分離によるシリカ粒子の沈降、及び上清の除去を１～３サイクル行うことが好ましい。洗浄液に特に制限はないが、例えば、水、水溶液、エタノール、プロパノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘキサノール、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。
　水又は水溶液により洗浄して不純物を除去すると同時にシリカ粒子表面に十分量の結合水を保持させた後、アルコール（好ましくはエタノール、プロパノール、ペンタノール、ヘキサノール又はヘキサノール）等の親水性有機溶媒で洗浄し、シリカ粒子表面に存在する結合水以外の余分な水分（自由水）を除去し、表面に結合水を有するシリカ粒子を得ることも好ましい。
　また、アンモニア水含有溶媒中でコア粒子を形成した直後であれば、通常、コア粒子表面に十分な結合水が保持されている。したがって、アンモニア水含有溶媒中で形成したコア粒子を親水性有機溶媒で洗浄し、シリカ粒子表面に存在する自由水を除去し、表面に結合水を有するシリカ粒子を得ることができる。
　続いて、表面に結合水を有するシリカナノ粒子にヒドロキシ基以外の反応性官能基（以下、「官能基（Ｉ）」という。）を導入する方法について説明する。本発明の製造方法では、官能基（Ｉ）は、チオール基、アミノ基、カルボキシ基、ハロゲン基、ビニル基、エポキシ基、イソシアネート基、及びイソチオシアネート基から選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。このような反応性官能基を採用することで、これらの反応性官能基を介して生体分子等を結合させることができる。
（官能基（Ｉ）の導入）
　本発明の製造方法は、上記で得られた表面に結合水を有するシリカ粒子と、官能基（Ｉ）を有するシランカップリング剤とを有機溶媒中に混合し、当該結合水により当該シランカップリング剤を加水分解する工程を含む。
　上記で加水分解された官能基（Ｉ）を有するシランカップリング剤は、その加水分解サイトのヒドロキシ基とシリカナノ粒子表面のヒドロキシ基とが縮重合することでシリカナノ粒子表面に結合する。この縮重合反応により水分子が放出されるため、結合水の量は縮重合反応の前後で変化しない。
　上記有機溶媒としては、ジメチルスルホキシド、スルホラン、ピリジン、Ｎ－メチルピロリドン、Ｎ－シクロヘキシルピロリドン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、アルコール（好ましくは炭素数２以上、より好ましくは炭素数３～１０、さらに好ましくは炭素数４～８のアルコール）が挙げられる。なかでも、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド及び炭素数４～８のアルコールから選ばれるものが好ましく、炭素数４～８のアルコールから選ばれるものがより好ましく、ペンタノール、ヘキサノール及びヘプタノールから選ばれる溶媒がさらに好ましい。
　上記官能基（Ｉ）を有するシランカップリング剤において、官能基（Ｉ）とケイ素原子との連結は、連結基を介していることが好ましい。当該連結基としては、アルキレン基又はアルキレンオキシ基であることが好ましい。当該アルキレン基又はアルキレンオキシ基の炭素数は、２～１０が好ましく、２～５がより好ましく、２～４がさらに好ましい。連結基と有機溶媒との間の溶媒和により、官能基をシリカ粒子の表面外側に向けて効果的に配置させることができる。
　上記官能基（Ｉ）を有するシランカップリング剤の具体例としては、３－メルカプトプロピルトリメトキシシラン、γ-メルカプトプロピルトリエトキシシラン、γ-アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、３－チオシアナトプロピルトリエトキシシラン、３－グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン、３－イソチオシアナトプロピルトリエトキシシラン、３－［２－（２－アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピルトリエトキシシラン、（３－クロロプロピルトリメトキシシラン、ビニルメトキシシラン、３－メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、３－アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、Ｎ－フェニル－３－アミノプロピルトリメトキシシラン、３－ウレイドプロピルトリエトキシシラン、ビス（トリエトキシシリルプロピル）テトラスルフィド等が挙げられるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　上記方法によりシリカ粒子に官能基（Ｉ）を導入することで、官能基（Ｉ）を有するシランカップリング剤同士の縮重合反応を大幅に抑えることができる。その結果、官能基（Ｉ）を有するシェル層をより薄膜化することができる。このシェル層の薄膜化は、シリカ粒子を分析試薬の標識粒子として用いた際に、検体中に存在する成分等の非特異的な吸着を抑え、感度と精度に優れた分析を可能とする。
　また、シェル層を薄膜化できるため、その分、コア粒子の割合を増やすことができる。その結果、１粒子当たりの標識物質（色素等）の量を増やすことができ、分析試薬として用いた際のさらなる感度アップにつながる。
　官能基（Ｉ）が導入された機能性分子含有シリカナノ粒子のゼータ（ζ）電位の絶対値は２０～７０ｍＶであることが好ましい。ゼータ電位の絶対値が上記範囲内である粒子は、凝集が抑制され、分散性がより高まる。
