JP2002207041A - 発光アリールスルホネートシアニン染料を用いた物質の標識ないし検出方法 - Google Patents
発光アリールスルホネートシアニン染料を用いた物質の標識ないし検出方法Info
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Abstract
物質を提供すること。 【解決手段】 下記水性液体中の成分に共有結合反応性
の、芳香族核に結合したスルホン酸基若しくはスルホネ
ート基少なくとも1個を有するシアニン、メロシアニン
およびスチリル染料よりる群から選ばれる発光染料を結
合して含む、水性液体中の発光標識成分。
Description
ホネートシアニン染料を用いた物質の標識および検出に
関する。
料は写真フィルムに用いられてきた。斯かる染料は吸光
特性を必要とするが、ルミネッセンス(蛍光若しくは燐
光)特性を必要としない。これまでルミネッセンス特性
を有するシアニン染料は非常に限られた用途しかなかっ
た。斯かる用途に取分け蛋白のスルフヒドリル基を標識
することが含まれる。「スルフヒドリル試薬染料は筋形
質小網嚢(SR)からの迅速Ca2+解放を開始させる
(Sulfhydryl Reagent DyesTr
igger the Rapid Release of
Ca2 from Sacoplasmic Reticu
lum Vesicles(SR))」と題する論文
で、Salama G.Waggoner A.S.Ab
ramsonJ.は、ヨードアセチル基を有するシアニ
ン発色団がCa2+解放を開始させるべくpH6.7で筋
形質小網蛋白上のスルフヒドリル基と共有結合を形成す
るのに用いられたことを報告している(Biophys
ical Journal、47、456a(198
5))。この論文はまた、蛍光染料が蛋白の標識ないし
単離に用いられたことを述べている。
シン分子領域での配座変化の力学(Kinetics
of Conformational Changes
ina Region of the Rhodopsin
Molecule AwayFrom the Reti
nylidene Binding Site)」と題
する論文で、Waggoner A.S.、Jenki
ns P.L.、Carpenter J.P.および
Gupta R.は、牛ロドプシンのF1領域上のスル
フヒドリル基が660nmで吸光度を有するシアニン染
料により共有標識されたことを報告している〔Biop
hysical Journal、33、292a(1
985)〕。ここでも、特に蛋白のスルフヒドリル基を
標識するのにシアニン染料を用いたことが報告されてい
るが、蛍光染料の使用については開示されていない。
ブリーチ技法の応用に関する国際ゼミ(Interna
tional Workshop on the Appl
ication of Fluorescence ph
otobleaching Techniques to
Problems in Cell Biology)」
と題する記事には蛋白質に複合され得しかもスペクトル
の濃赤領域で励起されうるシアニンタイプ蛍光プローブ
に関するJacobson K.、ElsonE.、K
oppel D.およびWebb W.の論文が報告され
ている(Fed.Proc.42:72−79(198
3))。
る唯一のシアニンプローブは特に蛋白質のスルフヒドリ
ル基に共有結合するものである。記述されている唯一の
特定シアニン化合物はヨードアセチル基を有するもの
で、該基はシアニン染料をスルフヒドリル基と共有反応
させる。上記記事はいずれもシアニン染料と蛋白質以外
の物質又はスルフヒドリル基以外の蛋白質上任意基との
共有反応を開示していない。
非蛋白質物質はスルフヒドリル基を有さず、また多くの
