JPWO2009136541A1 - 不溶性担体粒子の製造方法、不溶性担体粒子、測定試薬、検体分析用具および免疫比濁法 - Google Patents
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Abstract
Description
下記(A)および(B)の少なくとも一方の感作反応工程を有することを特徴とする。
(A)感作反応液中で、極性電荷側鎖アミノ酸の存在下、前記不溶性担体粒子に前記抗体または抗原を接触させる感作反応工程であって、
前記感作反応液中の前記極性電荷側鎖アミノ酸濃度が、0.1mol/Lを超え1mol/L以下の範囲である感作反応工程
(B)感作反応液中で、極性電荷側鎖アミノ酸の存在下、前記不溶性担体粒子に前記抗体または抗原を接触させる感作反応工程であって、
前記不溶性担体粒子として、化学結合用ラテックス粒子を用いる感作反応工程
本発明の製造方法は、前述のように、粒子表面に抗体または抗原を担持する不溶性担体粒子の製造方法であって、感作反応液中で、極性電荷側鎖アミノ酸の存在下、前記不溶性担体粒子に前記抗体または前記抗原を接触させる感作反応工程を有する。
(A)感作反応液中で、極性電荷側鎖アミノ酸の存在下、前記不溶性担体粒子に前記抗体または前記抗原を接触させる感作反応工程であって、
前記感作反応液中の前記極性電荷側鎖アミノ酸濃度が、0.1mol/Lを超え1mol/L以下の範囲である感作反応工程
(B)感作反応液中で、極性電荷側鎖アミノ酸の存在下、前記不溶性担体粒子に前記抗体または前記抗原を接触させる感作反応工程であって、
前記不溶性担体粒子として、化学結合用ラテックス粒子を用いる感作反応工程
本発明の不溶性担体粒子は、前述のように、免疫比濁法に用いる不溶性担体粒子であって、本発明の製造方法により製造した不溶性担体粒子である。前記本発明の不溶性担体粒子は、前記本発明の製造方法により製造されること以外は、何ら制限されない。なお、本発明において、抗体または抗原を担持する不溶性担体粒子、前記不溶性担体粒子に担持された抗体または抗原は、前述のとおりである。
本発明の測定試薬は、前述のように、本発明の不溶性担体粒子を含む。本発明の測定試薬において、前記本発明の不溶性担体粒子としては、本発明の製造方法Aおよび製造方法Bのいずれか一方の製造方法で製造された不溶性担体粒子を用いてもよいし、前記各製造方法でそれぞれ製造された不溶性担体粒子を組み合わせて用いてもよい。
本発明の検体分析用具は、前述のように、本発明の測定試薬を含むことを特徴とする。本発明の検体分析用具は、本発明の測定試薬を含んでいればよく、その他の構成や条件は何ら制限されない。本発明の検体分析用具において、前記測定試薬は、例えば、その形態に応じて、乾燥体で配置されてもよいし、分散液または懸濁液等の液体で配置されてもよい。
本発明の免疫比濁法は、前述のように、粒子表面に抗体または抗原を担持する不溶性担体粒子と、抗原または抗体となる測定対象物とを免疫反応させて、前記不溶性担体粒子を免疫反応液中で凝集させる凝集反応工程と、前記凝集反応による前記免疫反応液の濁度変化を測定する測定工程とを有し、前記不溶性担体粒子として、本発明の不溶性担体粒子を用いることを特徴とする。本発明の免疫比濁法は、前記工程を有し、本発明の不溶性担体粒子を用いる以外に特に限定されず、例えば、ラテックス免疫凝集法であってもよい。
本例では、極性電荷側鎖アミノ酸として、リジン塩酸塩を用い、下記の方法により、測定試薬を調製した。