　ゼータ電位は、例えば、ゼータサイザーナノ（商品名、マルバーン社製）、ＥＬＳ－Ｚ１（商品名、大塚電子社製）、ＮＩＣＯＭＰ　３８０ＺＬＳ（商品名、ＩＢＣ社製）を用いて測定することができる。
　本発明の製造方法により、シリカ粒子が有する官能基（Ｉ）の総量に占める、粒子表面に存在する官能基（Ｉ）の割合を高めることができる。
　上述のように調製される、表面に官能基（Ｉ）を有するシリカ粒子の形状は、長軸と短軸の比が２以下の球状である。本発明の実施において、表面修飾に必要とされる溶媒置換のためには、シリカ粒子を遠心分離できることが必要である。粒径（平均粒径）が２０ｎｍより小さい場合、遠心分離により沈降が困難となり、従って、２０ｎｍ以上であることが好ましい。また、粒径が１０００ｎｍより大きい場合、反応中に粒子が沈降してしまう。そのため、粒径は１０００ｎｍ以下であることが好ましい。よって、粒径は２０～１０００ｎｍであることが好ましく、２０～５００ｎｍであることがより好ましく、３０～３００ｎｍであることがさらに好ましい。
　本発明の製造方法において、官能基（Ｉ）はチオール基が好ましい。官能基（Ｉ）がチオール基の場合に得られるシリカ粒子について以下に説明する。
　官能基（Ｉ）がチオール基である場合には、チオール基を有するシリカ粒子中の硫黄元素の量Ａ（シリカ粒子１個当たりのチオール由来の硫黄元素個数）に対する、当該シリカ粒子の表面に存在するチオール基の量Ｂ（個／１粒子）の比（Ｂ／Ａ）が、０．１０～０．６０であることが好ましく、０．１５～０．６０であることがより好ましく、０．２０～０．６０であることがさらに好ましい。
　ここでいう粒子１個当たり（１粒子当たり）とは、所定量のシリカ粒子が有する硫黄元素量あるいはチオール基の量を、その粒子数で割った値である（すなわち平均値である）。ここで、所定量のシリカ粒子の粒子数は、当該所定量のシリカ粒子の総質量を、シリカ粒子１個当たりの質量で除することで求められる。シリカ粒子１個当たりの質量は、シリカ粒子の平均体積とシリカ粒子の比重（２．０ｇ／ｃｍ３）を用いて算出することができる。シリカ粒子の平均体積は、１００００倍のＳＥＭ写真から、画像処理により視野中の所定個数（通常２００個程度）の個々のシリカ粒子の粒径（長径と短径の平均）を求め、これを用いて、個々のシリカ粒子を球体と想定して体積を計算し（体積＝４π×（シリカ粒子の粒径の半分）３／３）、これに基づき総体積を求め、これを上記視野中の所定個数（粒子数）で割ることにより算出することができる。
　上記の比（Ｂ／Ａ）は、シリカ粒子の硫黄元素の総重量に対するシリカ粒子表面に露出している硫黄元素の重量の比率と同じ意味である。
　また、官能基（Ｉ）がチオール基である場合において、シリカ粒子表面におけるチオール基の密度は、０．００２～０．２個／ｎｍ２が好ましく、０．００２～０．１個／ｎｍ２がより好ましい。また、０．００２～０．０５個／ｎｍ２であってもよく、０．００３～０．０２個／ｎｍ２であってもよく、０．００３～０．０１であってもよい。
　シリカ粒子表面におけるチオール基の密度を０．００２個／ｎｍ２以上とすることで、生体分子を十分量結合することができ、例えばイムノクロマトグラフィー等のイムノアッセイに適用した際に検出感度をより高めることができる。
　また、シリカ粒子表面におけるチオール基の密度を０．２個／ｎｍ２以下とすることで、粒子の凝集を効果的に抑えることができる。また、生体分子を結合させて分析試薬として用いた際には、非特異的な吸着がさらに抑えられ、偽陽性がより生じにくくなる。
　なお、官能基（Ｉ）がチオール基である場合において、粒子表面へのチオール基の導入前のコア粒子が硫黄元素を有する場合には（例えば、色素とシランカップリング剤との連結部に硫黄元素が存在する等）、コア粒子中の硫黄元素の量は、シリカ粒子中の硫黄元素の量Ａには含まれないものとする。つまり、上記Ａはチオール基の形態で粒子中に存在する硫黄元素の総量となる。粒子表面へのチオール基の導入前のコア粒子は、硫黄元素を有さないことが好ましい。
　上記の、表面にチオール基を有するシリカ粒子中の硫黄元素の量Ａ（当該チオール基を有するシリカ粒子１個当たりの量）は、燃焼法により測定することができる。具体的には、Ｎｉカプセル等の金属カプセルにシリカナノ粒子を５～５０μｇ入れ、燃焼させて生じる二酸化硫黄（ＳＯ２）の量を定量することで硫黄元素の量を測定することができる。
　上記の、表面にチオール基を有するシリカ粒子において、粒子表面に存在するチオール基の量Ｂは、ＤＮＴＢ（5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoic　acid)）を試薬として用いて測定することができる。ＤＮＴＢを用いたチオール基の定量法は、例えば、Archives　of　Biochemistry　and　Biophysics，1959，vol.82，p.70　に記載されている。具体的な方法の一例としては、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した１０ｍＭのＤＮＴＢの溶液２０μＬと、２００ｍｇ／ｍＬに調製したシリカ粒子コロイド２．５ｍＬとを混合し、１時間後に４１２ｎｍの吸光度を測定し、標準物質としてγ－メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）を用いて作成した検量線から粒子表面に存在するチオール基量を定量することができる。
