CN114167053A - 一种碳荧光微球侧流层析高灵敏定量检测方法及应用 - Google Patents
一种碳荧光微球侧流层析高灵敏定量检测方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种碳荧光微球侧流层析高灵敏定量检测方法及应用。所述检测方法利用碳荧光微球良好的荧光特性，结合碳荧光微球标记技术和侧流层析技术，在优化实验条件的基础上，构建荧光侧流层析试纸条。试纸条进行检测后，采用碳荧光微球侧流层析检测测试带和质控带荧光信号强度，并以荧光强度得到积分面积的曲线，进而依据碳荧光微球侧流层析仪获取的标准曲线实现分析物的定量检测。本发明的检测方法具有标记稳定性好、非特异性低、灵敏度高、线性范围宽以及定量准确的优势。本发明适用于夹心法和竞争法检测方法，分析物可以是小分子、抗原、抗体、激素、抗生素、细菌或病毒及其他生化标志物，可应用于食品安全、环境监测等诸多相关领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种侧流层析检测方法，尤其涉及一种以优选材料为基础，利用碳荧光微球标记配体实现分析物定量检测的方法及相应的碳荧光微球侧流层析试纸条，特别公开了一种基于碳荧光微球的荧光免疫层析技术，可实现多种分析物的半定量与定量检测，属于荧光免疫检测技术领域。
背景技术
侧流层析技术(Lateral flow assay，LFA)于1960年代末首次出现，用于监测血清蛋白。1976年出现了第一个自制的LFA，以检测尿液中的人绒毛膜促性腺激素(hCG)。该测试的原理基于抗体-抗原特异性相互作用。从那时起，它就被广泛用于检测各种分子，例如癌症标志物，微生物，霉菌毒素，重金属和农药等。与常规分析方法相比，侧流层析技术具有低成本，易于操作，使用方便，现场响应，结果可视化等诸多优点。其中，胶体金免疫层析使用最广泛。胶体金因其化学稳定性高、比表面积大、成本低、容易制备等优点成为最常用的标记物，但存在灵敏度偏低、稳定性差的局限。因此，层析技术迫切需要开发新型的标记材料。
荧光因其更灵敏而在传感和成像领域受到广泛关注。一些发光标记材料，例如荧光/磷光微球、量子点微球、上转换发光微球等材料也逐渐被引入层析技术，其灵敏度高于胶体金试纸条。但是，仍然存在一些问题，如制备工艺复杂、成本高、稀土上转换发光材料的量子效率通常较低且需要特定的激光器光源。因此，开发制备简单、成本低、发光强的荧光微球具有重要的现实意义。
碳点(Carbon dots，CDs)又称碳纳米点，是一类尺寸小于10nm的零维荧光准球形纳米粒子。CDs的关键特性包括激发光/pH依赖性、化学稳定性、抗光漂白性和上转换荧光。与半导体量子点相比，CDs的低毒性和高生物相容性使其成为生物成像和化学生物传感中半导体量子点的有力竞争者。基于CDs的荧光分析由于具有灵敏度高、操作简便、成本低等优势，在分析检测领域具有巨大的应用潜力。目前，基于碳点的侧流层析技术已有报道，然而，此类CDs的荧光量子效率偏低，构建二氧化硅包被的微球时会存在自淬灭等问题，靶标检测灵敏度偏低。因而，制备高量子效率的碳荧光微球并应用于侧流层析标记与检测具有重要意义。
发明内容
本发明的主要目的就是提供一种及碳荧光微球侧流层析高灵敏定量检测方法及相应的荧光侧流层析试纸条，以克服现有侧流层析标记材料存在的部分不足。
本发明的另一目的还在于提供一种碳荧光微球在侧流层析检测领域中的应用。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种非诊断目的的碳荧光微球侧流层析高灵敏定量检测方法，其包括：
1)使结构如式(Ⅰ)所示的化合物与支化聚乙烯亚胺进行水热反应，制得碳荧光微球；
2)在所述碳荧光微球的表面修饰羧基；
3)将待分析物对应的抗体或适配体连接到步骤2)所获碳荧光微球表面，得到抗体修饰的碳荧光微球或适配体修饰的碳荧光微球；
4)在层析膜上设有检测线和质控线，其中质控线固定有能与待分析物对应的抗体或适配体特异性结合的生物分子，所述检测线固定有能与待分析物结合或与步骤3)所述抗体或适配体竞争结合分析物的抗原或抗体；
5)以样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫、底板和卡壳构建成荧光侧流层析试纸条，其中所述层析膜为弱荧光层析膜，底板和卡壳具有低荧光特性；
6)将步骤3)所获抗体修饰的碳荧光微球或适配体修饰的碳荧光微球与可能含有待分析物的待检测样品混合，将形成的混合液施加于荧光侧流层析试纸条上进行层析，样品流经测试带和质控带后，检测测试带和质控带的荧光信号强度﹐并以荧光强度得到积分曲线，进而以获取的标准曲线实现待分析物的定量检测。
本发明实施例还提供了一种荧光侧流层析试纸条，其包括：沿设定方向依次连接的样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫，所述样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫设置于底板上，所述层析膜为弱荧光层析膜，所述层析膜上设置有检测线和质控线，其中质控线固定有能与待分析物对应的抗体或适配体特异性结合的生物分子，所述检测线固定有能与待分析物结合或与抗体或适配体竞争结合分析物的抗原或抗体。
