CN112601949A - 使用载体粒子增强表面等离子体共振的免疫层析法 - Google Patents
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Abstract
提供增强表面等离子体共振的免疫层析法,不需要复杂的制作工序、检查工艺。形成将发生表面等离子体共振的共振粒子经由被检测物质聚集在其它的保持粒子上的复合体,并在免疫层析法用试验片上捕捉该复合体进行检测,从而检测出被检测物质的免疫层析法。在该方法中,与仅使用发生表面等离子体共振的粒子的情况相比,提高灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及免疫层析法,该免疫层析法利用毛细现象展开包含被检测物质的溶液,捕捉标记的被检测物质进行检测。
背景技术
免疫层析法通常为利用了三明治免疫分析法的方法,该三明治免疫分析法使用由检测区域中的捕捉抗体和胶体粒子等粒子标记的检测抗体。免疫层析法由以下的流程来进行。使包含被检测物质的液体样品在免疫层析法用试验片上展开移动时,形成标记的检测抗体:被检测物质(“:”表示结合)的复合体。包含该复合体的液体试样由于毛细现象而向下游展开移动。复合体由在免疫层析法用试验片上的检测部位上固相化而成的捕捉抗体捕捉。最后,在检测部位形成被标记的检测抗体:被检测物质:捕捉抗体(“:”表示结合)的复合体,以基于标记物质的线形成等为指标来检测被检测物质。
标记物质作为可以用肉眼识别的物质,可使用发生表面等离子体共振的金属胶体(例如金胶体)、着色的纳米粒子(例如胶乳粒子)等。这些胶体粒子等在观测时不需要特别的装置,但当试样溶液中的被检测物质浓度低时信号强度变小,有时达不到可以用肉眼识别的水平。
银增感法(参照专利文献1)等二次增感法的灵敏度高,但很多时候会增加操作步骤、或者在观测时需要专用的设备等。
除此之外,报告有胶体粒子的着色的色彩强度的高度化(参照专利文献2)、金属胶体的复合粒子化(参照专利文献3及4)、基于核壳结构的高灵敏度化(参照专利文献5及6),但未结合的粒子残存于流路上的情况等,使背景也容易变高,并且制作粒子需要特别的材料、工序。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2008-286590号公报
专利文献2:国际公开第WO2011/062157号
专利文献3:日本特开2017-40631号公报
专利文献4:日本特开2005-233744号公报
专利文献5:日本特开2009-281760号公报
专利文献6:日本特开2018-36176号公报
发明内容
发明要解决的问题
本发明的课题是在免疫层析法中使用能够由现有的工序制作的载体粒子并易于检测,且不使背景变高而达到被检测物质检测的高灵敏度化。
用于解决问题的方案
由表面等离子体共振引起的特定波长附近的光吸收是由于共振粒子表面电子的集体振动所造成的。
本发明人等认为,在免疫层析法中,用于标记的共振粒子集中于局部时,特定波长附近的光吸收增加而使信号增感,并对信号增感方法进行了深入研究。本发明人等发现通过使用以根据现有的方法制作的金胶体粒子为共振粒子并以胶乳粒子为保持粒子这两种粒子,使金胶体粒子与保持粒子结合、聚集,从而发现以简易的工艺实现信号增感,于是完成了本发明。
即,本发明如下所述。
[1]一种免疫层析法,是使用固定化有与检查体试样中的被检测物质结合的亲和性物质被的共振粒子和保持粒子的免疫层析分析法,其中,该共振粒子发生表面等离子体共振,该保持粒子的尺寸大于共振粒子且不发生表面等离子体共振,通过形成由与被检测物质结合的亲和性物质结合保持粒子:被检测物质:与被检测物质结合的亲和性物质结合共振粒子(“:”表示结合)表示的复合体,从而使共振粒子聚集在保持粒子上,在将与被检测物质结合的亲和性物质作为捕捉物质加以固定化的免疫层析法用试验片上的检测部位捕捉该复合体,并通过检测来自共振粒子和保持粒子的信号来检测被检测物质。
[2]根据[1]的免疫层析法,其中,共振粒子为金胶体粒子。
[3]根据[1]或[2]的免疫层析法,其中,保持粒子为胶乳粒子。
[4]根据[1]~[3]中任一项的免疫层析法,其中,使用预先在表面结合有共振粒子的保持粒子。
[5]根据[1]~[3]中任一项的免疫层析法,其中,使用预先内含共振粒子的保持粒子。
[6]根据[1]~[5]中任一项的免疫层析法,其中,与共振粒子结合的亲和性物质以及与保持粒子结合的亲和性物质结合在被检测物质的不同部位。
[7]根据[1]~[6]中任一项的免疫层析法,其中,共振粒子数为保持粒子数的12倍以上。
[8]根据[7]的免疫层析法,其中,共振粒子数为保持粒子数的X倍以上[在设为保持粒径=R、共振粒径=r时,X由(3(R+r)2)/r2表示,其中,粒径设为分别在所有方向测定时的中值]。
[9]根据[1]~[8]中任一项的免疫层析法,其中,先将保持粒子和被检测物质添加至免疫层析法用试验片,其后添加共振粒子。
[10]根据[1]~[8]中任一项的免疫层析法,其中,将共振粒子和保持粒子与被检测物质混合,添加至免疫层析法用试验片。
