CN104502584A - 基于金属纳米粒子增强荧光的干式免疫层析分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于金属纳米粒子增强荧光的干式免疫层析分析方法。本发明基于金属纳米粒子增强荧光的干式免疫层析分析方法，以金属纳米粒子代替聚苯乙烯等微球载体，并在距金属纳米粒子表面5～20nm处有荧光物质，金属纳米粒子表面5～20nm处的荧光物质最大吸收峰和金属表面等离子体最大吸收峰耦合共振，通过表面等离子体振荡和电磁场剪裁效应，产生比自由态的荧光发射强度有显著增强的荧光发射。本发明方法应用在干式免疫层析试纸条中，具有操作简单，检测快速准确、特异性强、灵敏度高的优势。

Description

基于金属纳米粒子增强荧光的干式免疫层析分析方法
技术领域
本发明涉及到临床医学诊断领域，特别是涉及到一种基于金属纳米粒子增强荧光的干式免疫层析分析方法。
背景技术
干式免疫层析分析法是将高特异性的免疫反应与纳米载体标记技术相结合，用于定量、半定量或定性检测各种抗原、半抗原、抗体、激素、药物和毒品等具有免疫特异性物质。干式免疫层析分析法是体外诊断领域的一种重要的快速诊断方法，具有价格低，检测方便，检测快速等特点。它结合了亲和技术、标记技术、印记技术和层析技术等技术方法。免疫试剂条主要由样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸四部分构成。
干式免疫层析分析法有胶体金法和荧光法。荧光法是将荧光物质(异硫氰酸荧光素、3H-吲哚菁类染料、罗丹明、藻红蛋白、量子点等)在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和蛋白类物质(IgG，链霉亲和素，牛血清白蛋白等)化学偶联，然后将荧光蛋白分子包被在微球表面，形成技术逐渐在免疫层析中占主导地位。然而化学偶联荧光物质存在破坏抗原抗体结合位点的缺点，偶联荧光物质过少则检测灵敏度过低，检测低浓度的样本灵敏度不足影响临床判定。因此，在干式免疫层析分析法提高荧光物质的发光强度是必要的。
文献报道表明，荧光物质可通过一种特殊表面(一般是金属纳米粒子)的等离子体振荡和电磁场剪裁效应,使分布在表面附近的荧光物种的荧光发射强度比自由态的荧光发射强度有显著增强的现象。特别指出，这种增强效应产生存在临界距离5～20nm，专利CN102308211A，纳米金属粒子与荧光物质距离过大则不具有提高荧光物质的发光强度。该方法免疫分析、核酸杂交分析等应用领域，但目前市场上还没有基于金属增强荧光干式免疫层析分析法原理为指导的体外快速诊断产品。
发明内容
本发明针对干式免疫层析分析法现有技术的上述不足，公开了一种基于金属纳米粒子增强荧光的干式免疫层析分析方法。
本发明还公开了一种基于金属纳米粒子增强荧光的干式免疫层析试纸条。
为实现上述目标，本发明采用以下的技术方案予以实现：
基于金属纳米粒子增强荧光的干式免疫层析分析法，包括以下(I)或(II)所述的任意一种方法：
(Ⅰ)夹心法：利用有机大分子或无机材料在金属纳米粒子表面形成5～20nm隔离层，将能够与待测分子特异性结合的探测分子连接到金属纳米粒子或隔离层表面，再标记上荧光物质，形成荧光物质距离金属纳米粒子表面的距离为5～20nm的荧光致敏金属纳米粒子复合物，将能够与待测分子特异性结合的捕获分子包被在硝酸纤维素膜检测线上，将荧光致敏金属纳米粒子复合物均匀分布于样品垫上，滴加样本后荧光致敏金属纳米粒子复合物随液体层析，荧光致敏金属纳米粒子和待测分子结合形成荧光致敏金属纳米粒子～待测分子复合物，最后复合物被捕获分子结合层析结束，在检测线上形成荧光致敏金属纳米粒子～待测分子～捕获分子复合物，此时复合物上荧光物质最大吸收峰和金属表面等离子体最大吸收峰耦合共振，通过表面等离子体振荡和电磁场剪裁效应，产生比自由态的荧光发射强度有显著增强的荧光发射，用荧光免疫定量分析仪检测荧光强度，进而回算待测样本中的目标分析物的浓度；