本发明实施例还提供了一种产品，应用于待检测样品中待分析物的定量检测方法中，所述产品包括前述的荧光侧流层析试纸条，并且，所述的检测方法包括：
使结构如式(Ⅰ)所示的化合物与支化聚乙烯亚胺进行水热反应，制得碳荧光微球；
在所述碳荧光微球的表面修饰羧基；
将待分析物对应的抗体或适配体连接到碳荧光微球表面，得到抗体修饰的碳荧光微球或适配体修饰的碳荧光微球；以及，
将所获抗体修饰的碳荧光微球或适配体修饰的碳荧光微球与可能含有待分析物的待检测样品混合，将形成的混合液施加于荧光侧流层析试纸条上进行层析，样品流经测试带和质控带后，检测测试带和质控带的荧光信号强度﹐并以荧光强度得到积分曲线，进而以获取的标准曲线实现待分析物的定量检测。
与现有技术相比，本发明的优点包括：
1)本发明公开了一种碳荧光微球侧流层析高灵敏定量检测的方法以及应用，本发明的方法利用碳荧光微球良好的荧光特性，结合碳荧光微球标记技术和侧流层析技术，在优化实验条件的基础上，构建荧光侧流层析试纸条。本发明的检测方法简单、快速、准确、成本低，且灵敏度高。与常用的胶体金免疫层析方法相比，本发明具有标记稳定性好、非特异性低、灵敏度高、线性范围宽以及定量准确的优势。同时，本发明采用的碳荧光微球材料的制备步骤简单，量子效率高，且表面富含氨基，可进行表面修饰；
2)本发明的检测方法适用于夹心法和竞争法(抗原-抗体，适配体)检测方法，分析物可以是小分子、抗原、抗体、激素、抗生素、细菌或病毒及其他生化标志物，可应用于目标物质的定量检测、食品安全、环境监测等诸多相关领域。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一典型实施方案中碳荧光微球的制备及其与抗体偶联示意图；
图2是本发明一典型实施方案中一种免疫层析试纸条的组装示意图；
图3是本发明实施例1中基于竞争法原理的碳荧光微球标记免疫层析技术及AFB1检测示意图；
图4是本发明实施例1中碳荧光微球的TEM图片；
图5是本发明实施例1中碳荧光微球的红外光谱图；
图6a是本发明实施例1中免疫层析试纸条在不同浓度AFB1的图片(紫外灯照射下)；
图6b是本发明实施例1中免疫层析试纸条的T线与C线峰面积比值与AFB1浓度间的线性拟合结果图。
附图说明：1-样品垫，2-结合垫，3-检测线，4-质控线，5-吸水垫，6-PVC底板。
具体实施方式
鉴于现有技术的不足和缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，公开了一种碳荧光微球免疫层析高灵敏定量检测的方法，下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
本发明实施例的一个方面提供了一种碳荧光微球在侧流层析检测领域中的应用。
本发明所用碳荧光微球是由结构如式(Ⅰ)所示的化合物和支化聚乙烯亚胺经水热反应法合成，且碳荧光微球具有较强的光稳定性以及抗光漂白能力。
作为优选，在本发明的一个实施例中，如式(Ⅰ)所示的化合物(以下可简称为RB)、支化聚乙烯亚胺(PEI)经水热法合成了粒径在3～200nm之间的荧光微球。本发明采用的碳荧光微球材料的制备步骤简单，量子效率高，且表面富含氨基，可进行表面修饰。
本发明实施例的另一个方面提供了一种非诊断目的的碳荧光微球侧流层析高灵敏定量检测方法，其包括：
1)使结构如式(Ⅰ)所示的化合物与支化聚乙烯亚胺进行水热反应，制得碳荧光微球；
2)在所述碳荧光微球的表面修饰羧基；
3)将待分析物对应的抗体或适配体连接到步骤2)所获碳荧光微球表面，得到抗体修饰的碳荧光微球或适配体修饰的碳荧光微球；
4)在层析膜上设有检测线和质控线，其中质控线固定有能与待分析物对应的抗体或适配体特异性结合的生物分子，所述检测线固定有能与待分析物结合或与步骤3)所述抗体或适配体竞争结合分析物的抗原或抗体；
5)以样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫、底板和卡壳构建成荧光侧流层析试纸条；
6)将步骤3)所获抗体修饰的碳荧光微球或适配体修饰的碳荧光微球与可能含有待分析物的待检测样品混合，将形成的混合液施加于荧光侧流层析试纸条上进行层析，样品流经测试带和质控带后，检测测试带和质控带的荧光信号强度﹐并以荧光强度得到积分曲线，进而以获取的标准曲线(ST/SC)实现待分析物的定量检测。
本发明提供的碳荧光微球免疫层析高灵敏定量检测的方法是一种以碳荧光微球为荧光信号的、在免疫层析试纸条上实现分析物快速灵敏检测的新方法。
这种方法是将分析物的配体(如适配体、抗体等)修饰碳荧光微球，分析物的另一配体固定在层析膜上，利用配体作用，如竞争法或夹心法原理结合碳荧光微球的荧光性质检测样本中是否含有分析物。
本发明的层析试纸条用于定量样本中的至少一种待分析物。所述待分析物包括小分子、抗原、抗体、激素、抗生素、细菌或病毒及其他生化标志物。