　本発明の製造方法で得られる、表面にチオール基を有するシリカ粒子は、当該チオール基を介して生体分子を結合し、生体分子複合粒子とすることができる。生体分子を結合については後述する。
　また、本発明の製造方法において、シリカ粒子が有する官能基（Ｉ）がアミノ基、カルボキシ基、ビニル基、エポキシ基、イソシアネート基又はイソチオシアネート基である場合も、得られるシリカ粒子表面に常法により生体分子を結合させることができる。これらの方法は、例えば、特開2009-274923（アミノ基）号公報、特開2009-162537（カルボキシ基）号公報、特開2010-100542（エポキシ基、イソシアネート基）号公報等の記載を参照することができる。
［本発明のシリカ粒子］
　本発明のシリカ粒子は、その表面にチオール基を有し、（ａ）粒径が２０～１０００ｎｍであり、（ｂ）粒子表面における前記チオール基の密度が０．００２～０．２個／ｎｍ２であり、さらに（ｃ）シリカ粒子中の硫黄元素の量Ａ（シリカ粒子１個当たりのチオール由来の硫黄元素個数）に対する、該シリカ粒子の表面に存在するチオール基の量Ｂ（個／１粒子）の比（Ｂ／Ａ）が０．１０～０．６０である。本発明のシリカ粒子は、通常はその表面にチオール基が均質に存在している。
　本発明のシリカ粒子の調製方法に特に制限はなく、例えば、上述した本発明の製造方法において、官能基（Ｉ）としてチオール基を採用することにより得ることができる。
　本発明のシリカ粒子の好ましい形態は、上述の本発明の製造方法において、官能基（Ｉ）としてチオール基を採用した場合に得られるシリカ粒子の好ましい形態と同じである。したがって、本発明のシリカ粒子の粒径は、２０～５００ｎｍであることがより好ましく、３０～３００ｎｍであることがさらに好ましい。またシリカ粒子表面におけるチオール基の密度は０．００２～０．１個／ｎｍ２が好ましく、０．００２～０．０５個／ｎｍ２であってもよく、０．００３～０．０２個／ｎｍ２であってもよい。また、本発明のシリカ粒子は、上記比（Ｂ／Ａ）が、０．１５～０．６０であることが好ましく、０．２０～０．６０であることがより好ましい。
　本発明のシリカ粒子は標識物質を含有しなくてもよいが、標識物質を含有することが好ましい。標識物質を含有することにより、標識試薬として好適に用いることができる。標識物質は、蛍光性又は吸光性の色素であることが好ましく、蛍光性色素がより好ましい。当該色素は、チオール基を導入する前の粒子（コア粒子）に含有させることが好ましい。すなわち、標識物質を含有するコア粒子を調製し、その表面に、例えば本発明の製造方法によってチオール基を導入することにより、標識物質を含有する形態の本発明のシリカ粒子を得ることができる。コア粒子の調製は上述したとおりである。上記コア粒子には硫黄元素が含まれないことが好ましい。
［本発明の生体分子複合粒子］
　本発明の生体分子複合粒子は、上記本発明のシリカ粒子がその表面に有するチオール基を介して生体分子を結合した形態の粒子である。
　生体分子に特に制限はなく、タンパク質、核酸、糖等を広く用いることができる。これらの生体分子はさらに化学修飾されていてもよく、また、一部の構造が化学的に改変されていてもよい。なかでも、生体分子は所望の標的物質との特異的な結合能を有することが好ましい。当該生体分子と標的物質の組み合わせの例として、抗体とその抗原、抗原とその抗体、核酸（ＤＮＡやＲＮＡ等）と該核酸に相補的な配列を有する核酸、受容体とそのリガンド、リガンドとその受容体、レクチンと糖鎖、アプタマーと該アプタマーに特異的に結合する分子、等が挙げられる。生体分子は好ましくは抗体又は抗原であり、より好ましくは抗体である。
　上記生体分子が抗体である場合には、本発明の生体分子複合粒子は抗原を検出するための免疫測定試薬として用いることができる。
　上記抗体としては、免疫グロブリン（whole抗体）や、それを酵素分解して得られるＦ（ａｂ’）２やＦａｂ、重鎖の可変領域（ＶＨ）と軽鎖の可変領域（ＶＬ）とをリンカーを介してタンデムに連結したｓｃＦｖやｓｃ（Ｆｖ）２、ＶＨとＶＬがリンカーを介して連結したユニット２つからなるダイアボディー、人工的に化学合成した、ＶＨ及びＶＬを含むポリアミノ酸、大腸菌や酵母等を発現系として用いて作製された、ＶＨ及びＶＬを含む組換えタンパク質ないし組換えポリアミノ酸を含む。すなわち、本発明において「抗体」とは、ＶＨ及びＶＬを有する分子ないしユニットを意味し、ＶＨ及びＶＬを有する限り、その形態は限定されない。
　本発明のシリカ粒子への生体分子の結合は、粒子表面に存在するチオール基と、生体分子とを、共有結合させるのが好ましい。当該共有結合は常法により行うことができる。例えば、本発明のシリカ粒子と、マレイミド基及びカルボキシ基を有するリンカー分子とを非プロトン性溶媒中に共存させ、これにより粒子表面のチオール基と前記マレイミド基との間でチオエーテル結合を形成させて、リンカー分子が結合したシリカ粒子を得る。続いて、前記のリンカー分子が結合したシリカ粒子と、カルボジイミドと、アミノ基を有する生体分子とを水系溶媒中に共存させ、前記カルボジイミドにより活性エステル化された前記カルボキシ基と、前記生体分子が有するアミノ基との間でアミド結合を形成させる。こうすることで、チオール基を介して生体分子が結合してなる生体分子複合粒子を得ることができる。
　また、表面にチオール基を有するシリカ粒子と、マレイミド基及びアミノ基を有するリンカー分子とを溶媒中に共存させ、これによりチオール基を有するシリカ粒子の当該チオール基と前記マレイミド基との間でチオエーテル結合を形成させ、次いでリンカー分子が結合したシリカ粒子を得、続いて、前記のリンカー分子が結合したシリカ粒子と、カルボジイミドと、抗体とを水系溶媒中に共存させ、前記リンカー分子が有するアミノ基と、前記抗体が有するカルボキシ基との間でアミド結合を形成させてもよい。
