JP4985541B2 - ナノ粒子内包シリカ、それを用いた生体物質の標識物質および生体物質の標識方法 - Google Patents
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Description
1.複数のナノ粒子を含有するシリカ粒子であって、該複数のナノ粒子の粒子間距離が3nm以上7nm以下であることを特徴とするナノ粒子内包シリカ。
2.前記シリカ粒子内に5個以上のナノ粒子を内包することを特徴とする1に記載のナノ粒子内包シリカ。
3.前記ナノ粒子が、コア及びシェルで構成されるコアシェル構造を有するナノ粒子であることを特徴とする1又は2に記載のナノ粒子内包シリカ。
4.前記ナノ粒子のコアがSiであり、前記シェルがSiO2であることを特徴とする3に記載のナノ粒子内包シリカ。
5.ナノ粒子内包シリカの表面を化学修飾することにより表層修飾した修飾基を介し、
生体物質が特異的に結合していることを特徴とする生体物質の標識物質。
6.生体物質の標識方法であって、5に記載の生体物質の標識物質を用い、
ナノ粒子を前記生体物質と特異的に結合する部位を有する修飾基を介して生体物質を
結合させることを特徴とする生体物質の標識方法。
本発明の修飾基は、ナノ粒子内包シリカの表面に結合しうる化合物を用いて前記表面結合部位を形成し、この化合物に前記生体物質結合部位を形成する物質を結合させることにより、導入することが可能である。また、表面結合部位を形成する化合物に、スペーサーを形成する化合物を結合させた後、前記生体物質結合部位を形成する物質を結合させてもよい。
本発明のナノ粒子内包シリカにおいて、上述したようなリンク形成修飾基を介してナノ粒子内包シリカ同士は互いに連結し、クラスターを形成する。このクラスターを構成するナノ粒子内包シリカの数は、温度またはpHにより調整することが可能であることが望ましい。リンク形成修飾基同志の結合力は、例えば温度、またはpHなどの環境を変更したり、リンク形成修飾基の結合を妨げる修飾基を導入しその数をコントロールすることによって調整することができる。また、リンク形成修飾基として例えばオリゴヌクレオチドを利用する場合、相補的な塩基配列と相補的でない塩基配列とを混在させることにより、リンク形成修飾基の結合力を調整することも可能である。
本発明の蛍光標識剤は、DNAまたはRNAなどの遺伝子情報を持つ、生体物質を対象とした各種分析に用いることができるが、とりわけ下記のような分析に好適に用いることができる。
以下にSi/SiO2ナノ粒子および該ナノ粒子を内包するシリカ球のより詳細な製造方法を説明する。
反応前の混合液と反応後の反応終了液について、それぞれ蛍光スペクトルを測定した。なお、測定では励起スリット幅は5nm、蛍光スリット幅は5nmとしたときの560nmの蛍光強度を読み取った。励起波長を350nmとして測定したところ、反応前後の蛍光強度はそれぞれ103.45(反応前)と237.94(反応後)であり、反応によって約2.3倍蛍光強度が増加したことがわかった。
得られた分散液中のSiナノ粒子内包シリカを透過型電子顕微鏡で観察したところ、直径約20nmの粒子像が観察された。さらに、直径約20nmの粒子内にはSiナノ粒子と考えられる直径1.5nmから2.5nmの格子像が2から3個観察された。直径約20nmの粒子の顕微鏡観察を100粒子分行い、シリカ球内部に含まれるナノ粒子数の平均を見積もった結果、シリカ球1粒子あたり6個から7個のナノ粒子が内包されていることがわかった。また、シリカ球内でナノ粒子は互いに3nmから7nm離れていることがわかった。
上記でえられたシリカ球についてエタノール中、励起波長350nmで定常光ではなく、ナノ秒オーダーのパルス光を照射し、一回のパルス光で励起され発光した蛍光ピーク強度を測定した。この結果は、同様にして測定したSi/SiO2ナノ粒子のエタノール分散液の結果とほぼ同じであったことから(蛍光寿命:13.5nsec)、Siナノ粒子内包シリカ内のナノ粒子は濃度消光を起こしていないことがわかった。
ナノ粒子内包シリカの水分散液0.5mlを、4.5mlの4mM 3−(アミノプロピル)トリエトキシシラン(APS)とともに室温下で12時間反応させた。これにより、シリカ球にAPSを付着させて表面にアクセプター基としてNH2基を有するシリカ球を作製した。
上記の表面にNH2基を有する発光波長750nmのシリカ球1mgをPBS2ml中に分散させ、NHS化したビオチン(NHS−PEO4−Biotin、テクノケミカル)1mgを添加し3時間撹拌した。反応終了後、反応液を遠心式濃縮メンブレン(アミコンウルトラ−4、100K、ミリポア社)を使用し、PBSを用いたろ過洗浄を数回繰り返して3mlの分散液を得た。このようにして調整したビオチン/シリカ球分散液500μLを、C末端をアビジン化したGCN5 Bromodomainタンパク質PBS溶液(5μM)3ml中に添加し、タンパク質とナノ粒子内包シリカを結合させた。