在一些实施例中，所述待分析物包括有黄曲霉毒素B1(AFB1)、金黄色葡萄球菌以及大肠杆菌等。
本发明碳荧光微球免疫层析高灵敏定量检测的方法能够解决现有技术中背景与信号难区分、灵敏度低、荧光定量方法不准确的不足和缺陷，可实现对微量样本的检测。由于此碳荧光微球受激发光干扰很小，灵敏度大大提高，其灵敏度是用传统染料和有色标记物检测方法的10～1000倍。
在一些具体实施方案中，步骤1)具体包括：使结构如式(Ⅰ)所示的化合物与支化聚乙烯亚胺溶解于水中，并在80～220℃进行水热反应1～24h，制得碳荧光微球。本发明采用的碳荧光微球材料的制备步骤简单，量子效率高，且表面富含氨基，可进行表面修饰。
进一步地，所述碳荧光微球的粒径为3～200nm，优选为5～200nm。
进一步地，所述结构如式(Ⅰ)所示的化合物与支化聚乙烯亚胺的摩尔比(亦可称为在反应体系中的浓度比)为1:0.1～1。
进一步地，所述碳荧光微球的发射波长为500～700nm，且碳荧光微球具有较强的光稳定性以及抗光漂白能力。
在一些具体实施方案中，步骤2)具体包括：采用丁二酸酐法在所述碳荧光微球的表面修饰羧基，反应为无水条件，溶剂可以使用包括DMF，还可以使用二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇、乙醇、丙三醇等，但不限于此。
进一步地，步骤2)所获碳荧光微球的荧光发射波长为440～600nm。
在一些具体实施方案中，步骤3)具体包括：采用化学交联将待分析物对应的抗体或适配体连接到步骤2)所获碳荧光微球表面，得到抗体修饰的碳荧光微球或适配体修饰的碳荧光微球。本发明采用化学交联将分析物的配体连接到碳荧光微球表面，得到配体修饰的碳荧光微球，其中配体能与分析物特异性结合。
本发明中的化学交联为，当碳荧光微球表面有活性基团，可与配体或质控分子直接反应时，不需用化学交联剂，反之用化学交联剂把配体修饰到碳荧光微球表面。
在本发明的实施例中采用化学交联法对碳荧光微球进行蛋白质或核酸分子修饰的方法为：利用1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化偶联方法将将待分析物对应的抗体或适配体与碳荧光微球进行反应，即将碳荧光微球表面的官能团(如羧基、氨基)与蛋白质分子(如抗原、抗体等)或DNA链表面的官能团(如氨基、羧基、醛基等)连接。
其中具体的，反应所选缓冲液包括2-(N-吗啉)乙磺酸溶液，pH值为4.5～7.5。
进一步地，所述方法还包括：活化羧基后用碱性物质调节pH值至7.0。
作为优选，在本发明的一个实施例中，采用EDC/NHS交联法对量子点进行修饰，一般步骤为：将碳荧光微球溶液与EDC和NHS混合，然后加入一定量的蛋白质或DNA，以缓冲液为反应介质，孵育4h，加入BSA封闭，以色谱、层析柱或超滤离心等方式纯化，从而得到蛋白质或核酸修饰的碳荧光微球。
在一些具体实施方案中，步骤3)中，所述待分析物对应的抗体或适配体包括抗原、半抗原、单克隆抗体、多克隆抗体或适配体等。
进一步地，所述抗体修饰的碳荧光微球中抗体包括抗黄曲霉毒素B1的单克隆抗体，标记的能识别黄曲霉毒素B1的DNA链的序列如SEQ ID NO.1所示，具体序列为5’-HOOC-A12-GTT-GGG-CAC-GTG-TTG-TCT-CTC-TGT-GTC-TCG-TGC-CCT-TCG-CTA-GGC-CCA-CA-3’。
在一些具体实施方案中，步骤4)中，基于抗原-抗体和适配体的试纸条控制线固定材料不同。
进一步地，基于抗原-抗体的试纸条质控线为能与荧光标记抗体结合的抗体，而基于适配的试纸条质控线为碳荧光微球荧光标记DNA的互补链(与链霉亲和素结合)。
进一步地，基于抗原-抗体检测黄曲霉毒素B1的试纸条检测线固定有AFB1-BSA，质控线固定有山羊抗小鼠IgG。
进一步地，基于适配体检测黄曲霉毒素B1的试纸条检测线固定有AFB1-BSA，质控线固定有与碳荧光微球标记DNA链的互补链，序列如SEQ ID NO.2所示，具体为5’-biotin-TGT-GGG-CCT-AGC-GAA-GGG-CAC-GAG-ACA-CAG-AGA-GAC-AAC-ACG-TGC-CCA-AC-3’。
在本发明的一个实施例中，所述碳荧光微球标记的配体为抗黄曲霉毒素B1抗体，检测线上固定的AFB1-BSA，质控线固定能与抗AFB1抗体结合的抗体。
在本发明的另一个实施例中，所述碳荧光微球标记的配体为能识别黄曲霉毒素B1的DNA链，检测线上固定的AFB1-BSA，质控线固定与链霉亲和素结合的互补链。
在一些具体实施方案中，步骤4)中，所述检测线与质控线的间隔距离为3mm～10mm。
在一些具体实施方案中，所述层析膜为弱荧光层析膜，底板和卡壳具有低荧光特性。
进一步的，步骤4)中所述底板为荧光层析专用，不含荧光剂或荧光很弱。为了降低对碳荧光微球荧光信号的影响，本发明采用弱荧光层析膜、低荧光底板和低荧光扣卡，从而保证获得高荧光信背比，能良好区分信号与背景，进而提高检测灵敏度。
