CN103940798A - 一种实体荧光纳米微球及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种实体荧光纳米微球及其制备方法和应用，属于荧光检测技术领域。本发明的实体荧光纳米微球是由羧基罗丹明B与苯乙炔共价加成得到罗丹明B-苯乙烯，再由罗丹明B-苯乙烯与苯乙烯按照1:1～12的摩尔比聚合而成。本发明将荧光分子嵌入到聚苯乙烯的空间网络中，得到的实体荧光微球具有微球间荧光强弱均匀一致、荧光强度高、信号放大倍数高等特点，由于微球表面没有荧光分子的阻碍，微球能与蛋白进行高效率、高产率的偶联。且该微球产生的荧光背景低，不会影响检测结果的精确性，可广泛应用于诊断试剂中。
Description
技术领域
本发明涉及荧光检测技术领域，具体涉及一种实体荧光纳米微球及其制备方法和在免疫定量层析中的应用。
背景技术
侧向层析法在疾病快速诊断、小分子快速检测等领域已得到了广泛的应用。其原理是将特异性的抗原或抗体包被到硝酸纤维素膜上，构成检测线，将二抗包被在距离检测线2～3毫米的区域构成质控线。当样本中的目标分子与带有特定标记物的检测抗体结合后，从硝酸纤维素膜的上样端向吸水端层析。由于毛细管作用，复合物将沿着膜向前移动，但移动到检测线时，样品中的目标分子将被检测线中的捕获抗体捕捉而停留在检测线上，多余的检测抗体则通过检测线后被质控线的二抗所捕捉。常用的标记物为胶体金颗粒、酶以及着色微球。胶体金颗粒和着色微球是通过静电吸附将抗原或抗体标记到颗粒表面，通过观察胶体金颗粒或着色微球在检测线上的聚集显色判断检测结果。而酶标记则通过催化底物显色，显示检测结果。以上标记技术都是通过显色和比色的方法来进行检测，存在依靠肉眼识别、灵敏度低、无法精确定量等缺点。
传统的侧向层析产品主要是金标试纸卡。金标试纸卡是主要利用胶体金的电荷性通过静电相互作用标记抗体、层析显色的检测技术，该技术主要用于定性检测，如早早孕等产品。随着CCD图像技术的发展，胶体金发展出半定量产品，即通过T线和C线颜色的深浅进行定量检测。但这种半定量检测类似于照相比色定量技术，具有分辨率低，精确度低，误差很大的缺点。
荧光标记技术具有灵敏度高、操作简单等特点，已被广泛用于生物检测领域。如DNA测序、蛋白表达分析、细胞成像、活体成像、临床诊断等。荧光微球技术是将聚苯乙烯羧基微球、荧光染料标记系统、激光技术、应用流体学及微球专用流式细胞仪等有机整合在一起的一项新技术，通过荧光微球信号来进行实验数据采集和分析，具有快速分析多重生物反应的特点及高灵敏度和特异性，可用于抗原抗体、核酸探针检测等领域的研究。
通常的荧光微球多为表面荧光微球，即将荧光分子通过特定的官能团偶联到微球表面制得，表面荧光微球存在荧光较弱、均一性较差等不足。
发明内容
为了解决现有技术中的上述问题，本发明提供了一种实体荧光纳米微球的制备方法。
本发明建立了一种基于近红外荧光分子的聚苯乙烯材料合成荧光纳米微球的方法，将近红外荧光分子偶联到苯乙烯分子上，通过聚合反应，整合到聚乙烯微球的分子内部。获得的微球属于实体荧光微球，荧光很强，荧光均一性很好。
本发明的技术方案：
一种实体荧光纳米微球的制备方法，是将羧基罗丹明B与苯乙炔共价加成得到罗丹明B-苯乙烯，再由罗丹明B-苯乙烯与苯乙烯按照1:1～12 的摩尔比聚合，获得实体荧光纳米微球。具体合成路线参见图1和图2。