或者是将能够与待测分子特异性结合的捕获分子连接到金属纳米粒子表面后包被在硝酸纤维素膜检测线上，检测分子标记上荧光物质，均匀分布于样品垫上，滴加样本后将荧光检测分子复合物随液体层析，荧光检测分子和待测分子结合形成复合物，最后复合物被金属纳米粒子上捕获分子捕获，在检测线上形成荧光探测分子～待测分子～捕获分子～金属纳米粒子复合物，此时荧光物质距离金属纳米粒子表面距离正好位于其等离子体共振距离范围内，荧光物质最大吸收峰和致敏金属纳米粒子表面等离子体最大吸收峰耦合共振，通过表面等离子体振荡和电磁场剪裁效应，产生比自由态的荧光发射强度有显著增强的荧光发射，用荧光免疫定量分析仪检测荧光强度进而回算待测样本中的目标分析物的浓度；
(Ⅱ)竞争法：利用有机大分子或无机材料在金属纳米粒子表面形成5～20nm隔离层，将能够与待测分子特异性结合的探测分子连接到金属纳米粒子或隔离层表面，再标记上荧光物质，形成荧光物质距离金属纳米粒子表面的距离为5～20nm具有荧光标记效果的致敏金属纳米粒子复合物，将能够与待测分子竞争性结合致敏纳米金属粒子的竞争分子包被在硝酸纤维素膜检测线上，滴加样本后将荧光致敏金属纳米粒子复合物随液体层析，硝酸纤维素膜上的竞争分子与待测分子将竞争结合致敏金属纳米粒子，待测分子浓度越低，致敏金属粒子的荧光强度越强，反之则越弱，此时竞争分子上荧光物质最大吸收峰和致敏金属纳米粒子表面等离子体最大吸收峰耦合共振，通过表面等离子体振荡和电磁场剪裁效应，产生比自由态的荧光发射强度有显著增强的荧光发射，用荧光免疫定量分析仪检测荧光强度进而回算待测样本中的目标分析物的浓度。
所述的探测分子优选通过共价偶联、结合对、物理吸附的方式连接到金属纳米粒子或隔离层表面上；所述的共价偶联方式选自金属纳米粒子隔离层表面修饰的巯基、氨基或羧基共价偶联至探测分子的氨基；所述结合对方式选自生物素～链霉亲和素、生物素～亲和素、凝集素～糖类、葡萄球菌A蛋白～IgG、抗原～抗体、阳离子～阴离子等。
所述的用于形成隔离层的有机大分子选自牛血清白蛋白、酪蛋白、超支化聚合物；用于形成隔离层的无机材料选自二氧化硅、三氧化二铝、碱式碳酸钇；所述的金属纳米粒子的粒径为1～100nm。
所述的夹心法中，所述的待测分子选自蛋白质或多肽，所述的蛋白质包括抗原或抗体；所述的探测分子选自可与待测分子特异性结合的蛋白质或多肽，所述的蛋白质包括抗体或抗原；所述的捕获分子选自与探测分子配对，并且能够与探测分子特异性结合的蛋白质或多肽，所述的蛋白质包括抗原或抗体。
所述竞争法中，所述的待测分子选自小分子或半抗原；所述的竞争分子选自与待测分子具有相同或相似结构或相同或相似结合结构域的物质且能与捕获分子结合的物质，选自小分子、半抗原，大分子、抗原；所述的检测分子选自能与待测分子或竞争分子特异性结合的物质。
所述的荧光物质选自异硫氰酸荧光素,3H-吲哚菁类染料、荧光素cy5、荧光素cy7、羧基荧光素、2-甲氧基荧光增强素、罗丹明、量子点、EGFP、藻红蛋白、铕、上转发光物质等物质中的一种或几种或含有上述荧光物质的复合物质。
基于金属纳米粒子增强荧光的干式免疫层析试剂盒，其特征在于所述试剂盒工作原理如权利要求1所述，该试剂盒由塑料底衬，样品垫，硝酸纤维素膜，吸水纸，质控线，检测线组成。
所述试剂盒包括以下制法：
夹心法一：
1)致敏金属纳米粒子的制备：先将探测分子和荧光物质反应后透析形成探测分子～荧光素复合物，使用无机或有机分子包覆至金属纳米粒子表面形成5～20nm的隔离层，连接探测分子～荧光素复合物，反应完成后多次离心清洗去除游离的探测分子～荧光素复合物得到致敏金纳米粒子；