本例では、前記小粒子として平均粒子径が0.096μmのカルボキシル基変性ポリスチレンラテックス粒子(10%溶液、セラダイン社製)を用い、前記大粒子として0.213μmのカルボキシル基変性ポリスチレンラテックス粒子(10%溶液、セラダイン社製)を用いた。まず、下記表1に示す組成の活性化液に前記小粒子を加え、室温(25℃)で1時間反応させ、前記小粒子表面の官能基を活性化させた。なお、前記活性化液は、500mmol/LのMESバッファー(pH6.1)に、前記MESバッファー以外の成分を添加後、同表に示す最終濃度になるように蒸留水を加えて調製した。下記組成に示す濃度は、前記活性化液に前記小粒子を混合した全液における各成分の最終濃度であり、この全液における前記小粒子の最終濃度は、1w/v%とした。反応終了後、遠心分離(60000rpm、15分)して上清を除去し、前記官能基を活性化させた小粒子を、50mmol/L MESバッファー(pH6.1)に懸濁し、超音波で再分散させて洗浄した。この洗浄工程を再度行った後、遠心分離(60000rpm、15分)して上清を除去した。得られた前記小粒子を前記MESバッファーで懸濁し、超音波で再分散させ、ラテックス液(小粒子)を得た。なお、前記ラテックス液(小粒子)における前記小粒子の濃度は、2w/v%とした。また、前記小粒子に代えて、前記大粒子を用いた以外は、前記ラテックス液(小粒子)の調製と同様にして、ラテックス液(大粒子)を調製した。
前記小粒子分散液および前記大粒子分散液を混合し、さらに、前記分散液を添加して、本例の測定試薬を調製した。なお、本例の測定試薬において、前記小粒子濃度は0.517w/v%とし、前記大粒子濃度は0.117w/v%とした。
前記ブロッキング処理開始後12時間静置した前記大粒子分散液について、分散性を評価した。前記分散性の評価は、以下に示すように、A、BおよびCの三段階とした。
A:沈殿せず分散している
B:一部沈殿している
C:沈殿している
自動汎用測定機器(製品名「Bio−majesty(BM−8)」、日本電子株式会社製)を用いて、本例の測定試薬の分散性を評価した。まず、試薬希釈液(2w/v% BSA水溶液)および反応バッファー(50mmol/L Tris−HCl(pH7.5)、1.28w/v% NaCl(ナカライテスク社製)、0.05%BSA)を調製した。つぎに、本例の測定試薬調製後、所定時間(0、24および48時間)静置した本例の測定試薬21μLを、前記試薬希釈液6μLと前記反応バッファー63μLとの混合液に添加した。前記混合液を撹拌し、前記測定機器を使用して、658nmにおける前記混合液の吸光度を、前記撹拌直後から10分間、経時的に計測した。そして、下記式(1)を用いて、前記所定時間静置後の測定試薬について、計測開始時(撹拌直後)と計測終了時(撹拌10分後)との吸光度の変化率(%)を算出し、分散性を評価した。
a=計測開始時の吸光度
b=計測終了時の吸光度
本例の測定試薬を用い、以下のようにして、免疫比濁法によるCRPの測定を行った。CRPは、C−Reactive Protein Antigen,High Pure、Capricon社製を用いた。
本例の測定試薬は、リジン塩酸塩に代えて、アルギニン塩酸塩を0.5mol/Lの濃度で用いた以外は、実施例1−1と同様にして調製した。また、本例の測定試薬について、実施例1−1と同様に、目視および測定機器による分散性評価を行った。さらに、本例の測定試薬を用いて、実施例1−1と同様に、免疫比濁法による測定を行った。
本例の測定試薬は、リジン塩酸塩に代えて、ヒスチジンを0.5mol/Lの濃度で用いた以外は、実施例1−1と同様にして調製した。また、本例の測定試薬について、実施例1−1と同様に、目視および測定機器による分散性評価を行った。さらに、本例の測定試薬を用いて、実施例1−1と同様に、免疫比濁法による測定を行った。