聚苯乙烯是一种无色透明的热塑性塑料，质地硬而脆，可以和多种染料混合产生不同的颜色。本发明所采用的荧光分子是罗丹明B，又称玫瑰红B、或碱性玫瑰精，俗称花粉红，是一种具有鲜艳桃红色的人工合成的染料，吸收波长在540nm，属于绿光区；最大发射波长在610nm，属于红光区。540nm的激发光脱离了紫外光区，能量较小，对生物体不会产生较高的背景荧光，而且与610nm的吸收波长相隔70nm的激发范围，一般的生物材料产生的荧光达不到如此高的能量激发，因此产生的背景荧光更弱。
本发明将羧基罗丹明B分子和苯乙炔分子进行1:1加成反应，制得罗丹明B-苯乙烯，再将罗丹明B-苯乙烯和苯乙烯进行聚合反应，生成罗丹明B聚苯乙烯，再将罗丹明B聚苯乙烯制成不同粒径的纳米微球。
优选地，所述的实体荧光纳米微球的制备方法，步骤如下：
（1）罗丹明B的DMSO（二甲基亚砜）溶液与苯乙炔的DMSO溶液混合，混合液中加入CuCl2的水溶液，混合得反应体系，再加水，在惰性气体保护下搅拌反应2～4小时；
（2）步骤（1）反应结束后，加入SDS（十二烷基磺酸钠）、CHPO（过氧化羟基二异丙苯）、TEPA（四乙烯五胺），以及苯乙烯的DMSO溶液，惰性气体保护下搅拌反应2～4h，获得聚合物；
（3）聚合物经过离心，取沉淀洗涤，干燥，得到实体荧光纳米微球。
优选地，步骤（1）所述罗丹明B的DMSO溶液中罗丹明B的浓度为0.1～1mol/L；所述苯乙炔的DMSO溶液中苯乙炔的浓度为0.1～1mol/L；所述CuCl2的水溶液中CuCl2的浓度为0.05～0.5mol/L。
优选地，步骤（1）加水的量与反应体系的体积比为5～30:4。
优选地，步骤（2）所述苯乙烯的DMSO溶液中苯乙烯浓度为0.5～5mol/L。
优选地，所述惰性气体为氮气；步骤（2）搅拌速度为1000～5000rpm，反应温度为41～43℃。
上述实体荧光纳米微球的制备方法中，SDS作为乳化剂，CHPO和TEPA作为氧化-还原引发剂，其加入量可根据实际需要进行调整，实现其各自功能即可，例如SDS在整个体系的终浓度为1.42～50.00g/L，CHPO在整个体系的终浓度为0.82～29.00g/L，TEPA在整个体系的终浓度为0.65～23.00g/L。
由上述实体荧光纳米微球的制备方法获得的实体荧光纳米微球也在本发明保护范围之内。
本发明还提供上述实体荧光纳米微球在制备荧光检测试剂中的应用。
基于上述实体荧光纳米微球，可以采用侧向层析技术，制备近红外免疫层析定量试纸条，例如硝酸纤维素膜上包被检测线和质控线抗体。在检测过程中，利用荧光扫描仪，分别扫描质控线和检测线，激发荧光分子发光。荧光经滤光片过滤后，被传感器捕捉转换成电信号，经光电倍增管再转换成数字信号。将质控线荧光强度校正检测线荧光强度后代入荧光分析仪中的标准曲线，即可获得样本中待测物的含量。该方法与荧光分子直接标记到纳米微球表面相比，属于实体荧光，荧光更强、更稳定，显著提高了检测灵敏度，降低了背景荧光强度。该方法可广泛用于食品、病毒、微生物、细胞因子、血液因子、毒品、危险化学品的快速定量检测和应用。
本发明还提供一种荧光定量检测试剂盒，包括：由本发明的实体荧光纳米微球标记的检测抗体和免疫层析试纸，检测抗体能与待检测物质特异性结合；所述免疫层析试纸为固定有检测线和质控线的纤维层析材料，检测线固定有与检测抗体特异性结合的捕捉抗体，质控线固定有其他抗体，所述其他抗体能与检测抗体结合但不与待检测物质结合。