[11]根据[1]~[8]中任一项的免疫层析法,其中,在免疫层析用法试验片的标记部位含有共振粒子和保持粒子。
[12]根据[1]~[11]中任一项的免疫层析法,其中,保持粒子用色素着色或标记。
[13]根据[12]的免疫层析法,其中,保持粒子的色素颜色与共振粒子的颜色(非吸收峰)为同系色。
[14]根据[1]~[11]中任一项的免疫层析法,其中,保持粒子在粒子内包含荧光色素。
[15]根据[1]~[11]中任一项的免疫层析法,其中,在保持粒子表面结合有荧光色素。
[16]根据[1]~[15]中任一项的免疫层析法,其中,被检测物质为存在于活体的抗原或抗体。
[17]根据[1]~[15]中任一项的免疫层析法,其中,被检测物质为病原性微生物及病原性微生物的一部分。
[18]一种免疫层析法用试剂盒,其中,包含:结合有相对于被检测物质的亲和性物质的保持粒子、以及结合有相对于被检测物质的亲和性物质的共振粒子。
[19]根据[18]的免疫层析法用试剂盒,其中,共振粒子为金胶体粒子。
[20]根据[18]或[19]的免疫层析法用试剂盒,其中,保持粒子为胶乳粒子。
[21]根据[18]~[20]中任一项的免疫层析法用试剂盒,其中,使用预先在表面结合有共振粒子的保持粒子。
[22]根据[18]~[20]中任一项的免疫层析法用试剂盒,其中,使用预先内含共振粒子的保持粒子。
[23]根据[18]~[22]中任一项的免疫层析法用试剂盒,其中,与共振粒子结合的亲和性物质以及与保持粒子结合的亲和性物质结合在被检测物质的不同部位。
[24]根据[18]~[23]中任一项的免疫层析法用试剂盒,其中,共振粒子数为保持粒子数的12倍以上。
[25]根据[24]的免疫层析法用试剂盒,其中,共振粒子数为保持粒子数的X倍以上[在设为保持粒径=R、共振粒径=r时,X由(3(R+r)2)/r2表示,其中,粒径设为分别在所有方向测定时的中值]。
[26]根据[18]~[25]中任一项的免疫层析法用试剂盒,其中,在免疫层析用法试验片的标记部位含有共振粒子和保持粒子。
[27]一种免疫层析法用的试验片,其中,在标记部位包含结合有相对于被检测物质的亲和性物质的保持粒子以及结合有相对于被检测物质的亲和性物质的共振粒子。
[28]根据[27]的免疫层析法用的试验片,其中,共振粒子为金胶体粒子。
[29]根据[27]或[28]的免疫层析法用的试验片,其中,保持粒子为胶乳粒子。
[30]根据[27]~[29]中任一项的免疫层析法用的试验片,其中,使用预先在表面结合有共振粒子的保持粒子。
[31]根据[27]~[29]中任一项的免疫层析法用的试验片,使用预先内含共振粒子的保持粒子。
[32]根据[27]~[31]中任一项的免疫层析法用的试验片,其中,与共振粒子结合的亲和性物质以及与保持粒子结合的亲和性物质结合在被检测物质的不同部位。
[33]根据[27]~[32]中任一项的免疫层析法用的试验片,其中,共振粒子数为保持粒子数的12倍以上。
[34]根据[33]的免疫层析法用的试验片,其中,共振粒子数为保持粒子数的X倍以上[在设为保持粒径=R、共振粒径=r时,X由(3(R+r)2)/r2表示,其中,粒径设为分别在所有方向测定时的中值]。
本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请编号2018-154995号的公开内容。
发明的效果
本发明针对免疫层析法的被检测物质的检测,实现信号/噪声比的上升与高灵敏度化。此时,不需要超过现有的技术的材料制作工序、复杂的检查操作技术。并且,仅在被检测物质的存在时发生该现象,因此,根据本发明的机理,背景不会增感。在本发明的方法中,通过金胶体粒子等共振粒子(或其一部分)在有限数量的胶乳粒子等保持粒子表面被捕捉而聚集,从而与仅共振粒子在免疫层析法用试验片上的捕捉物质(与被检测物质具有亲和性的物质,例如抗体或抗原等)所存在的检测部位的广泛范围中以聚集度低的状态结合的情况相比,实现更高的灵敏度。
附图说明
图1是示出在检测部位的复合体形成模型(1)的示意图的图。
图2是示出在检测部位的复合体形成模型(2)的示意图的图。
图3是示出保持粒子数/共振粒子数的比与信号峰面积的关系的图。
图4是保持粒子与共振粒子经由被检测物质结合的图。
图5是示出通过共振粒子经由被检测物质而与保持粒子结合来检测信号变高的图。
具体实施方式
下面,详细地说明本发明。
本发明为所使用的标记粒子具有特征的免疫层析法。
在包含侧流免疫层析法的免疫层析法中,使用将特异性识别并结合被检测物质的亲和性物质固相化的试验片、以及特异性识别被检测物质的亲和性物质结合的不溶性载体粒子。即,由不溶性载体粒子来标记亲和性物质加以使用。该不溶性载体粒子与被检测物质结合,在具备多孔质结构的试验片中因毛细现象而展开移动,与在试验片中的检测部位固相化的与被检测物质特异性地结合的亲和性物质即捕捉物质结合,从而在该检测部位形成捕捉物质:被检测物质:不溶性载体粒子的复合体(“:”表示结合),利用凝集的不溶性载体粒子发生聚集,以在不溶性载体粒子聚集的部位发出的光为检测光通过检测装置或目视进行测定,来检测不溶性载体粒子有无聚集并分析有无被检测物质。
