KR20190101992A - 금속-수지 복합체 및 그 이용 - Google Patents
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Abstract
금속-수지 복합체는, 수지입자에 복수의 금속입자가 고정화된 구조를 갖고, pH3∼pH10의 범위에 있어서 제타전위의 최대값이 5mV 이상이며, 또한 최소값이 -5mV 이하이다. 금속-수지 복합체는, pH3∼pH10의 범위에 있어서 제타전위의 최대값과 최소값의 차가 20mV 이상인 것이 바람직하고, 제타전위의 제로 전하점이 pH 3.5∼pH 9.0의 범위 내에 존재하는 것이 보다 바람직하다. 금속-수지 복합체는, 그 표면에 항원 또는 항체를 흡착시켜서 표식물질로 해서 면역학적 측정법이나 면역학적 측정용 시약에 이용할 수 있다.
Description
본 발명은, 예를 들면 면역학적 측정 등의 용도에 바람직하게 사용 가능한 금속-수지 복합체, 그것을 이용한 표식물질, 면역학적 측정법, 면역학적 측정용 시약, 피분석물(analyte)의 측정 방법, 피분석물 측정용 키트, 및 측방유동형 크로마토그래피용 테스트 스트립에 관한 것이다.
생체 내에는 무수한 화학물질이 존재하기 때문에, 생체 내의 특정의 미량성분을 정성적, 정량적으로 분석하는 기술은 매우 중요하다. 의료, 제약, 건강식품, 바이오테크놀러지, 환경 등의 분야에 있어서, 생체 내의 특정의 개소(화학물질)에만 작용하는 약품 및 식품, 생체의 약간의 변화를 검출하는 분석 장치 및 진단약 등은 상기 기술과 함께 발전해 왔다.
상기 분석 기술의 하나로, 이뮤노에세이(immunoassay)가 있다. 이것은 면역학적 측정법이라고도 불리고, 면역반응의 하나인 항원-항체간에 있어서의 특이적인 반응을 이용하여 미량성분을 정성적, 정량적으로 분석하는 방법이다. 항원-항체간 반응은 감도나 반응의 선택성이 높기 때문에, 상기 분야에서 널리 사용되고 있다. 이뮤노에세이는 그 측정 원리에 따라, 다양한 측정법이 있다. 예를 들면, 효소 면역측정법(EIA), 방사성 면역측정법(RIA), 화학발광 면역측정법(CLIA), 형광 면역측정법(FIA), 라텍스 등의 응집법(LIA, PA), 면역크로마토그래피법(ICA), 적혈구 응집법(HA), 적혈구 응집 억제법(HI) 등을 들 수 있다. 또, 이뮤노에세이 이외에는, 물리·화학적 측정법, 생물학적 측정법 등이 있다.
이뮤노에세이는 항원 및 항체가 반응해 복합체를 형성했을 때의 변화(항원, 항체 또는 복합체의 농도 변화)로부터, 항원 또는 항체를 정성적 또는 정량적으로 검출한다. 이것들을 검출할 때에, 항체, 항원 또는 복합체에 표식물질을 결합시킴으로써 검출 감도가 증대한다.
그 때문에, 표식물질의 표식능력은 이뮤노에세이에 있어서의 검출능력을 좌우하는 중요한 요소라고 할 수 있다. 상기에 예시한 이뮤노에세이에 있어서도, 표식물질로서 적혈구(HA의 경우), 라텍스 입자(LIA의 경우), 형광색소(FIA의 경우), 방사성 원소(RIA의 경우), 효소(EIA의 경우), 화학발광물질(CLIA의 경우) 등이 사용되고 있다.
그런데, 표식물질로서 착색된 미립자를 사용했을 경우, 특별한 분석 장치를 사용하지 않고 육안에 의해 검출을 확인할 수 있기 때문에, 보다 간편한 측정이 가능한 것이 기대된다. 이러한 착색된 미립자로서는, 금속 및 금속 산화물의 콜로이드상 입자, 색소로 착색된 라텍스 입자 등을 들 수 있다(특허문헌 1, 특허문헌 4 등). 그러나, 상기 콜로이드상 입자는 입자지름 및 조제 조건에 따라서 색조가 결정되어 버리기 때문에, 원하는 선명한 짙은 색조의 것을 얻기 어려운, 즉 시인성이 불충분하다고 하는 문제가 있다.
또한, 상기 착색된 라텍스 입자는 색소에 의한 착색의 효과가 낮고, 육안 판정성이 불충분하다고 하는 문제가 있다. 또, 이 문제를 해소하기 위해서 색소의 착색량을 늘리려고 하면, 색소가 라텍스의 표면을 덮고, 라텍스 입자 본래의 표면 상태가 손상되기 때문에, 항원 또는 항체를 결합시키는 것이 곤란해진다고 하는 문제가 있었다. 또한, 멤브레인 필터 등의 크로마토그래프 매체의 세공 내에 막히거나, 라텍스 입자가 비특이 응집을 일으키거나 해서, 색소의 착색량을 늘려서 짙게 착색하는 것이, 반드시 성능의 향상으로 결부되지 않는다,라고 하는 문제도 있었다.
상기 표식물질의 시인성을 향상시키기 위해서, 표식물질이 결합한 항체(표식항체)와 항원이 반응해 복합체를 형성한 후에, 이것들의 표식물질에 대하여 또 다른 금속을 수식시킴으로써 표식물질의 검출 감도를 증폭시키는 면역크로마토그래프 방법이 개시되어 있다(특허문헌 2 및 5). 그러나, 이 방법에서는 조작이 번잡하고, 안정된 증폭이 어렵다. 또한, 특별한 장치가 필요한 등, 측정 비용이 소요되기 때문에, 적용 가능한 용도 및 사용 환경은 한정된다고 생각된다.
또한, 폴리머계 라텍스 입자의 표면에 결합한 금 나노입자로 이루어지는 착색 라텍스가 개시되어 있다(특허문헌 3).
폴리머계 라텍스 입자의 표면에 금 나노입자를 결합시킴으로써 상기 금 나노입자 자신이 착색제로서 육안 판정성이나 검출 감도의 향상에 도움이 된다. 또한, 금 나노입자 자신이 항원 또는 항체에 대한 결합성에도 뛰어나기 때문에, 충분한 농색으로 될 정도로까지 금 나노입자를 결합시켜도 충분한 양의 항원 또는 항체를 결합시킬 수 있다고 되어 있다.
상기 착색 라텍스는 스티렌-아크릴산 공중합체 라텍스 및 금 나노입자의 전구체인 HAuCl의 분산액에 감마선을 조사함으로써 상기 라텍스의 표면에 금 나노입자를 결합시킨 것이다. 그러나, 상기 착색 라텍스는 금 나노입자가 라텍스의 표면에만 결합되기 때문에, 표면 플라즈몬 공명을 발현시키기 위한 금 나노입자의 담지량에 제한이 있는 동시에, 금 나노입자가 탈리하기 쉽다. 그 결과, 면역학적 측정용 시약으로서의 시인성이나 감도가 충분하지 않을 우려가 있다. 또한, 감마선 등의 전자방사선을 조사하기 때문에 라텍스에 데미지를 줄 우려가 있다. 또한, 특허문헌 3의 명세서 중에는 상기 라텍스 지름이나 금 나노입자지름의 바람직한 범위를 개시하고 있다. 그러나, 그 실시예는 이들 바람직한 범위에서 검증되어 있는지 명확하지 않고, 바람직한 범위의 규정의 근거가 없는 등, 실시에 적합한 조건의 개시가 거의 없다.
또한, 특허문헌 4에서는 금속금으로 피복된 폴리머 라텍스 입자가 개시되고, 현미경 검사법 및 이뮤노에세이법에 이용 가능한 시약으로의 적용이 시사되어 있다.
그러나, 상기 금속금으로 피복된 폴리머 라텍스 입자는 폴리머 라텍스 입자의 재질이나 입경의 개시가 없다. 또한, 이뮤노에세이법에 이용 가능한 시약으로서의 효과에 대해서 검증이 없다. 그 때문에, 금속금 및 폴리머 라텍스 입자에 있어서의 시약으로서의 효과는 불분명하다.
또한, 비특허문헌 1에서는 폴리-2-비닐피리딘 라텍스 입자에 금 나노입자를 담지시킨 마이크로겔이 개시되고, 마이크로겔의 입경의 pH 응답성을, 금 나노입자의 국재형 표면 플라즈몬 공명의 거동의 변화로부터 확인하고 있다. 그러나, 상기 마이크로겔은 금 나노입자가 상기 라텍스 입자의 표층 부근에 단층으로 담지되어 있다. 그 때문에, 금 나노입자의 담지량이 적고, 이뮤노에세이에 유효한 짙은 색조가 얻어지지 않는다고 생각된다. 또한, 마이크로겔의 재질, 구조, 조성 등의 검토는 행해져 있지 않아, 면역학적 측정용 시약 등의 구체적인 용도로의 효과는 불분명하다.
또한, 특허문헌 5에서는, 금속 코어 초미립자와, 금속이온 배위성기를 갖고 상기 금속 코어 초미립자를 포위하는 중합체를 포함하는 복합 미립자가 개시되어, 진단약 등의 센셍 분야 등, 여러 가지 분야로의 적용이 시사되어 있다. 또한, 실시예에 있어서 비닐피리딘-디비닐벤젠 공중합체의 가교 미립자에, 염화금산을 환원해서 얻어진 금 나노입자를 포위시킨 복합 미립자가 개시되어 있다. 그러나, 상기 복합 미립자는 그 상세한 구조나 물성의 검토는 행하고 있지 않아 면역학적 측정용 시약 등의 구체적인 용도로의 효과는 불분명하다.
이상으로부터, 금 나노입자가 결합 또는 피복된 라텍스 입자는 면역학적 측정용의 시약으로서 기대되는 것이지만, 종래의 기술로는 내구성이나 시인성이 충분하지 않았다. 또한, 시인성이 높은 것이라도 적용 가능한 용도 및 사용 환경은 한정되는 것이었다.
상기 종래 기술의 상황을 감안하여, 본 출원인은 특정 비율의 금속입자가 수지입자의 표층부에 존재하는 수지-금속 복합체를 찾아내어 먼저 제안했다(예를 들면, 특허문헌 6). 이 수지-금속 복합체는 특히 면역학적 측정 재료의 용도에 있어서 내구성 및 시인성이 뛰어나고, 또한, 특별한 장치나 작업 공정의 추가를 필요로 하지 않고 고감도의 판정을 가능하게 하는 것이다.
K. Akamatsu, M. Shimada, T. Tsuruoka, H. Nawafune, S. Fujii and Y. Nakamura; Langmuir 2010, 26, 1254-1259.
금속-수지 복합체를 면역학적 측정에 있어서의 표식물질로서 사용하기 위해서는, 항원, 항체 등의 리간드나, 블록킹제 등에 안정적으로 결합시키는 것이 필요하다. 그러나, 리간드를 금속-수지 복합체에 의해 표식할 경우, 안정적인 결합 상태를 형성할 수 있었다고 해도, 반드시 뛰어난 검출 감도가 얻어진다고는 할 수 없다. 예를 들면, 미세한 금속-수지 복합체는 응집이 생기기 쉽다. 응집이 생기면, 핸들링성이 대폭 저하할 뿐만 아니라, 표식물질인 금속-수지 복합체의 농도에 불균일이 생겨서 검출 감도가 크게 저하할 경우가 있다.
또한, 면역학적 측정에 사용되는 항원, 항체 및 블록킹제로서는, 단백질, 합성 고분자, 저분자 화합물 등 다양한 종류의 것이 있고, 음이온성의 성질이 강한 것(예를 들면 카제인)과, 양이온성의 성질이 강한 것(예를 들면 유청 훼이)이 있다. 그래서, 이것들 모두의 항원 및 항체를 사용할 수 있는 표식물질이 있으면, 재료 비용 저감 등의 이유로부터 매우 바람직하다.
본 발명의 목적은, 항원, 항체 등의 리간드나, 블록킹제와 결합시킨 상태에서 응집이 생기기 어려워 핸들링성이 뛰어나고, 또한 많은 종류의 항원, 항체, 블록킹제를 적용할 수 있는 금속-수지 복합체를 제공하는 것이며, 예를 들면 면역학적 측정에 있어서, 고감도의 판정을 가능하게 하는 면역학적 측정용 금속-수지 복합체를 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은 예의 연구를 행한 결과, 수지입자에 복수의 금속입자가 고정화되고, 또한, 구조 및 전기적 성질을 제어한 금속-수지 복합체에 의해서, 상기 과제를 해결할 수 있는 것을 찾아내어 본 발명을 완성했다.
즉, 본 발명의 금속-수지 복합체는, 수지입자와 상기 수지입자에 고정화된 복수의 금속입자를 갖는 금속-수지 복합체로서, pH3∼pH10의 범위에 있어서 제타전위의 최대값이 5mV 이상이며, 또한, 최소값이 -5mV 이하인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 금속-수지 복합체는, pH3∼pH10의 범위에 있어서 상기 제타전위의 최대값과 최소값의 차가 20mV 이상이라도 좋다.
본 발명의 금속-수지 복합체는, 상기 제타전위의 제로 전하점이 pH3.5∼pH9.0의 범위에 존재하는 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 금속-수지 복합체는, 상기 금속입자의 평균 입자지름이 1㎚∼100㎚의 범위 내이어도 좋다.
본 발명의 금속-수지 복합체는, 그 평균 입자지름이 30㎚∼1000㎚의 범위 내이어도 좋다.
본 발명의 금속-수지 복합체는, 상기 수지입자가 금속이온을 흡착하는 것이 가능한 치환기를 구조에 갖는 폴리머 입자라도 좋다.
본 발명의 금속-수지 복합체는, 상기 금속입자가 금, 백금, 팔라듐, 은, 니켈, 구리, 또는 이것들의 합금의 입자라도 좋다.
본 발명의 표식물질은 상기 어느 하나의 금속-수지 복합체를 구비하고 있다. 이 경우, 상기 금속-수지 복합체의 표면에 항원 또는 항체를 흡착시켜서 사용하는 것이라도 좋다.
본 발명의 면역학적 측정법은, 상기 어느 하나의 표식물질을 사용하는 것이다.
본 발명의 면역학적 측정용 시약은, 상기 어느 하나의 금속-수지 복합체를 구비하고 있다.
본 발명의 피분석물의 측정 방법은, 시료 중에 포함되는 피분석물을 검출 또는 정량하는 방법이다. 이 피분석물의 측정 방법은 멤브레인, 및 상기 멤브레인에 상기 피분석물과 특이적으로 결합하는 포착 리간드가 고정되어서 이루어지는 판정부를 포함하는 측방유동형 크로마토그래피용 테스트 스트립을 사용하고, 하기 공정 (I)∼(III);
공정 (I): 시료에 포함되는 상기 피분석물과, 상기 피분석물에 특이적으로 결합하는 항체를 상기 어느 하나의 금속-수지 복합체로 표식한 표식항체를 접촉시키는 공정,
공정 (II): 상기 판정부에서 공정 (I)에 있어서 형성된 피분석물과 표식항체를 포함하는 복합체를, 포착 리간드에 접촉시키는 공정,
공정 (III): 상기 금속-수지 복합체의 국재형 표면 플라즈몬 공명 및/또는 전자전이에 의한 광에너지 흡수에 유래하는 발색강도를 측정하는 공정,
을 포함하는 공정을 행하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 피분석물 측정용 키트는, 시료 중에 포함되는 피분석물을 검출 또는 정량하기 위한 피분석물 측정용 키트이다. 이 피분석물 측정용 키트는 멤브레인, 및 상기 멤브레인에 상기 피분석물과 특이적으로 결합하는 포착 리간드가 고정되어서 이루어지는 판정부를 포함하는 측방유동형 크로마토그래피용 테스트 스트립과, 상기 피분석물에 특이적으로 결합하는 항체를 상기 어느 하나의 금속-수지 복합체로 표식한 표식항체를 포함하는 검출 시약을 포함한다.