　本発明の製造方法で製造された生体分子複合粒子は、粒径（平均粒径）が２０～１０００ｎｍであることが好ましく、２０～５００ｎｍであることがより好ましく、３０～３００ｎｍであることがさらに好ましい。
　本発明の生体分子複合粒子の用途に特に制限はない。例えば、生体分子として抗体又は抗原を用いれば、各種免疫学的検査（イムノアッセイ）の標識試薬として用いることができる。当該イムノアッセイとしては、イムノクロマトグラフィー、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ、例えばＥｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）等）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）等の標識粒子として適用することができる。
　また、免疫凝集法（抗体又は抗原を結合した粒子と検体とを混合し、検体に含まれる抗原又は抗体との抗原抗体反応によって粒子を凝集させる検査方法）、免疫比濁法（抗体又は抗原を結合した粒子と検体とを混合し、検体に含まれる抗原又は抗体との抗原抗体反応によって生じる抗原－抗体複合体の沈降物を形成させ、その凝集塊に光を照射して、散乱による照射光の減衰を分光光度計で計測して検体に含まれる抗原量を測定する検査方法）、免疫比ろう法（抗体又は抗原を結合した粒子と検体とを混合し、検体に含まれる抗原または抗体との抗原抗体反応によって生じる抗原－抗体複合物を形成させ、その複合物の分散液に光をあて散乱した光を測定することで、検体に含まれる抗原または抗体を定量する検査方法）、ＣＬＥＩＡ法（化学発光酵素免疫測定法；抗体を結合した粒子及び酵素標識抗体と抗原を含む検体とを混合し、粒子－抗原－酵素標識抗体の複合体を形成し、未反応物を除去後、発光試薬を添加し、その発光量を測定して検出対象物を定量する検査方法）などにも利用できる。
　その他にも、本発明の生体分子複合粒子は、フローサイトメトリーにおける標識粒子や、各種バイオチップ等における標識粒子としても用いることができる。
［本発明のイムノクロマト方法］
　本発明のイムノクロマト方法（イムノクマトグラフィー法）の好ましい実施形態について説明する。
（テストストリップ）
　本発明のイムノクロマト方法は、特定のテストストリップを用いて実施される。当該テストストリップは、
（１）試料添加用部材（サンプルパッド）と標識抗体（シリカ粒子が例えば蛍光性又は吸光性の色素を含有する生体分子複合粒子であって、当該生体分子が抗体であるもの）を含有させてなる部材（コンジュゲートパッド）とが、
（２）前記コンジュゲートパッドと、標的物質と標識抗体とを含む複合体を捕捉するための抗体が固定化されたメンブレン（捕捉抗体固定化メンブレン）とが、並びに
（３）前記捕捉抗体固定化メンブレンと吸収パッドとが
相互に毛細管現象が生じるように直列に連結している構造であることが好ましい。
　上記捕捉抗体分子は、標的物質と標識抗体とを含む複合体において、標的物質上の、標識抗体が結合している部位以外の部位に結合可能な抗体である。
　図１（Ａ）及び（Ｂ）を参照して、上記テストストリップの好ましい実施形態について説明するが、本発明はこれに制限されるものではない。
　図１（Ａ）は、上記テストストリップの好ましい一実施形態の平面図を示し、図１（Ｂ）は、図１（Ａ）で示した上記テストストリップの縦断面図を示す図である。
　上記テストストリップ１は、サンプルパッド２、コンジュゲートパッド３、捕捉抗体固定化メンブレン４、吸収パッド５からなることが好ましい。上記各構成部材は粘着剤付きバッキングシート６により裏打ちされていることが好ましい。
　前記捕捉抗体固定化メンブレン４における捕捉抗体固定化部に、標的物質の有無を判定、すなわち陽性／陰性を判定するための抗体が固定化された判定部４１を設ける。捕捉抗体固定化メンブレン４には、標識抗体と結合する分子が固定化されたコントロールライン４２を含むことが好ましい。
　次に、上記各部材について説明する。
（サンプルパッド２）
　サンプルパッド２は標的物質を含む液体試料を滴下する構成部材である。
（コンジュゲートパッド３）
　コンジュゲートパッド３は標識抗体を含有する構成部材であり、サンプルパッド２から毛細管現象により移動してきた液体試料に含まれる標的物質が特異的分子認識反応によって標識抗体と液相中で結合して複合体の形成が開始される部分である。
（捕捉抗体固定化メンブレン４）
　捕捉抗体固定化メンブレン４は前記複合体を含む溶液が毛細管現象により移動してくる構成部材であり、標的物質と標識抗体とを含む複合体が固定化抗体上に捕捉される捕捉抗体固定化部（判定部）を有する。
　前記メンブレンにおける前記捕捉抗体固定化部（判定部）の形状としては局所的に捕捉用抗体が固定化されている限り特に制限はなく、ライン状、円状、帯状等が挙げられるが、ライン状であることが好ましく、通常には幅０．５～１．５ｍｍのライン状である。
　上記複合体形成反応により、結果的に捕捉抗体固定化部（判定部）に、標識抗体が濃縮される。その結果、蛍光シグナル等の含色素シリカ粒子が有する色素量の程度により標的物質の量を定性又は定量することができる。
　前記捕捉抗体固定化部（判定部）における捕捉抗体固定化量に特に制限ないが、形状がライン状の場合、単位長さ（ｃｍ）当たり０．１μｇ～５μｇが好ましい。固定化方法としては、捕捉抗体溶液を塗布、滴下ないしは噴霧後、乾燥して物理吸着により固定化する方法等が挙げられる。捕捉分子はメンブレンに直接固定化されていてもよいし、他の分子を介して間接的に固定化されていてもよい。