在本说明书中,有时将与被检测物质结合的亲和性物质简称为亲和性物质。
作为用于标记与被检测物质结合的亲和性物质的标记物质,可广泛使用发生表面等离子体共振的金属纳米粒子或使用有着色胶乳粒子等有机材料的纳米粒子。
在本发明中,使用两种不同的粒子作为标记物质的不溶性载体粒子。两种粒子为共振粒子和保持粒子。共振粒子为发生表面等离子体共振的粒子,保持粒子是直径比共振粒子大的粒子,共振粒子与保持粒子表面结合。
1.保持粒子和共振粒子
共振粒子和保持粒子使用在表面固定有与被检测物质结合的亲和性物质的物质。亲和性物质是与被检测物质结合的物质,若被检测物质为抗体,则为该抗体所结合的抗原,若被检测物质为抗原,则为与该抗原结合的抗体。被检测物质和亲和性物质不仅可以是抗原与抗体的组合,例如,被检测物质和亲和性物质也可以是配体与受体、或受体与配体的关系。作为这样的亲和性物质,可以列举出能够与被检测物质结合的多肽或其它化合物。
与被检测物质结合的亲和性物质的在共振粒子或保持粒子表面的固定化方法使用物理结合、电结合、化学结合等即可。例如,可列举出:利用官能团之间的共价键的固定化、基于物理吸附的固定化。在将亲和性物质固定化到共振粒子、保持粒子之后,为了抑制这些粒子与其它物质的非特异结合,可以利用聚乙二醇等高分子聚合物、牛血清白蛋白(BSA)、乳酪蛋白等蛋白质等将粒子表面进行阻隔(blocking)。在本说明书中,有时将结合有与被检测物质结合的亲和性物质的保持粒子、以及结合有与被检测物质结合的亲和性物质的共振粒子分别称为亲和性物质结合保持粒子、以及亲和性物质结合共振粒子。
共振粒子是通过发生表面等离子体共振来吸收特定波长附近的光的粒子即可,可以为任意的粒子。例如可列举金属胶体,无论金属、合金、氧化金属、金属化合物等的种类、形状,只要是金属胶体即可。共振粒子的直径为10~200nm,优选为10~100nm,更优选为10~50nm。此外,也包括用一层二氧化硅等对一个金胶体粒子进行涂布而成的核壳型的物质。共振粒子不必须是单一金属纳米粒子,可以是它们的组合。优选地,基于这些组合的色调对于观察者而言有利、或吸收/不吸收的光的波长对于观察设备有利。
保持粒子的尺寸大于共振粒子,材料、形状等不作限定。保持粒子的直径为数十nm~数百nm,优选为50nm~800nm,更优选为200~600nm。作为保持粒子,例如可列举包含着色胶乳粒子、荧光色素的胶乳粒子等。胶乳粒子是指形成以胶体状分散于水中的乳液的粒子。粒子的材质不作限定,可以使用在试验药等技术领域用于结合抗体、抗原、配体、受体等的蛋白质的固相载体的材料的物质。例如,可列举出:聚苯乙烯、苯乙烯-丙烯酸共聚物等苯乙烯共聚物、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯甲苯等树脂、二氧化硅、纤维素等。其中,优选以苯乙烯为基础的粒子。以苯乙烯为基础的粒子是指以聚苯乙烯、苯乙烯或苯乙烯的衍生物与聚合性不饱和羧酸、聚合性不饱和磺酸等的共聚物制成的粒子。作为苯乙烯的衍生物,可列举出:氯甲基苯乙烯,二乙烯基苯等,作为聚合性不饱和羧酸,可列举出:丙烯酸、甲基丙烯酸等,作为聚合性不饱和磺酸,可列举出:苯乙烯磺酸钠等。在本发明中,将以苯乙烯为基础的胶乳粒子称为聚苯乙烯胶乳粒子。此外,优选呈现与共振粒子同系色的颜色、或通过与共振粒子的相互作用而使荧光强度上升的保持粒子。此外,为了达成这些,可以使用多种材料、形状、尺寸的保持粒子。在基于保持粒子的色素的着色时,通过使用识别为共振粒子的非吸收峰(吸收峰外波长)、或与共振粒子相同色系的色调而会使检测灵敏度上升。保持粒子包含荧光色素时,可以为包含具有与共振粒子的非吸收峰同等程度的激发波长或荧光波长的荧光色素的保持粒子,或者使具有这样的荧光波长的荧光粒子与保持粒子结合。此外,也可以为产生表面增强荧光(也称为SEF:surface enhancedfluorescence表面增强荧光、metal enhanced fluorescence金属增强荧光、或plasmonenhanced fluorescence等离子体增强荧光)的共振粒子、以及包含荧光色素的保持粒子或结合有荧光粒子的保持粒子的组合。保持粒子包含荧光色素时,可以通过荧光检测装置检测荧光。
在本发明的免疫层析法中,最终,共振粒子结合到保持粒子表面。优选地,使共振粒子以覆盖保持粒子表面的整体的方式结合到保持粒子表面。
共振粒子也可以预先与保持粒子表面的一部分结合。共振粒子向保持粒子的结合使用物理结合、电结合、化学结合等即可。例如,可列举出:利用官能团之间的共价键的结合、基于物理吸附的结合。此外,也可以预先在保持粒子的内部包含共振粒子。将在保持粒子的内部包含共振粒子称为使共振粒子内含于保持粒子。在使共振粒子内含于保持粒子时,例如使用核壳粒子作为保持粒子即可。核壳粒子是指在无孔性的芯粒子的表面存在多孔质层作为外壳(壳)的粒子,共振粒子可以存在于多孔质层的孔内。核壳粒子的种类不作限定,例如可以使用市售的核壳粒子。