본 발명의 측방유동형 크로마토그래피용 테스트 스트립은, 시료 중에 포함되는 피분석물을 검출 또는 정량하기 위한 것이다. 이 측방유동형 크로마토그래피용 테스트 스트립은 멤브레인과, 상기 멤브레인에 상기 시료가 전개하는 방향에 있어서 상기 피분석물과 특이적으로 결합하는 포착 리간드가 고정되어서 이루어지는 판정부와, 상기 판정부보다 상류측에 상기 피분석물에 특이적으로 결합하는 항체를 상기 어느 하나의 금속-수지 복합체로 표식한 표식항체가 포함되는 반응부를 포함한다.
(발명의 효과)
본 발명의 금속-수지 복합체는, 특정의 제타전위를 갖기 때문에 음이온성, 양이온성에 관계 없이 다양한 물질과 상호작용할 수 있다. 그 때문에, 항원, 항체 등의 많은 종류의 리간드나, 블록킹제에 결합시킨 상태에서의 분산성이 뛰어나, 응집이 생기기 어렵다. 여기에서, 「제타전위」란 산성 용액 또는 알칼리성 용액 중에서 금속-수지 복합체의 주위에 형성되는 전기이중층의 미끄럼면의 전위를 의미하고, 예를 들면, 전기영동 광산란법에 의해 금속-수지 복합체로부터 충분하게 떨어진 전기적으로 중성의 영역과 상기 미끄럼면 사이의 전위차로서 측정되는 것이다.
또한, 본 발명의 금속-수지 복합체는 수지입자에 복수의 금속입자가 고정화된 구조를 갖기 때문에 금속입자의 담지량이 많고, 또한 금속입자가 수지입자로부터 탈리하기 어렵다.
또한, 금속입자는 국재형 표면 플라즈몬 공명에 추가해, 전자전이에 의한 광에너지 흡수를 발현한다.
따라서, 본 발명의 금속-수지 복합체는 핸들링성, 내구성, 시인성, 육안 판정성, 검출 감도가 우수하다. 그 때문에, 예를 들면 EIA, RIA, CLIA, FIA, LIA, PA, ICA, HA, HI 등의 면역학적 측정용 표식물질, 면역학적 측정용 시약, 의약, 고체촉매, 안료, 도료, 도전성 재료, 전극, 센서 소자 등의 목적으로 바람직하게 적용할 수 있다. 특히, 본 발명의 금속-수지 복합체를 면역학적 측정에 사용할 경우에는, 핸들링성, 내구성 및 시인성이 뛰어나고, 비특이 반응이 억제되며, 또한, 다양한 항원 및 항체에 대해서 특별한 장치나 작업 공정의 추가를 필요로 하지 않고, 고감도의 판정이 가능하게 된다.
도 1은 본 발명의 일실시형태에 따른 금속-수지 복합체의 단면의 구조를 나타내는 모식도이다.
도 2a는 금속-수지 복합체의 일형태의 단면의 구조를 나타내는 모식도이다.
도 2b는 금속-수지 복합체의 다른 형태의 단면의 구조를 나타내는 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일실시형태에 따른 측방유동형 크로마토그래피용 테스트 스트립을 사용한 피분석물의 측정 방법의 개요를 나타내는 설명도이다.
도 2a는 금속-수지 복합체의 일형태의 단면의 구조를 나타내는 모식도이다.
도 2b는 금속-수지 복합체의 다른 형태의 단면의 구조를 나타내는 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일실시형태에 따른 측방유동형 크로마토그래피용 테스트 스트립을 사용한 피분석물의 측정 방법의 개요를 나타내는 설명도이다.
이하, 적당하게 도면을 참조하면서 본 발명의 실시형태에 대해서 상세하게 설명한다. 도 1은 본 발명의 일실시형태에 따른 금속-수지 복합체의 단면 모식도이다. 금속-수지 복합체(100)는 수지입자(10)와 금속입자(20)를 구비하고 있다. 금속-수지 복합체(100)는 수지입자(10)에 금속입자(20)가 고정화되어 있다. 수지입자(10)는 금속입자(20)보다 상대적으로 큰 입자인 것이 바람직하다. 즉, 금속-수지 복합체(100)에서는, 큰 수지입자(10)에 상대적으로 작은 다수의 금속입자(20)가 고정되어 있다. 이 경우, 도 1에 나타내는 바와 같이, 금속-수지 복합체(100) 전체의 입자지름(D1)과, 수지입자(10)의 입자지름(D2)과, 금속입자(20)의 입자지름(D3)의 관계는 D1>D2>D3이다.
또한, 금속-수지 복합체(100)는 수지입자(10)에 있어서의 금속입자(20)의 분산 상태는 한정하지 않는다. 예를 들면, 수지입자(10)의 표면에 금속입자(20)가 이차원적으로 분포되어도 좋고, 수지입자(10)의 내부에 금속입자(20)가 내포되어 있어도 좋다. 전자의 일형태로서, 수지입자(10)의 표면에 복수의 금속입자(20)가 서로 접촉해서 연속적인 막을 형성해도 좋다. 또한, 후자의 일형태로서, 수지입자(10)를 쉘로 하고, 금속입자(20)를 코어로 하는, 코어-쉘 구조를 형성해도 좋다. 또한, 금속입자(20)의 일부가 수지입자(10)의 표층부(60)에 있어서 3차원적으로 분포되어서 있어도 좋다. 이 경우, 3차원적으로 분포된 금속입자(20)의 일부가 부분적으로 수지입자(10) 밖으로 노출되어 있어도 좋고, 나머지의 일부가 수지입자(10)에 내포되어 있어도 좋다. 구체적으로는, 도 1에 나타내는 바와 같이, 금속입자(20)에는 수지입자(10)에 완전하게 내포된 금속입자(이하, 「내포입자(30)」라고도 한다.), 수지입자(10) 내에 매포된 부위 및 수지입자(10) 밖으로 노출된 부위를 갖는 금속입자(이하, 「일부 노출 입자(40)」라고도 한다.) 및 수지입자(10)의 표면에 흡착되어 있는 금속입자(이하, 「표면 흡착 입자(50)」라고도 한다.)가 존재하고 있는 것이 바람직하다.
예를 들면, 금속-수지 복합체(100)를 면역학적 측정용 표식물질 또는 면역학적 측정용 시약에 사용할 경우, 수지입자(10)의 표면 또는 일부 노출 입자(40) 또는 표면 흡착 입자(50)의 표면에, 항원, 항체 또는 블록킹제를 고정화해서 사용한다. 그 때, 일부 노출 입자(40) 및 표면 흡착 입자(50)에는 상기 항원, 항체 또는 블록킹제가 고정화되는 한편으로, 내포입자(30)에는 고정화되기 어렵다고 생각된다. 그러나, 일부 노출 입자(40), 표면 흡착 입자(50) 및 내포입자(30)의 어느 것이나 국재형 표면 플라즈몬 공명에 추가해, 전자전이에 의한 광에너지 흡수를 발현하기 때문에, 일부 노출 입자(40) 및 표면 흡착 입자(50) 뿐만 아니라, 내포입자(30)도 면역학적 측정용 표식물질 및 면역학적 측정용 시약의 시인성 향상에 기여한다. 또한, 일부 노출 입자(40) 및 내포입자(30)는 표면 흡착 입자(50)와 비교해서 수지입자(10)와의 접촉 면적이 큰 것에 추가해, 매포 상태에 의한 앵커 효과 등이 이루어지기 때문에, 물리적 흡착력이 강하여, 수지입자(10)로부터 탈리하기 어렵다. 또한, 일부 노출 입자(40) 또는 표면 흡착 입자(50)에 흡착한 항원, 항체 또는 블록킹제는 금속과 배위결합하기 때문에 탈리하기 어렵다. 그 때문에, 금속-수지 복합체(100)를 사용한 면역학적 측정용 표식물질 및 면역학적 측정용 시약의 내구성, 안정성을 뛰어난 것으로 할 수 있다.
이하, 금속-수지 복합체(100)를 면역학적 측정용 표식물질(이하, 단지 「표식물질」이라고도 한다.) 또는 면역학적 측정용 시약(이하, 단지 「시약」이라고도 한다.)에 적용할 경우를 예로 해서 설명한다.
금속-수지 복합체(100)는 pH3∼pH10의 범위에 있어서 제타전위의 최대값이 5mV 이상이며, 또한, 최소값이 -5mV 이하이다(제1특성). 제타전위가 이 범위일 경우, 산성 환경 하(예를 들면, pH7 미만의 분산매 중에 분산시켰을 경우)에서는, 금속-수지 복합체(100)는 그 복합체 표면에 양이온성의 관능기를 갖고, 정전하를 띤다. 한편, 염기성 환경 하(예를 들면, pH7을 초과하는 분산매 중에 분산시켰을 경우)에서는, 금속-수지 복합체(100)는 그 복합체 표면에 음이온성의 관능기를 갖고, 부전하를 띤다. 즉, 금속-수지 복합체(100)는 항원, 항체 또는 블록킹제를 그 표면에 결합시킬 경우, 분산매(결합용 버퍼)의 pH에 대응하여, 항원, 항체 또는 블록킹제의 결합에 적합한 표면 전하 상태가 된다. 구체적으로는, 산성 환경 하에서는, 음이온성이 강한 항원 또는 항체와 결합할 수 있고, 염기성 환경 하에서는, 양이온성이 강한 항원 또는 항체와 결합할 수 있다. 즉, 금속-수지 복합체(100)는 음이온성 및 양이온성에 의하지 않고, 모든 항원 또는 항체와 안정되게 결합할 수 있다. 그 때문에, 면역학적 측정용 표식물질 및 면역학적 측정용 시약으로서의 내구성, 안정성, 범용성이 높다.
한편으로, 제타전위의 최대값이 5mV 미만, 또는 최소값이 -5mV를 초과할 경우, 금속-수지 복합체(100)의 정전반발에 의한 분산성이 부족하여, 금속-수지 복합체(100) 자체가 응집하기 쉬워져 버린다. 그 때문에, 면역학적 측정용 표식물질 및 면역학적 측정용 시약으로서 취급이 곤란해져, 불리하다.
이 관점으로부터, 제타전위의 최대값은 큰 편이 바람직하고, 최소값은 작은 편이 바람직하다. 제타전위의 최대값은 10mV 이상이 바람직하고, 20mV 이상이 보다 바람직하다. 또한, 제타전위의 최소값은 -10mV 이하가 바람직하고, -20mV 이하가 보다 바람직하다. 또한 같은 이유로부터, 금속-수지 복합체(100)는 pH3∼pH10의 범위에 있어서, 상기 제타전위의 최대값과 최소값의 차가 20mV 이상인 것이 바람직하다(제2특성). 보다 바람직하게는 40mV 이상이며, 더 바람직하게는 60mV 이상이다.
또한, 금속-수지 복합체(100)는 상기 제타전위의 제로 전하점이 pH3.5∼pH9.0의 범위에 존재하는 것이 바람직하다(제3특성). 여기에서, 제로 전하점이란 제타전위가 플러스 마이너스 제로인 점이다. 제로 전하점이 상기 범위 내이면, 통상적으로 분자생물 화학적 반응이 행해지는, 약산성부터 약염기성의 환경 하에 있어서, 금속-수지 복합체(100)의 표면전하를 정부 양극성의 폭넓은 전하 상태로 하는 것이 가능하여 바람직하다. 특히, 상기 제1특성 및 제2특성에 추가해서, 또한 제3특성을 만족시킬 경우에는, pH3.5∼pH9.0의 범위에서 제타전위가 플러스측에서 마이너스측 또는 마이너스측에서 플러스측으로 크게 변화되고 있는 것을 의미하기 때문에, 약산성을 포함하는 산성 환경과 약염기성을 포함하는 염기성 환경의 양쪽의 폭넓은 pH 영역에서 뛰어난 분산성을 발휘할 수 있다.
한편, 제로 전하점이 상기 범위 밖일 경우, 비교적 강산성 또는 강염기성의 환경 하가 아니면 정부 양극성의 전하 상태로 할 수 없는 경향이 있다.
금속-수지 복합체(100)에 있어서, 내포입자(30)는 그 표면의 전부가 수지입자(10)를 구성하는 수지에 피복되어 있는 것이다. 또한, 일부 노출 입자(40)는 그 표면적의 5% 이상 100% 미만이 수지입자(10)를 구성하는 수지에 피복되어 있는 것이다. 면역학적 측정용 표식물질 및 면역학적 측정용 시약의 내구성의 관점으로부터, 그 하한은 표면적의 20% 이상인 것이 바람직하고, 30% 이상인 것이 보다 바람직하다. 또한, 표면 흡착 입자(50)는 그 표면적의 0%를 초과하고 5% 미만이, 수지입자(10)를 구성하는 수지에 피복되어 있는 것이 바람직하다.
또한, 금속-수지 복합체(100)로의 금속입자(20)(내포입자(30), 일부 노출 입자(40) 및 표면 흡착 입자(50)의 합계)의 담지량은, 금속-수지 복합체(100)의 중량에 대하여 3wt%∼80wt%인 것이 바람직하다. 이 범위이면, 금속-수지 복합체(100)는 표식물질로서의 시인성, 육안 판정성 및 검출 감도가 우수하다. 금속입자(20)의 담지량이 3wt% 미만에서는 항체 또는 항원의 고정화량이 적어지고, 검출 감도가 저하하는 경향이 있다. 한편, 금속입자(20)의 담지량이 80wt%를 초과하면, 금속입자(20)의 입자지름이 현저하게 증대하고, 금속입자(20)에 의한 광흡수 특성이 저하하는 경향이 있다. 금속입자(20)의 담지량은, 보다 바람직하게는 15wt%∼70wt%, 더 바람직하게는 15wt%∼60wt%이다.
또한, 금속입자(20)의 10wt%∼90wt%가 일부 노출 입자(40) 및 표면 흡착 입자(50)인 것이 바람직하다. 이 범위이면, 금속입자(20) 상으로의 항체 또는 항원의 고정화량을 충분히 확보할 수 있기 때문에 표식물질로서의 감도가 높다. 금속입자(20)의 20wt%∼80wt%가 일부 노출 입자(40) 및 표면 흡착 입자(50)인 것이 보다 바람직하고, 면역학적 측정용 표식물질 및 면역학적 측정용 시약의 내구성의 관점으로부터, 표면 흡착 입자(50)가 20wt% 이하인 것이 더욱 바람직하다.