　前述の捕捉抗体固定化後に、非特異的吸着による測定への影響を防止するために前記捕捉抗体固定化メンブレン全体にいわゆるブロッキング処理を施しておくことが好ましい。例えば、アルブミン、カゼイン、ポリビニルアルコール等のブロッキング剤を含有する緩衝液中に適当な時間浸漬した後乾燥することでブロッキングを行うことができる。市販の前記ブロッキング剤としては、例えば、スキムミルク（ＤＩＦＣＯ社製）、４％ブロックエース（明治乳業社製）などが挙げられる。
（吸収パッド５）
　吸収パッド５は、毛細管現象でメンブレンを移動してきた溶液を吸収し、一定の流れを生じさせるための構成部材である。
　これら各構成部材の材料としては特に制限は無く、イムノクロマト用テストストリップに通常用いられる部材が使用できるが、サンプルパッド及びコンジュゲートパッドとしてはＧｌａｓｓ　Ｆｉｂｅｒ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｐａｄ（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）等のガラスファイバーのパッドが好ましく、メンブレンとしてはＨｉ－Ｆｌｏｗ　Ｐｌｕｓ１２０メンブレン（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）等のニトロセルロースメンブレンが好ましい。また、吸収パッドとしてはＣｅｌｌｕｌｏｓｅ　Ｆｉｂｅｒ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｐａｄ（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）等のセルロースメンブレンが好ましい。
　前記粘着剤付きバッキングシートとしては、ＡＲ９０２０（商品名、Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）等が挙げられる。
　前記テストストリップの作製法としては、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、捕捉抗体固定化メンブレン、吸収パッドの並び順に、各部材間で毛管現象を生じさせ易くするために、それら各部材の両端を隣接する部材と１～５ｍｍ程度重ね合わせて（好ましくはバッキングシート上に）貼付することで作製することができる。
（検出方法）
　次にイムノクロマト法における検出方法について説明する。
　標的物質を含有しうる液体試料を上記テストストリップのサンプルパッド２に滴下することで、サンプルパッド２を通過した当該液体試料がコンジュゲートパッド３に浸透して接触し、該コンジュゲートパッド３に保持されていた標識抗体と当該液体試料中の標的物質との結合反応が開始する。液体試料は、前記結合反応により標識抗体と該標的物質とを含む複合体を形成しながら、毛細管現象により捕捉抗体固定化メンブレン４、吸収バッド５へと順次移動していき、試料中に標的物質が含まれる場合には、上述したようにテストライン上に標識抗体が濃縮される。この濃縮された標識抗体に含まれる色素の吸光（プラズモン共鳴）を目視で、又は色素の蛍光を蛍光検出器を用いて検出することで、標的物質の存在を検出することができる。本発明において「検出」とは、定性的な検出と定量的な検出の双方を含む概念である。
　滴下する液体試料の量はテストストリップの構成に合わせて適宜調節することができる。
　本発明において、標的物質を含有しうる試料に特に制限なく、臨床検体、食品検体、環境サンプリング検体等が挙げられる。
　上記臨床検体としては、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、唾液、膵液、胃液、喀痰、鼻や咽等の粘膜から採取したぬぐい液等の体液や便等が挙げられるがこれらに限定されず、目的とする標的物質が含まれ得る試料であればよい。
　上記食品検体としては、液体飲料、半固形食品、固形食品等が挙げられる。
　環境サンプリング検体としては、土壌、河川、海水等の自然界のサンプルの他、工場内の生産ラインやクリーンルームに設置されたエアーサンプラーによるサンプリング検体や、ふき取り検体等も挙げられる。
　試料は液体であればそのまま本発明の方法に用いることもできるし、半固形又は固形物等の場合には、希釈や抽出等の処理を施した後に本発明に用いることもできる。
　本発明のイムノクロマト方法は５～４０℃の温度下で行うことが好ましい。
　本発明の生体分子複合粒子をイムノクロマト法の標識抗体として用いると、検体中に存在する標的物質以外の成分の、標識抗体に対する非特異的な吸着が生じにくい。その結果、より高感度かつ高精度の分析を行うことが可能になる。
［実施例１］　表面に反応性官能基を有する含色素シリカ粒子の調製
　下記工程（ｉ）～（ｉｖ）を経て表面に反応性官能基としてチオール基を有する含色素シリカ粒子を調製した。
－工程（ｉ）：コア粒子の調製－
　１４％のアンモニア水をさらにエタノールで５倍希釈してアンモニア水含有有機溶媒３．５ｍｌを調製した。このアンモニア水含有有機溶媒中に、当該アンモニア水含有有機溶媒１００体積％に対して０．８６体積％のＴＥＯＳと、当該ＴＥＯＳ１００体積％に対して５３体積％のカルボキシローダミン６Ｇ－ＡＰＳのＤＭＦ溶液とをそれぞれ添加して、４０℃の温度下で攪拌した。ここで、前記カルボキシローダミン６Ｇ－ＡＰＳは、前記カルボキシローダミン６Ｇ－ＮＨＳエステルとＡＰＳとを反応させて得たものである。また、前記ＤＭＦ溶液中のカルボキシローダミン６Ｇ－ＡＰＳ濃度は１０ｍＭとした。