2)样品垫的制备：样品垫选用玻璃纤维或者聚酯材质，然后将样品垫用PBS缓冲液浸泡，取出后干燥，将上述致敏金属纳米粒子均匀涂布于样品垫上；
3)硝酸纤维素膜的处理：
A、检测线的制备：将待测分子捕获分子(若为竞争法，此处为竞争分子)用PB缓冲液稀释，在硝酸纤维素膜右端划线得到检测线；
B、质控线的制备：将兔抗鼠IgG抗体在硝酸纤维素膜右端划质控线，该线与检测线平行，与检测线间隔5mm，后在干燥箱内鼓风干燥；
4)吸水垫的制备：吸水纸裁剪成30*2.7cm每条；
5)组装：塑料底衬，样品垫和吸水纸为本领域通用的部件，将上述硝酸纤维素膜、吸水垫、样品垫粘贴在塑料底衬上，将贴好的中间物用斩切机切成一定宽度的试纸条。
夹心法二：
1)样品垫的制备：样品垫选用玻璃纤维或者聚酯材质，然后将样品垫用PBS缓冲液浸泡，取出后干燥，将待测分子检测分子标记上荧光物质后均匀涂布于上述样品垫上；
2)硝酸纤维素膜的处理：
A、检测线的制备：将待测分子捕获分子连接至金属纳米粒子表面后用PB缓冲液稀释，在硝酸纤维素膜右端划线得到检测线；
B、质控线的制备：将兔抗鼠IgG抗体在硝酸纤维素膜右端划质控线，该线与检测线平行，与检测线间隔5mm，后在干燥箱内鼓风干燥；
3)吸水垫的制备：吸水纸裁剪成30*2.7cm每条；
4)组装：塑料底衬，样品垫和吸水纸为本领域通用的部件，将上述硝酸纤维素膜、吸水垫、样品垫粘贴在塑料底衬上，将贴好的中间物用斩切机切成一定宽度的试纸条。
本发明公开了一种基于金属纳米粒子增强荧光的干式免疫层析分析方法，通过在金属表面5～20nm距离范围内的荧光其最大吸收峰可以和金属表面等离子体最大吸收峰耦合共振，使得荧光强度得到加强的原理，本发明可大幅提高现有荧光免疫层析的检测限、灵敏度等参数，所述的干式免疫荧光增强检测试剂盒通过双抗夹心法或者竞争法原理定量测定待测物质，适用于所有的采用双抗夹心或竞争法模式的心肌类、肾脏类、肿瘤类、传染病类等疾病的干式免疫定量诊断。
说明书附图
图1本发明技术路线示意图
图2本发明试纸条结构图
图3胶体金、聚苯乙烯荧光和夹心法一、夹心法二试纸条灵敏度对比
图4本发明体系夹心法一和罗氏相关产品测定值的相关性
图5本发明体系夹心法二和罗氏相关产品测定值的相关性
图6胶体金、聚苯乙烯荧光和竞争法一、竞争法二试纸条灵敏度对比
图7本发明体系竞争法一和罗氏相关产品测定值的相关性
图8本发明体系竞争法二和罗氏相关产品测定值的相关性
图中，1为样品垫、2为结合垫、3为检测线、4为质控线、5为硝酸纤维素膜、6为吸水纸。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何修改、等同变化与改型、仍属于本发明技术方案的保护范围(以下实施例方式均以纳米金为例)。
实施例1：金属增强荧光免疫层析试纸条的制备工艺
夹心法一和竞争法一：
一、表面羧基的金纳米粒子的制备
A.用去离子水配制1mL浓度为4％的氯金酸溶液；
B.0.5mL上述氯金酸溶液加入200mL去离子水中充分搅拌并煮沸；
C.将3ml浓度为1％的柠檬酸钠水溶液快速注入上述沸腾溶液中去；
D.冷凝回流30分钟。当金纳米粒子形成时，悬浮液的颜色将从深蓝色变为红色；
E.冷却到室温；
F.透射电子显微镜下测量所制备金纳米粒子的粒径在1-100nm范围之间，根据粒径和密度计算单个球形金纳米粒子的质量，根据总体系中金元素的质量推算出纳米金溶液中的粒子浓度为2-20nmol/L。
二、二氧化硅包覆纳米金表面隔离层和偶联探测分子
A.取粒径为40nm、浓度为8nmol/L 40mL上述制备的纳米金溶液分散在80mL乙醇中，加入20mL纯化水，再逐滴加入1mL24％‐28％的浓氨水，加完之后立即迅速加入20μL正硅酸乙酯，期间保持300rpm搅拌1小时，测得反应后粒径为50nm；