또한, 금속-수지 복합체(100)를 면역학적 측정에 사용할 경우에, 뛰어난 검출 감도를 얻기 위해서는 금속입자(20)의 60wt%∼100wt%, 바람직하게는 75∼100wt%가, 보다 바람직하게는 85∼100wt%가 표층부(60)에 존재하는 것이 좋고, 더 바람직하게는 수지입자(10)의 표면으로부터 깊이 방향으로 입자반경의 40%의 범위에 존재하는 것이 좋다. 또한, 표층부(60)에 존재하는 금속입자(20)의 5wt%∼90wt%가 일부 노출 입자(40) 또는 표면 흡착 입자(50)인 것이, 금속입자(20) 상으로의 항체 또는 항원의 고정화량을 충분 확보할 수 있기 때문에, 표식물질로서의 감도가 높아져서 바람직하다. 바꾸어 말하면, 표층부(60)에 존재하는 금속입자(20)의 10wt%∼95wt%가 내포입자(30)인 것이 좋다.
여기에서, 상기 「표층부」란 금속-수지 복합체(100)의 가장 외측의 위치(즉, 일부 노출 입자(40) 또는 표면 흡착 입자(50)의 돌출단부)를 기준으로 해서, 수지입자(10)의 표면으로부터 깊이 방향으로 입자반경의 50%의 범위를 의미한다. 또한, 상기 「3차원적으로 분포」란, 금속입자(20)가 수지입자(10)의 면방향 뿐만 아니라 깊이 방향으로도 분산되어 있는 것을 의미한다.
상기와 같이, 내포입자(30)도 국재형 표면 플라즈몬 공명에 추가해, 전자전이에 의한 광에너지 흡수를 발현하기 때문에, 일부 노출 입자(40) 및 표면 흡착 입자(50) 뿐만 아니라 내포입자(30)도, 면역학적 측정용 표식물질 및 면역학적 측정용 시약의 시인성 향상에 기여한다. 이러한 시인성 향상이라고 하는 관점에서는, 금속-수지 복합체(100)는, 예를 들면 도 2a에 나타내는 바와 같이, 내포입자(30)가 수지입자(10)의 표면으로부터 깊이 방향으로 일정한 범위 내에 집중해서 분포되고, 수지입자(10)의 중심 부근에는 내포입자(30)가 존재하지 않는 것이 바람직하다. 보다 구체적으로는, 내포입자(30)에 의한 국재형 표면 플라즈몬 공명에 추가해, 전자전이에 의한 광에너지 흡수를 효과적으로 발현시키기 위해서는, 예를 들면, 수지입자(10)의 입자지름(D2)이 800㎚일 때, 수지입자(10)의 표면으로부터 깊이 방향으로 예를 들면 0∼200㎚의 범위 내에 내포입자(30)의 70wt% 이상, 바람직하게는 80wt% 이상, 보다 바람직하게는 90∼100wt%가 존재하고 있는 것이 좋다. 특히, 내포입자(30)의 전부(100wt%)가 분포되는 영역(내포입자 분포 영역)이, 수지입자(10)의 표면으로부터 예를 들면 0∼100㎚의 범위 내인 경우에는, 내포입자(30)에 의한 국재형 표면 플라즈몬 공명에 추가해, 전자전이에 의한 광에너지 흡수의 발현을 최대화할 수 있으므로 바람직하다.
또한, 금속-수지 복합체(100)는 내포입자(30)를 갖지 않아도 좋다. 예를 들면, 도 2b에 나타내는 바와 같이, 금속-수지 복합체(100)에 있어서 금속입자(20)의 전부가 수지입자(10)의 지름방향으로 서로 겹치지 않고, 수지입자(10)의 표면에 고정되어 있어도 된다. 이 경우, 금속입자(20)는 일부 노출 입자(40)와 표면 흡착 입자(50)로 구성된다.
수지입자(10)는 그 구조나 조성은 한정하지 않지만, 금속이온을 흡착하는 것이 가능한 치환기를 구조에 갖는 폴리머 입자인 것이 바람직하다. 예를 들면, 음이온성 이온을 흡착 가능한 폴리머를 들 수 있다. 음이온성 이온을 흡착 가능한 폴리머로서, 특히 질소 함유 폴리머가 바람직하다. 질소 함유 폴리머 중의 질소원자는 시인성이 뛰어나고, 항원 또는 항체의 고정화가 용이한 금속입자(20)의 전구체인 [AuCl4]-, [PtCl6]2- 등의 음이온성 이온을 화학흡착하기 쉽기 때문에 바람직하다. 본 실시형태에서는, 질소 함유 폴리머 중에 흡착한 금속이온을 환원하고, 금속입자(20)를 형성하기 위해서, 생성한 금속입자(20)의 일부는 내포입자(30) 또는 일부 노출 입자(40)로 된다. [AuCl4]-를 사용한 경우에는 금입자를 형성하고, [PtCl6]2-를 사용한 경우에는 백금입자를 형성한다. 기타, 팔라듐, 은, 니켈, 구리 등 음이온성 이온도 사용할 수 있다.
또한, 아크릴산 중합체와 같은 카르복실산기 함유 폴리머 및 폴리스티렌술폰산과 같은 술폰산기 함유 폴리머(이하, 합쳐서 「양이온성 이온을 흡착 가능한 폴리머」라고 한다.)는, 함유하는 카르복실산기 및 술폰산기에 의해 Au+, Pt2+와 같은 양이온성 이온을 화학 흡착할 수 있기 때문에 바람직하다. 예를 들면, 화학 흡착한 Au+나 Pt2+를 환원하고, 금속입자(20)(이 경우, 금입자나 백금입자)를 형성함으로써 상기 질소 함유 폴리머 입자와 같은 구조를 제작하는 것이 가능하다. 기타, 팔라듐, 은, 니켈, 구리 등의 금속의 전구체인 양이온성 이온을 사용할 수 있다.
또, 상기 음이온성 이온을 흡착 가능한 폴리머는 양이온성이기 때문에, 금속-수지 복합체(100)의 산성 환경 하에 있어서의 제타전위를 플러스측으로 하는 기능을 나타낸다. 한편, 양이온성 이온을 흡착 가능한 폴리머는 음이온성이기 때문에, 금속-수지 복합체(100)의 염기성 환경 하에 있어서의 제타전위를 마이너스측으로 하는 기능을 나타낸다.
한편, 금속이온을 흡착하는 것이 가능한 치환기를 구조에 갖는 질소 함유 폴리머 이외의 수지입자로서, 예를 들면 폴리스티렌 등도 사용할 수 있다. 그러나, 이 경우, 비교적 상기 금속이온을 수지 내부에 흡착하기 어렵다. 그 결과, 생성한 금속입자(20)의 대부분은 표면 흡착 입자(50)가 된다. 상기와 같이, 표면 흡착 입자(50)는 수지입자(10)와의 접촉 면적이 작기 때문에 수지와 금속의 접착력이 작고, 수지입자(10)로부터 금속입자(20)가 탈리하기 쉬운 경향이 있다.
상기 질소 함유 폴리머는 주쇄 또는 측쇄에 질소원자를 갖는 수지이며, 예를 들면, 폴리아민, 폴리아미드, 폴리펩티드, 폴리우레탄, 폴리요소, 폴리이미드, 폴리이미다졸, 폴리옥사졸, 폴리피롤, 폴리아닐린 등이 있다. 바람직하게는, 폴리-2-비닐피리딘, 폴리-3-비닐피리딘, 폴리-4-비닐피리딘 등의 폴리아민이다. 또한, 측쇄에 질소원자를 갖는 경우에는, 예를 들면 아크릴 수지, 페놀 수지, 에폭시 수지 등 폭넓게 이용하는 것이 가능하다.
또한, 상기 양이온성 이온을 흡착 가능한 폴리머는 주쇄 또는 측쇄에 카르복실산기, 술폰산기 등을 갖는 수지이며, 예를 들면 폴리아크릴산, 카르복실산 비닐, 폴리아세산 비닐, 폴리비닐술폰산, 폴리스티렌설폰산 등 폭넓게 이용할 수 있다.
상기 질소 함유 폴리머 등의 음이온성 이온을 흡착 가능한 폴리머 및 양이온성 이온을 흡착 가능한 폴리머는, 공지의 중합성 모노머와의 공중합체라도 된다. 여기에서, 공중합체는 랜덤 공중합체, 블록 공중합체, 교대 공중합체, 중합체끼리가 가교된 것이 예시된다. 또한, 2종류 상의 모노머를 공중합시켜서 수지입자(10)를 형성해도 좋고, 수지입자(10)의 표면에 존재하는 관능기에 모노머를 반응시키고, 그것을 중합 활성 말단으로서 더 중합시켜도 좋다. 그 공중합 조성은 한정하지 않지만, 상기 금속이온을 흡착하는 것이 가능한 치환기를 함유하는 모노머가 10mol% 이상인 것이 바람직하다.
중합성 모노머로서는 금속-수지 복합체(100)의 용도에 따라 제한 없이 선택할 수 있다. 예를 들면, 수지입자(10)의 형상, 사이즈의 균일성 및 분산 안정성의 향상의 용도에서는, 계면활성제로서의 특성을 갖는 중합성 모노머를 사용할 수 있다. 이러한 중합성 모노머로서는, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜메틸에테르메타크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜디메타크릴레이트를 들 수 있다.
또한, 상기 수지입자(10)가 에스테르 결합 등의 가수분해 가능한 기를 가질 경우, 이것을 산 처리나 알칼리 처리를 함으로써 부분적으로 가수분해를 행해도 된다. 가수분해에 의해, 수지입자(10)의 표면에 카르복실기 등의 양이온성 이온을 흡착 가능한 기가 발생하고, 금속이온을 흡착하는 효과가 얻어지므로 바람직하다. 산으로서는 공지의 산을 사용할 수 있다. 가수분해 반응의 촉진의 관점으로부터 강산성의 염산, 황산 등이 바람직하다. 알칼리로서는 공지의 알칼리를 사용할 수 있다. 가수분해 반응의 촉진의 관점으로부터, 강알칼리성의 수산화칼륨, 수산화나트륨 수용액 등이 바람직하다.
또한, 상기 가수분해에 의해서 생긴 카르복실기는 음이온성이기 때문에, 금속-수지 복합체(100)의 염기성 환경 하에 있어서의 제타전위를 마이너스측으로 하는 기능을 나타낸다. 즉, 상기 수지입자(10)가 에스테르 결합 등의 가수분해 가능한 기를 가질 경우, 가수분해에 의해 금속-수지 복합체(100)의 제타전위를 제어할 수 있다.
또한, 금속-수지 복합체(100)는 금속과 수지의 나노 사이즈에서의 복합화의 하기 쉬움의 관점으로부터, 상기 금속입자(20)가 금, 백금, 팔라듐, 은, 니켈, 구리, 또는 이것들의 합금인 것이 바람직하다. 이들 금속은 단체 또는 합금 등의 복합체로 사용하는 것이 가능하다. 여기에서, 예를 들면 금 합금으로서는 금과 금이외의 금속종으로 이루어지고, 금을 10중량% 이상 함유하는 합금을 의미한다. 또한, 예를 들면 백금 합금으로서는 백금과 백금 이외의 금속종으로 이루어지고, 백금을 1중량% 이상 함유하는 합금을 의미한다.
면역학적 측정용 표식물질 및 면역학적 측정용 시약으로서 사용할 경우, 보다 바람직하게는 시인성이 뛰어나고, 항원 또는 항체의 고정화가 용이한 금, 백금 및 팔라듐이다. 이것들은 국재형 표면 플라즈몬 공명에 유래하는 흡수를 발현하기 때문에 바람직하다. 더 바람직하게는, 보존 안정성이 좋은 금, 또는 면역학적 측정에 있어서의 검출 감도가 우수한 백금이다.
금속입자로서 백금입자를 사용한 백금-수지 복합체는, 다른 금속종의 입자를 갖는 금속-수지 복합체와 비교하여 항체 등의 리간드와 결합시킨 상태에서 응집을 발생시키기 어려워 매우 분산성이 우수하다. 또한, 백금입자는 산화 등의 변질에 강하여 보존 안정성에도 뛰어나다. 또한, 백금입자는, 예를 들면 250㎚∼900㎚까지의 범위의 폭넓은 파장에서 국재형 표면 플라즈몬 공명에 유래하는 흡수를 발현하고, 또한 전자전이에 의한 광에너지 흡수의 발현에 의해 흑색에 가까운 강한 발색을 띠므로, 백금-수지 복합체를 표식물질로서 사용함으로써 면역학적 측정에 있어서 높은 시인성이 얻어지고, 피분석물의 검출 감도도 높일 수 있다. 이 경우, 백금입자를 사용함으로써 다른 금속의 입자에 비하여 적은 담지량으로 뛰어난 검출 감도가 얻어진다. 따라서, 가령 평균 입자지름이 동등하면, 백금-수지 복합체는 다른 금속종의 입자를 갖는 수지 복합체에 비해서 유의하게 높은 검출 감도를 나타내므로 특히 바람직하다.
백금입자는 백금만으로 이루어지는 것이라도 좋고, 백금과 다른 금속의 합금이라도 좋다. 백금합금에 있어서 백금과 합금을 형성하는 다른 금속종으로서는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 은, 니켈, 구리, 금, 팔라듐 등이 바람직하다.
금속입자로서 금입자를 사용 한 금-수지 복합체는, 다른 금속종의 입자를 갖는 금속-수지 복합체와 비교하여 항체 등의 리간드와 결합시킨 상태에서 응집을 발생시키기 어려워 매우 분산성이 우수하다. 또한, 시인성이 뛰어나고, 항원 또는 항체의 고정화가 용이하다. 특히, 금입자의 입자지름이나 금입자끼리의 입자간 거리를 제어함으로써 적색, 자색, 청색 등, 다양한 발색을 보인다. 그 때문에, 금-수지 복합체를 면역크로마토그래프의 표식물질로서 사용할 경우에, 여러가지 색의 표식물질을 얻을 수 있다.
또한, 주사형 전자현미경(SEM) 관찰에 의해 측장되는 금속입자(20)의 평균 입자지름(즉, 도 1에 있어서의 입자지름(D3)의 평균)은, 예를 들면 1∼100㎚인 것이 바람직하다. 금속입자(20)의 평균 입자지름이 1㎚ 미만인 경우나 100㎚를 초과하는 경우에는, 국재형 표면 플라즈몬 공명 및 전자전이에 의한 광에너지 흡수가 발현되기 어려워지기 때문에 감도가 저하하는 경향이 있다.
금속입자(20)로서 백금입자를 사용할 경우, 백금입자의 평균 입자지름은 면역학적 측정용 표식물질 및 면역학적 측정용 시약으로서 높은 검출 감도를 얻는 관점으로부터, 바람직하게는 1㎚ 이상 50㎚ 이하이며, 보다 바람직하게는 1㎚ 이상 30㎚ 이하이며, 더 바람직하게는 1㎚ 이상 20㎚ 이하이며, 가장 바람직하게는 1㎚ 이상 15㎚ 이하이다. 예를 들면, 백금입자의 평균 입자지름이 15㎚ 이하인 백금-수지 복합체를 면역크로마토그래프의 표식물질로서 사용할 경우에, 특히 뛰어난 검출 감도가 얻어진다.
또한, 금속입자(20)로서 금입자를 사용할 경우, 금입자의 평균 입자지름은 면역학적 측정용 표식물질 및 면역학적 측정용 시약으로서 높은 검출 감도를 얻는 관점으로부터, 바람직하게는 1㎚ 이상 70㎚ 미만이며, 보다 바람직하게는 1㎚ 이상 50㎚ 미만이다.