－工程（ｉｉ）：シェル層の形成－
　上記工程（ｉ）で形成されてきた含色素シリカ粒子の分散液に、前記カルボキシローダミン６Ｇ－ＡＰＳとＴＥＯＳとを追添し、４０℃で３０分間反応させ、シェル層を形成させた。
　上記のカルボキシローダミン６Ｇ－ＡＰＳの追添量は、上記工程（ｉ）におけるカルボキシローダミン６Ｇ－ＡＰＳの添加量１００体積％に対して６７体積％、ＴＥＯＳの追添量は、上記工程（ｉ）におけるＴＥＯＳ添加量と同量とした。
　この操作を繰り返してシェル層を積層し、２層のシェル層を有する含色素シリカ粒子を調製した。なお、２回目のカルボキシローダミン６Ｇ－ＡＰＳの追添量は、上記工程（ｉ）におけるカルボキシローダミン６Ｇ－ＡＰＳの添加量１００体積％に対して３３体積％、ＴＥＯＳの追添量も上記工程（ｉ）におけるＴＥＯＳ添加量１００体積％に対して３３体積％とした。
－工程（ｉｉｉ）：自由水の除去－
　上記工程（ｉｉ）で得られた、２層のシェル層を有する含色素シリカ粒子の分散液を遠心分離（１００００ｒｐｍ、１０分間）し、粒子を沈降させた後、直ちに上清を除去した。得られた沈殿物をエタノールに再分散させ、再度遠心分離（１００００ｒｐｍ、１０分間）して、粒子を沈降させ、次いで上清を除去した。
－工程（ｉｖ）：反応性官能基の導入－
　上記工程（ｉｉｉ）で得られた、表面に結合水を有する含色素シリカ粒子を、下記表１に示す各種溶媒３．５ｍＬに再分散させた（条件１～条件５）。ここで、条件１は比較例、条件２～条件５は、本発明例である。次いで、粒子表層にチオール基を導入するために、粒子分散液に３－メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＭＳ）を投入して４０℃で２０分反応させ、表層にヒドロキシ基およびチオール基を有するシリカナノ粒子を得た。ＭＰＭＳの投入量は、条件１～４に関しては、上記工程（ｉ）におけるＴＥＯＳとカルボキシローダミン６Ｇ－ＡＰＳの総投入量１００体積％に対して３３体積％、条件５に関しては、上記工程（ｉ）におけるＴＥＯＳとカルボキシローダミン６Ｇ－ＡＰＳの総投入量１００体積％に対して１０体積％とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　反応終了後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１０分間）して粒子を沈降させた後、直ちに上清を除去した。得られた沈殿物をエタノールに再分散させ、再度遠心分離（１００００ｒｐｍ、１０分間）し、粒子を沈降させた。同様のエタノール洗浄操作をさらに１回行い、未反応のＴＥＯＳ等を除去した。続いて、上記エタノールの代わりに蒸留水を用いた以外は上記と同様に洗浄操作を４回行い、遊離色素等を除去した。こうして反応溶媒の異なる５種類のチオール基導入含色素シリカ粒子を得た。
（ζ（ゼータ）電位測定とチオール基の定量）
　上記で得られたチオール基導入含色素シリカ粒子を洗浄し、平均粒径、ζ電位測定の測定、燃焼法による硫黄元素量の測定（粒子中に含まれる硫黄量）、及び、ＤＮＴＢによるチオール基の定量を行った。
　得られた結果を下記表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　上記条件１～５で得られたチオール基導入含色素シリカ粒子の表面におけるチオール基の密度は、順に、０．００３３個／ｎｍ２、０．００５３個／ｎｍ２、０．００７１個／ｎｍ２、０．００５３個／ｎｍ２、０．００７１個／ｎｍ２となる。
　上記表２に示されるように、本発明例で調製されたチオール基導入含色素シリカ粒子（条件２～５）において、Ｂ／Ａが顕著に高められた。すなわち、本発明例で調製されたチオール基導入含色素シリカ粒子において、ＭＰＭＳが縮重合して形成されたシェル層は、比較例で調製されたチオール基導入含色素シリカ粒子（条件１）において、ＭＰＭＳが縮重合して形成されたシェル層に比べて、格段に薄い。
　この結果は、有機溶媒中で反応性官能基を有するシランカップリング剤を粒子表面に縮重合させることにより、チオール基を極めて効率的に粒子表面に導入できることを示している。
［実施例２］　チオール基を有する含色素シリカ粒子への抗体の導入
　工程（ｉｖ）で得られたチオール基導入含色素シリカ粒子の分散液（濃度２５ｍｇ／ｍＬ、分散媒：蒸留水）４０μＬに、ＤＭＦ４６０μＬを加え、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離した。上清を除去し、ＤＭＦを５００μＬ加えて遠心分離し、上清を除去した。再度ＤＭＦを５００μＬ加えチオール基導入蛍光シリカナノ粒子を分散させた。これにリンカー分子として３－マレイミド安息香酸を１ｍｇ加え、３０分混合することで、上記リンカー分子のマレイミド基とチオール基導入含色素シリカ粒子のチオール基との間でチオエーテル結合を形成させた。
　この反応液を１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去後、蒸留水９０．６μＬを加え、粒子を分散させた。続いて、０．５Ｍ　ＭＥＳ（２－モルホリノエタンスルホン酸)（ｐＨ６．０）１００μＬ、５０ｍｇ／ｍＬ　ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）　２３０．４μＬ、１９．２ｍｇ／ｍＬ　ＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）７５μＬを加え混合した。これに抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体（６．２ｍｇ／ｍｌ、マウス由来、ＨｙＴｅｓｔ社製）を４．０μＬ加え、１０分間混合した。