本例の測定試薬は、リジン塩酸塩に代えて、アスパラギン酸ナトリウムを0.5mol/Lの濃度で用いた以外は、実施例1−1と同様にして調製した。また、本例の測定試薬について、実施例1−1と同様に、目視および測定機器による分散性評価を行った。さらに、本例の測定試薬を用いて、実施例1−1と同様に、免疫比濁法による測定を行った。
本例の測定試薬は、リジン塩酸塩を用いなかった以外は、実施例1−1と同様にして調製した。また、本例の測定試薬について、実施例1−1と同様に、目視および測定機器による分散性評価を行った。さらに、本例の測定試薬を用いて、実施例1−1と同様に、免疫比濁法による測定を行った。
本例の測定試薬は、リジン塩酸塩に代えて、アスパラギンを0.5mol/Lの濃度で用いた以外は、実施例1−1と同様にして調製した。また、本例の測定試薬について、実施例1−1と同様に、目視および測定機器による分散性評価を行った。さらに、本例の測定試薬を用いて、実施例1−1と同様に、免疫比濁法による測定を行った。
本例の測定試薬は、リジン塩酸塩に代えて、セリンを0.5mol/Lの濃度で用いた以外は、実施例1−1と同様にして調製した。また、本例の測定試薬について、実施例1−1と同様に、目視および測定機器による分散性評価を行った。さらに、本例の測定試薬を用いて、実施例1−1と同様に、免疫比濁法による測定を行った。
本例の測定試薬は、リジン塩酸塩に代えて、トレオニンを0.5mol/Lの濃度で用いた以外は、実施例1−1と同様にして調製した。また、本例の測定試薬について、実施例1−1と同様に、目視および測定機器による分散性評価を行った。さらに、本例の測定試薬を用いて、実施例1−1と同様に、免疫比濁法による測定を行った。
本例の測定試薬は、リジン塩酸塩の濃度を0.5mol/Lから0.17mol/Lに変更し、測定試薬中の小粒子の濃度を0.5w/v%とし、大粒子の濃度を0.1w/v%とし、全ラテックス粒子濃度を0.6w/v%とした以外は、実施例1−1と同様にして調製した。
本例の測定試薬は、リジン塩酸塩に代えて、グルタミン酸ナトリウムを0.17mol/Lの濃度で用いた以外は、実施例2−1と同様にして調製した。また、本例の測定試薬について、実施例2−1と同様に、目視による分散性評価を行った。さらに、本例の測定試薬を用いて、実施例2−1と同様に、免疫比濁法による測定を行った。
本例の測定試薬は、リジン塩酸塩に代えて、アスパラギン酸ナトリウムを0.18mol/Lの濃度で用いた以外は、実施例2−1と同様にして調製した。また、本例の測定試薬について、実施例2−1と同様に、目視による分散性評価を行った。さらに、本例の測定試薬を用いて、実施例2−1と同様に、免疫比濁法による測定を行った。
本例の測定試薬は、リジン塩酸塩を用いなかった以外は、実施例2−1と同様にして調製した。また、本例の測定試薬について、実施例2−1と同様に、目視による分散性評価を行った。さらに、本例の測定試薬を用いて、実施例2−1と同様に、免疫比濁法による測定を行った。
本例の測定試薬は、リジン塩酸塩に代えて、アスパラギン酸ナトリウムを0.075mol/Lの濃度で用い、測定試薬中の小粒子の濃度を0.533w/v%とし、大粒子の濃度を0.1w/v%とし、全ラテックス粒子濃度を0.633w/v%とした以外は、実施例1−1と同様にして調製した。
本例の測定試薬は、アスパラギン酸ナトリウムの濃度を0.15mol/Lとした以外は、実施例3−1と同様にして調製した。また、本例の測定試薬について、実施例3−1と同様にして、目視による分散性評価を行った。さらに、本例の測定試薬を用いて、実施例3−1と同様に、免疫比濁法による測定を行った。