또한, 금속-수지 복합체(100)의 평균 입자지름(즉, 도 1에 있어서의 입자지름(D1)의 평균)은, 예를 들면 30∼1000㎚인 것이 바람직하다. 금속-수지 복합체(100)의 평균 입자지름이 30㎚ 미만에서는, 예를 들면, 금속입자(20)의 담지량이 적어지는 경향이 있기 때문에 동 사이즈의 금속입자(20)보다 착색이 약해지는 경향이 있고, 1000㎚를 초과하면 표식물질 또는 시약으로 했을 때에 멤브레인 필터 등의 크로마토그래프 매체의 세공 내에 막히기 쉬운 경향이나, 분산성이 저하하는 경향이 있다. 금속-수지 복합체(100)의 평균 입자지름은 표식물질 또는 시약으로 했을 때의 분산성을 향상시킴과 아울러, 금속-수지 복합체(100)를 면역학적 측정에 사용할 경우에 높은 검출 감도를 얻는 관점으로부터, 바람직하게는 100㎚ 이상 700㎚ 이하이며, 보다 바람직하게는 250㎚ 이상 650㎚ 이하이며, 가장 바람직하게는 280㎚ 이상 600㎚ 이하이다. 특히, 금속-수지 복합체(100)의 평균 입자지름이 280㎚ 이상이면, 금속-수지 복합체(100)를 면역크로마토그래프의 표식물질로서 사용할 경우에 안정되고 뛰어난 검출 감도가 얻어진다. 여기에서, 금속-수지 복합체(100)의 입자지름은 수지입자(10)의 입자지름에 일부 노출 입자(40) 또는 표면 흡착 입자(50)의 돌출 부위의 길이를 더한 값을 의미하고, 레이저 회절/산란법, 동적 광산란법, 또는 원심 침강법에 의해 측정할 수 있다.
[금속-수지 복합체의 제조 방법]
금속-수지 복합체(100)의 제조 방법은 특별하게 한정되지 않는다. 예를 들면, 유화중합법에 의해 제조한 수지입자(10)의 분산액에 금속이온을 함유하는 용액을 첨가해서 금속이온을 수지입자(10)에 흡착시킨다(이하, 「금속이온 흡착 수지입자」라고 한다.). 또한, 상기 금속이온 흡착 수지입자를 환원제 용액 중에 첨가함으로써 금속이온을 환원해서 금속입자(20)를 생성시키고, 금속-수지 복합체(100)를 얻을 수 있다.
예를 들면, 금속입자(20)로서 백금입자를 생성시키는 경우에는, 백금이온을 함유하는 용액으로서는 염화백금산(H2PtCl6) 수용액, 염화백금(PtCl2) 용액 등을 들 수 있다. 또한, 백금이온 대신에 백금 착체를 사용해도 된다.
또한, 예를 들면 금속입자(20)로서 금입자를 생성시키는 경우에는, 금이온을 함유하는 용액으로서는 염화금산(HAuCl4) 수용액 등을 들 수 있다. 또한, 금이온 대신에 금 착체를 사용해도 된다.
또한, 금속이온을 함유하는 용액의 용매로서, 물 대신에 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, sec-부탄올, t-부탄올 등의 함수 알콜 또는 알콜, 염산, 황산, 질산 등의 산 등을 사용해도 된다.
또한, 상기 용액에 필요에 따라서, 예를 들면, 폴리비닐알콜 등의 수용성 고분자 화합물, 계면활성제, 알콜류; 테트라히드로푸란, 디에틸에테르, 디이소프로필 에테르 등의 에테르류; 알킬렌글리콜, 폴리알킬렌글리콜, 이것들의 모노알킬에테르 또는 디알킬에테르, 글리세린 등의 폴리올류; 아세톤, 메틸에틸케톤 등의 케톤류 등의 각종 수 혼화성 유기용매 등의 첨가제를 첨가해도 좋다. 이러한 첨가제는 금속이온의 환원반응 속도를 촉진하고, 또 생성되는 금속입자(20)의 크기를 제어하는데도 유효하게 된다.
또한, 환원제는 공지의 것을 사용할 수 있다. 환원제로서는, 예를 들면, 수소화붕소나트륨, 디메틸아민보란, 시트르산, 차아인산 나트륨, 포수 히드라진, 염산 히드라진, 황산 히드라진, 포름알데히드, 수크로오스, 포도당, 아스코르브산, 에리소르빈산, 포스핀산 나트륨, 하이드로퀴논, 로셸염 등을 들 수 있다. 이들 중, 수소화붕소나트륨 또는, 디메틸아민보란, 시트르산이 바람직하다.
환원제 용액에는, 필요에 따라서 계면활성제를 첨가하거나, 용액의 pH를 조정하거나 할 수 있다. pH 조정은, 예를 들면 붕산이나 인산 등의 완충제, 염산, 황산 등의 산, 수산화나트륨, 수산화칼륨 등의 알칼리를 이용하여 행할 수 있다.
또한, 환원제 용액의 온도에 의해, 금속이온의 환원 속도를 조정함으로써 생성하는 금속입자(20)의 입경을 컨트롤 할 수 있다.
또한, 상기 금속이온 흡착 수지입자 중의 금속이온을 환원해서 금속입자(20)를 생성시킬 때, 상기 금속이온 흡착 수지입자를 환원제 용액에 첨가해도 좋고, 환원제를 상기 금속이온 흡착 수지입자에 첨가해도 좋지만, 내포입자(30) 및 일부 노출 입자(40)의 생성하기 쉬움의 관점으로부터 전자가 바람직하다.
또한, 금속-수지 복합체(100)의, 물로의 분산성을 유지하기 위해서, 예를 들면, 시트르산, 폴리-L-리신, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐피리딘, 폴리비닐알콜, DISPERBYK194, DISPERBYK180, DISPERBYK184(빅케미 재팬사제) 등의 분산제를 첨가해도 좋다.
또한, 붕산이나 인산 등의 완충제, 염산, 황산 등의 산, 수산화나트륨, 수산화칼륨 등의 알칼리에 의해 pH를 조정하고, 분산성을 유지할 수 있다.
이상의 구성을 갖는 금속-수지 복합체(100)는, 특히, 금속입자(20)의 표면에 항원 또는 항체를 흡착시킴으로써 표식물질로서, 예를 들면 EIA, RIA, CLIA, FIA, LIA, PA, ICA, HA, HI 등의 면역학적 측정법에 바람직하게 적용할 수 있다. 또한, 특히, 저농도역(고감도 영역)에서의 육안 판정성이 우수한 면역학적 측정용 표식물질 또는 면역학적 측정용 시약의 재료로서 바람직하게 적용할 수 있다. 또한, 면역학적 측정용 표식물질 또는 면역학적 측정용 시약의 형태에 특별하게 한정은 없지만, 예를 들면, 금속-수지 복합체(100)를 물 또는, pH를 조정한 완충액 중에 분산시킨 분산액으로서 사용할 수 있다.
상기 금속입자(20)의 표면에 항원 또는 항체를 흡착시키는 방법으로서는 특별하게 한정하지 않고, 공지의 물리흡착 및 화학흡착에 의한 방법을 사용할 수 있다. 금속입자(20)와 항원 또는 항체의 결합이 강고하게 되기 때문에, 화학흡착에 의한 방법이 바람직하다. 물리흡착과 화학흡착을 병용해도 좋다.
물리흡착으로서는, 예를 들면, 항원 또는 항체를 포함하는 완충액 중에 금속-수지 복합체(100)를 침지시키고 인큐베이트하는 방법, 완충액 중에 금속-수지 복합체(100)를 침지시키고, 항원 또는 항체를 더 첨가하는 방법 등을 들 수 있다.
화학흡착으로서는 항원 또는 항체에 SH기를 도입하고, 금속-수지 복합체(100)와 반응시켜서 금속-SH 결합을 형성하는 방법, 금속-수지 복합체(100)의 표면에 카르복실기를 도입한 후, 숙신이미딜화하여 항원 또는 항체의 아미노기와 반응시켜 화학결합을 형성하는 방법 등을 들 수 있다. 금속-수지 복합체(100)의 표면에 카르복실기를 도입하는 화합물은, 예를 들면 아미노기, SH기, 카르보닐, 아미드, 이미드 등의 금속과 배위결합성이 있는 관능기와 카르복실기의 양쪽을 갖는 화합물이 적합하다. 금속과의 배위결합이 강고하다고 하는 이유로부터, 관능기로서는 SH기가 바람직하고, SH기와 카르복실기를 양말단에 갖는 화합물로서는, 예를 들면 메르캅토프로피온산, 메르캅토운데칸산, 메르캅토라우르산 등을 들 수 있다. 또한, 금속과 배위결합성이 있는 관능기와 카르복실기를 1분자 내에 복수 갖는 고분자 화합물은, 금속-수지 복합체(100)와 안정된 결합을 얻기 쉽다. 예를 들면 글루탐산이나 아스파르트산의 폴리펩티드인 폴리글루타민산, 폴리아스파라긴산은, 금속-수지 복합체(100)의 표면에 카르복실기를 도입하기 위한 고분자 화합물로서 보다 바람직하다.
또한, 금속-수지 복합체(100)의 표면에 도입한 카르복실기는 음이온성이기 때문에, 금속-수지 복합체(100)의 염기성 환경 하에 있어서의 제타전위를 마이너스측으로 하는 기능이 있다. 즉, 금속-수지 복합체(100)의 표면에 카르복실기를 도입함으로써 금속-수지 복합체(100)의 제타전위를 제어할 수 있다.
본 실시형태의 금속-수지 복합체(100)에 있어서, 제타전위의 특징적인 거동이 발현되는 이유는, 금속-수지 복합 입자(100)(또는 수지입자(10))의 표면에, 「양이온성의 관능기」와 「음이온성의 관능기」의 양쪽을 갖고 있는 점에 있다. 예를 들면, 수지입자(10)를 구성하는 폴리머가 폴리비닐피리딘일 경우에 대해서 설명하면, 폴리비닐피리딘에 포함되는 피리딘은 「양이온성의 관능기」이며, 수지입자 1표면의 가수분해에 의해 생긴 카르복실기나, 메르캅토프로피온산 처리, 폴리글루타민산 처리 등에 의해 금속-수지 복합체(100)에 도입한 카르복실기는 「음이온성의 관능기」이다. 그리고, 산성 환경 하에서는 피리딘의 질소가 NH+의 상태에서 정전하를 띠고, 카르복실기는 COOH의 상태에서 무전하로 되기 때문에, 금속-수지 복합체(100)는 전체로서 표면전하가 정으로 된다. 한편, 염기성 환경 하에서는 피리딘의 질소가 N의 상태에서 무전하로 되고, 카르복실기는 COO-의 상태에서 부전하로 되기 때문에, 금속-수지 복합체(100)는 전체로서 표면 전하가 부로 된다. 그 결과, 금속-수지 복합체(100)의 제타전위가 상술의 제1∼제3특성을 나타낸다고 생각된다.
이상의 관점으로부터, 예를 들면 다음의 (i)∼(iii)의 방법으로 금속-수지 복합체(100)에 있어서의 제타전위를 제어하는 것이 바람직하다.
(i) 수지입자(10)를 양이온성을 나타내는 폴리머(예를 들면, 상기 음이온성 이온을 흡착 가능한 폴리머 등)에 의해서 구성함과 아울러, 금속-수지 복합체(100)(또는 수지입자(10))의 표면에 음이온성의 관능기를 도입하는 방법.
(ii) 수지입자(10)를 음이온성을 나타내는 폴리머(예를 들면, 상기 양이온성 이온을 흡착 가능한 폴리머 등)에 의해서 구성함과 아울러, 금속-수지 복합체(100)(또는 수지입자(10))의 표면에 양이온성의 관능기를 도입하는 방법.
(iii) 금속-수지 복합체(100)(또는 수지입자(10))의 표면에 음이온성의 관능기와 양이온성의 관능기를 각각 도입하는 방법.
여기에서, 「음이온성의 관능기」로서는, 예를 들면 카르복실기, 술폰산기, 포스폰산기 등을 들 수 있다. 이들 음이온성의 관능기는, 폴리머종의 선택에 의해 수지입자(10)의 표면에 존재시킬 수 있다. 또한, 음이온성의 관능기를 금속-수지 복합체(100)(또는 수지입자(10))의 표면에 도입하기 위한 바람직한 방법으로서, 예를 들면 이하의 a), b)를 들 수 있다.
a) 산 처리 또는 알칼리 처리에 의해 수지입자(10)를 구성하는 폴리머의 표면을 부분적으로 가수분해하는 방법.
여기에서, 가수분해에 의해 음이온성의 관능기를 발생시키는 폴리머로서는, 예를 들면, 폴리에스테르, 폴리아미드를 들 수 있다.
b) 금속-수지 복합체(100)를, 예를 들면 상기 「금속과 배위결합성이 있는 관능기와 카르복실기의 양쪽을 갖는 화합물」과 같은, 금속과 배위결합성이 있는 관능기와 음이온성의 관능기의 양쪽을 갖는 화합물(고분자 화합물을 포함한다)에 의해 처리하는 방법.
또한, 「양이온성의 관능기」로서는, 예를 들면, 피리디닐기, 아미노기 등의 질소 함유기를 들 수 있다. 이들 양이온성의 관능기는 폴리머종의 선택에 의해 수지입자(10)의 표면에 존재시킬 수 있다. 또한, 양이온성의 관능기를 금속-수지 복합체(100)(또는 수지입자(10))의 표면에 도입하기 위한 바람직한 방법으로서, 예를 들면, 이하의 c), d)를 들 수 있다.
c) 산 처리 또는 알칼리 처리에 의해 수지입자(10)를 구성하는 폴리머의 표면을 부분적으로 가수분해하는 방법.
여기에서, 가수분해에 의해 양이온성의 관능기를 발생시키는 폴리머로서는, 예를 들면 폴리아미드를 들 수 있다.
d) 금속-수지 복합체(100)를 금속과 배위결합성이 있는 관능기와 질소 함유기의 양쪽을 갖는 화합물(고분자 화합물을 포함한다)에 의해 처리하는 방법.
여기에서, 「금속과 배위결합성이 있는 관능기와 질소 함유기의 양쪽을 갖는 화합물(고분자 화합물을 포함한다)」로서는, 예를 들면, 2-아미노에탄티올, 11-아미노-1-운데칸티올 염산염 등을 사용하는 것이 바람직하다.
이어서, 금속-수지 복합체(100)를 표식물질로서 사용한 피분석물의 측정 방법, 측방유동형 크로마토그래피용 테스트 스트립 및 피분석물 검출·정량 키트에 대하여 설명한다.
[측방유동형 크로마토그래피용 테스트 스트립]
우선, 도 3을 참조하면서 본 발명의 일실시형태에 따른 측방유동형 크로마토그래피용 테스트 스트립(이하, 단지 「테스트 스트립」이라고 기재하는 일이 있다)에 대하여 설명한다. 이 테스트 스트립(200)은, 후술하는 바와 같이, 본 발명의 일실시형태의 피분석물의 측정 방법에 바람직하게 사용할 수 있는 것이다.
테스트 스트립(200)은 멤브레인(110)을 구비하고 있다. 멤브레인(110)에는, 시료의 전개 방향에 있어서 순차적으로 시료 첨가부(120), 판정부(130) 및 흡액부(140)가 설치되어 있다.