　１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。１０ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を４００μＬ加え、粒子を分散させた。続いて１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。再度１０ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を４００μＬ加え、粒子を分散させてコロイドを得た。
　続いて上記コロイドに１０％ＢＳＡを１０μＬ加え１０分間混合した。１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。１０ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を５００μＬ加え、粒子を分散させ、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。再度１０ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）を４００μＬ加え、粒子を分散させ、抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体が結合した含色素シリカ粒子（生体分子複合粒子）が分散したコロイドを得た。
［試験例１］　イムノクロマト試験（インフルエンザ核タンパク質の迅速判定）
（イムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製）
　抗体固定化メンブレンを用いたテストストリップを以下の方法で作製した。
　メンブレン（丈２５ｍｍ、商品名：Ｈｉ－Ｆｌｏｗ　Ｐｌｕｓ１２０　メンブレン、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）の端から約６ｍｍの位置に、ウサギ由来の抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体（ポリクローナル抗体、自社製）を１ｍｇ／ｍＬ含有する溶液（（５０ｍＭＫＨ2ＰＯ4，ｐＨ７．０）＋５％スクロース）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布し、幅約１ｍｍのＡ型インフルエンザ用テストラインを設けた。
　続いて、ヤギ由来の抗マウスＩｇＧ抗体（ＡＫＰ　Ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）を１ｍｇ／ｍＬ含有する溶液（（５０ｍＭＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．０）シュガー・フリー）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布し、幅約１ｍｍのコントロールラインを設けた。その後、５０℃で３０分乾燥させた。なお、テストラインとコントロールラインとの間隔は３ｍｍとした。
　前記抗体固定化メンブレン、サンプルパッド（Ｇｌａｓｓ　Ｆｉｂｅｒ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｐａｄ（ＧＦＣＰ）、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）、及び吸収パッド（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　Ｆｉｂｅｒ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｐａｄ（ＣＦＳＰ）、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）をバッキングシート（商品名ＡＲ９０２０，Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）上で組み立てた。なお、メンブレンはＡ型インフルエンザ用テストラインがサンプルパッド側、コントロールラインが吸収パッド側になる向きで構成した。
（検出装置）
　光源と光学フィルタと光電子倍増管（ＰＭＴ）からなる検出ユニットを有し、該検出ユニットが、モーターによって一定速度で直線移動する機構を備え、ＰＭＴの受光強度を５０μ秒ごとに記録する記録機構を備えた検出装置を作製した。なお、検出ユニットは、光源が５３２ｎｍのレーザダイオードであり、レーザダイオードをサンプルに照射し、反射光を５５０ｎｍ以上の波長の光のみを透過する光学フィルタを透過させた後に光電子増倍管（ＰＭＴ）で受光する機構を有する。
（イムノクロマト試験）
　表３に示す濃度のＡ型インフルエンザ核タンパク質の溶液を調製した。この溶液１００μＬと、上記の抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体が結合した含色素シリカ粒子が分散したコロイド（２．５ｍｇ／ｍＬ）２μＬとの混合液を、テストストリップのサンプルパッド部分に滴下した。１５分後、目視検査を行った。また、上記検出装置によって測定したテストラインの蛍光強度を数値化した。結果を表３及び表４に示す。