在一些具体实施方案中，步骤6)中，将步骤3)所获抗体修饰的碳荧光微球或适配体修饰的碳荧光微球与可能含有待分析物的待检测样品混合，将形成的混合液施加于荧光侧流层析试纸条的样品垫上之后等待30min以上。
进一步的，10μL荧光标记物与50μL样品混合，添加到样品垫上后需等待30min。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种荧光侧流层析试纸条，包括：沿设定方向依次连接的样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫，所述样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫设置于底板上，所述层析膜为弱荧光层析膜，所述层析膜上设置有检测线和质控线，其中质控线固定有能与待分析物对应的抗体或适配体特异性结合的生物分子，所述检测线固定有能与待分析物结合或与抗体或适配体竞争结合分析物的抗原或抗体。
进一步地，所述荧光侧流层析试纸条还包括卡壳，所述底板和卡壳具有低荧光特性，为了降低对碳荧光微球荧光信号的影响，本发明采用弱荧光层析膜、低荧光底板和低荧光扣卡，从而保证获得高荧光信背比，能良好区分信号与背景，进而提高检测灵敏度。
进一步地，所述试纸条中质控线、检测线等限定均如前所述，此处不再赘述。
具体的，请参阅图2所示，为免疫荧光侧流层析试纸条的组装示意图，其包括样品垫1、结合垫2、检测线(T线)3、质控线(C线)4、吸水垫5和PVC底板。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种产品，应用于待检测样品中待分析物的定量检测方法中，所述产品包括前述的荧光侧流层析试纸条，并且，所述的检测方法包括：
使结构如式(Ⅰ)所示的化合物与支化聚乙烯亚胺进行水热反应，制得碳荧光微球；
在所述碳荧光微球的表面修饰羧基；
将待分析物对应的抗体或适配体连接到碳荧光微球表面，得到抗体修饰的碳荧光微球或适配体修饰的碳荧光微球；以及，
将所获抗体修饰的碳荧光微球或适配体修饰的碳荧光微球与可能含有待分析物的待检测样品混合，将形成的混合液施加于荧光侧流层析试纸条上进行层析，样品流经测试带和质控带后，检测测试带和质控带的荧光信号强度﹐并以荧光强度得到积分曲线，进而以获取的标准曲线实现待分析物的定量检测。
综上所述，本发明利用碳荧光微球良好的荧光特性，结合碳荧光微球标记技术和侧流层析技术，在优化实验条件的基础上，构建荧光侧流层析试纸条。试纸条进行检测后，采用碳荧光微球侧流层析检测测试带和质控带荧光信号强度，并以荧光强度得到积分面积的曲线，进而依据碳荧光微球侧流层析仪获取的标准曲线实现分析物的定量检测。本发明方法简单、快速、准确、成本低，且灵敏度高。与常用的胶体金免疫层析方法相比，本发明具有标记稳定性好、非特异性低、灵敏度高、线性范围宽以及定量准确的优势。本发明适用于夹心法和竞争法(抗原-抗体，适配体)检测方法，分析物可以是小分子、抗原、抗体、激素、抗生素、细菌或病毒及其他生化标志物，可应用于体外诊断、食品安全、环境监测等诸多相关领域。
以下结合附图和若干较佳实施例对本发明的技术方案作进一步的解释说明，但其中的实验条件和设定参数不应视为对本发明基本技术方案的局限。并且本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1 基于抗原-抗体竞争法检测黄曲霉毒素B1
(一)碳荧光微球(FCNs)的合成及修饰(可参阅图1所示)
将45mg RB和60mg bPEI溶于15mL水中，转移到25mL水热反应釜中。将混合物置于烘箱中，在160℃下反应6h，冷却至室温后，经0.2μm膜过滤和透析(MV 3KD)纯化得到粗产物。将纯化后的FCNs冷冻干燥，得到固体粉末。所述碳荧光微球的TEM图片如图4所示，红外光谱图如图5所示。
将5mg FCNs分散在5mL DMSO中，加入25mg琥珀酸酐和25mg三乙胺搅拌反应2h，用水稀释，透析24h，冷冻干燥成固体粉末备用。
将1mg FCNs-COOH分散在5mL MES缓冲液(10mM，pH值为6.0)中。25μL EDC(10mg/mL)和75μL NHS(10mg/mL)被添加到500μL上述FCNs-COOH溶液中，反应30分钟。然后溶液的pH值调整到7.0，加入10μg抗AFB1抗体孵育4h。添加20μL 1％BSA到混合溶液，反应1h封闭结合位点。FCNs-mAbs用超滤管(30K)纯化，用PBS(10Mm，pH值为7.4)洗涤2次。最后用PBS稀释至500μL，4℃保存至使用。
(二)AFB1-BSA人工抗原的合成
-AFB1肟(AFB1O)的制备
a)500μL CMO(8mg/mL，溶于吡啶)溶解1mg AFB1，置于28℃摇床，150rpm，反应24h。
b)上述离心管中加入1.5mL超纯水，用NaOH(0.1mol/L)将pH值调至8.0。
c)上述离心管中加入2mL甲苯，剧烈震荡3min，静置分层，将水相吸取到干净的离心管中。
d)NaOH(0.1mol/L)将pH值调至8.0。