作为使保持粒子内部或表面含有共振粒子的现有技术,包括:在以二氧化硅、树脂为材料的检测粒子(固定有检测抗体的粒子)的内部含有发生表面等离子体共振的粒子(日本特开2009-281760号公报以及日本特开2018-36176号公报),或者用发生表面等离子体共振的粒子修饰检测粒子表面的技术(日本特开2017-40631号公报、日本特开2005-233744号公报)。根据这些文献的记载,可以制造在内部或表面含有共振粒子的保持粒子。而且,可以经由被检测物质使共振粒子与保持粒子结合。即,通过经由被检测物质使与结合于共振粒子的被检测物质结合的亲和性物质和与结合于保持粒子的被检测物质结合的亲和性物质结合,从而使共振粒子结合在保持粒子表面。此时,形成由亲和性物质结合保持粒子:被检测物质:亲和性物质结合共振粒子(“:”表示结合)表示的复合体。
在免疫层析法中,作为液体的检查体在试验片上边使试剂溶解边流动,并不断展开移动,此时,亲和性物质结合保持粒子与亲和性物质结合共振粒子在试验片上边展开边形成上述的复合体。最终,复合体由在免疫层析法用试验片上的检测部位固定化的与被检测物质结合的亲和性物质捕捉而聚集,在检测部位基于表面等离子体共振的特定波长附近的光吸收,而从共振粒子发出信号并且从保持粒子发出信号,因此能够检测出包含基于表面等离子体共振的信号和来自保持粒子的信号的总计信号。这时,可以使用在内部或表面未含共振粒子的保持粒子,在展开液中使保持粒子与共振粒子结合,还可以使用在内部或表面含有保持粒子的保持粒子,然后在展开液中使共振粒子与保持粒子结合。根据该方法,在保持粒子表面的共振粒子的密度变大,表面等离子体共振增感,与现有技术相比,能够实现信号/噪声比高的高灵敏度化。
与被检测物质结合的亲和性物质除了与共振粒子结合的亲和性物质及与保持粒子结合的亲和性物质以外,在试验片上的检测部位存在至少3个固定化的亲和性物质。这些亲和性物质(组)可以分别为各一种,也可以为多种。此外,各个亲和性物质或亲和性物质组的构成既可以相同,也可以一部分或全部不同。在此,亲和性物质相同或共通是指该亲和性物质与相同的被检测物质的相同部位结合,亲和性物质不同或不共通是指该亲和性物质与相同被检测物质结合但与被检测物质的不同部位结合。亲和性物质组的构成相同是指与各个亲和性物质的量、比例无关,而全部使用共通的亲和性物质。一部分不同的构成是指分别至少逐个地包含不共通的亲和性物质与共通的亲和性物质。全部不同的构成是指不含共通的亲和性物质。例如,亲和性物质为相对于被检测物质的抗体时,与共振粒子结合的亲和性物质以及与保持粒子结合的亲和性物质相同或者共通是指,双方的亲和性物质识别并结合作为抗原的被检测物质的相同的表位。另一方面,双方的亲和性物质不同或者不共通时,双方的亲和性物质识别作为抗原的被检测物质的不同表位。被检测物质为病毒粒子、聚合物等大分子时,在同一被检测物质中存在多个供亲和性物质结合的部位,因此可通过共振粒子上和/或保持粒子上和/或试验片上的检测部位上共通的亲和性物质,在免疫层析法用试验片上的检测部位形成共振粒子与保持粒子的复合体。另一方面,被检测物质为较小的分子时,该复合体难以形成。这是因为,在同一被检测物质中供亲和性物质结合的部位少,各粒子或检测部位上的共通的亲和性物质相互关于与被检测物质的结合发生竞争。因此,共振粒子的亲和性物质、保持粒子的亲和性物质以及免疫层析法用试验片上的检测部位的亲和性物质优选为不同的物质或者全部为不同的构成。
共振粒子数与保持粒子数的比具有优选的范围。在这些粒子为球体的情况下,对保持粒子结合有最大数量的共振粒子的情况、即保持粒子数/共振粒子数比率为最小的情况进行考察。反应时间无限大且共振粒子与保持粒子的尺寸为同等程度,并且与它们相比粒子表面间距离以及被检测物质的尺寸为可以忽略的尺寸时,能够与保持粒子结合的共振粒子数根据三维吻接数是12。因此,为了使表面等离子体共振最大,本发明所实施的保持粒子数/共振粒子数比的最佳值很多时候为1/12以下。在此,三维吻接数是指单元球在三维的单元球的周围以不重叠地彼此接触的方式排列时,最大排列的数量。即,共振粒子数优选为保持粒子数的12倍以上。可认为该倍数根据反应时间、共振粒子/保持粒子粒径比、被检测物质的尺寸、被检测物质浓度等而受到影响。
对根据粒径的一般化的最佳值进行考察。当假定与半径R的球体A接触最大数量的半径r的球体B(R≥r)的状态时,若根据B中心所形成的球表面积和B最大截面积近似地推定B的最大接触粒子数,则将充填率(在三维球中最大为0.75左右,在二维圆中最大0.9左右。本近似法中R比r越大则越接近0.9)设为a时,球体B相对于球体A的最大接触粒子数目X能够通过以下方式进行近似。
X=4a(r+R)2/r2
该近似可用于抗原粒子、共振粒子、保持粒子的彼此间的最大接触粒子数目的计算,虽然根据反应时间、被检测物质浓度而受到影响,但可能对保持粒子数/共振粒子数比的最佳值的推测有用。
设为保持粒径=R、共振粒径=r时,共振粒子数优选为保持粒子数的(4a(R+r)2)/r2倍。设为a=0.75的情况下,共振粒子数优选为保持粒子数的(3(R+r)2)/r2倍。