B.将制备得到的上述纳米金溶液清洗3次后，重新分散在80mL纯化水中，加入0.3g十六烷基三甲基溴化铵、60mL乙醇，最后逐滴缓慢加入1.5mL 24％～28％的浓氨水，300rpm搅拌30分钟。向上述体系中加入400μL硅酸四乙酯(TEOS)，再加入200μL3‐氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，继续搅拌反应6小时。反应结束后，对纳米金溶液进行清洗，得到含5‐20nm隔离层的纳米金颗粒。取上述制备的氨基修饰的含隔离层的纳米金溶液，加入4mL 50％戊二醛活化氨基，37℃搅拌12小时，采用50mM pH8.0的磷酸缓冲液清洗三次；
C.根据纳米金与cTnI单克隆抗体所需偶联质量比50:1计算出所需偶联单克隆抗体的量，将cTnI单抗用50mM pH8.0的磷酸缓冲液稀释成所需浓度，缓慢向单抗溶液中加入上述金纳米粒子，室温下搅拌反应两小时，高速离心洗涤后得偶联抗体的纳米金粒子；
D.按照荧光素：单抗摩尔比1:18的比例标记上述偶联了单抗的纳米金粒子，将荧光素用DMSO充分溶解后滴加进入偶联抗体的金纳米粒子溶液中，反应后透析去除未结合的荧光素即可。
三、试纸条的组装
1)致敏金纳米粒子包被：将处理好的样品垫上均匀的喷上致敏金纳米粒子，置于25℃干燥4小时；
2)样品垫的制备：将样品垫用100mmol/L pH7.2PBS缓冲液浸泡2～4小时，取出后25℃干燥8小时；
3)硝酸纤维素膜的处理：
A、检测线的制备：将cTnI捕获抗体(若此处为竞争分子，则为竞争法一)用20mmol/L pH7.2的PB缓冲液稀释到2.0mg/ml的浓度，0.8ul/cm在离硝酸纤维素膜右端4.0cm处划线得到检测线；
B、质控线的制备：将兔抗鼠IgG抗体按4mg/ml的浓度，0.8ul/cm在硝酸纤维素膜右端3.5cm处划质控线，该线与检测线平行，与检测线间隔5mm，然后在干燥箱内20℃鼓风干燥12h；
4)吸水垫的制备：吸水纸裁剪成30*2.7cm每条；
5)组装：塑料底衬，样品垫和吸水纸为本领域通用的部件，将上述硝酸纤维素膜、吸水垫、样品垫粘贴在塑料底衬上，将贴好的中间物用斩切机切成一定宽度的试剂条。
夹心法二和竞争法二：
1)样品垫的制备：样品垫选用玻璃纤维或聚酯材料，用缓冲盐(PBS，Tris或甘氨酸等)等溶解5mg/ml的蛋白(BSA，酪蛋白等)，然后加入少量的表面活性剂(Tween20等)，调节pH到6～8，将璃纤维或聚酯材料置于浸泡2～4小时，取出后25℃干燥8小时可得；
2)抗体-荧光素的制备：HCG抗体溶解于20～100Mmol的PBS缓冲液中，活化的荧光素(FITC，Cy5等)溶解于二甲基亚砜(DMF)中，然后将HCG抗体与荧光素以1:1～1:3混合，充分搅拌反应1h，然后将溶液置于透析袋中梯度换液透析3次，每次6～8h，得到的溶液即为抗体IgG荧光素复合物；将上述HCG抗体-荧光素(若此处为竞争分子，则为竞争法二)均匀涂布于上述样品垫上
3)硝酸纤维素膜的处理：
A、检测线的制备：将HCG捕获分子用20mmol/L pH7.2的PB缓冲液稀释到2.0mg/ml的浓度，0.8ul/cm在离硝酸纤维素膜右端4.0cm处划线得到检测线；此处捕获分子是用金属纳米粒子和抗体偶联所得的金属离子-抗体复合物；
B、质控线的制备：将兔抗鼠IgG抗体按4mg/ml的浓度，0.8ul/cm在硝酸纤维素膜右端3.5cm处划质控线，该线与检测线平行，与检测线间隔5mm，然后在干燥箱内20℃鼓风干燥12h；
4)吸水垫的制备：吸水纸裁剪成30*2.7cm每条；
5)组装：塑料底衬，样品垫和吸水纸为本领域通用的部件，将上述硝酸纤维素膜、吸水垫、样品垫粘贴在塑料底衬上，将贴好的中间物用斩切机切成一定宽度的试剂条，如图2所示。
实施例2中的胶体金和聚苯乙烯胶乳微球标记荧光试纸条和上述试纸条制作工艺相同，仅仅是把致敏金属纳米粒子换为胶体金或聚苯乙烯胶乳微球。