蛋白質は該基を蛍光探査に有用とする程十分には有して
いない。しかも、スルフヒドリル基(−SHSH−)は
空気の存在でジスルフィド(−S−S−)に容易に酸化
し、それによって蛍光プローブへの共有結合に受容され
なくなる。
成分を標識する方法を提供する。該方法は、(a) 前
記成分を含有する前記液体に、芳香族核に結合したスル
ホン酸基若しくはスルホネート基少なくとも1個を有す
るシアニン、メロシアニンおよびスチリル染料よりなる
群から選ばれる発光染料を加え、該染料は前記成分と反
応性であり、そして(b) 前記染料が前記成分を標識
するように前記染料と前記成分とを反応させることを含
む。
の成分を標識する方法が提供される。該方法は、(a)
前記成分を含有する前記液体に、複素環式核の1個な
いし2個以上の環に結合したスルホン酸基若しくはスル
ホネート基少なくとも1個を含有するスルホインドレニ
ン基剤およびナフトスルホインドレニン基剤ポリメチン
染料よりなる群から選ばれる発光染料を加え、該染料は
前記成分と反応性であり、(b) 前記染料が前記成分
を標識するように前記染料と前記成分とを反応させ、そ
して(c) 前記標識成分を光学的方法により検出する
ことを含む。
標識し、標識された前記第1成分を用いて第2成分と結
合させ標識第2成分を形成する方法が提供される。該方
法は、(a) 前記第1成分を含有する水性液体に、芳
香族核に結合したスルホン酸基若しくはスルホネート基
少なくとも1個を含有するシアニン、メロシアニンおよ
びスチリル染料よりなる群から選ばれる発光染料を加
え、該染料は前記第1成分と反応性であり、(b) 前
記染料が前記第1成分を発光標識して標識第1成分をも
たらすように前記染料と前記第1成分とを反応させ、
(c) 前記標識第1成分を前記第2成分に結合させて
標識第2成分を形成し、そして(d) 前記標識第2成
分を光学的方法により検出することを含む。
ホシアニン染料標識物質と、すべてが単一励起波長で有
意に光を吸収するが異なる波長で蛍光を発する別異の蛍
光物質1種若しくは2種以上とを混合し、次いで前記蛍
光物質をすべて、単一波長の光で励起させ、そして前記
蛍光物質の各々を、それらの異なる蛍光波長でそれら個
々の蛍光信号を検出することにより計量することを含む
方法が提供される。
し燐光検出のために適当な反応条件下、蛋白質および他
物質上のスルフヒドリル基のみならずアミン(−NH
2 )およびヒドロキシ(OH)基その他アルデヒド(−
CHO)基の如き基と共有反応する置換基を有するシア
ニンおよび関連ポリメチン染料が開発された。本発明
は、従来法のヨードアセチルシアニン染料の使用および
その、スルフヒドリル基との特異反応性よりもかなりの
益をもたらす。アミンおよびヒドロキシ基はスルフヒド
リル基よりも蛋白ないし他の物質中で優勢であり、安定
である。それによって、特定蛋白有無の探査に蛍光シア
ニン染料を用いるとき、被探査蛋白に多くの染料分子が
結合しうるので、より強い蛍光ないし燐光の光度信号が
出される。しかも、アミンないしヒドロキシ基は、当然
スルフヒドリル、アミン若しくはヒドロキシ基を含まな
い重合体粒子の如き標識の所望される成分に、より容易
に付加される。
ないし量が、該標識成分をクロマトグラフィー法で分離
後探査されうるように、アミン若しくはヒドロキシ基又
は他の反応基と共有反応する基を含む発光シアニン染料
を用いて混合物中の染料と反応しうるアミン若しくはヒ
ドロキシ基又は他の基を有する蛋白又は他の原料を標識
する方法に関する。先に引用せる文献に依れば、明らか
にスルフヒドリル基は、特に蛋白分子上のスルフヒドリ
ル基が非常に少なくまた或る場合該基が蛋白の機能で有
意な役割を果たす故に共有反応用に選定された。それ
故、著者が蛋白構造上のスルフヒドリル基の特定位置を
確認する試みは可能であった。また、上記文献で、スル