上述检测试剂盒是利用夹心法检测目标分子（待检测物质），检测时，在免疫层析试纸的检测线上固定的是与目标分子可以特异性结合的捕捉抗体，在质控线上作为参照物固定的是与目标分子和检测线固定的分子无关的其他抗体，通常为山羊抗鼠多克隆抗体。荧光微球标记的检测抗体被定量分装到0.5mL EP管底部冻干保存。当含有目标分子的样品与上样缓冲液按1:1混匀，加入到检测抗体的冻干管中，混匀，这时目标分子与溶解后的荧光微球标记的检测抗体形成抗原抗体复合物。然后把它们滴加到试纸的滤血垫上进行层析。抗原抗体复合物及多余的没结合抗原的荧光微球抗体随溶液向试纸条上端移动。当抗原抗体复合物移动到检测线时，被固定在检测线上的捕捉抗体所捕获，而未结合抗原的荧光微球抗体则被质控线的二抗所捕获。反应结束后，用荧光扫描仪扫描检测线和质控线的荧光的峰面积，并对峰面积进行积分。由于所使用的荧光微球的量一定，故以质控线的荧光的峰面积作为内参，通过计算检测线与质控线荧光强度的比值，并且与标准工作曲线进行计算，就能够得出样品中目标分子的浓度。
本发明还提供一种荧光定量检测试剂盒，包括荧光微球抗体混合物和免疫层析试纸；荧光微球混合物包括本发明的实体荧光纳米微球标记的检测抗体和鼠IgG，检测抗体为能与待检测物质特异性结合的单克隆抗体；免疫层析试纸为固定有检测线和质控线的纤维层析材料，检测线固定有与待检物质特异性结合的BSA（牛血清白蛋白）偶联物，质控线固定有羊抗鼠内参抗体。
上述检测试剂盒是利用竞争法检测目标分子（待检测物质）：在免疫层析试纸的检测线上固定的是目标分子-BSA偶联物，在质控线上固定的是内参羊抗鼠。微球管中预先干燥了两种荧光微球抗体的混合物，分别是抗目标分子的单抗和鼠IgG。将样品液和上样缓冲液按1:1加入到微球中，混匀，滴加到试纸上，样品中的目标分子与它的微球单抗结合，迅速通过检测线和质控线；而多余的没有饱和的微球单抗则被检测线上的目标分子捕捉，鼠IgG则被羊抗鼠多抗捕捉在质控线。反应结束后，扫描荧光强度，通过标准曲线求出样品中目标分子的浓度。目标分子浓度越高，则检测线的荧光强度越弱。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明采用的实体荧光微球技术不同于一般的表面荧光微球技术。表面荧光微球技术是通过活化分子，对微球表面的羧基或氨基进行活化后，将荧光分子通过取代反应偶联到微球表面，反应过程由于必须在常温常压下进行，往往造成偶联反应的不彻底，因此，得到的表面荧光微球具有微球间荧光强弱不均匀、荧光强度低等缺点，还由于表面荧光分子的覆盖，往往还会造成蛋白分子偶联的低效率和致死性。而本发明首先将荧光分子偶联到苯乙烯分子上，合成得到荧光苯乙烯，再按一定的比例将荧光苯乙烯和苯乙烯混合，聚合成荧光聚苯乙烯。在聚合的过程中，荧光分子嵌入到聚苯乙烯的空间网络中，得到实体荧光微球。本发明得到的实体荧光微球具有微球间荧光强弱均匀一致、荧光强度高、信号放大倍数高等特点，而且由于微球表面没有荧光分子的阻碍，微球能与蛋白进行高效率、高产率的偶联。而且，本发明采用的是罗丹明B，激发波长547nm，具有较高的能量，能完全激发微球内部荧光分子的活化；吸收波长610nm，属于红外波长，所产生的荧光背景低，不会影响检测结果的精确性。
2、荧光微球用于诊断试剂，可以放大生物信号，极大提高灵敏度。根据粒径的不同，本发明的每个实体微球中含有几十至几千个荧光分子，当标记了抗体的荧光微球与抗原偶联后，单分子的抗原信号就被放大成几百几千倍的荧光信号，更易于被荧光扫描仪所捕捉。