实施例2：夹心法中金属增强荧光免疫层析试纸条检测指标
一、胶体金、聚苯乙烯胶乳微球标记荧光和夹心法一、夹心法二试纸条检测灵敏度对比
样品垫上加入不同浓度的cTnI抗原标准品(取10个不同浓度，分别为0,0.01，0.02,0.04,0.08,0.16,0.32,0.64,1.28,2.56,5.12ng/ml,每个样本浓度设定三次重复)分别滴加120ul于四种试剂条加样孔中，15min后通过南京基蛋生物有限公司的荧光免疫定量分析仪Getein1100和胶体金免疫定量分析仪FIA8100读取信号，实验结果见图3。
如图3所示，传统胶体金双抗夹心法的检测范围下限仅为0.16ng/mL，聚苯乙烯荧光的记放大体系的检测范围下限为0.08ng/mL。利用本发明所述的纳米金粒子增强荧光后，检测范围下限为0.01ng/mL，与传统的胶体金和聚苯乙烯微球相比，有了10～20倍以上的提高。这一结果证实了本发明体系实现了纳米球的标记放大增强性能，同时利用金纳米粒子的表面增强发光的特性，进一步大幅提高了灵敏度。
二、夹心法一、夹心法二试纸条相关性评估
取多份血清标本分别用罗氏相关产品和本发明体系夹心法一、夹心法二试纸条测试cTnI含量后，挑选出其中梯度合适的15份，作图比较相关性由图4、图5可见。两种体系表现出良好地相关性，夹心法一R2值高达0.998，夹心法二R2值高达0.995。证实了本发明体系以及依据该体系的试剂盒除了具有超高灵敏度，更宽的检测范围外，还有极佳的准确性。
三、夹心法一、夹心法二试纸条时间衍变性评估
配制浓度为1.00ng/ml的检测样本，分别滴加120ul于夹心法一、夹心法二试纸条加样孔中分别于1min，3min，5min，10min，20min和30min使用GT1100系列免疫定量分析仪重复测定，比较不同时间检测结果的差异，计算相对偏差(以3min为基准)，结果如表1、表2所示。结果显示在3～30min内夹心法一和夹心法二样本检测浓度差异性均较小，夹心法一时间衍变性＜3％，夹心法二时间衍变性＜5％。证实了本发明体系以及依据该体系的试剂盒检测时间衍变性小，更好体现测量准确性。
表1夹心法一试纸条的不同时间衍变性
时间 3min 5min 8min 10min 20min 30min
浓度 0.98 0.99 0.98 0.10 0.10 0.99
相对偏差 0 1.02％ 0％ 2.04％ 2.04％ 1.02％
表2夹心法二试纸条的不同时间衍变性
时间 3min 5min 8min 10min 20min 30min
浓度 0.98 0.10 0.99 0.11 0.12 0.97
相对偏差 0 2.04％ 1.02％ 3.06％ 4.08％ 1.02％
四、夹心法一、夹心法二试纸条重复性评估
配制1.0ng/L和0.2mg/L的cTnI标准品溶液，采用本发明体系夹心法一、夹心法二试纸条进行测定浓度，分别重复测定10次，分别计算测定均值和标准偏差、CV值如表3、4所示。进行重复性考察，结果显示夹心法一中两种浓度重复性分别为1.3％、3.9％，夹心法二中两种浓度重复性分别为2.29％、7.24％，完全能够满足临床要求。
表3夹心法一试纸条重复性
表4夹心法二试纸条重复性
序号 标准值1.00ng/ml 标准值0.20ng/ml
1 0.992 0.194
2 1.006 0.211
3 1.023 0.203
4 0.976 0.215
5 0.985 0.222
6 1.044 0.197
7 1.034 0.188
8 0.987 0.186
9 0.975 0.215
10 1.014 0.234
平均值 1.004 0.207
标准偏差 0.023 0.015
CV 2.29％ 7.24％
实施例3：竞争法中金属增强荧光试纸条检测指标
一、胶体金，聚苯乙烯胶乳微球标记荧光和竞争法一、竞争法二试纸条检测灵敏度对比