e)上述离心管中加入2mL乙酸乙酯，剧烈震荡3min，静置分层，将上层吸取到干净的离心管中。下层继续加入2mL乙酸乙酯，继续震荡重复前一步操作，收集上层。
f)上述离心管中加入1.5mL超纯水，剧烈震荡，静置分层后将上层弃掉。
g)通过真空干燥将上述混合物彻底干燥，得到肟化产物。
-AFB1肟与BSA偶联物的制备
a)将肟化产物用500μL DMF溶解后，加入2.5mg NHS、10mg EDC置于25℃摇床，120rpm，反应16h。
b)1mL BSA(6mg/mL，溶于0.13mol/L的NaHCO3)加到上述离心管中置于37℃摇床，120rpm，反应8h。
c)4℃环境下，在0.01mol/LPBS(pH值为7.4)中透析2天(24h更换一次透析液)，置于-20℃备用。
(三)免疫层析试纸条的构建
将由玻璃纤维制成的样品垫用20mmol/L硼酸钠缓冲液(pH 8.0)饱和，其中含有1.0％(w/v)BSA，0.25％Tween-20和0.1％(w/v)NaN3，并在60℃下放置干燥2小时。将1.0mg/mL的AFB1-BSA偶联物和1.0mg/mL的山羊抗小鼠IgG以0.74μL/cm的密度喷涂到NC膜上分别作为测试线(T线)和对照线(C线)。然后将所制备的NC膜在37℃下过夜干燥。LFIA试纸条是通过将样品垫，NC膜和吸收垫粘贴到PVC背衬卡上而彼此重叠2mm而构成的。将组装好的条切成4mm宽，将其包装在装有干燥剂的塑料袋中以备进一步使用。
(四)AFB1检测(请参阅图3所示)
以PBS作为稀释液，将AFB1标准溶液配制系列浓度如下：0ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL。将样品(60μL AFB1标准品或预处理颗粒样品)与10μL FCNs-mAbs混合在96孔板的孔中。孵育5min后，将试条垂直插入混合溶液中，反应30min后从孔板上取下。测试条安装在塑料壳中后，用紫外分析仪观察可视化结果。对于定量结果，将检测条插入荧光免疫层析仪进行分析，将T线和C线的荧光强度转换成一个积分区域来表示结果。为了减少干扰，提高信噪比(SNR)值，计算了T线和C线的荧光强度之比(ST/SC比)。通过绘制标准曲线量化ST/SC与AFB1浓度的关系。
图6a示出了试纸条在不同浓度AFB1的图片(紫外灯照射下)，图6b示出了T线与C线峰面积比值与AFB1浓度间的线性拟合结果图。
结果表明，该荧光免疫试纸条对于AFB1的检测范围为0.1-100ng/mL，检测限为0.056ng/mL，相关系数为0.9909，可用于检测AFB1。
实施例2 基于适配体竞争法检测黄曲霉毒素B1
(一)碳荧光微球(FCNs)的合成及修饰
将RB和bPEI按照摩尔比为1:1溶于15mL水中，转移到25mL水热反应釜中。将混合物置于烘箱中，在80℃下反应24h，冷却至室温后，经0.2μm膜过滤和透析(MV 3KD)纯化得到粗产物。将纯化后的FCNs冷冻干燥，得到固体粉末。
60μL EDC(2mg/mL)和30μL NHS(2mg/mL)添加到400μL羧基修饰的适配体(2nmol/mL)反应0.5h。1mg FCNs加入到500μL MES(0.5mM，pH值为6.1)缓冲溶液混合，摇床反应过夜。用超纯水清洗后存储在Tris-HCl缓冲液(10Mm，pH值为7.4)。检测探针DNA序列为：5’-HOOC-A12-GTT-GGG-CAC-GTG-TTG-TCT-CTC-TGT-GTC-TCG-TGC-CCT-TCG-CTA-GGC-CCA-CA-3’。互补探针序列为：5’-biotin-TGT-GGG-CCT-AGC-GAA-GGG-CAC-GAG-ACA-CAG-AGA-GAC-AAC-ACG-TGC-CCA-AC-3’。
(二)AFB1-BSA人工抗原的合成
-AFB1肟(AFB1O)的制备
a)500μL CMO(8mg/mL，溶于吡啶)溶解1mg AFB1，置于28℃摇床，150rpm，反应24h。
b)上述离心管中加入1.5mL超纯水，用NaOH(0.1mol/L)将pH值调至8.0。
c)上述离心管中加入2mL甲苯，剧烈震荡3min，静置分层，将水相吸取到干净的离心管中。
d)NaOH(0.1mol/L)将pH值调至8.0。
e)上述离心管中加入2mL乙酸乙酯，剧烈震荡3min，静置分层，将上层吸取到干净的离心管中。下层继续加入2mL乙酸乙酯，继续震荡重复前一步操作，收集上层。
f)上述离心管中加入1.5mL超纯水，剧烈震荡，静置分层后将上层弃掉。
g)通过真空干燥将上述混合物彻底干燥，得到肟化产物。
-AFB1肟与BSA偶联物的制备
a)将肟化产物用500μL DMF溶解后，加入2.5mg NHS、10mg EDC置于25℃摇床，120rpm，反应16h。
b)1mL BSA(6mg/mL，溶于0.13mol/L的NaHCO3)加到上述述离心管中置于37℃摇床，120rpm，反应8h。
c)4℃环境下，在0.01mol/LPBS(pH值为7.4)中透析2天(24h更换一次透析液)，置于-20℃备用。
(三)免疫层析试纸条的构建