　なお、下記表３及び表４には、抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体が結合した含色素シリカ粒子の調製に用いた、各チオール基導入含色素シリカ粒子について、チオールの導入に用いた溶媒を記載している。また、表３中、「－」は検出不可、「＋」は検出可を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　水を含む溶媒中でチオール基を導入して得たシリカ粒子を用いた場合（条件１）に比べて、有機溶媒中でチオール基を導入して得たシリカ粒子を用いた場合（条件２～５）には、目視観察における検出感度が向上しており（表３）、蛍光検出においても、蛍光強度がより高く検出感度に優れていた（表４）。
　上記表４は、Ａ型インフルエンザ核タンパク質が０ｎｇ／ｍｌの蛍光強度を０とした場合の蛍光強度を示している。表４には示していないが、比較例（条件１）のチオール基導入含色素シリカ粒子を用いて調製した、抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体が結合した含色素シリカ粒子を用いると、本発明例（条件２～５）のチオール基導入含色素シリカ粒子を用いて調製した、抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体が結合した含色素シリカ粒子を用いた場合に比べて、Ａ型インフルエンザ核タンパク質が０ｎｇ／ｍｌのときの蛍光強度（バックグラウンドシグナル）が高かった。
　上記表３及び４の結果は、本発明例のチオール基導入含色素シリカ粒子を用いて調製した、抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質抗体が結合した含色素シリカ粒子を用いると、シグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）が大きく、検出感度に優れることを示している。
　本発明例のチオール基導入含色素シリカ粒子を用いた場合に優れた検出感度が得られた理由として、１）本発明例で調製したチオール基導入含色素シリカ粒子においてＭＰＭＳのシェル層が薄く（上記表２）、これから得られた生体分子複合粒子の非特異的な吸着が抑えられてバックグラウンドシグナルが低下したことの他、２）チオール基溶媒和効果により、導入されたチオール基が粒子の外側に向けて配置し、このチオール基に結合した抗体が、抗原と結合しやすくなったことが考えられる。特に、疎水性の強いヘキサノール中でチオール基を導入して得たシリカ粒子を用いると（条件３及び５）、Ｂ／Ａをより高めることができ、検出感度の向上がより顕著であった。
　本発明をその実施態様とともに説明したが、我々は特に指定しない限り我々の発明を説明のどの細部においても限定しようとするものではなく、添付の請求の範囲に示した発明の精神と範囲に反することなく幅広く解釈されるべきであると考える。
　本願は、2013年8月12日に日本国で特許出願された特願2013-167902に基づく優先権を主張するものであり、これはここに参照してその内容を本明細書の記載の一部として取り込む。
　１　　テストストリップ
　２　　サンプルパッド
　３　　コンジュゲートパッド
　４　　抗体固定化メンブレン
　４１　判定部（テストライン）
　４２　コントロールライン
　５　　吸収パッド
　６　　バッキングシート

Claims (11)

  1. 　チオール基を表面に有するシリカ粒子であって、下記（ａ）及び（ｂ）を満たすシリカ粒子：
    （ａ）粒径が２０～１０００ｎｍである、
    （ｂ）シリカ粒子表面における前記チオール基の密度が、０．００２～０．２個／ｎｍ２である、
    （ｃ）シリカ粒子中の硫黄元素の量Ａ（シリカ粒子１個当たりのチオール由来の硫黄元素個数）に対する、該シリカ粒子の表面に存在するチオール基の量Ｂ（個／１粒子）の比（Ｂ／Ａ）が０．１０～０．６０である。
  2. 　前記シリカ粒子が蛍光性又は吸光性の色素を含有する、請求項１に記載のシリカ粒子。
  3. 　前記チオール基が、アルキレン基又はアルキレンオキシ基を介してシリカ粒子表面に結合している、請求項１又は２に記載のシリカ粒子。
  4. 　請求項１～３のいずれか一項に記載のシリカ粒子の表面に、前記チオール基を介して生体分子が結合してなる生体分子複合粒子。
  5. 　前記生体分子が抗体又は抗原である、請求項４に記載の生体分子複合粒子。
  6. 　請求項５に記載の生体分子複合粒子を用いたイムノクロマト方法。
  7. 　表面にヒドロキシ基以外の反応性官能基を有するシリカ粒子の製造方法であって、
    　表面に結合水を有するシリカ粒子と、ヒドロキシ基以外の反応性官能基を有するシランカップリング剤とを有機溶媒中に混合し、該結合水により該シランカップリング剤を加水分解することを含む、製造方法。
  8. 　前記のヒドロキシ基以外の反応性官能基が、チオール基、アミノ基、カルボキシ基、ハロゲン原子、ビニル基、エポキシ基、イソシアネート基、及びイソチオシアネート基から選ばれる少なくとも１つである、請求項７に記載の製造方法。
  9. 　前記有機溶媒が、極性非プロトン性溶媒又は炭素数２以上のアルコールである、請求項７又は８に記載の製造方法。
  10. 　前記の表面に結合水を有するシリカ粒子が蛍光性又は吸光性の色素を含有する、請求項７～９のいずれか一項に記載の製造方法。
  11. 　前記の表面に結合水を有するシリカ粒子が、前記シランカップリング剤との混合前に、親水性有機溶媒による洗浄処理が施されたものである、請求項７～１０のいずれか一項に記載の製造方法。
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