样品垫上加入不同浓度的HCG抗原标准品(取10个不同浓度，分别为0,0.1，0.3,0.5,1.0,2.5,5.0,10.0,25.0,50.0,100.0,250.0,500.0,1000ng/ml,每个样本浓度设定三次重复)分别滴加120ul于四种试剂条加样孔中，15min通过南京基蛋生物有限公司的荧光免疫定量分析仪Getein1100和胶体金免疫定量分析仪FIA8100读取信号，实验结果如图6所示。
如图6所示，传统胶体金双抗夹心法的检测范围至50mIU/mL，聚苯乙烯荧光的记放大体系的检测范围至100mIU/mL。利用本发明所述的纳米金粒子增强荧光后检测范围至1000mIU/mL，与传统的胶体金和聚苯乙烯微球相比，有了10～20倍以上的提高。这一结果证实了本发明体系实现了纳米球的标记放大增强性能，同时利用金纳米粒子的表面增强发光的特性，进一步大幅提高了灵敏度。
二、竞争法一、竞争法二试纸条相关性评估
取多份血清标本分别用罗氏相关产品和本发明体系竞争法一、竞争法二测试HCG含量后，挑选出其中梯度合适的15份，作图比较相关性由图7、8可见。两种体系表现出良好地相关性，竞争法一R2值高达0.995，竞争法二R2值高达0.981。证实了本发明体系以及依据该体系的试剂盒除了具有超高灵敏度，更宽的检测范围外，还有极佳的准确性。
三、竞争法一、竞争法二试纸条时间衍变性评估
配制浓度为5.00mIU/ml的检测样本，分别滴加120ul于试剂条加样孔中分别于3min，5min，8min，10min，20min和30min使用GT1100系列免疫定量分析仪重复测定，比较不同时间检测结果的差异，计算相对偏差(以3min为基准)，结果如表5、6所示。结果显示在3～30min内竞争法一和竞争法二样本检测浓度差异性均较小，竞争法一时间衍变性＜5％，竞争法二时间衍变性＜10％。证实了本发明体系以及依据该体系的试剂盒检测时间衍变性小，更好体现测量准确性。
表5竞争法二试纸条时间衍变性
时间 3min 5min 8min 10min 20min 30min
浓度 4.83 4.95 5.02 4.98 5.01 4.89
相对偏差 0 2.5％ 3.9％ 3.1％ 3.7％ 1.2％
表6竞争法二试纸条时间衍变性
时间 3min 5min 8min 10min 20min 30min
浓度 4.83 4.99 5.22 5.24 5.06 5.29
相对偏差 0 3.3％ 8.1％ 8.5％ 4.8％ 9.5％
四、竞争法一、竞争法二试纸条重复性评估
配制2.5mIU/ml和10.0mIU/ml的HCG标准品溶液，采用本发明体系竞争法一、竞争法二试纸条进行测定，浓度分别重复测定10次，分别计算测定均值和标准偏差、CV值如表7、8所示。进行重复性考察，结果显示竞争法一中两种浓度重复性分别为4.8％、3.1％，竞争法二中两种浓度重复性分别为5.5％、7.0％，完全能够满足临床要求。
表7竞争法一试纸条重复性
序号 标准值2.5mIU/ml 标准值10.0mIU/ml
1 2.58 10.50
2 2.65 10.70
3 2.34 10.10
4 2.42 9.70
5 2.29 9.90
6 2.64 9.90
7 2.63 9.80
8 2.52 9.90
9 2.56 10.00
10 2.52 10.00
平均值 2.52 10.10
标准偏差 0.12 0.31
CV 4.8％ 3.1％
表8竞争法二试纸条重复性
序号 标准值2.5mIU/ml 标准值10.0mIU/ml
1 2.58 11.57
2 2.65 10.78
3 2.34 10.19
4 2.42 9.35
5 2.29 9.73
6 2.74 9.64
7 2.63 9.22
8 2.52 10.80