本例の測定試薬は、アスパラギン酸ナトリウムの濃度を0.6mol/Lとした以外は、実施例3−1と同様にして調製した。また、本例の測定試薬について、実施例3−1と同様にして、目視による分散性評価を行った。さらに、本例の測定試薬を用いて、実施例3−1と同様に、免疫比濁法による測定を行った。
本例の測定試薬は、アスパラギン酸ナトリウムの濃度を1.0mol/Lとした以外は、実施例3−1と同様にして調製した。また、本例の測定試薬について、実施例3−1と同様にして、目視による分散性評価を行った。さらに、本例の測定試薬を用いて、実施例3−1と同様に、免疫比濁法による測定を行った。
本例の測定試薬は、アスパラギン酸ナトリウムの濃度を2.0mol/Lとした以外は、実施例3−1と同様にして調製した。また、本例の測定試薬について、実施例3−1と同様にして、目視による分散性評価を行った。さらに、本例の測定試薬を用いて、実施例3−1と同様に、免疫比濁法による測定を行った。
本例の測定試薬は、アスパラギン酸ナトリウムを用いなかった以外は、実施例3−1と同様にして調製した。また、本例の測定試薬について、実施例3−1と同様にして、目視による分散性評価を行った。さらに、本例の測定試薬を用いて、実施例3−1と同様に、免疫比濁法による測定を行った。
本例の測定試薬は、前記不溶性担体粒子群として前記小粒子は用いず、前記大粒子のみを用い、測定試薬中の前記大粒子の濃度を0.167w/v%とし、全ラテックス粒子濃度を0.167w/v%とした以外は、実施例1−1と同様にして調製した。
本例の測定試薬は、リジン塩酸塩に代えて、アルギニン塩酸塩を0.5mol/Lの濃度で用いた以外は、実施例4−1と同様にして調製した。また、本例の測定試薬を用いて、実施例4−1と同様に、測定機器による分散性評価および免疫比濁法による測定を行った。
本例の測定試薬は、リジン塩酸塩に代えて、ヒスチジンを0.5mol/Lの濃度で用いた以外は、実施例4−1と同様にして調製した。また、本例の測定試薬を用いて、実施例4−1と同様に、測定機器による分散性評価および免疫比濁法による測定を行った。
本例の測定試薬は、リジン塩酸塩に代えて、アスパラギン酸ナトリウムを0.5mol/Lの濃度で用いた以外は、実施例4−1と同様にして調製した。また、本例の測定試薬を用いて、実施例4−1と同様に、測定機器による分散性評価を行った。
本例の測定試薬は、リジン塩酸塩を用いなかった以外は、実施例4−1と同様にして調製した。また、本例の測定試薬を用いて、実施例4−1と同様に、測定機器による分散性評価および免疫比濁法による測定を行った。
本例の測定試薬は、リジン塩酸塩に代えて、アスパラギンを0.5mol/Lの濃度で用いた以外は、実施例4−1と同様にして調製した。また、本例の測定試薬を用いて、実施例4−1と同様に、測定機器による分散性評価を行った。
本例の測定試薬は、リジン塩酸塩に代えて、セリンを0.5mol/Lの濃度で用いた以外は、実施例4−1と同様にして調製した。また、本例の測定試薬を用いて、実施例4−1と同様に、測定機器による分散性評価および免疫比濁法による測定を行った。
本例の測定試薬は、リジン塩酸塩に代えて、トレオニンを0.5mol/Lの濃度で用いた以外は、実施例4−1と同様にして調製した。また、本例の測定試薬を用いて、実施例4−1と同様に、測定機器による分散性評価を行った。
Claims (19)
- 粒子表面に抗体または抗原を担持する不溶性担体粒子の製造方法であって、
下記(A)および(B)の少なくとも一方の感作反応工程を有する不溶性担体粒子の製造方法。
(A)感作反応液中で、極性電荷側鎖アミノ酸の存在下、前記不溶性担体粒子に前記抗体または抗原を接触させる感作反応工程であって、