将由玻璃纤维制成的样品垫用20mmol/L硼酸钠缓冲液(pH值为8.0)饱和，其中含有1.0％(w/v)BSA，0.25％Tween-20和0.1％(w/v)NaN3，并在60℃下放置干燥2小时。为了将互补探针固定在NC膜上，我们使用链霉亲和素作为中间体，使生物素与NC膜发生结合反应。具体方法为：在生物素修饰的互补探针(干粉)中加入20μL链霉亲和素(1mg/mL)，摇匀静置40min，得到100μM的捕获探针和互补探针溶液。然后将AFB1-BSA作为T线，将检测探针固定在NC膜上作为C线，在37℃烘箱中烘干。LFIA试纸条是通过将样品垫，NC膜和吸收垫粘贴到PVC背衬卡上而彼此重叠2mm而构成的。将组装好的试纸条切成4mm宽，将其包装在装有干燥剂的塑料袋中以备进一步使用。
(四)AFB1检测
以PBS作为稀释液，将AFB1标准溶液配制系列浓度如下：0ng/mL、0.01ng/mL、0.02ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL。将样品(60μL AFB1标准品或预处理颗粒样品)与10μL FCNs-mAbs混合在96孔板的孔中。孵育5min后，将试条垂直插入混合溶液中，反应30min后从孔板上取下。测试条安装在塑料壳中后，用紫外分析仪观察可视化结果。对于定量结果，将检测条插入荧光免疫层析仪进行分析，将T线和C线的荧光强度转换成一个积分区域来表示结果。为了减少干扰，提高信噪比(SNR)值，计算了T线和C线的荧光强度之比(ST/SC比)。通过绘制标准曲线量化ST/SC与AFB1浓度的关系。
结果表明，该荧光免疫试纸条对于AFB1的检测范围为0.01-1ng/mL，检测限为0.01ng/mL，相关系数为0.9897，可用于检测AFB1。
实施例3 基于双抗夹心法检测PSA抗原
(一)碳荧光微球(FCNs)的合成及修饰
将RB和bPEI按照摩尔比为1:0.1溶于15mL水中，转移到25mL水热反应釜中。将混合物置于烘箱中，在220℃下反应1h，冷却至室温后，经0.2μm膜过滤和透析(MV 3KD)纯化得到粗产物。将纯化后的FCNs冷冻干燥，得到固体粉末。
将5mg FCNs分散在5mL DMSO中，加入25mg琥珀酸酐和25mg三乙胺搅拌反应2h，用水稀释，透析24h，冷冻干燥成固体粉末备用。
将0.5mg FCNs-COOH溶于5mL PBS缓冲液(1X)中，得到FCNs悬浮液(0.1mg/mL)。然后将溶液的pH值调节至5.0以使FCNs的羧基质子化。之后，将EDC(19mg)和NHS(22mg)的混合物添加到该溶液中，以在室温下搅拌30分钟激活FCN羧基。然后，将FCNs悬浮液的pH值调节至7。向上述活化溶液中加入50μg PSA抗体，在室温下连续搅拌2小时，得到FCNs-抗体偶联物。添加25μL 1％BSA反应1h封闭未反应的羧基位点。将获得的FCNs-PSA抗体偶联物溶液在4℃下保持过夜，然后使用100K离心超滤管以4000rpm的速度离心20分钟，并在4℃下黑暗保存直至使用。
(二)免疫层析试纸条的构建
将由玻璃纤维制成的样品垫用20mmol/L硼酸钠缓冲液(pH值为8.0)饱和，其中含有1.0％(w/v)BSA，0.25％Tween-20和0.1％(w/v)NaN3，并在60℃下干燥放置2小时。将小鼠PSA单克隆抗体(0.8mg/mL)和山羊抗小鼠IgG抗体(0.5mg/mL)分别置于NC膜上作为T线和C线。将所制备的NC膜在37℃下过夜干燥。然后，将组装有样品垫，NC膜和吸收垫的塑料衬板切成4毫米宽的横向流动条。
(四)PSA抗原的检测
以PBS作为稀释液，将PSA抗原标准溶液配制系列浓度如下：0ng/mL、0.01ng/mL、0.02ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL。将样品(60μL PSA标准品或预处理样品)与10μLFCNs-mAbs混合在96孔板的孔中。孵育5min后，将试条垂直插入混合溶液中，反应30min后从孔板上取下。测试条安装在塑料壳中后，用紫外分析仪观察可视化结果。对于定量结果，将检测条插入荧光免疫层析仪进行分析，将T线和C线的荧光强度转换成一个积分区域来表示结果。为了减少干扰，提高信噪比(SNR)值，计算了T线和C线的荧光强度之比(ST/SC比)。通过绘制标准曲线量化ST/SC与PSA抗原浓度的关系。
实施例4 基于双抗夹心法检测大肠杆菌O157:H7(E.coli O157:H7)
(一)碳荧光微球(FCNs)的合成及修饰
将45mg RB和60mg bPEI溶于15mL水中，转移到25mL水热反应釜中。将混合物置于烘箱中，在160℃下反应6h，冷却至室温后，经0.2μm膜过滤和透析(MV 3KD)纯化得到粗产物。将纯化后的FCNs冷冻干燥，得到固体粉末。
将5mg FCNs分散在5mL DMSO中，加入25mg琥珀酸酐和25mg三乙胺搅拌反应2h，用水稀释，透析24h，冷冻干燥成固体粉末备用。