<멤브레인>
테스트 스트립(200)에 사용되는 멤브레인(110)으로서는, 일반적인 테스트 스트립에 있어서 멤브레인 재료로서 사용되는 것을 적용 가능하다. 멤브레인(110)은, 예를 들면 모관현상을 나타내고, 시료를 첨가함과 동시에, 시료가 전개되는 미세 다공성 물질로 이루어지는 불활성 물질(피분석물(160), 각종 리간드 등과 반응하지 않는 물질)로 형성되어 있는 것이다. 멤브레인(110)의 구체예로서는, 폴리우레탄, 폴리에스테르, 폴리에틸렌, 폴리염화비닐, 폴리불화비닐리덴, 나일론, 셀룰로오스 유도체 등으로 구성되는 섬유상 또는 부직섬유상 매트릭스, 막, 여과지, 유리섬유 여과지, 천, 면 등을 들 수 있다. 이것들 중에서도, 바람직하게는 셀룰로오스 유도체나 나일론으로 구성되는 막, 여과지, 유리섬유 여과지 등이 사용되고, 보다 바람직하게는 니트로셀루로스막, 혼합 니트로셀루로스에스테르(니트로셀루로스와 아세트산 셀룰로오스의 혼합물)막, 나일론막, 여과지가 사용된다.
테스트 스트립(200)은 조작을 보다 간편하게 하기 위해서 멤브레인(110)을 지지하는 지지체를 구비하는 것이 바람직하다. 지지체로서는, 예를 들면 플라스틱 등을 사용할 수 있다.
<시료 첨가부>
테스트 스트립(200)은 피분석물(160)을 포함하는 시료를 첨가하기 위한 시료 첨가부(120)를 갖고 있어도 된다. 시료 첨가부(120)는 테스트 스트립(200)에, 피분석물(160)을 포함하는 시료를 수납하기 위한 부위이다. 시료 첨가부(120)는 시료가 전개하는 방향에 있어서, 판정부(130)보다 상류측의 멤브레인(110)에 형성되어 있어도 되고, 또는, 예를 들면 셀룰로오스 여과지, 유리섬유, 폴리우레탄, 폴리아세테이트, 아세트산 셀룰로오스, 나일론, 면포 등의 재료로 구성된 시료첨가 패드가 멤브레인(110)에 설치되어서 시료 첨가부(120)를 구성하고 있어도 된다.
<판정부>
판정부(130)에는 피분석물(160)과 특이적으로 결합하는 포착 리간드(131)가 고정되어 있다. 포착 리간드(131)는 피분석물(160)과 특이적인 결합을 형성하는 것이면 특별히 제한 없이 사용할 수 있고, 예를 들면 피분석물(160)에 대한 항체 등을 바람직하게 사용할 수 있다. 포착 리간드(131)는 테스트 스트립(200)에 시료를 제공했을 경우에 있어서도, 판정부(130)로부터 이동할 일이 없도록 부동화되어 있다. 포착 리간드(131)는 물리적 또는 화학적인 결합이나 흡착 등에 의해, 멤브레인(110)에 직접적 또는 간접적으로 고정되어 있으면 좋다.
또한, 판정부(130)는 표식항체(150)와 피분석물(160)을 포함하는 복합체(170)가, 피분석물(160)과 특이적으로 결합하는 포착 리간드(131)에 접촉하는 구성인 한 특별하게 한정되지 않는다. 예를 들면, 멤브레인(110)에 직접, 포착 리간드(131)가 고정되어 있어도 되고, 또는, 멤브레인(110)에 고정된 셀룰로오스 여과지, 유리섬유, 부직포 등으로 이루어지는 패드에 포착 리간드(131)가 고정되어 있어도 된다.
<흡액부>
흡액부(140)는, 예를 들면 셀룰로오스 여과지, 부직포, 천, 셀룰로오스아세테이트 등의 흡수성 재료의 패드에 의해 형성된다. 첨가된 시료의 전개 앞선(프론트 라인)이 흡액부(140)에 닿고부터의 시료의 이동속도는, 흡액부(140)의 재질, 크기 등에 따라 다른 것으로 된다. 따라서, 흡액부(140)의 재질, 크기 등의 선정에 의해 피분석물(160)의 검출·정량에 최적인 속도를 설정할 수 있다. 또, 흡액부(140)는 임의의 구성이며, 생략해도 좋다.
테스트 스트립(200)은, 필요에 따라서 반응부, 컨트롤부 등의 임의의 부위를 더 포함하고 있어도 된다.
<반응부>
도시는 생략하지만, 테스트 스트립(200)에는 멤브레인(110)에 표식항체(150)를 포함하는 반응부가 형성되어 있어도 된다. 반응부는 시료가 흐르는 방향에 있어서, 판정부(130)보다 상류측에 설치할 수 있다. 또, 도 3에 있어서의 시료 첨가부(120)를 반응부로서 이용해도 좋다. 테스트 스트립(200)이 반응부를 가질 경우, 피분석물(160)을 포함하는 시료를 반응부 또는 시료 첨가부(120)에 제공하면, 반응부에 있어서 시료에 포함되는 피분석물(160)과 표식항체(150)를 접촉시킬 수 있다. 이 경우, 시료를 단지 반응부 또는 시료 첨가부(120)에 제공함으로써 피분석물(160)과 표식항체(150)를 포함하는 복합체(170)를 형성시킬 수 있으므로, 소위 1스텝형의 면역크로마토그래프가 가능하게 된다.
반응부는 피분석물(160)과 특이적으로 결합하는 표식항체(150)를 포함하는 한 특별하게 한정되지 않지만, 멤브레인(110)에 직접, 표식항체(150)가 도포되어서 이루어지는 것이라도 된다. 또는, 반응부는, 예를 들면 셀룰로오스 여과지, 유리섬유, 부직포 등으로 이루어지는 패드(콘쥬게이트 패드)에 표식항체(150)를 함침한 것을, 멤브레인(110)에 고정하여 이루어지는 것이라도 된다.
<컨트롤부>
도시는 생략하지만, 테스트 스트립(200)은 멤브레인(110)에 시료가 전개되는 방향에 있어서 판정부(130)보다 하류측에, 표식항체(150)와 특이적으로 결합하는 포착 리간드가 고정되어서 이루어지는 컨트롤부가 형성되어 있어도 된다. 판정부(130)와 함께 컨트롤부에서도 발색강도가 측정됨으로써, 테스트 스트립(200)에 제공한 시료가 전개되어, 반응부 및 판정부(130)에 도달하고, 검사가 정상으로 행하여진 것을 확인할 수 있다. 또, 컨트롤부는 포착 리간드(131) 대신에, 표식항체(150)와 특이적으로 결합하는 별도의 종류의 포착 리간드를 사용하는 것을 제외하고는, 상슬의 판정부(130)와 같은 방법으로 제작되고, 동일한 구성을 채용할 수 있다.
[피분석물의 측정 방법]
이어서, 테스트 스트립(200)을 사용해서 행하여지는 본 발명의 일실시형태의 피분석물(160)의 측정 방법에 대하여 설명한다.
본 실시형태의 피분석물(160)의 측정 방법은, 시료 중에 포함되는 피분석물(160)을 검출 또는 정량하는 피분석물(160)의 측정 방법이다. 본 실시형태의 피분석물(160)의 측정 방법은, 멤브레인(110), 및 상기 멤브레인(110)에 피분석물(160)과 특이적으로 결합하는 포착 리간드(131)가 고정되어서 이루어지는 판정부(130)를 포함하는 테스트 스트립(200)을 사용한다. 그리고, 본 실시형태의 피분석물(160)의 측정 방법은, 하기 공정 (I)∼(III);
공정 (I): 시료에 포함되는 상기 피분석물(160)과, 상기 피분석물(160)에 특이적으로 결합하는 항체를 수지입자(10)에 복수의 금속입자(20)가 고정화된 구조를 갖는 금속-수지 복합체(100)로 표식한 표식항체(150)를 접촉시키는 공정,
공정 (II): 판정부(130)에서 공정 (I)에 있어서 형성된 피분석물(160)과 표식항체(150)를 포함하는 복합체(170)를, 포착 리간드(131)에 접촉시키는 공정,
공정 (III): 금속-수지 복합체(100)의 국재형 표면 플라즈몬 공명 및/또는 전자전이에 의한 광에너지 흡수에 유래하는 발색강도를 측정하는 공정,
을 포함할 수 있다.
공정 (I):
공정 (I)은 시료에 포함되는 피분석물(160)을 표식항체(150)에 접촉시키는 공정이다. 피분석물(160)과 표식항체(150)를 포함하는 복합체(170)를 형성하는 한, 접촉의 형태는 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 테스트 스트립(200)의 시료 첨가부(120) 또는 반응부(도시생략)에 시료를 제공하고, 상기 시료 첨가부(120) 또는 반응부에 있어서 피분석물(160)을 표식항체(150)에 접촉시켜도 좋고, 테스트 스트립(200)에 시료를 제공하기 전에 시료 중의 피분석물(160)을 표식항체(150)에 접촉시켜도 좋다.
공정 (I)에서 형성된 복합체(170)는 테스트 스트립(200) 상에서 전개해서 이동하고, 판정부(130)에 이른다.
공정 (II):
공정 (II)는 테스트 스트립(200)의 판정부(130)에 있어서, 공정 (I)에 있어서 형성된 피분석물(160)과 표식항체(150)를 포함하는 복합체(170)를 포착 리간드(131)에 접촉시킨다. 복합체(170)를 포착 리간드(131)에 접촉시키면, 포착 리간드(131)는 복합체(170)의 피분석물(160)에 특이적으로 결합한다. 그 결과, 복합체(170)가 판정부(130)에 있어서 포착된다.
또, 포착 리간드(131),는 표식항체(150)에는 특이적으로 결합하지 않기 때문에, 피분석물(160)과 미결합의 표식항체(150)가 판정부(130)에 도달했을 경우, 상기 피분석물(160)과 미결합의 표식항체(150)는 판정부(130)를 통과한다. 여기에서, 테스트 스트립(200)에 표식항체(150)에 특이적으로 결합하는 별도의 포착 리간드가 고정된 컨트롤부(도시생략)가 형성되어 있을 경우, 판정부(130)를 통과한 표식항체(150)는 전개를 계속하고, 컨트롤부에서 상기 별도의 포착 리간드와 결합한다. 그 결과, 피분석물(160)과 복합체(170)를 형성하고 있지 않은 표식항체(150)는 컨트롤부에서 포착된다.
공정 (II)의 뒤, 필요에 따라서 공정 (III)의 앞에, 예를 들면 물, 생리식염수, 인산완충액 등의 생화학 검사에서 범용되는 완충액으로 테스트 스트립(200)을 세정하는 세정 공정을 실시해도 좋다. 세정 공정에 의해서, 판정부(130), 또는, 판정부(130) 및 컨트롤부에 포착되지 않은 표식항체(150)(피분석물(160)과 결합하고 있지 않고, 복합체(170)를 형성하고 있지 않은 표식항체(150))를 제거할 수 있다.
세정 공정을 실시함으로써, 공정 (III)에 있어서 판정부(130), 또는, 판정부(130) 및 컨트롤부에 있어서의 금속-수지 복합체(100)의 국재형 표면 플라즈몬 공명 및/또는 전자전이에 의한 광에너지 흡수에 의한 발색을 측정할 때에, 백그라운드의 발색강도를 저감시킬 수 있고, 시그널/백그라운드비를 높여 한층더, 검출 감도나 정량성을 향상시킬 수 있다.
공정 (III):
공정 (III)은 금속-수지 복합체(100)의 국재형 표면 플라즈몬 공명 및/또는 전자전이에 의한 광에너지 흡수에 유래하는 발색강도를 측정하는 공정이다. 상기 공정 (II) 또는 필요에 따라서 세정 공정을 실시한 후, 테스트 스트립(200)에 있어서 금속-수지 복합체(100)의 국재형 표면 플라즈몬 공명 및/또는 전자전이에 의한 광에너지 흡수에 유래하는 발색강도를 측정한다.
또, 테스트 스트립(200)에 컨트롤부가 형성되어 있을 경우, 공정 (II)에 의해서, 컨트롤부에서 표식항체(150)가 다른 포착 리간드에 의해 포착되어 복합체가 형성된다. 그 때문에, 공정 (III)에서는 테스트 스트립(200)에 있어서 판정부(130)뿐만 아니라 컨트롤부에 있어서도 국재형 표면 플라즈몬 공명 및/또는 전자전이에 의한 광에너지 흡수에 의한 발색을 발생시킬 수 있다. 이와 같이, 판정부(130)와 함께 컨트롤부에 있어서도 발색강도를 측정함으로써 테스트 스트립(200)에 제공한 시료가 정상적으로 전개되어 반응부 및 판정부(130)에 도달했는지의 여부를 확인할 수 있다.
<시료 및 피분석물>
본 실시형태의 피분석물의 측정 방법에 있어서의 시료는, 피분석물(160)로서 단백질 등의 항원이 될 수 있는 물질을 포함하는 것인 한 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 목적의 피분석물(160)을 포함하는 생체 시료(즉, 전혈, 혈청, 혈장, 요, 타액, 객담, 비강 또는 인두 닦기액, 수액, 양수, 유두분비액, 눈물, 땀, 피부로부터의 침출액, 조직이나 세포 및 변으로부터의 추출액 등)나 식품의 추출액 등을 들 수 있다. 필요에 따라서, 표식항체(150) 및 포착 리간드(131)와 피분석물(160)의 특이적인 결합 반응이 생기기 쉽게 하기 위해서, 상기 공정 (I)에 앞서, 시료에 포함되는 피분석물(160)을 전처리해도 좋다. 여기에서, 전처리로서는 산, 염기, 계면활성제 등의 각종 화학약품 등을 사용한 화학적 처리나, 가열·교반·초음파 등을 사용한 물리적 처리를 들 수 있다. 특히, 피분석물(160)이 인풀루엔자 바이러스 NP 항원 등의, 통상은 표면에 노출되어 있지 않은 물질일 경우, 계면활성제 등에 의한 처리를 행하는 것이 바람직하다. 이 목적으로 사용되는 계면활성제로서, 특이적인 결합 반응, 예를 들면 항원항체 반응 등의 포착 리간드(131)와 피분석물(160)의 결합 반응성을 고려하여 비이온성 계면활성제를 사용할 수 있다.
또한, 상기 시료는 통상의 면역학적 분석법에서 사용되는 용매(물, 생리식염수, 또는 완충액 등)나 물 혼화 유기용매로 적당하게 희석되어 있어도 된다.