9 2.56 10.65
10 2.66 10.10
平均值 2.54 10.20
标准偏差 0.14 0.71
CV 5.5％ 7.0％

Claims (7)

1.基于金属纳米粒子增强荧光的干式免疫层析分析方法，其特征在于包括：
(I)夹心法：利用有机大分子或无机材料在金属纳米粒子表面形成5～20nm隔离层，将能够与待测分子特异性结合的探测分子连接到金属纳米粒子或隔离层表面，再标记上荧光物质，形成荧光物质距离金属纳米粒子表面的距离为5～20nm的荧光致敏金属纳米粒子复合物，将能够与待测分子特异性结合的捕获分子包被在硝酸纤维素膜检测线上，将荧光致敏金属纳米粒子复合物均匀分布于样品垫上，滴加样本后荧光致敏金属纳米粒子复合物随液体层析，荧光致敏金属纳米粒子和待测分子结合形成荧光致敏金属纳米粒子～待测分子复合物，最后复合物被捕获分子结合层析结束，在检测线上形成荧光致敏金属纳米粒子～待测分子～捕获分子复合物，此时复合物上荧光物质最大吸收峰和金属表面等离子体最大吸收峰耦合共振，通过表面等离子体振荡和电磁场剪裁效应，产生比自由态的荧光发射强度有显著增强的荧光发射，用荧光免疫定量分析仪检测荧光强度，进而回算待测样本中的目标分析物的浓度；
或者是将能够与待测分子特异性结合的捕获分子连接到金属纳米粒子表面后包被在硝酸纤维素膜检测线上，检测分子标记上荧光物质，均匀分布于样品垫上，滴加样本后荧光检测分子复合物随液体层析，荧光检测分子和待测分子结合形成复合物，最后复合物被金属纳米粒子上捕获分子捕获，在检测线上形成荧光探测分子～待测分子～捕获分子～金属纳米粒子复合物，此时荧光物质距离金属纳米粒子表面距离正好位于其等离子体共振距离范围内，荧光物质最大吸收峰和致敏金属纳米粒子表面等离子体最大吸收峰耦合共振，通过表面等离子体振荡和电磁场剪裁效应，产生比自由态的荧光发射强度有显著增强的荧光发射，用荧光免疫定量分析仪检测荧光强度进而回算待测样本中的目标分析物的浓度；
(II)竞争法：利用有机大分子或无机材料在金属纳米粒子表面形成5～20nm隔离层，将能够与待测分子特异性结合的探测分子连接到金属纳米粒子或隔离层表面，再标记上荧光物质，形成荧光物质距离金属纳米粒子表面的距离为5～20nm具有荧光标记效果的致敏金属纳米粒子复合物，将能够与待测分子竞争性结合致敏纳米金属粒子的竞争分子包被在硝酸纤维素膜检测线上，滴加样本后荧光致敏金属纳米粒子复合物随液体层析，硝酸纤维素膜上的竞争分子与待测分子将竞争结合金属纳米粒子，待测分子浓度越低，金属纳米粒子的荧光强度越强，反之则越弱，此时竞争分子上荧光物质最大吸收峰和致敏金属纳米粒子表面等离子体最大吸收峰耦合共振，通过表面等离子体振荡和电磁场剪裁效应，产生比自由态的荧光发射强度有显著增强的荧光发射，用荧光免疫定量分析仪检测荧光强度进而回算待测样本中的目标分析物的浓度；
或者是将能够与待测分子特异性结合的捕获分子连接到金属纳米粒子表面后包被在硝酸纤维素膜检测线上，能够和待测分子竞争性结合捕获分子的竞争分子标记上荧光物质，均匀分布于样品垫上，滴加样本后荧光竞争分子随液体层析，荧光竞争分子和待测分子竞争结合捕获分子，此时待测分子浓度越低，金属纳米粒子的荧光强度越强，反之则越弱，此时荧光物质距离金属纳米粒子表面距离正好位于其等离子体共振距离范围内，荧光物质最大吸收峰和致敏金属纳米粒子表面等离子体最大吸收峰耦合共振，通过表面等离子体振荡和电磁场剪裁效应，产生比自由态的荧光发射强度有显著增强的荧光发射，用荧光免疫定量分析仪检测荧光强度进而回算待测样本中的目标分析物的浓度。
2.根据权利要求1所述的基于金属纳米粒子增强荧光的干式免疫层析分析方法，其特征在于所述的夹心法中，探测分子通过共价偶联、结合对、物理吸附方式连接到金属纳米粒子或隔离层表面；所述的共价偶联方式选自金属纳米粒子隔离层表面修饰的巯基、氨基或羧基共价偶联至探测分子的氨基；所述结合对方式选自生物素～链霉亲和素、生物素～亲和素、凝集素～糖类、葡萄球菌A蛋白～IgG、抗原～抗体、阳离子～阴离子等。