将0.5mg FCNs-COOH溶于5mL PBS缓冲液(1X)中，得到FCNs悬浮液(0.1mg/mL)。然后将溶液的pH值调节至5.0以使FCNs的羧基质子化。之后，将EDC(19mg)和NHS(22mg)的混合物添加到该溶液中，以在室温下搅拌30分钟激活FCN羧基。然后，将FCNs悬浮液的pH值调节至7.0。向上述活化溶液中加入20μg E.coli O157:H7抗体，在室温下连续搅拌2小时，得到FCNs-抗体偶联物。添加25μL 1％BSA反应1h封闭未反应的羧基位点。将获得的FCNs-mAbs偶联物溶液在4℃下保持过夜，然后使用100K离心超滤管以4000rpm的速度离心20分钟，并在4℃下黑暗保存直至使用。
(二)免疫层析试纸条的构建
将由玻璃纤维制成的样品垫用20mmol/L硼酸钠缓冲液(pH值为8.0)饱和，其中含有1.0％(w/v)BSA，0.25％Tween-20和0.1％(w/v)NaN3，并在60℃下干燥放置2小时。将小鼠E.coli O157:H7单克隆抗体(1mg/mL)和山羊抗小鼠IgG抗体(0.5mg/mL)分别置于NC膜上作为T线和C线。将所制备的NC膜在37℃下过夜干燥。然后，将组装有样品垫，NC膜和吸收垫的塑料衬板切成4毫米宽的横向流动条。
(四)E.coli O157:H7的检测
以PBS作为稀释液，将E.coli O157:H7配制系列浓度如下：2.5×105,1.25×105,5×104,2.5×104,1.25×104,5×103,2.5×103,1.25×103,5×102,2.5×102,1.25×101,5×100,and 0CFU/mL。将样品(60μL菌液或预处理样品)与10μL FCNs-mAbs混合在96孔板的孔中。孵育5min后，将试条垂直插入混合溶液中，反应30min后从孔板上取下。测试条安装在塑料壳中后，用紫外分析仪观察可视化结果。对于定量结果，将检测条插入荧光免疫层析仪进行分析，将T线和C线的荧光强度转换成一个积分区域来表示结果。为了减少干扰，提高信噪比(SNR)值，计算了T线和C线的荧光强度之比(ST/SC比)。通过绘制标准曲线量化ST/SC与E.coli O157:H7浓度的关系。
综上所述，藉由上述技术方案，本发明的检测方法具有标记稳定性好、非特异性低、灵敏度高、线性范围宽以及定量准确的优势。本发明适用于夹心法和竞争法检测方法，分析物可以是小分子、抗原、抗体、激素、抗生素、细菌或病毒及其他生化标志物，可应用于食品安全、环境监测等诸多相关领域。
此外，本案发明人还利用前文所列出的其它工艺条件等替代实施例1-4中的相应工艺条件进行了相应试验，所需要验证的内容和与实施例1-4产品均接近。故而此处不对各个实施例的验证内容进行逐一说明，仅以实施例1-4作为代表说明本发明申请优异之处。
本发明的各方面、实施例、特征及实例应视为在所有方面为说明性的且不打算限制本发明，本发明的范围仅由权利要求书界定。在不背离所主张的本发明的精神及范围的情况下，所属领域的技术人员将明了其它实施例、修改及使用。
尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例，而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。
序列表
<110> 宁波慈溪生物医学工程研究所、中国科学院宁波材料技术与工程研究所
<120> 一种碳荧光微球侧流层析高灵敏定量检测方法及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
gttgggcacg tgttgtctct ctgtgtctcg tgcccttcgc taggcccaca 50
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
tgtgggccta gcgaagggca cgagacacag agagacaaca cgtgcccaac 50
Claims (10)
1.一种非诊断目的的碳荧光微球侧流层析高灵敏定量检测方法，其特征在于，包括：
1)使结构如式(Ⅰ)所示的化合物与支化聚乙烯亚胺进行水热反应，制得碳荧光微球；
2)在所述碳荧光微球的表面修饰羧基；
3)将待分析物对应的抗体或适配体连接到步骤2)所获碳荧光微球表面，得到抗体修饰的碳荧光微球或适配体修饰的碳荧光微球；
4)在层析膜上设有检测线和质控线，其中质控线固定有能与待分析物对应的抗体或适配体特异性结合的生物分子，所述检测线固定有能与待分析物结合或与步骤3)所述抗体或适配体竞争结合分析物的抗原或抗体；
5)以样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫、底板和卡壳构建成荧光侧流层析试纸条，其中所述层析膜为弱荧光层析膜，底板和卡壳具有低荧光特性；
6)将步骤3)所获抗体修饰的碳荧光微球或适配体修饰的碳荧光微球与可能含有待分析物的待检测样品混合，将形成的混合液施加于荧光侧流层析试纸条上进行层析，样品流经测试带和质控带后，检测测试带和质控带的荧光信号强度﹐并以荧光强度得到积分曲线，进而以获取的标准曲线实现待分析物的定量检测。