2.被检测物质和检查体
作为被检测物质,主要可列举出:活体中的标记、病原性微生物。活体中的标记是指用于检测特定的疾病的蛋白质、低分子化合物、脂质、糖等物质。作为检查体,主要使用水相的检查体或检查体的由缓冲液形成的稀释液等。作为检查体,可列举出:血清、血浆、血液、尿、唾液、组织液、体液、咽喉或者鼻腔拭液、咽喉或者鼻腔洗液、鼻腔吸取液等体液等,粪便、粪便悬浊液、培养液等。被检测物质的尺寸不作限定,但明显大于保持粒子时,预测基于本发明的检测灵敏度上升效果变小。此外,保持粒子的尺寸小于共振粒子时,预测基于本发明的检测灵敏度上升效果变小。由此,优选为共振粒子的尺寸<被检测物质的尺寸<保持粒子的尺寸,或者被检测物质的尺寸<共振粒子的尺寸<保持粒子的尺寸。
3.免疫层析法
免疫层析法可以使用公知的免疫层析法用装置通过公知的方法进行。免疫层析法用装置也称为免疫层析法用试验片(试纸),以硝化纤维素、醋酸纤维素、尼龙、聚醚砜、聚乙烯醇、聚酯、玻璃纤维、聚烯烃、纤维素、由它们的混合纤维构成的材质等制成的多孔性的吸水性材质制成,检查体试样液可以利用毛细现象进行移动。膜片的厚度不作特别限定,优选为100~200μm左右。此外,膜片用作长方形的试纸,其大小不作特别限定,通常为短边×长边为3mm~9mm×40mm~60mm左右。免疫层析法用试验片具有:检测部位、试样添加部位、吸收带等,也可以具有标记部位。检测部位固定有亲和性物质,该亲和性物质能够与应检测的被检测物质特异性地结合并捕捉被检测物质。有时也将检测部位称为捕捉部位。在本说明书中,有时将在免疫层析法用试验片的检测部位固定化的亲和性物质称为检测部位固定化亲和性物质。试样添加部位为添加检查体试样液的部位,可以将检查体试样液直接添加到免疫层析法用试验片上,也可以在试验片上设置具有吸水性的材质、例如海绵、玻璃纤维等无纺布等衬垫并添加到该部分。将试样添加部位的衬垫称为样品垫。吸收带也称为吸收垫部位,设置在与本发明的免疫层析法用试验片的试样添加部位不同的一端,添加到试样添加部位之后,通过吸收在试验片上展开移动的试样液体,从而促进试验片上的试样液体的流动。吸收带为了能够吸收大量的液体,可以由吸水性的材质制成,例如使用由纤维素、玻璃纤维等制成的无纺布等。此外,其大小不作特别限定,通常为短边×长边为3mm~15mm×10mm~40mm、厚度0.5mm~3mm左右。标记部位为含有亲和性物质结合保持粒子和/或亲和性物质结合共振粒子的部位。标记部位使用由吸水性的材质例如海绵及玻璃纤维等制成的无纺布等材质,其大小不作特别限定,通常短边×长边为3mm~10mm×3mm~10mm、厚度0.5mm~3mm左右,使亲和性物质结合保持粒子和/或亲和性物质结合共振粒子以干燥状态含有。在使上述的吸水性的材质含有亲和性物质结合保持粒子和/或亲和性物质结合共振粒子来用作标记部位时,可以将该标记部位称为联结垫。亲和性物质结合保持粒子与亲和性物质结合共振粒子可以被相同的标记部位含有,也可以被不同的标记部位含有。
此外,亲和性物质结合保持粒子与亲和性物质结合共振粒子也可以不必需在免疫层析法用试验片上含有。这种情况下,在试验片上不存在标记部位。此外,也可以在试验片上仅含有亲和性物质结合保持粒子和亲和性物质结合共振粒子中的一者。标记部位中,使亲和性物质结合保持粒子和/或亲和性物质结合共振粒子含浸于上述的吸水性材质并进行干燥即可。将检查体试样液在试验片上从试样添加部位流动到吸收带时的试样添加部位侧设为上游,并将吸收带侧设为下游时,标记部位设置在试样添加部位的下游且检测部位的上游即可。免疫层析法用试验片还可以存在对照显示部位。对照显示部位是表示正确地实施试验的部位。例如,对照显示部位存在于检测部位的下游,检查体试样通过检测部位到达对照显示部位时,由于着色等而发出信号。在对照表示部,可以预先将与粒子所结合的被检测物质结合的亲和性物质相结合的物质例如抗体固定化,还可以预先将在检查体试样到达时颜色会发生变化的pH指示剂等试剂固定化。
本发明的免疫层析法通过以下的工序进行被检测物质的检测。
在本发明的免疫层析法中,最终在检测部位形成由如下表示的复合体(在本说明书中,有时称为“在检测部位被捕捉的被检测物质粒子复合体”),检测部位固定化亲和性物质:被检测物质:<亲和性物质结合保持粒子:被检测物质:亲和性物质结合共振粒子>(“:”表示结合。用“<>”括起来的部分是指被检测物质与亲和性物质结合保持粒子、亲和性物质结合共振粒子中的任一者交替地结合,这三种物质以枝状结合的状态。例如,为图1B的保持粒子、共振粒子与被检测物质的复合体的状态。与检测部位固定化亲和性物质结合的被检测物质和由<亲和性物质结合保持粒子:被检测物质:亲和性物质结合共振粒子>表示的被检测物质可以相同也可以不同)。通过在检测部位处的表面等离子体共振,使基于共振粒子的特定波长附近的光吸收增加。由该共振粒子引起的特定波长附近的光吸收在肉眼显色,除此之外表示为(非)吸收峰波长,通过目视或检测装置对其进行测定,从而可以检测被检测物质。此时,在检测部位捕捉的被检测物质粒子复合体的最小单位为在保持粒子表面经由被检测物质所能够结合的最大数目的共振粒子结合后的复合体,因能够得到高信号故优选,需要其经由被检测物质与检测部位固定化亲和性物质结合。