3、实体荧光微球在侧向层析快速检测试剂的应用中可用于生产高精度的定量产品。本发明利用实体荧光微球技术，将荧光微球标记到抗体上，结合CMOS光感应技术，即使很微弱的荧光也可以捕捉到。因此，本发明所制备的快速检测试纸具有高精度、高分辨率和低误差的优点，属于全定量检测产品。本发明解决了传统荧光微球荧光较弱、荧光均一性差、信号放大不稳定的问题，提高了检测试剂中荧光的强度、均一性和灵敏度。
附图说明
图1、是罗丹明B和苯乙炔水合成罗丹明B-苯乙烯的路线图。
图2、是苯乙烯和罗丹明B-苯乙烯按5:1的摩尔比聚合成罗丹明聚苯乙烯的路线图，其中R基表示罗丹明B基团。
图3是免疫层析卡示意图，其中，1滤血垫，2硝酸纤维素膜，3检测线，4质控线，5吸水垫。
图4是NT-proBNP标准曲线，横坐标为NT-proBNP浓度，纵坐标为信号值。
图5是对NT-proBNP血液样品的检测结果图，横坐标为荧光扫描范围，纵坐标为荧光强度。
图6是对cTnI血液样品的检测结果图，横坐标为荧光扫描范围，纵坐标为荧光强度。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。实施例中使用的试剂、药品均为市售商品。
实施例1：实体荧光纳米微球的合成
1、将1～10mmol的罗丹明B溶解于10mL的DMSO中。
2、将1～10mmol苯乙炔溶解于10mL的DMSO中，然后与罗丹明B的DMSO溶液混合。
3、在步骤2的反应体系中加入20mL的1～10mmol的CuCl2水溶液，在混合液中加入50～300mL的水，在室温下以300rpm的转速通氮气保护搅拌反应2～4h。
4、在步骤3的反应体系中加入0.5～5g 十二烷基磺酸钠(SDS)作为乳化剂，0.29～2.9g 过氧化羟基二异丙苯(CHPO)和0.23～2.3g四乙烯五胺(TEPA)作为氧化-还原引发剂，5～50mmol的苯乙烯的10mL的DMSO溶液作为反应剂，通入氮气(N2)，持续以1000～5000rmp的转速搅拌，42℃聚合反应2～4h。
5、将所得聚合物在8000～10000rpm的转速下离心，取沉淀，用乙醇洗涤后真空干燥，即为近红外实体荧光纳米微球（以下简称微球），粒径大小50～300纳米。
表1 不同转速在聚合反应中对微球粒径大小的影响
| 转速（rpm） | 1000 | 1500 | 2000 | 2500 | 3000 |
| 所得微球粒径（nm） | 300 | 220 | 150 | 80 | 50 |
注：10mmol罗丹明B-苯乙烯和50mmol苯乙烯在不同转速下得到的微球粒径，加水量为300mL。
表2 不同水含量在聚合反应中对微球粒径大小影响
| 水含量（mL） | 50 | 100 | 150 | 200 | 250 | 300 |
| 所得微球粒径（nm） | 330 | 240 | 160 | 120 | 80 | 50 |
注：10mmol罗丹明B-苯乙烯和50mmol苯乙烯在不同加水量下得到的微球粒径，转速为3000rpm。
实施例2 实体荧光纳米微球制备
1、将0.1g 罗丹明B溶解于200μL的DMSO中。
2、将0.1g苯乙炔溶解于200μL的DMSO中，然后与罗丹明B的DMSO溶液混溶。
3、在反应体系中加入5mL水，室温下搅拌反应2h。
4、在反应体系中加入0.5g 十二烷基磺酸钠(SDS)作为乳化剂，0.29g 过氧化羟基二异丙苯(CHPO)和0.23g四乙烯五胺(TEPA)作为氧化-还原引发剂，0.5g苯乙烯作为反应剂，通N2，持续以5000rmp搅拌，42℃聚合2h。
5、将所得聚合物用乙醇洗涤后真空干燥，获得产品。