상기 피분석물(160)로서는, 특별히 제한은 없이 공지의 것을 사용할 수 있고, 음이온성의 성질이 강한 것이나, 양이온성의 성질이 강한 것, 그 이외의 것도 사용할 수 있다. 피분석물(160)로서는, 예를 들면 종양 마커, 시그널 전달물질, 호르몬 등의 단백질(폴리펩티드, 올리고펩티드 등을 포함한다), 핵산(단일쇄 또는 이중쇄의, DNA, RNA, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, PNA(펩티드핵산) 등을 포함한다) 또는 핵산을 갖는 물질, 당(올리고당, 다당류, 당쇄 등을 포함한다) 또는 당쇄를 갖는 물질, 지방질 등 그 밖의 분자를 들 수 있고, 표식항체(150) 및 포착 리간드(131)에 특이적으로 결합하는 것인 한 특별하게 한정되지 않지만, 예를 들면 암 태아성 항원(CEA), HER2 단백질, 전립선 특이항원(PSA), CA19-9, α-페토프로테인(AFP), 면역억제 산성 단백질(IAP), CA15-3, CA125, 에스트로겐 리셉터, 프로게스테론 리셉터, 변잠혈, 트로포닌I, 트로포닌T, CK-MB, CRP, 인간 융모성 고나도트로핀(HCG), 황체형성 호르몬(LH), 난포자극 호르몬(FSH), 매독 항체, 인풀루엔자 바이러스 인간 헤모글로빈, 클라미디아 항원, A군 β용련균 항원, HBs 항체, HBs 항원, 로타바이러스, 아데노바이러스, 알부민, 당화 알부민 등을 들 수 있다. 이것들 중에서도 비이온성 계면활성제에 의해 가용화되는 항원이 바람직하고, 바이러스의 핵 단백질과 같이 자기 집합체를 형성하는 항원이 보다 바람직하다.
<표식항체>
표식항체(150)는, 공정 (I)에 있어서 시료에 포함되는 피분석물(160)에 접촉시켜서 피분석물(160)과 표식항체(150)를 포함하는 복합체(170)를 형성하기 위해서 사용된다. 표식항체(150)는 피분석물(160)에 특이적으로 결합하는 항체를, 수지입자(10)에 복수의 금속입자(20)가 고정화된 구조를 갖는 금속-수지 복합체(100)로 표식화하여 이루어지는 것이다. 여기에서, 「표식화」란 공정 (I)∼(III)에 있어서 표식항체(150)로부터 금속-수지 복합체(100)가 탈리하지 않는 정도로, 항체에 금속-수지 복합체(100)가 직접적으로 또는 간접적으로, 화학적 또는 물리적인 결합이나 흡착 등으로 고정되어 있는 것을 의미한다. 예를 들면, 표식항체(150)는 항체에 금속-수지 복합체(100)가 직접 결합하여 이루어지는 것이여도 좋고, 항체와 금속-수지 복합체(100)가 임의의 링커 분자를 통해서 결합하여 이루어지는 것이나, 각각이 불용성 입자에 고정되어서 되는 것이라도 좋다.
또한, 본 실시형태에 있어서, 「항체」로서는 특별히 제한은 없이 공지의 것을 사용할 수 있고, 음이온성의 성질이 강한 것이나, 양이온성의 성질이 강한 것, 그 이외의 것도 사용할 수 있다. 예를 들면, 폴리크로날 항체, 모노클로날 항체, 유전자 재조합에 의해 얻어진 항체 외에, 항원과 결합능을 갖는 항체 단편[예를 들면, H쇄, L쇄, Fab, F(ab')2 등] 등을 사용할 수 있다. 또한, 면역 글로블린으로서, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD의 어느 것이라도 좋다. 항체의 산생 동물종으로서는, 인간을 비롯해, 인간 이외의 동물(예를 들면 마우스, 래트, 토끼, 염소, 말 등)이라도 좋다. 항체의 구체예로서는, 항PSA 항체, 항AFP 항체, 항CEA 항체, 항아데노바이러스 항체, 항인풀루엔자 바이러스 항체, 항HCV 항체, 항IgG 항체, 항인간 IgE 항체 등을 들 수 있다.
<표식항체의 바람직한 제작 방법>
이어서, 표식항체(150)의 바람직한 제작 방법을 들어서 설명한다. 표식항체(150)의 제조는, 적어도 다음 공정 A;
공정 A) 금속-수지 복합체(100)를 제1의 pH 조건에서 항체와 혼합해서 결합 시킴으로써 표식항체(150)를 얻는 공정
을 포함하고, 바람직하게는 또한 공정 B;
공정 B) 표식항체(150)를 제2의 pH 조건에서 처리하는 공정
을 포함할 수 있다.
[공정 A]
공정 A에서는 금속-수지 복합체(100)를 제1의 pH 조건에서 항체와 혼합해서 표식항체(150)를 얻는다. 공정 A는 고체상의 금속-수지 복합체(100)를 액상 중에 분산시킨 상태에서 항체와 접촉시키는 것이 바람직하다.
제1의 pH 조건은 금속-수지 복합체(100)의 분산과 항체의 활성을 유지한 채 금속-수지 복합체(100)와 항체를 균일하게 접촉시키는 관점으로부터, pH2∼10의 범위 내의 조건이 바람직하고, 또한 예를 들면 pH5∼9의 범위 내가 보다 바람직하다. 금속-수지 복합체(100)와 항체를 결합시킬 때의 조건이, pH2 미만에서는 강산성에 의해 항체가 변질되어 실활할 경우가 있고, pH10을 초과하면 금속-수지 복합체(100)와 항체를 혼합했을 때에 응집해 분산이 곤란하게 된다. 단, 강산성에 의해 항체가 실활하지 않는 경우에는 pH2 미만에 있어서도 처리가 가능하다.
공정 A는 제1의 pH 조건으로 조정한 결합용 완충액(Binding Buffer) 중에서 행하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 상기 pH로 조정한 결합용 완충액에 소정량의 금속-수지 복합체(100)를 혼합하고, 충분하게 혼화한다. 결합용 완충액으로서는, 예를 들면 소정 농도로 조정한 붕산 용액 등을 사용할 수 있다. 결합용 완충액의 pH의 조정은, 예를 들면 염산, 수산화나트륨 등을 이용하여 행할 수 있다.
이어서, 얻어진 혼합액에 소정량의 항체를 첨가하고, 충분하게 교반, 혼합 함으로써 표식항체 함유액을 얻을 수 있다. 이와 같이 하여 얻어진 표식항체 함유액은, 예를 들면 원심분리 등의 고액 분리수단에 의해 고형 부분으로서 표식항체(150)만을 분취할 수 있다.
[공정 B]
공정 B에서는 공정 A에서 얻어진 표식항체(150)를 제2의 pH 조건으로 처리함으로써, 표식항체(150)로의 비특이적인 흡착을 억제하는 블록킹을 행한다. 이 경우, 고액 분리수단에 의해 분취해 둔 표식항체(150)를, 제2의 pH 조건으로 액상 중에 분산시킨다.
제2의 pH 조건은 항체의 활성을 유지하고 또한 표식항체(150)의 응집을 억제하는 관점으로부터, 예를 들면 pH2∼10의 범위 내가 바람직하고, 표식항체(150)의 비특이적인 흡착을 억제하는 관점으로부터, pH5∼9의 범위 내가 보다 바람직하다. 블록킹의 조건이 pH2 미만에서는 강산성에 의해 항체가 변질되어 실활할 경우가 있고, pH10을 초과하면 표식항체(150)가 응집해 버려 분산이 곤란하게 된다.
공정 B는 블록킹제를 제2의 pH의 조건으로 조제한 블록용 완충액(Blocking Buffer)을 이용하여 행하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 소정량의 표식항체(150)에 상기 pH로 조정한 블록용 완충액을 첨가하고, 블록용 완충액 중에서 표식항체(150)를 균일하게 분산시킨다. 블록용 완충액으로서는, 예를 들면 피검출물과 결합하지 않는 단백질의 용액을 사용하는 것이 바람직하다. 블록용 완충액에 사용 가능한 블록킹제로서는 특별히 제한은 없이 공지의 것을 사용할 수 있고, 음이온성의 성질이 강한 것이나, 양이온성의 성질이 강한 것, 그 이외의 것도 사용할 수 있다. 예를 들면, 단백질이면, 소혈청 알부민, 난백 알부민, 카제인, 젤라틴, 유청 훼이 등을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 소정 농도로 조정한 소혈청 알부민 용액 등을 사용하는 것이 바람직하다. 블록용 완충액의 pH의 조정은, 예를 들면 염산, 수산화나트륨 등을 이용하여 행할 수 있다. 표식항체(150)의 분산에는, 예를 들면 초음파 처리 등의 분산수단을 사용하는 것이 바람직하다. 이와 같이 하여 표식항체(150)가 균일 분산된 분산액이 얻어진다.
상기 공정 A 및 공정 B에 있어서, 금속-수지 복합체(100)는 pH에 의한 응집이 일어나기 어렵고, 산성∼알칼리성까지 넓은 범위의 pH로 처리가 가능하다. 따라서, 본 발명에서 사용하는 금속-수지 복합체(100)는 표식항체의 제작 조건의 제한을 받기 어렵다고 하는 이점도 있다.
이상과 같이 하여 표식항체(150)의 분산액이 얻어진다. 이 분산액으로부터, 예를 들면 원심분리 등의 고액 분리수단에 의해 고형 부분으로서 표식항체(150)만을 분취할 수 있다. 또한 필요에 따라서, 세정 처리, 보존 처리 등을 실시할 수 있다. 이하, 세정 처리, 보존 처리에 대하여 설명한다.
(세정 처리)
세정 처리는 고액 분리수단에 의해 분취한 표식항체(150)에 세정용 완충액을 첨가하고, 세정용 완충액 중에서 표식항체(150)를 균일하게 분산시킨다. 분산에는, 예를 들면 초음파 처리 등의 분산수단을 사용하는 것이 바람직하다. 세정용 완충액으로서는 특히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 pH8∼9의 범위 내로 조정한 소정 농도의, 트리스(Tris) 완충액, 글리신아미드 완충액, 아르기닌 완충액 등을 사용할 수 있다. 세정용 완충액의 pH의 조정은, 예를 들면 염산, 수산화나트륨 등을 이용하여 행할 수 있다. 표식항체(150)의 세정 처리는, 필요에 따라서 복수회 반복하여 행할 수 있다.
(보존 처리)
보존 처리는 고액 분리수단에 의해 분취한 표식항체(150)에 보존용 완충액을 첨가하고, 보존용 완충액 중에서 표식항체(150)를 균일하게 분산시킨다. 분산에는, 예를 들면 초음파 처리 등의 분산수단을 사용하는 것이 바람직하다. 보존용 완충액으로서는, 예를 들면 세정용 완충액에 소정 농도의 응집 방지제 및/또는 안정제를 첨가한 용액 등을 사용할 수 있다. 응집 방지제로서는, 예를 들면 수크로오스, 말토오스, 락토오스, 트레할로오스로 대표되는 당류나, 글리세린, 폴리비닐알콜로 대표되는 다가알콜 등을 사용할 수 있다. 안정제로서는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 소혈청 알부민, 난백 알부민, 카제인, 젤라틴 등의 단백질을 사용할 수 있다. 이와 같이 하여 표식항체(150)의 보존 처리를 행할 수 있다.
이상의 각 공정에서는, 또한 필요에 따라서 계면활성제나, 아지화나트륨, 파라옥시벤조산 에스테르 등의 방부제를 사용할 수 있다.
[피분석물 측정용 키트]
본 발명의 일실시형태에 따른 피분석물 측정용 키트는, 예를 들면 테스트 스트립(200)을 사용하여, 본 실시형태의 피분석물의 측정 방법에 기초하여 시료 중에 포함되는 피분석물(160)의 검출 또는 정량하기 위한 키트이다.
본 실시형태의 피분석물 측정용 키트는,
멤브레인(110)과,
멤브레인(110)에 상기 피분석물(160)과 특이적으로 결합하는 포착 리간드(131)가 고정되어서 이루어지는 판정부(130)를 포함하는 테스트 스트립(200)과,
피분석물(160)에 특이적으로 결합하는 항체를 수지입자(10)에 복수의 금속입자(20)가 고정화된 구조를 갖는 금속-수지 복합체(100)로 표식한 표식항체(150)를 포함하는 검출 시약을 포함하고 있다. 본 실시형태의 피분석물 측정용 키트는, 필요에 따라서, 또한 그 밖의 구성요소를 포함하는 것이라도 좋다.
본 실시형태에 따른 피분석물 측정용 키트를 사용함에 있어서는, 시료 중의 피분석물(160)과 검출시약 중의 표식항체(150)를 접촉시켜서 공정 (I)을 실시한 후, 테스트 스트립(200)의 반응부 또는 시료 첨가부(120)에 시료를 제공하고, 공정 (II), 공정 (III)을 순차적으로 실시해도 좋다. 또는, 테스트 스트립(200)의 판정부(130)보다 상류측에 검출 시약을 도포하고, 적당하게 건조시켜서 반응부를 형성한 후, 형성된 반응부 또는 상기 반응부보다 상류측의 위치(예를 들면, 시료 첨가부(120))에 시료를 첨가하고, 공정 (I)∼(III)을 순차적으로 실시해도 좋다.
또한, 금속-수지 복합체(100)의 면역학적 측정용 표식물질 또는 면역학적 측정용 시약 이외의 용도로서는, 고체 촉매, 안료, 도료, 도전성 재료, 전극, 센서 소자로서 바람직하게 적용할 수 있다.
(실시예)
이어서, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들의 실시예에 의해 조금도 한정되는 것은 아니다. 이하의 실시예, 비교예에 있어서 특별히 언급이 없는 한, 각종 측정, 평가는 하기에 의한 것이다.
<금속-수지 복합체 입자의 흡광도 측정 >
금속-수지 복합체 입자의 흡광도는, 석영유리제 셀(광로 길이 10㎜)에 0.01wt%로 조제한 금속-수지 복합체 입자 분산액(분산매: 물)을 넣고, 분광광도계(시마즈 세이사쿠쇼사제, UV3600)를 사용하여 금-수지 복합체의 경우 570㎚, 백금-수지 복합체의 경우 400㎚의 흡광도를 측정했다.
<고형분 농도 측정 및 금속 담지량의 측정>
자석제 도가니에 농도 조정 전의 분산액 1g을 넣고, 70℃, 3시간 건조를 행하였다. 건조 전후의 중량을 측정하고, 하기 식에 의해 고형분 농도를 산출했다.
고형분 농도(wt%)=
[건조 후의 중량(g)/건조 전의 중량(g)]×100
또한, 상기 건조 처리 후의 샘플을, 또한 500℃, 5시간 열처리를 행하고, 열처리 전후의 중량을 측정하고, 하기 식으로부터 금속 담지량을 산출했다.
금속 담지량(wt%)=
[열처리 후의 중량(g)/열처리 전의 중량(g)]×100
<수지입자 또는 금속-수지 복합체 입자의 평균 입자지름의 측정>
디스크 원심식 입도분포 측정 장치(CPS Disc Centrifuge DC24000 UHR, CPS instruments, Inc.사제)를 이용하여 측정했다. 측정은 수지입자 또는 금속-수지 복합체 입자를 물에 분산시킨 상태에서 행하였다.
<금속입자의 평균 입자지름의 측정>
금속-수지 복합체 입자 분산액을 카본 지지막이 부착된 금속성 메쉬에 적하해서 작성한 기판을, 전계방출형 주사 전자현미경(FE-SEM; 히타치 하이테크놀러지즈사제, SU-9000)에 의해 관측한 화상으로부터, 임의의 100개의 금속입자의 면적 평균지름을 측정했다.