3.根据权利要求1所述的基于金属纳米粒子增强荧光的干式免疫层析分析方法，其特征在于用于形成隔离层的有机大分子选自牛血清白蛋白、酪蛋白、超支化聚合物等；用于形成隔离层的无机材料选自二氧化硅、三氧化二铝、碱式碳酸钇等；所述的金属纳米粒子的粒径为1～100nm。
4.根据权利要求1所述的基于金属纳米粒子增强荧光的干式免疫层析分析方法，其特征在于夹心法中，所述的待测分子选自蛋白质或多肽，所述的蛋白质包括抗原或抗体；所述的探测分子选自可与待测分子特异性结合的蛋白质或多肽，所述的蛋白质包括抗体或抗原；所述的捕获分子选自与探测分子配对，并且能够与探测分子特异性结合的蛋白质或多肽，所述的蛋白质包括抗原或抗体；竞争法中，所述的待测分子选自小分子或半抗原；所述的竞争分子选自与待测分子具有相同或相似结构或相同或相似结合结构域的物质且能与捕获分子结合的物质，选自小分子、半抗原，大分子、抗原；所述的检测分子选自能与待测分子或竞争分子特异性结合的物质。
5.根据权利要求1所述的基于金属纳米粒子增强荧光的干式免疫层析分析方法，其特征在于所述的荧光物质选自异硫氰酸荧光素,3H-吲哚菁类染料、荧光素cy5、荧光素cy7、羧基荧光素、2-甲氧基荧光增强素、罗丹明、量子点、EGFP、藻红蛋白、铕、上转发光物质等物质中的一种或几种或含有上述荧光物质的复合物质。
6.基于金属纳米粒子增强荧光的干式免疫层析试剂盒，其特征在于所述试剂盒工作原理如权利要求1所述，该试剂盒由塑料底衬，样品垫，硝酸纤维素膜，吸水纸，质控线，检测线组成。
7.根据权利要求7所述的基于金属纳米粒子增强荧光的干式免疫层析检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括以下制法：
夹心法一：
1)致敏金属纳米粒子的制备：先将探测分子和荧光物质反应后透析形成探测分子～荧光素复合物，使用无机或有机分子包覆至金属纳米粒子表面形成5～20nm的隔离层，连接探测分子～荧光素复合物，反应完成后多次离心清洗去除游离的探测分子～荧光素复合物得到致敏金纳米粒子；
2)样品垫的制备：样品垫选用玻璃纤维或者聚酯材质，然后将样品垫用PBS缓冲液浸泡，取出后干燥，将上述致敏金属纳米粒子均匀涂布于样品垫上；
3)硝酸纤维素膜的处理：
A、检测线的制备：将待测分子捕获分子(若此处为竞争分子，则为竞争法一)用PB缓冲液稀释，在硝酸纤维素膜右端划线得到检测线；
B、质控线的制备：将兔抗鼠IgG抗体在硝酸纤维素膜右端划质控线，该线与检测线平行，与检测线间隔5mm，后在干燥箱内鼓风干燥；
4)吸水垫的制备：吸水纸裁剪成30*2.7cm每条；
5)组装：塑料底衬，样品垫和吸水纸为本领域通用的部件，将上述硝酸纤维素膜、吸水垫、样品垫粘贴在塑料底衬上，将贴好的中间物用斩切机切成一定宽度的试纸条。
夹心法二：
1)样品垫的制备：样品垫选用玻璃纤维或者聚酯材质，然后将样品垫用PBS缓冲液浸泡，取出后干燥，将待测分子检测分子(若此处为竞争分子，则为竞争法二)标记上荧光物质后均匀涂布于上述样品垫上；
2)硝酸纤维素膜的处理：
A、检测线的制备：将待测分子捕获分子连接至金属纳米粒子表面后用PB缓冲液稀释，在硝酸纤维素膜右端划线得到检测线；
B、质控线的制备：将兔抗鼠IgG抗体在硝酸纤维素膜右端划质控线，该线与检测线平行，与检测线间隔5mm，后在干燥箱内鼓风干燥；
3)吸水垫的制备：吸水纸裁剪成30*2.7cm每条；
4)组装：将上述硝酸纤维素膜、吸水垫、样品垫粘贴在塑料底衬上，将贴好的中间物用斩切机切成一定宽度的试纸条。
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