实施例3：制作实体荧光纳米微球NT-proBNP的免疫层析检测试剂
1、标记抗体：
⑴ 取0.5mL实体荧光纳米微球，离心取沉淀，加入pH 6.0的MES缓冲液洗涤两次。
⑵ 活化：在洗涤后的微球中加入200μL的50mM的碳二亚胺(EDAC)和200μL的50mM的羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)，室温震荡2h。
⑶ 离心微球，用PBS洗涤两次。
⑷ 加入适当量的抗体，室温震荡2h。
⑸ 离心微球，加入50mM的甘氨酸淬灭反应，室温震荡5min；然后离心微球，加入50mM的甘氨酸彻底淬灭反应，室温震荡15min。
⑹ 离心微球，加入封闭液（1% BSA，5%蔗糖，0.2% Tween-20，0.1%叠氮化钠，25mM Tris-HCl），室温震荡1h。
⑺ 加入200μL封闭液保存于4℃。
2、制作免疫层析试纸条
选取玻璃纤维素膜，将NT-proBNP的捕捉抗体4NT1（来源于芬兰Hytest公司）和羊抗鼠IgG多克隆抗体（英国Abcam公司）用划线机在膜上制成检测带和质控带，检测带和质控带间距0.4cm，室温风干膜条带。
3、组装检测试纸卡
将免疫层析试纸条、滤血垫和吸水垫切条后按如图3方式按照顺序放入塑料卡槽中安装好，组装成品试纸卡。
实施例4：检测NT-proBNP标准品
连续稀释NT-proBNP标准品（芬兰Hytest公司），用稀释液（含5% BSA、0.1% Tween-20的PBS）将标准品进行10倍稀释，制成40000ng/L、4000ng/L、400ng/L、40ng/L、4ng/L的样品。用移液器取75μL样品溶液，加入到225μL的样品缓冲液（含0.2% Tween-20的PBS）中，加入3μL微球，混匀后取75μL点加到试纸卡的加样孔中。室温静置15min，将试纸卡放到荧光扫描仪中读数。用检测线荧光值除以质控线荧光值为测量值。每个样品浓度进行测量两次，取平均值后，以测量值对样品浓度作图。结果如表3和图4所示。
表3 不同浓度的NT-proBNP对应检测结果
| 样品号 | NT-proBNP (ng/L) | 信号值（T/(T+C)) | 误差 |
| 1 | 20 | 0.0006 | 0.04 |
| 2 | 50 | 0.0014 | 0.08 |
| 3 | 100 | 0.0022 | 0.14 |
| 4 | 200 | 0.0046 | 0.11 |
| 5 | 400 | 0.0095 | 0.16 |
| 6 | 800 | 0.0213 | 0.34 |
| 7 | 1200 | 0.0287 | 0.21 |
| 8 | 1600 | 0.0425 | 0.25 |
实施例5：检测NT-proBNP血液样品
稀释NT-proBNP标准品（芬兰Hytest公司），用不含有NT-proBNP的标准血清（芬兰Hytest公司），制成200ng/L、100ng/L、20ng/L的样品。用移液器取75μL样品溶液，加入到225μL的样品缓冲液（含0.2% Tween-20的PBS）中，加入3μL微球，混匀后取75μL点加到试纸卡的加样孔中。室温静置15min，将试纸卡放到荧光扫描仪中读数。用检测线荧光值除以质控线荧光值为测量值。每个样品浓度进行测量两次，取平均值后，以测量值对样品浓度作图。结果如图5所示，精确度可以达到pg/mL级别。
实施例6：检测cTnI血液样品