<제타전위 측정>
제타전위는 측정 장치로서 Malvern사제 Zetasizer Nano-ZS를 사용하고, 전기영동 광산란법에 의해 측정했다. 샘플을 순수로 0.01wt%로 희석하고, 염산 또는 NaOH 수용액을 이용하여 pH3∼10에 있어서의 각 pH값으로 조정한 것을 측정 샘플로 한다. pH 미터(HORIBA LAQUA twin)를 이용하여 pH 측정한 후 제타전위 측정을 행함으로써, pH3∼10의 복수점의 pH에 있어서의 제타전위의 변화의 거동을 측정했다. pH3∼6의 산성 영역에 있어서의 제타전위의 최대값과 pH6∼10의 알칼리성 영역에 있어서의 제타전위의 최소값로부터 제타전위의 변화폭을 산출했다. 또한, 제타전위가 0mV에 가까운, 0mV보다 큰 임의의 1점의 제타전위, 및 0mV보다 작은 임의의 1점의 제타전위를 연결하는 1차 함수를 구하고, 제타전위가 0mV로 되는 pH, 즉 제로 전하점(zero point of charge)을 산출했다.
[제작예 1]
<수지입자의 합성>
트리옥틸암모늄클로라이드(0.91g) 및 폴리에틸렌글리콜메틸에테르메타크릴레이트(10.00g)를 300g의 순수에 용해한 후, 2-비닐피리딘(48.00g) 및 디비닐벤젠(2.00g)을 첨가하고, 질소기류 하에 있어서 30℃에서 50분, 이어서 60℃에서 30분간 교반했다. 교반 후, 18.00g의 순수에 용해한 2,2-아조비스(2-메틸프로피온아미딘)2염산염(0.250g)을 적하하고, 60℃에서 3.5시간 교반함으로써 평균 입자지름 371㎚의 수지입자 A-1을 얻었다. 원심분리(9000rpm, 40분)에 의해 침전시켜 상청을 제거한 후, 순수로 다시 분산시킨 후, 투석처리에 의해 불순물을 제거했다. 그 후, 농도 조정을 행해 10wt%의 수지입자 분산액 B-1을 얻었다.
[제작예 2]
<수지입자의 합성>
트리옥틸암모늄클로라이드를 0.39g 사용하고, 2,2-아조비스(2-메틸프로피온아미딘)2염산염을 0.50g 사용한 것 이외는, 제작예 1과 같은 방법으로, 평균 입자지름 439㎚의 수지입자 A-2 및 10wt%의 수지입자 분산액 B-2를 얻었다.
[제작예 3]
<수지입자의 합성>
트리옥틸암모늄클로라이드를 1.50g 사용하고, 2-비닐피리딘을 49.50g 사용하고, 디비닐벤젠을 0.50g 사용하고, 2,2-아조비스(2-메틸프로피온아미딘)2염산염을 0.50g 사용한 것 이외는, 제작예 1과 같은 방법으로, 평균 입자지름 430㎚의 수지입자 A-3 및 10wt%의 수지입자 분산액 B-3을 얻었다.
[제작예 4]
<수지입자의 합성>
트리옥틸암모늄클로라이드(1.50g) 및 폴리에틸렌글리콜메틸에테르메타크릴레이트(10.00g)를 300g의 순수에 용해한 후, 2-비닐피리딘(48.00g) 및 디비닐벤젠(2.00g)을 첨가하고, 질소기류 하에 있어서 30℃에서 50분, 이어서 60℃에서 30분간 교반했다. 교반 후, 18.00g의 순수에 용해한 2,2-아조비스(2-메틸프로피온아미딘)2염산염(0.250g)을 적하하고, 60℃에서 3.5시간 교반했다. 그 후, 농도 50wt%의 수산화나트륨 수용액을 20g 첨가하고, 60℃에서 2시간 교반함으로써 평균 입자지름 312㎚의 수지입자 A-4를 얻었다. 원심분리(9000rpm, 40분)에 의해 침전시켜 상청을 제거한 후, 순수로 다시 분산시킨 후, 투석처리에 의해 불순물을 제거했다. 그 후, 농도 조정을 행해 10wt%의 수지입자 분산액 B-4를 얻었다.
[실시예 1]
<백금-수지 복합체 입자의 합성>
B-1(91.5g)에 순수 54g을 첨가한 후, 400mM 염화백금산 수용액(100g)을 첨가하여 30℃에서 3시간 교반했다. 이 혼합액을 24시간 정치한 후, 원심분리(3000rpm, 30분)에 의해 A-1을 침전시켜 상청을 제거함으로써 여분의 염화백금산을 제거했다. 그 후, 농도를 조정하여 5wt%의 백금이온 흡착 수지입자 분산액 C-1을 얻었다.
이어서, 순수 1392g에 C-1(20.6g)을 첨가하고, 3℃에서 교반하면서 132mM의 디메틸아민보란 수용액(40g)을 20분 걸쳐서 적하한 후, 3℃에서 1시간, 실온에서 3시간 교반함으로써 평균 입자지름 381㎚의 백금-수지 복합체 입자 D-1을 얻었다. D-1을 원심분리에 의해 농축한 후, 투석처리에 의해 정제하고, 농도를 조정하여 1wt%의 백금-수지 복합체 입자 분산액 E-1을 얻었다. E-1 중의 백금-수지 복합체 입자 F-1의 흡광도는 1.79이었다. 또한, F-1에 있어서의 백금입자의 평균 입자지름은 4.5㎚, 백금의 담지량은 36.7wt%이었다. F-1의 제타전위 측정의 결과를 표 1에 나타낸다.
이 수지-백금 복합체 F-1에 있어서, 백금입자는 수지입자에 완전하게 내포된 내포 백금입자와, 수지입자 내에 매포된 부위 및 수지입자 밖으로 노출된 부위를 갖는 일부 노출 백금입자와, 수지입자의 표면에 흡착되어 있는 표면 흡착 백금입자를 포함하고 있고, 적어도 일부의 백금입자가 수지입자의 표층부에 있어서 3차원적으로 분포되어 있었다. 또, 백금입자는 수지입자의 표면으로부터 깊이 방향으로 입자반경의 40%의 범위에는 97% 존재했다.
[실시예 2]
<백금-수지 복합체 입자의 합성>
B-1 대신에 B-2를 사용하는 것 이외에는 실시예 1과 마찬가지로 해서, 5wt%의 백금이온 흡착 수지입자 분산액 C-2, 백금-수지 복합체 입자 D-2, 1wt%의 백금-수지 복합체 입자 분산액 E-2 및 백금-수지 복합체 입자 F-2를 제작했다.
D-2의 평균 입자지름은 461㎚이며, F-2의 흡광도는 1.77이었다. 또한, F-2에 있어서의 백금입자의 평균 입자지름은 5.0㎚, 백금의 담지량은 37.6wt%이었다. F-2의 제타전위 측정의 결과를 표 1에 나타낸다.
이 수지-백금 복합체 F-2에 있어서, 백금입자는 수지입자에 완전하게 내포된 내포 백금입자와, 수지입자 내에 매포된 부위 및 수지입자 밖으로 노출된 부위를 갖는 일부 노출 백금입자와, 수지입자의 표면에 흡착되어 있는 표면 흡착 백금입자를 포함하고 있고, 적어도 일부의 백금입자가 수지입자의 표층부에 있어서 3차원적으로 분포되어 있었다.
[실시예 3]
<백금-수지 복합체 입자의 합성>
B-1 대신에 B-3을 사용하는 것 이외에는 실시예 1과 마찬가지로 해서, 5wt%의 백금이온 흡착 수지입자 분산액 C-3, 백금-수지 복합체 입자 D-3, 1wt%의 백금-수지 복합체 입자 분산액 E-3 및 백금-수지 복합체 입자 F-3을 제작했다.
D-3의 평균 입자지름은 454㎚이며, F-3의 흡광도는 1.45이었다. 또한, F-3에 있어서의 백금입자의 평균 입자지름은 3.8㎚, 백금의 담지량은 37.7wt%이었다. F-3의 제타전위 측정의 결과를 표 1에 나타낸다.
이 수지-백금 복합체 F-3에 있어서, 백금입자는 수지입자에 완전하게 내포된 내포 백금입자와, 수지입자 내에 매포된 부위 및 수지입자 밖으로 노출된 부위를 갖는 일부 노출 백금입자와, 수지입자의 표면에 흡착되어 있는 표면 흡착 백금입자를 포함하고 있고, 적어도 일부의 백금입자가 수지입자의 표층부에 있어서 3차원적으로 분포되어 있었다.
[실시예 4]
<금-수지 복합체 입자의 합성>
B-4(91.5g)에 순수 255g을 첨가한 후, 400mM 염화금산 수용액(147g)을 첨가하여 실온에서 3시간 교반했다. 이 혼합액을 원심분리(3000rpm, 30분)에 의해 A-4를 침전시켜 상청을 제거함으로써 여분의 염화금산을 제거했다. 그 후, 농도를 조정하여 2.5wt%의 금이온 흡착 수지입자 분산액 C-4를 얻었다.
이어서, 순수 1580g에 C-4(43.3g)를 첨가하고, 3℃에서 교반하면서 528mM의 디메틸아민보란 수용액(10.0g)을 2분 걸쳐서 적하한 후, 3℃에서 1시간, 실온에서 3시간 교반함으로써 평균 입자지름 322㎚의 금-수지 복합체 입자 D-4를 얻었다. D-4를 원심분리에 의해 농축한 후, 투석처리에 의해 정제하고, 농도를 조정하여 1wt%의 금-수지 복합체 입자 분산액 E-4를 얻었다. E-4 중의 금-수지 복합체 입자 F-4의 흡광도는 1.27이었다. 또한, F-4에 있어서의 금입자의 평균 입자지름은 30㎚, 금의 담지량은 53.8wt%이었다. F-4의 제타전위 측정의 결과를 표 1에 나타낸다.
이 수지-금 복합체 F-4에 있어서, 금입자는 수지입자에 완전하게 내포된 내포 금입자와, 수지입자 내에 매포된 부위 및 수지입자 밖으로 노출된 부위를 갖는 일부 노출 금입자와, 수지입자의 표면에 흡착되어 있는 표면 흡착 금입자를 포함하고 있고, 적어도 일부의 금입자가 수지입자의 표층부에 있어서 3차원적으로 분포되어 있었다. 또, 금입자는 수지입자의 표면으로부터 깊이 방향으로 입자반경의 40%의 범위에는 97% 존재했다.
[실시예 5]
<금-수지 복합체 입자의 합성>
B-4 대신에 B-2을 사용하는 것 이외에는 실시예 4와 마찬가지로 해서, 2.5wt%의 금이온 흡착 수지입자 분산액 C-5, 금-수지 복합체 입자 D-5, 1wt%의 금-수지 복합체 입자 분산액 E-5 및 금-수지 복합체 입자 F-5를 제작했다.
이 수지-금 복합체 F-5에 있어서, 금입자는 수지입자에 완전하게 내포된 내포 금입자와, 수지입자 내에 매포된 부위 및 수지입자 밖으로 노출된 부위를 갖는 일부 노출 금입자와, 수지입자의 표면에 흡착되어 있는 표면 흡착 금입자를 포함하고 있고, 적어도 일부의 금입자가 수지입자의 표층부에 있어서 3차원적으로 분포되어 있었다.
<메르캅토프로피온산 처리>
E-5(0.1g)와 10mM의 메르캅토프로피온산 수용액(1.0g)을 혼합하고, 23℃에서 1시간 교반했다. 원심분리(12000rpm, 5분)에 의해 금-수지 복합체 입자 F-5를 침전시켜 상청을 제거한 후, 순수(1.0g)를 첨가해서 재분산함으로써 여분의 메르캅토프로피온산을 제거함으로써, 메르캅토프로피온산 처리한 금-수지 복합체 입자 G-5를 제작했다.
G-5의 평균 입자지름은 455㎚이며, G-5의 흡광도는 1.36이었다. 또한, G-5에 있어서의 금입자의 평균 입자지름은 20㎚, 금의 담지량은 48.3wt%이었다. G-5의 제타전위 측정의 결과를 표 1에 나타낸다.
[실시예 6]
<메르캅토프로피온산 처리>
E-5 대신에 E-2를 사용하는 것 이외에는 실시예 5과 마찬가지로 해서, 메르캅토프로피온산 처리한 백금-수지 복합체 입자 G-6을 제작했다. G-6의 제타전위 측정의 결과를 표 1에 나타낸다.
[실시예 7]
<폴리글루타민산 처리>
E-5(0.1g)와 0.5wt%의 폴리글루타민산 수용액(1.0g)을 혼합하고, 23℃에서 1시간 교반했다. 원심분리(12000rpm, 5분)에 의해 금-수지 복합체 입자 D-5를 침전시켜 상청을 제거한 후, 순수(1.0g)를 첨가함으로써 여분의 폴리글루타민산을 제거함으로써, 폴리글루타민산 처리한 금-수지 복합체 입자 G-7을 제작했다. G-7의 제타전위 측정의 결과를 표 1에 나타낸다.
[실시예 8]
<폴리글루타민산 처리>
E-5 대신에 E-2를 사용하는 것 이외에는 실시예 7과 마찬가지로 해서, 폴리글루타민산 처리한 백금-수지 복합체 입자 G-8을 제작했다. G-8의 제타전위 측정의 결과를 표 1에 나타낸다.
[비교예 1]
<금-수지 복합체 입자의 합성>
B-4 대신에 B-1을 사용하는 것 이외에는 실시예 4와 마찬가지로 해서, 2.5wt%의 금이온 흡착 수지입자 분산액 C-9, 금-수지 복합체 입자 D-9, 1wt%의 금-수지 복합체 입자 분산액 E-9 및 금-수지 복합체 입자 F-9를 제작했다.
D-9의 평균 입자지름 380㎚이며, F-9의 흡광도는 1.46이었다. 또한, F-9에 있어서의 금입자의 평균 입자지름은 22㎚, 금의 담지량은 53.7wt%이었다. F-9의 제타전위 측정의 결과를 표 1에 나타낸다.
이 수지-금 복합체 F-9에 있어서, 금입자는 수지입자에 완전하게 내포된 내포 금입자와, 수지입자 내에 매포된 부위 및 수지입자 밖으로 노출된 부위를 갖는 일부 노출 금입자와, 수지입자의 표면에 흡착되어 있는 표면 흡착 금입자를 포함하고 있고, 적어도 일부의 금입자가 수지입자의 표층부에 있어서 3차원적으로 분포되어 있었다.
[비교예 2]
<금-수지 복합체 입자의 합성>
B-4 대신에 B-2를 사용하는 것 이외에는 실시예 4와 마찬가지로 해서, 2.5wt%의 금이온 흡착 수지입자 분산액 C-10, 금-수지 복합체 입자 D-10, 1wt%의 금-수지 복합체 입자 분산액 E-10 및 금-수지 복합체 입자 F-10을 제작했다.
D-10의 평균 입자지름은 455㎚이며, F-10의 흡광도는 1.36이었다. 또한, F-10에 있어서의 금입자의 평균 입자지름은 20㎚, 금의 담지량은 48.3wt%이었다. F-10의 제타전위 측정의 결과를 표 1에 나타낸다.
이 수지-금 복합체 F-10에 있어서, 금입자는 수지입자에 완전하게 내포된 내포 금입자와, 수지입자 내에 매포된 부위 및 수지입자 밖으로 노출된 부위를 갖는 일부 노출 금입자와, 수지입자의 표면에 흡착되어 있는 표면 흡착 금입자를 포함하고 있고, 적어도 일부의 금입자가 수지입자의 표층부에 있어서 3차원적으로 분포되어 있었다.