例如,在检测检查体试样中的被检测物质的免疫层析法中,通过在试验片上的试样添加部位添加检查体试样,从而利用毛管现象使亲和性物质结合保持粒子和亲和性物质结合共振粒子与被检测物质一起在试验片上展开移动。此时,(1)使亲和性物质结合保持粒子比亲和性物质结合共振粒子先展开移动,在检测部位形成由检测部位固定化亲和性物质:被检测物质:亲和性物质结合保持粒子(“:”表示结合)表示的复合体,接着,使亲和性物质结合共振粒子展开移动,在检测部位形成被检测物质粒子复合体,检测基于表面等离子体共振的源自共振粒子的信号即可。或者,(2)使亲和性物质结合保持粒子和亲和性物质结合共振粒子同时展开移动,在展开移动中形成由如下表示的复合体,<亲和性物质结合保持粒子:被检测物质:亲和性物质结合共振粒子>(“:”表示结合。用“<>”括起来的部分是指被检测物质与亲和性物质结合保持粒子、亲和性物质结合共振粒子中的任一项交替地结合,这三种物质以枝状结合的状态。例如,为图1B的保持粒子、共振粒子与被检测物质的复合体的状态),并且,最终形成在检测部位捕捉的被检测物质粒子复合体,检测基于表面等离子体共振的源自共振粒子的信号即可。
在(1)的情况下,在免疫层析法用试验片的检测部位,首先,形成由检测部位固定化亲和性物质:亲和性物质结合保持粒子:被检测物质(“:”表示结合)表示的复合体,之后,亲和性物质结合共振粒子结合于该复合体,最终,形成在检测部位捕捉的被检测物质粒子复合体。在(1)的情况下,首先,将亲和性物质结合保持粒子与检查体混合,并将该混合液(第一液体)添加到试验片的添加部位,在免疫层析法用试验片上使其展开移动,之后,将包含亲和性物质结合共振粒子的液体(第二液体)添加到免疫层析法用试验片的添加部位,使其展开移动即可。在图1中示出(1)的模型的复合体形成的示意图。在图1中,使用抗体作为在免疫层析法用试验片的检测部位固定化的亲和性物质、以及与保持粒子和共振粒子结合的亲和性物质。图1的A表示添加第一液体时的反应,在检测部位形成抗体结合保持粒子:被检测物质:检测部位捕捉抗体的复合体(“:”表示结合)。图1的B表示添加包含抗体结合共振粒子的第二液体时的反应,在检测部位形成最终的复合体。在图1中,抗体结合保持粒子、抗体结合共振粒子以及检测部位捕捉抗体的抗体可以相同也可以不同。
在(2)的情况下,混合亲和性物质结合保持粒子、亲和性物质结合共振粒子和包含被检测物质的检查体,将该混合物添加到免疫层析法用试验片的试样添加部位即可。或者,在免疫层析法用试验片上的相同标记部位或不同标记部位含有亲和性物质结合保持粒子及亲和性物质结合共振粒子,利用添加的检查体试样,使亲和性物质结合保持粒子和亲和性物质结合共振粒子与被检测物质一起展开移动即可。图2中表示(2)模型的复合体形成的状态。在展开移动中形成由图2的A、图2的B及图2的C表示的复合体,或者它们进一步经由被检测物质结合的复合体,这些复合体在免疫层析法用试验片的检测部位被捕捉。本发明的免疫层析法中,作为在免疫层析法用试验片的检测部位形成的复合体,优选图2C的复合体。在图2中,抗体结合保持粒子、抗体结合共振粒子以及检测部位捕捉抗体的抗体可以相同也可以不同。
需要说明的是,可以在亲和性物质结合保持粒子的内部或表面的一部分预先存在未结合有亲和性物质的共振物质,然后,使亲和性物质结合共振粒子与该亲和性物质结合保持粒子结合。此时,在亲和性物质结合保持粒子预先所含有的共振粒子的基础上,之后添加到试验片的亲和性物质结合共振粒子进一步与亲和性物质结合保持粒子结合,从而亲和性物质结合保持粒子上的共振粒子的聚集度变大,因此通过表面等离子体共振产生的信号被进一步增感,因此,能够以更高灵敏度检测被检测物质。
用于使包含亲和性物质结合保持粒子和/或亲和性物质结合共振粒子的液体以及试剂展开移动的展开液优选含有抑制非特异反应的高分子、蛋白质、缓冲剂、表面活性剂。所含有的缓冲剂为具有因试样的添加、浓度的变化、异物的混入不会对检测产生致命的影响的缓冲作用的物质即可,而没有限制。优选为HEPES缓冲液、磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、Tris盐酸缓冲液等,特别优选为Tris盐酸缓冲液。
本发明也包含如下免疫层析法用试剂盒,该免疫层析法用试剂盒包含:保持粒子,结合相对于被检测物质的亲和性物质;以及共振粒子,结合相对于被检测物质的亲和性物质。该试剂盒还包含免疫层析法用的试验片、小册子(brochure)、缓冲液等。前述的亲和性物质结合保持粒子以及亲和性物质结合共振粒子对于免疫层析用法试验片可以作为其它的试剂而含有,也可以含有在免疫层析法用试验片的标记部位中。
本发明也包含含有使对于被检测物质的亲和性物质结合的保持粒子以及使对于被检测物质的亲和性物质结合的共振粒子的免疫层析法用试验片,在该试验片中,在标记部位含有使对于被检测物质的亲和性物质结合的保持粒子以及使对于被检测物质的亲和性物质结合的共振粒子。