稀释cTnI标准品（芬兰Hytest公司），用不含有cTnI的标准血清（芬兰Hytest公司），制成3ng/L、0.3ng/L的样品。用移液器取75μL样品溶液，加入到225μL的样品缓冲液（含0.2% Tween-20的PBS）中，加入3μL微球，混匀后取75μL点加到试纸卡的加样孔中。室温静置15min，将试纸卡放到荧光扫描仪中读数。用检测线荧光值除以质控线荧光值为测量值。每个样品浓度进行测量两次，取平均值后，以测量值对样品浓度作图。结果如图6所示，精确度可以达到0.03ng/mL级别。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (10)
1.一种实体荧光纳米微球的制备方法，其特征在于，由羧基罗丹明B与苯乙炔共价加成得到罗丹明B-苯乙烯，再由罗丹明B-苯乙烯与苯乙烯按照1:1～12 的摩尔比聚合，获得实体荧光纳米微球。
2.权利要求1所述的实体荧光纳米微球的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）罗丹明B的DMSO溶液与苯乙炔的DMSO溶液混合，混合液中加入CuCl2的水溶液，混合得反应体系，再加水，在惰性气体保护下搅拌反应2～4小时；
（2）步骤（1）反应结束后，加入SDS、CHPO、TEPA，以及苯乙烯的DMSO溶液，惰性气体保护下搅拌反应2～4h，获得聚合物；
（3）聚合物经过离心，取沉淀洗涤，干燥，得到实体荧光纳米微球。
3.根据权利要求2所述的实体荧光纳米微球的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述罗丹明B的DMSO溶液中罗丹明B的浓度为0.1～1mol/L；所述苯乙炔的DMSO溶液中苯乙炔的浓度为0.1～1mol/L；所述CuCl2的水溶液中CuCl2的浓度为0.05～0.5mol/L。
4.根据权利要求2所述的实体荧光纳米微球的制备方法，其特征在于，步骤（1）加水的量与反应体系的体积比为5～30:4。
5.根据权利要求2所述的实体荧光纳米微球的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述苯乙烯的DMSO溶液中苯乙烯浓度为0.5～5mol/L。
6.根据权利要求2所述的实体荧光纳米微球的制备方法，其特征在于，所述惰性气体为氮气；步骤（2）搅拌速度为1000～5000rpm，反应温度为41～43℃。
7.由权利要求1～6任一所述的实体荧光纳米微球的制备方法获得的实体荧光纳米微球。
8.权利要求7所述的实体荧光纳米微球在制备荧光检测试剂中的应用。
9.一种荧光定量检测试剂盒，其特征在于，包括：由权利要求7所述的实体荧光纳米微球标记的检测抗体和免疫层析试纸，检测抗体能与待检测物质特异性结合；
所述免疫层析试纸为固定有检测线和质控线的纤维层析材料，检测线固定有与检测抗体特异性结合的捕捉抗体，质控线固定有其他抗体，所述其他抗体能与检测抗体结合但不与待检测物质结合。
10.一种荧光定量检测试剂盒，其特征在于，包括荧光微球抗体混合物和免疫层析试纸；
荧光微球混合物包括由权利要求7所述的实体荧光纳米微球标记的检测抗体和鼠IgG，检测抗体为能与待检测物质特异性结合的单克隆抗体；
免疫层析试纸为固定有检测线和质控线的纤维层析材料，检测线固定有与待检物质特异性结合的BSA偶联物，质控线固定有羊抗鼠内参抗体。
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