[비교예 3]
<금-수지 복합체 입자의 합성>
B-4 대신에 B-3을 사용하는 것 이외에는 실시예 4와 마찬가지로 해서, 2.5wt%의 금이온 흡착 수지입자 분산액 C-11, 금-수지 복합체 입자 D-11, 1wt%의 금-수지 복합체 입자 분산액 E-11 및 금-수지 복합체 입자 F-11을 제작했다.
D-11의 평균 입자지름은 442㎚이며, F-11의 흡광도는 1.26이었다. 또한, F-11에 있어서의 금입자의 평균 입자지름은 16.1㎚, 금의 담지량은 53.9wt%이었다. F-11의 제타전위 측정의 결과를 표 1에 나타낸다.
이 수지-금 복합체 F-11에 있어서, 금입자는 수지입자에 완전하게 내포된 내포 금입자와, 수지입자 내에 매포된 부위 및 수지입자 밖으로 노출한 부위를 갖는 일부 노출 금입자와, 수지입자의 표면에 흡착되어 있는 표면 흡착 금입자를 포함하고 있고, 적어도 일부의 금입자가 수지입자의 표층부에 있어서 3차원적으로 분포되어 있었다.
[비교예 4]
금 콜로이드(다나카 키킨조쿠 고교사제 Au 콜로이드 용액-SC 평균 입자지름50㎚)의 제타전위 측정의 결과를 표 1에 나타낸다.
[비교예 5]
착색 라텍스 비즈(메르크 밀리포아사제 카르복실기 수식-착색 Estapor, K1-030 Red)의 제타전위 측정의 결과를 표 1에 나타낸다.
[시험예 1-1]
<카제인 흡착처리>
5mM의 Tris(트리스히드록시메틸아미노메탄) 수용액(0.9ml)과 카제인(25μg)의 혼합 용액에, 1mg의 F-1을 포함하는 분산액(0.1ml)을 첨가하고, 23℃에서 3시간 전도교반했다. 그 후, 원심분리(12000rpm, 4℃, 5min)하여 상청액 H-1을 채취했다.
<카제인 흡착량의 측정>
분광광도계를 이용하여 H-1의 파장 280㎚에 있어서의 흡광도를 측정하고, 하기의 블랭크 샘플 및 표준 샘플에 의한 일점 검량법에 의해 H-1 중의 카제인 함유량을 구했다. F-1로의 카제인 흡착량은 하기의 식으로부터 산출했다. 산출한 결과를 표 2에 나타낸다.
·블랭크 샘플:
5mM의 Tris 수용액(0.9ml) 및 순수(0.1ml)의 혼합 용액
·표준 샘플:
5mM의 Tris 수용액(0.9ml), 카제인(25μg) 및 순수(0.1ml)의 혼합 용액
·(금속-수지 복합체 입자에의 카제인 흡착량)=
(카제인 흡착처리에 사용한 카제인량)- (상청액 중의 카제인 함유량)
[시험예 1-2∼1-12]
F-1 대신에 F-2, F-3, F-4, G-5, G-6, G-7, G-8, F-9, F-10, F-11 및 착색 라텍스 비즈를, 각각 사용한 것 이외는 시험예 1-1과 같은 방법으로, F-2, F-3, F-4, G-5, G-6, G-7, G-8, F-9, F-10, F-11 및 착색 라텍스 비즈로의 카제인 흡착량을 산출했다. 산출한 결과를 표 2에 나타낸다. 또, 금 콜로이드는 1mg/0.1mL 수분산액을 제작할 때에 금 나노입자가 응집해 재분산이 곤란했기 때문에, 카제인 흡착처리를 행할 수 없었다.
[시험예 2-1]
<유청 훼이 흡착처리 및 유청 훼이 흡착량의 측정>
카제인 대신에 유청 훼이를 사용한 것 이외에는 시험예 1-1과 같은 방법으로, F-1로의 훼이 흡착처리를 행하여 흡착량을 측정했다. F-1로의 유청 훼이 흡착량은 하기의 식으로부터 산출했다. 산출한 결과를 표 3에 나타낸다.
·블랭크 샘플:
5mM Tris 수용액(0.9ml) 및 순수(0.1ml)의 혼합 용액
·표준 샘플:
5mM의 Tris 수용액(0.9ml), 유청 훼이(25μg) 및 순수(0.1ml)의 혼합
용액
·(금속-수지 복합체 입자로의 유청 훼이 흡착량)=
(유청 훼이 흡착처리에 사용한 유청 훼이량)-(상청액 중의 유청 훼이 함유량)
[시험예 2-2∼2-12]
F-1 대신에 F-2, F-3, F-4, G-5, G-6, G-7, G-8, F-9, F-10, F-11 및 착색 라텍스 비즈를, 각각 사용한 것 이외에는 시험예 2-1과 같은 방법으로, F-2, F-3, F-4, G-5, G-6, G-7, G-8, F-9, F-10, F-11 및 착색 라텍스 비즈로의 유청 훼이 흡착량을 산출했다. 산출한 결과를 표 3에 나타낸다. 또, 금 콜로이드는 1mg/0.1mL 수분산액을 제작할 때에 금 나노입자가 응집해 재분산이 곤란했기 때문에 유청 훼이 흡착처리를 행할 수 없었다.
[시험예 3]
(결합 공정)
항인풀루엔자 A형 모노클로날 항체 100μg과 100mM 붕산 수용액(pH8.5) 0.9mL를 혼합한 후, 실시예 1의 1wt%의 백금-수지 복합체 입자 분산액 E-1을 0.1mL 첨가하고, 실온에서 3시간 걸쳐서 전도교반을 행하여, 백금-수지 복합체 입자 F-1로 표식한 항인풀루엔자 A형 모노클로날 항체를 포함하는 표식항체 분산액 J-1을 얻었다.
(블록 공정)
이어서, 표식항체 분산액 J-1을 빙냉 후, 12000rpm으로 5분간 걸쳐서 원심분리를 행하여 상청을 제거한 후, 고형분 잔사에 1wt% 소혈청 알부민을 포함하는 5mM의 Tris 수용액(pH8.5) 1mL을 첨가하고, 10∼20초간 걸쳐서 초음파 분산처리를 행하고, 또한, 실온에서 2시간 걸쳐서 전도교반을 행하여 표식항체 분산액 K-1을 얻었다.
(세정 처리)
이어서, 표식항체 분산액 K-1을 빙냉 후, 12000rpm으로 5분간 걸쳐서 원심분리를 행하여 상청을 제거한 후, 고형분 잔사에 0.1wt% 미만의 계면활성제와 소혈청 알부민을 포함하는 5mM의 Tris 수용액(pH8.5) 1mL을 첨가하고, 10∼20초간 걸쳐서 초음파 분산처리를 행하였다. 이 조작을 3회 반복하고, 세정 처리로 했다.
(보존 처리)
이어서, 빙냉 후 12000rpm으로 5분간 걸쳐서 원심분리를 행하여 상청을 제거한 후, 고형분 잔사에 0.1wt% 미만의 계면활성제와 소혈청 알부민 및, 10wt%의 수크로오스를 포함하는 5mM의 Tris 수용액(pH8.5) 1mL을 첨가하고, 10∼20초간 걸쳐서 초음파 분산처리를 행함으로써 표식항체 분산액 L-1을 얻었다.
(면역크로마토그레피법에 의한 평가)
96웰 플레이트의 1행분의 12웰에, 표식항체 분산액 L-1을 3μl씩 넣고, 인풀루엔자 A형 양성 컨트롤(APC)의 2배 희석열(우로부터 ×1, ×2, ×4, ×8, ×16, ×32, ×64, ×128, ×256, ×512, ×1024) 및 음성 컨트롤을, 각각 100μl 혼화했다. 여기에서, 인풀루엔자 A형 양성 컨트롤(APC)은 인풀루엔자 A형 바이러스 부활화 항원(아드텍 가부시키가이샤제)을, 검체 처리액(아드텍 가부시키가이샤제)을 이용하여 100배 희석해서 APC×1을 조제했다. APC×1의 항원농도는 5000FFU/ml에 상당한다. 음성 컨트롤은 검체 처리액(아드텍 가부시키가이샤제)이다.
이어서, 인풀루엔자 A형 평가용 흑백 스크린(아드텍 가부시키가이샤제)의 1행 12구멍의 샘플 주입구에, 이 혼화한 분산액을 50μl 첨가하고, 5분 후, 10분 후, 15분 후의 테스트 라인 발색 레벨을 평가했다. 15분 후의 발색 레벨이 0.5 이상인 것을 「양호」로 판정했다. 발색 레벨은 금 콜로이드 판정용 색견본(아드텍 가부시키가이샤제)을 이용하여 판정했다.
표식항체 분산액 L-1의 면역크로마토그래피 평가 결과를 표 4에 나타냈다.
상기 표 4로부터, 표식항체 분산액 L-1은, 128배 희석의 항원에 대하여 15분 후의 발색 레벨이 0.5 이상으로 되고, 양호한 발색을 나타내는 것이 확인되었다.
[시험예 4] 착색 라텍스의 면역크로마토그래피 평가
시험예 3의 결합 공정에 있어서, 실시예 1의 1wt%의 백금-수지 복합체 입자 분산액 E-1을 사용하는 대신에, 비교예 5의 1wt% 착색 라텍스 비즈를 사용하는 것 이외에는 시험예 3과 마찬가지로 해서, 표식항체 분산액 J-2, K-2, L-2를 얻었다.
시험예 3의 면역크로마토그레피법에 의한 평가에 있어서, 표식항체 분산액 L-1을 사용하는 대신에 표식항체 분산액 L-2를 사용하는 것 이외에는 시험예 3과 마찬가지로 해서, 면역크로마토그래피 평가를 행한 결과를 표 5에 나타냈다.
상기 표 5로부터, 시판의 착색 라텍스 비즈에 의한 표식항체 분산액 L-2는 1배 희석의 항원에 대하여 15분 후의 발색 레벨이 0.5 미만으로 되고, 양호한 발색을 나타내지 않는 것이 확인되었다.
이상, 본 발명의 실시형태를 예시의 목적으로 상세하게 설명했지만, 본 발명은 상기 실시형태에 제약되는 것은 아니다.
본 출원은, 2016년 12월 28일에 출원된 일본국 특허출원 2016-256913호에 근거하는 우선권을 주장하는 것이며, 상기 출원의 전내용을 여기에 원용한다.
10…수지입자, 20…금속입자, 30…내포입자, 40…일부 노출 입자, 50…표면 흡착 입자, 60…표층부, 100…금속-수지 복합체, 110…멤브레인, 120…시료 첨가부, 130…판정부, 131…포착 리간드, 140…흡액부, 150…표식항체, 160…피분석물, 170…복합체, 200…테스트 스트립
Claims (14)
- 수지입자와,
상기 수지입자에 고정화된 복수의 금속입자를 갖는 금속-수지 복합체로서,
pH3∼pH10의 범위에 있어서 제타전위의 최대값이 5mV 이상이며, 또한, 최소값이 -5mV 이하인 것을 특징으로 하는 금속-수지 복합체. - 제 1 항에 있어서,
pH3∼pH10의 범위에 있어서 상기 제타전위의 최대값과 최소값의 차가 20mV 이상인 금속-수지 복합체. - 제 1 항에 있어서,
상기 제타전위의 제로 전하점이 pH3.5∼pH9.0의 범위에 존재하는 금속-수지 복합체. - 제 1 항에 있어서,
상기 금속입자의 평균 입자지름이 1㎚∼100㎚의 범위 내인 금속-수지 복합체. - 제 1 항에 있어서,
상기 금속-수지 복합체의 평균 입자지름이 30㎚∼1000㎚의 범위 내인 금속-수지 복합체. - 제 1 항에 있어서,
상기 수지입자가 금속이온을 흡착하는 것이 가능한 치환기를 구조에 갖는 폴리머 입자인 금속-수지 복합체. - 제 1 항에 있어서,
상기 금속입자가 금, 백금, 팔라듐, 은, 니켈, 구리, 또는 이것들의 합금의 입자인 금속-수지 복합체. - 제 1 항에 기재된 금속-수지 복합체를 구비한 표식물질.
- 제 8 항에 있어서,
상기 금속-수지 복합체의 표면에 항원 또는 항체를 흡착시켜서 사용하는 것인 표식물질. - 제 8 항에 기재된 표식물질을 사용하는 면역학적 측정법.
- 제 8 항에 기재된 표식물질을 구비한 면역학적 측정용 시약.
- 시료 중에 포함되는 피분석물을 검출 또는 정량하는 피분석물의 측정 방법으로서,
멤브레인, 및 상기 멤브레인에 상기 피분석물과 특이적으로 결합하는 포착 리간드가 고정되어서 이루어지는 판정부를 포함하는 측방유동형 크로마토그래피용 테스트 스트립을 사용하고, 하기 공정 (I)∼(III);
공정 (I): 시료에 포함되는 상기 피분석물과, 상기 피분석물에 특이적으로 결합하는 항체를 금속-수지 복합체로 표식한 표식항체를 접촉시키는 공정,
공정 (II): 상기 판정부에서, 공정 (I)에 있어서 형성된 피분석물과 표식항체를 포함하는 복합체를, 포착 리간드에 접촉시키는 공정,
공정 (III): 상기 금속-수지 복합체의 국재형 표면 플라즈몬 공명 및/또는 전자전이에 의한 광에너지 흡수에 유래하는 발색강도를 측정하는 공정을 포함하고,
상기 금속-수지 복합체가 수지입자와 상기 수지입자에 고정화된 복수의 금속입자를 가짐과 아울러, pH3∼pH10의 범위에 있어서 상기 금속-수지 복합체의 제타전위의 최대값이 5mV 이상이며, 또한, 최소값이 -5mV 이하인 것을 특징으로 하는 피분석물의 측정 방법. - 시료 중에 포함되는 피분석물을 검출 또는 정량하기 위한 피분석물 측정용 키트로서,
멤브레인, 및 상기 멤브레인에 상기 피분석물과 특이적으로 결합하는 포착 리간드가 고정되어서 이루어지는 판정부를 포함하는 측방유동형 크로마토그래피용 테스트 스트립과,
상기 피분석물에 특이적으로 결합하는 항체를, 금속-수지 복합체로 표식한 표식항체를 포함하는 검출 시약을 포함하고,
상기 금속-수지 복합체가, 수지입자에 복수의 금속입자가 고정화된 구조를 가짐과 아울러, pH3∼pH10의 범위에 있어서 제타전위의 최대값이 5mV 이상이며, 또한, 최소값이 -5mV 이하인 것을 특징으로 하는 피분석물을 검출 또는 정량하기 위한 피분석물 측정용 키트. - 시료 중에 포함되는 피분석물을 검출 또는 정량하기 위한 측방유동형 크로마토그래피용 테스트 스트립으로서,
멤브레인과,
상기 멤브레인에, 상기 시료가 전개하는 방향에 있어서 상기 피분석물과 특이적으로 결합하는 포착 리간드가 고정되어서 이루어지는 판정부와,
상기 판정부보다 상류측에, 상기 피분석물에 특이적으로 결합하는 항체를 금속-수지 복합체로 표식한 표식항체가 포함되는 반응부를 포함하고,
상기 금속-수지 복합체가, 수지입자에 복수의 금속입자가 고정화된 구조를 가짐과 아울러, pH3∼pH10의 범위에 있어서 제타전위의 최대값이 5mV 이상이며, 또한, 최소값이 -5mV 이하인 것을 특징으로 하는 측방유동형 크로마토그래피용 테스트 스트립.
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