实施例
利用下面的实施例具体地说明本发明,但本发明并不限于这些实施例。
<实施例1>
试验方法
购入直径20nm的金胶体粒子(BBI公司,英国)作为共振粒子以及直径400nm的白色胶乳粒子(JSR公司,日本)作为保持粒子。各个粒子固定相对于诺如病毒的抗体。
免疫层析法用试纸(白色)在检测部位固定与诺如病毒结合的捕捉抗体,作为阳性对照,将抗小鼠抗体分别以线状固定在其下游的对照显示部位。一定浓度的金胶体粒子、各种浓度的胶乳粒子、以及作为被检测物质的诺如病毒VLP在含有1.5%Tx-100的tris缓冲液中混合,直接浸渍免疫层析法用试纸条,使混合液在免疫层析法用试纸条上展开移动。15分钟后切断样品垫(接触溶液的材料部),对检测区域进行图像扫描,并对所得到的画像如图3所示用图像处理软件ImageJ进行分析,用统计软件R对所得到的信号峰面积值进行显著性检验。
试验结果
图3示出相对于一定的金胶体浓度混合有各种浓度的白色胶乳粒子时的峰面积。条柱表示SD,“+”是指对于对照具有显著的差异(Dunnett's test;p<0.05)。
如图3所示,可知在保持粒子数/共振粒子数比为3×10-5时信号显著地增加。
考察
白色胶乳粒子与免疫层析法用试纸条为相同颜色,在本实施例中,对检测灵敏度没有直接贡献。因此,认为在峰附近的灵敏度的上升是由于在白色胶乳上金胶体密集,增强表面等离子体共振的效果所造成的。
在峰值的左侧视为与最佳值相比灵敏度降低,这是与最佳值相比白色胶乳粒子的比例高的情况,认为由于表面等离子体共振的降低、立体障碍引起的金胶体表面抗体的结合障碍、物理上处于白色胶乳内侧的金胶体会从观测视野隐藏等效果而使灵敏度降低。
共振粒子/保持粒子数比的最佳值小于1/12。作为其理由,首先考虑共振粒子/保持粒子粒径比远离1。若将与保持粒子能够接近的共振粒子的最大数X设为a=0.9进行重算,则为X=4a(r+R)2/r2=1587,保持粒子数/共振粒子数比最佳值为1/1587以下,且本实施例的结果也满足该式。在本实施例的结果中,作为最适比率比其更小的理由被认为是病毒粒子粒径为金胶体粒子粒径的约2倍、有限的抗原浓度、有限的反应时间等。根据以上的结果,明确了通过在特定的共振粒子/保持粒子数比时使共振粒子与保持粒子混合,从而与共振粒子单独相比,灵敏度上升。
此外,为了观察本实施例中表面等离子体共振的效果而使用白色胶乳,但通过共振粒子与着色或荧光色素标记的保持粒子的各种组合能够进一步提高灵敏度。
<实施例2>
试验方法
使用链霉亲合素以线状形成固相的膜片进行免疫层析法。使膜片含浸于包含生物素化流感病毒抗体固相胶乳粒子(蓝)、流感病毒抗体固相金胶体粒子(红)、非活化流感病毒的含有1.5%Tx-100的tris溶液。在阴性对照中,使用去除胶乳粒子、金胶体粒子、病毒中的任一者的物质。
试验结果
图4示出试验结果。
如图4所示,观察到链霉亲合素:生物素化流感病毒抗体固相胶乳粒子:非活化流感病毒:流感病毒抗体固相金胶体粒子(:表示结合)复合体的紫色线。阴性对照未观察到着色线,或者观察到蓝色的线。
考察
表示保持粒子与共振粒子经由被检测物质而结合的情况。
使用流感病毒作为被检测物质时,表示本发明是能够实施的。
<实施例3>
试验方法
使用链霉亲合素以线状形成固相的膜片进行免疫层析法。
使膜片含浸于包含生物素化诺如病毒抗体固相胶乳粒子(红)、诺如病毒抗体固相金胶体粒子(红)、诺如病毒病毒样颗粒的含1.5%Tx-100的tris溶液。阴性对照中使用去除胶乳粒子、金胶体粒子、病毒中的任一项的物质。
试验结果
图5中示出试验结果。
如图5所示,由于形成链霉亲合素:生物素化诺如病毒抗体固相胶乳粒子:诺如病毒病毒样颗粒:诺如病毒抗体固相金胶体粒子(:表示结合)复合体,与未形成复合的情况相比,检测出强的信号。
考察
表示通过共振粒子经由被检测物质与保持粒子结合而使检测信号变高。
工业上的可利用性
本发明的免疫层析法可以用于被检测物质的高灵敏度检测。
本说明书中引用的所有刊行物、专利以及专利申请通过以原样引用而组入到本说明书中。
Claims (34)
1.一种免疫层析法,是使用共振粒子和保持粒子的免疫层析分析法,所述共振粒子和保持粒子固定化有与检查体试样中的被检测物质结合的亲和性物质,并且,所述共振粒子发生表面等离子体共振,所述保持粒子不发生表面等离子体共振且尺寸大于共振粒子,
通过形成由保持粒子:被检测物质:共振粒子(“:”表示结合)表示的复合体,从而使共振粒子聚集在保持粒子上,其中,所述保持粒子结合有将与被检测物质结合的亲和性物质,所述共振粒子结合有将与被检测物质结合的亲和性物质,在将与被检测物质结合的亲和性物质作为捕捉物质加以固定化的免疫层析法用试验片上的检测部位捕捉该复合体,并通过检测来自共振粒子和保持粒子的信号来检测被检测物质。
2.根据权利要求1所述的免疫层析法,其中,共振粒子为金胶体粒子。