2.根据权利要求1所述的碳荧光微球侧流层析高灵敏定量检测方法，其特征在于，步骤1)包括：使结构如式(Ⅰ)所示的化合物与支化聚乙烯亚胺溶解于水中，并在80～220℃进行水热反应1～24h，制得碳荧光微球；优选的，所述碳荧光微球的粒径为3～200nm；优选的，所述结构如式(Ⅰ)所示的化合物与支化聚乙烯亚胺的摩尔比为1:0.1～1；
和/或，所述碳荧光微球的发射波长为500～700nm。
3.根据权利要求1所述的碳荧光微球侧流层析高灵敏定量检测的方法，其特征在于，步骤2)包括：采用丁二酸酐法在所述碳荧光微球的表面修饰羧基，反应为无水条件，溶剂包括DMF、二甲基亚砜、乙二醇、乙醇、丙三醇中的任意一种或两种以上的组合；和/或，步骤2)所获碳荧光微球的荧光发射波长为440～600nm。
4.根据权利要求1所述的碳荧光微球侧流层析高灵敏定量检测的方法，其特征在于，步骤3)包括：采用化学交联将待分析物对应的抗体或适配体连接到步骤2)所获碳荧光微球表面，得到抗体修饰的碳荧光微球或适配体修饰的碳荧光微球；优选的，所述化学交联包括1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺活化偶联方法将待分析物对应的抗体或适配体与碳荧光微球进行反应，反应所选缓冲液包括2-(N-吗啉)乙磺酸溶液，pH值为4.5～7.5；优选的，所述方法还包括：活化羧基后用碱性物质调节pH值至7.0。
5.根据权利要求4所述的碳荧光微球侧流层析高灵敏定量检测的方法，其特征在于，步骤3)中，所述待分析物对应的抗体或适配体包括抗原、半抗原、单克隆抗体、多克隆抗体或适配体；
优选的，所述抗体修饰的碳荧光微球中抗体包括抗黄曲霉毒素B1的单克隆抗体，标记的能识别黄曲霉毒素B1的DNA链的序列如SEQ ID NO.1所示。
6.根据权利要求5所述的碳荧光微球侧流层析高灵敏定量检测的方法，其特征在于，步骤4)中，基于抗原-抗体的试纸条质控线为能与荧光标记抗体结合的抗体，而基于适配体的试纸条质控线为碳荧光微球荧光标记DNA的互补链；
优选的，基于抗原-抗体检测黄曲霉毒素B1的试纸条检测线固定有AFB1-BSA，质控线固定有山羊抗小鼠IgG；
优选的，基于适配体检测黄曲霉毒素B1的试纸条检测线固定有AFB1-BSA，质控线固定有与碳荧光微球荧光标记DNA链的互补链，具体序列如SEQ ID NO.2所示；
和/或，所述检测线与质控线的间隔距离为3mm～10mm。
7.根据权利要求1所述的碳荧光微球侧流层析高灵敏定量检测的方法，其特征在于：步骤6)中，将步骤3)所获抗体修饰的碳荧光微球或适配体修饰的碳荧光微球与可能含有待分析物的待检测样品混合，将形成的混合液施加于荧光侧流层析试纸条的样品垫上之后等待30min以上；
和/或，所述待分析物包括生化标志物，优选包括小分子、抗原、抗体、激素、抗生素、细菌或病毒，尤其优选的，所述待分析物包括黄曲霉毒素B1、金黄色葡萄球菌或大肠杆菌。
8.一种荧光侧流层析试纸条，其特征在于，包括：沿设定方向依次连接的样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫，所述样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫设置于底板上，所述层析膜为弱荧光层析膜，所述层析膜上设置有检测线和质控线，其中质控线固定有能与待分析物对应的抗体或适配体特异性结合的生物分子，所述检测线固定有能与待分析物结合或与抗体或适配体竞争结合分析物的抗原或抗体。
9.根据权利要求8所述的荧光侧流层析试纸条，其特征在于：所述荧光侧流层析试纸条还包括卡壳，所述底板和卡壳具有低荧光特性；
和/或，基于抗原-抗体的试纸条质控线为能与荧光标记抗体结合的抗体，而基于适配体的试纸条质控线为碳荧光微球荧光标记DNA的互补链；
优选的，基于抗原-抗体检测黄曲霉毒素B1的试纸条检测线固定有AFB1-BSA，质控线固定有山羊抗小鼠IgG；
优选的，基于适配体检测黄曲霉毒素B1的试纸条检测线固定有AFB1-BSA，质控线固定有与碳荧光微球荧光标记DNA链的互补链，具体序列如SEQ ID NO.2所示；
和/或，所述检测线与质控线的间隔距离为3mm～10mm。
10.一种产品，应用于待检测样品中待分析物的定量检测方法中，其特征在于：所述产品包括权利要求8-9中任一项所述的荧光侧流层析试纸条，并且，所述的检测方法包括：
使结构如式(Ⅰ)所示的化合物与支化聚乙烯亚胺进行水热反应，制得碳荧光微球；
在所述碳荧光微球的表面修饰羧基；
将待分析物对应的抗体或适配体连接到碳荧光微球表面，得到抗体修饰的碳荧光微球或适配体修饰的碳荧光微球；以及，
将所获抗体修饰的碳荧光微球或适配体修饰的碳荧光微球与可能含有待分析物的待检测样品混合，将形成的混合液施加于荧光侧流层析试纸条上进行层析，样品流经测试带和质控带后，检测测试带和质控带的荧光信号强度﹐并以荧光强度得到积分曲线，进而以获取的标准曲线实现待分析物的定量检测。
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