発光波長750nm、Siナノ粒子間距離3nmから7nmのSiナノ粒子内包シリカで標識したGCN5 Bromodomainタンパク質PBS溶液(5μM)3mlに、別途調整した発光波長550nmのナノ粒子内包シリカをC末端側に結合させた20残基のヒストンH4テール・ペプチド−を添加した。すると、GCN5 Bromodomainタンパク質分子と一部のヒストンH4テール・ペプチドが結合する様子を共焦点レーザー走査型顕微鏡(FV1000−D、Olympus)上で確認することができた。ここへ、発光波長650nmのナノ粒子内包シリカをC末端側に結合させ、16位のLys残基をアセチル化した20残基のヒストンテール・ペプチドを添加した。このとき、GCN5 Bromodomainタンパク質結合サイト上でLys16アセチル化ヒストンテール・ペプチドが非アセチル化ペプチドと入れ替わる様子を確認できるか各標識剤を用いてテストした結果を表3に示す。
表面NH2基修飾Siナノ粒子内包シリカ1mgを1mlのPBS中に分散させ、NHS活性化エステル−PEG[CH3O(CH2CH2O)n−COO−NHS、MW5000、日本油脂]1.5mgを加えて2時間撹拌した。反応終了後、反応液を遠心式濃縮メンブレン(アミコンウルトラ−4、100K、ミリポア社)を使用し、PBSを用いたろ過洗浄を数回繰り返すことによりPEG化Siナノ粒子内包シリカのPBS分散液を得た。
HeLa細胞をDMEM/F12中、37℃で細胞数が1×106cells/wellになるまでインキュベートした。続いて、0.05nMから1.6nMまでの濃度のPEG化Siナノ粒子内包シリカおよびSi/SiO2ナノ粒子をそれぞれマイクロインジェクションによりHeLa細胞に導入した。なお、濃度とはSiナノ粒子の濃度であり、PEG化Siナノ粒子内包シリカの濃度はシリカ球内に含まれるSiナノ粒子数を10分子と仮定して計算したものである。続いて、共焦点レーザー走査型顕微鏡(FV1000−D、Olympus)を用いて発光するHeLa細胞の相対蛍光強度を測定した。その結果、本発明のPEG化Siナノ粒子内包シリカで染色した場合は濃度の上昇とともに相対蛍光強度が高くなっていったのに対し、従来のSi/SiO2ナノ粒子で染色した場合では濃度が1nM以上になると相対蛍光が低下しはじめた。その結果を図1に示す。このことから、本発明のSiナノ粒子内包シリカは細胞内で濃度消光を起こしていないことがわかった。
発光波長の異なる量子ドットを内包するシリカ球表面をビオチン化し、アビジンを導入した抗インターロイキン抗体と結合させた。ここで、抗インターロイキン抗体は量子ドット内包シリカ球内の発光波長パターンの違いによりIL1抗体、IL2抗体、IL3抗体と異なるものを結合させている。また、シリカ球内にある発光波長の異なる量子ドットの組み合わせは、バーコード機能を有することとなる。標識した量子ドット内包シリカ球と細胞より抽出したインターロイキン(IL1、IL2、IL3・・・)を含む懸濁液を混合し1時間インキュベートし、各インターロイキンと抗体との結合反応を進行させた。ここへ、PE(Phycoerythrin)を結合させたディテクション用インターロイキン抗体を添加した。この操作により、量子ドット内包シリカ上の抗体に捕捉されたインターロイキンにPE標識したディテクション用抗体がサンドイッチ状に挟み込む反応が進行する。1時間インキュベートした後、リン酸バッファによる洗浄を行った。得られたサンプルをフローサイトメトリー(EPICS XL ADC;Beckman Coulter)にかけ、多種類のインターロイキンの同時解析が可能か調べた。その結果を表4にまとめる。解析の結果、多種類のインターロイキン同時解析にはシリカ球内のSi量子ドット間の距離が大きく影響していることがわかった。シリカ球内のSi量子ドット間距離が3nmから7nmである場合、高発光強度による高感度検出が可能であった。一方で、Si量子ドット間距離が10nm以上である場合、または0nmから2nmである場合、発光強度の低下により検出困難または検出不可という結果であった。以上の結果より、多種類インターロイキンの同時検出にはSi粒子間距離が3nmから7nmであることが重要であることがわかった。
Claims (6)
- 複数のナノ粒子を含有するシリカ粒子であって、該複数のナノ粒子の粒子間距離が3nm以上7nm以下であることを特徴とするナノ粒子内包シリカ。
- 前記シリカ粒子内に5個以上のナノ粒子を内包することを特徴とする請求項1に記載のナノ粒子内包シリカ。
- 前記ナノ粒子が、コア及びシェルで構成されるコアシェル構造を有するナノ粒子であることを特徴とする請求項1又は2に記載のナノ粒子内包シリカ。
- 前記ナノ粒子のコアがSiであり、前記シェルがSiO2であることを特徴とする請求項3に記載のナノ粒子内包シリカ。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のナノ粒子内包シリカの表面を化学修飾することにより表層修飾した修飾基を介し、
生体物質が特異的に結合していることを特徴とする生体物質の標識物質。 - 生体物質の標識方法であって、請求項5に記載の生体物質の標識物質を用い、
ナノ粒子を前記生体物質と特異的に結合する部位を有する修飾基を介して生体物質を
結合させることを特徴とする生体物質の標識方法。
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