3.根据权利要求1或2所述的免疫层析法,其中,保持粒子为胶乳粒子。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的免疫层析法,其中,使用预先在表面结合有共振粒子的保持粒子。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的免疫层析法,其中,使用预先内含共振粒子的保持粒子。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的免疫层析法,其中,与共振粒子结合的亲和性物质以及与保持粒子结合的亲和性物质结合在被检测物质的不同部位。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的免疫层析法,其中,共振粒子数为保持粒子数的12倍以上。
8.根据权利要求7所述的免疫层析法,其中,共振粒子数为保持粒子数的X倍以上[在设为保持粒径=R、共振粒径=r时,X由(3(R+r)2)/r2表示,其中,粒径为分别在所有方向测定时的中值]。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的免疫层析法,其中,先将保持粒子和被检测物质添加至免疫层析法用试验片,其后添加共振粒子。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的免疫层析法,其中,将共振粒子和保持粒子与被检测物质混合,添加至免疫层析法用试验片。
11.根据权利要求1至8中任一项所述的免疫层析法,其中,在免疫层析用法试验片的标记部位含有共振粒子和保持粒子。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的免疫层析法,其中,保持粒子用色素着色或标记。
13.根据权利要求12所述的免疫层析法,其中,保持粒子的色素颜色与共振粒子的颜色(非吸收峰)为同系色。
14.根据权利要求1至11中任一项所述的免疫层析法,其中,保持粒子在粒子内包含荧光色素。
15.根据权利要求1至11中任一项所述的免疫层析法,其中,在保持粒子表面结合有荧光色素。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的免疫层析法,其中,被检测物质为存在于活体的抗原或抗体。
17.根据权利要求1至15中任一项所述的免疫层析法,其中,被检测物质为病原性微生物及病原性微生物的一部分。
18.一种免疫层析法用试剂盒,其中,包含:结合有相对于被检测物质的亲和性物质的保持粒子、以及结合有相对于被检测物质的亲和性物质的共振粒子。
19.根据权利要求18所述的免疫层析法用试剂盒,其中,共振粒子为金胶体粒子。
20.根据权利要求18或19所述的免疫层析法用试剂盒,其中,保持粒子为胶乳粒子。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的免疫层析法用试剂盒,其中,使用预先在表面结合有共振粒子的保持粒子。
22.根据权利要求18至20中任一项所述的免疫层析法用试剂盒,其中,使用预先内含共振粒子的保持粒子。
23.根据权利要求18至22中任一项所述的免疫层析法用试剂盒,其中,与共振粒子结合的亲和性物质以及与保持粒子结合的亲和性物质结合在被检测物质的不同部位。
24.根据权利要求18至23中任一项所述的免疫层析法用试剂盒,其中,共振粒子数为保持粒子数的12倍以上。
25.根据权利要求24所述的免疫层析法用试剂盒,其中,共振粒子数为保持粒子数的X倍以上[在设为保持粒径=R、共振粒径=r时,X由(3(R+r)2)/r2表示,其中,粒径为分别在所有方向测定时的中值]。
26.根据权利要求18至25中任一项所述的免疫层析法用试剂盒,其中,在免疫层析用法试验片的标记部位含有共振粒子和保持粒子。
27.一种免疫层析法用的试验片,其中,在标记部位包含结合有相对于被检测物质的亲和性物质的保持粒子以及结合有相对于被检测物质的亲和性物质的共振粒子。
28.根据权利要求27所述的免疫层析法用的试验片,其中,共振粒子为金胶体粒子。
29.根据权利要求27或28所述的免疫层析法用的试验片,其中,保持粒子为胶乳粒子。
30.根据权利要求27至29中任一项所述的免疫层析法用的试验片,其中,使用预先在表面结合有共振粒子的保持粒子。
31.根据权利要求27至29中任一项所述的免疫层析法用的试验片,其中,使用预先内含共振粒子的保持粒子。
32.根据权利要求27至31中任一项所述的免疫层析法用的试验片,其中,与共振粒子结合的亲和性物质以及与保持粒子结合的亲和性物质结合在被检测物质的不同部位。
33.根据权利要求27至32中任一项所述的免疫层析法用的试验片,其中,共振粒子数为保持粒子数的12倍以上。
34.根据权利要求33所述的免疫层析法用的试验片,其中,共振粒子数为保持粒子数的X倍以上[在设为保持粒径=R、共振粒径=r时,X由(3(R+r)2)/r2表示,其中,粒径为分别在所有方向测定时的中值]。
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