前記感作反応液中の前記極性電荷側鎖アミノ酸濃度が、0.1mol/Lを超え1mol/L以下の範囲である感作反応工程
(B)感作反応液中で、極性電荷側鎖アミノ酸の存在下、前記不溶性担体粒子に前記抗体または抗原を接触させる感作反応工程であって、
前記不溶性担体粒子として、化学結合用ラテックス粒子を用いる感作反応工程 - 前記極性電荷側鎖アミノ酸が、塩基性アミノ酸または酸性アミノ酸である請求の範囲1記載の不溶性担体粒子の製造方法。
- 前記(A)の感作反応工程において、前記不溶性担体粒子が、ラテックス粒子である請求の範囲1記載の不溶性担体粒子の製造方法。
- 前記(A)の感作反応工程において、前記ラテックス粒子が、化学結合用ラテックス粒子である請求の範囲3記載の不溶性担体粒子の製造方法。
- 免疫比濁法に用いる不溶性担体粒子であって、
請求の範囲1記載の不溶性担体粒子の製造方法により製造した不溶性担体粒子。 - 免疫比濁法に用いる測定試薬であって、
請求の範囲5記載の不溶性担体粒子を含有することを特徴とする測定試薬。 - 不溶性担体粒子を複数含む不溶性担体粒子群を含み、
前記不溶性担体粒子群は、平均粒子径の異なる二種類の不溶性担体粒子群を含み、
前記二種類の不溶性担体粒子群のうち、少なくとも一種類の不溶性担体粒子群が、請求の範囲5記載の不溶性担体粒子を複数含む不溶性担体粒子群である請求の範囲6記載の測定試薬。 - 前記二種類の不溶性担体粒子群のうち、平均粒子径のより大きい不溶性担体粒子群が、請求の範囲5記載の不溶性担体粒子を複数含む不溶性担体粒子群である請求の範囲7記載の測定試薬。
- 請求の範囲5記載の不溶性担体粒子の平均粒子径が、0.03〜2.0μmの範囲である請求の範囲6記載の測定試薬。
- 請求の範囲5記載の不溶性担体粒子の平均粒子径が、0.08〜2.0μmの範囲である請求の範囲6記載の測定試薬。
- 請求の範囲5記載の不溶性担体粒子の平均粒子径が、0.12〜0.5μmの範囲である請求の範囲6記載の測定試薬。
- 請求の範囲6記載の測定試薬を含有する検体分析用具。
- 前記検体分析用具が、試験片、カートリッジおよびマイクロチップのいずれかである請求の範囲12記載の検体分析用具。
- 粒子表面に抗体または抗原を担持する不溶性担体粒子と、抗原または抗体となる測定対象物とを免疫反応させて、前記不溶性担体粒子を免疫反応液中で凝集させる凝集反応工程と、
前記凝集反応による前記免疫反応液の濁度変化を測定する測定工程とを有する免疫比濁法であって、
前記不溶性担体粒子として、請求の範囲5記載の不溶性担体粒子を用いることを特徴とする免疫比濁法。 - 前記凝集反応工程において、不溶性担体粒子を複数含む不溶性担体粒子群を使用し、
前記不溶性担体粒子群が、平均粒子径の異なる二種類の不溶性担体粒子群を含み、
前記二種類の不溶性担体粒子群の少なくとも一種類が、請求の範囲5記載の不溶性担体粒子を複数含む不溶性担体粒子群である請求の範囲14記載の免疫比濁法。 - 前記二種類の不溶性担体粒子群のうち、平均粒子径のより大きい不溶性担体粒子群が、請求の範囲5記載の不溶性担体粒子を複数含む不溶性担体粒子群である請求の範囲15記載の免疫比濁法。
- 請求の範囲5記載の不溶性担体粒子の平均粒子径が、0.03〜2.0μmの範囲である請求の範囲14記載の免疫比濁法。
- 請求の範囲5記載の不溶性担体粒子の平均粒子径が、0.08〜2.0μmの範囲である請求の範囲14記載の免疫比濁法。
- 請求の範囲5記載の不溶性担体粒子の平均粒子径が、0.12〜0.5μmの範囲である請求の範囲14記載の免疫比濁法。
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