フヒドリル基は特定蛋白の構造変化を探査し或いは該変
化をもたらすプローブとして用いられた。斯くして、染
料による吸光の変化又は染料結合による解放カルシウム
イオンの変化を判断するために、プローブの結合場所を
知ることが必要であった。
に少ない故に、探査に十分な全ルミネッセンスをもたら
すのに該スルフヒドリル基数が十分でないことがある。
これとは対照的に、アミンないしヒドロキシ基数は蛋白
分子上に数において有意に多く且つ広く分散しているの
で分子上の多数箇所に蛍光プローブを結合させることが
でき、それによって蛋白検出が容易になるため吸光若し
くは蛍光変化の判断が排除される。
連ポリメチン染料による蛋白その他、核酸、DNA、薬
物、トキシン、血液細胞、微生物物質、粒子、プラスチ
ック若しくはガラス表面材、重合体膜等を含む物質の、
該物質上アミン若しくはヒドロキシ箇所での標識に関す
る。有利なことに、染料は、標識物質を含む水性ないし
他の媒体に可溶である。本発明は標識1段法に加えて標
識2段法に関する。標識2段法では、抗体の如き第一成
分を、該成分上の、アミン、ヒドロキシ、アルデヒド若
しくはスルフヒドリル箇所を含む箇所で標識しうる。標
識された成分は、抗体が特異な抗原の如き第二成分のプ
ローブとして用いられる。
基と共有反応するプローブを用いることにより、シアニ
ンプローブによる結合箇所の特異性が達成された。本発
明の2段法に従えば、第一段階でシアニンないし関連プ
ローブを抗体の如き第一成分上のアミン、アルデヒド、
スルフヒドリル、ヒドロキシ若しくは他の基と反応させ
ることができ、而して第二ないし染色段階で抗体は抗原
の如き第二成分での所望の特異性を達成しうる。この特
異性は抗体への抗原結合箇所により調べられる。
ン、ヒドロキシ、アルデヒド若しくはスルフヒドリル基
への共有結合を可能にする基を含む発光ポリメチンシア
ニンおよび関連化合物に関する。本発明は抗原のプロー
ブとなりうるこれら発光シアニン化合物で標識された単
一クローン抗体および他の成分に関する。ターゲットが
1種の細胞であるとき、本発明は、該細胞に結合する標
識抗体の量を測定するのに用いることができる。この測
定は、細胞のルミネッセンスの相対的明暗を調べること
によって実施しうる。
濃度を調べるのに用いることができる。もし、プローブ
と反応しうる蛋白上の反応基数が既知なら、分子当りの
蛍光を知ることができ、また系の分子濃度を系の全ルミ
ネッセンス強度によって調べることができる。
し、次いで標識蛋白をクロマトグラフィーの如き任意手
段で分離することにより系の各種の蛋白ないし他の物質
を定量するのに用いることができる。次いで、分離せる
発光性の蛋白量を調べることができ、クロマトグラフィ
ー検出系で、標識物質上の染料位置を確認することがで
きる。
の細胞数を調べるのに使用しうる。この数の調査は系の
複数種の細胞を標識し次いで標識細胞を系外に分離する
ことにより実施しうる。また、標識細胞は系外の非標識
細胞からも分離することができる。
複数第一成分にして、各々が抗原の如き別異の第二成分
に特異な第一成分に夫々結合した複数の発光シアニン若
しくは関連染料を、抗原混合物中複数抗原の各々を同定
するのに用いられるマルチパラメーター方法を含む。こ
の具体化に従えば、各抗体は、他のプローブを標識する
のに用いられる染料とは別異の吸光およびルミネッセン
ス波長特性を有する染料で別個に標識される。次いで、
標識抗体はすべて、夫々特定の標識抗体により染色され
うる抗原の如き第二成分を含むと分析された生物学的調
製物に加えられる。未反応染料物質は、もしそれが分析
を妨げるなら、洗浄によって調製物から全て除去されう
る。生物学的調製物は次いで種々の励起波長に付され
る。用いられる各励起波長は特定の共役染料の励起波長
である。励起波長に相当する発光波長の光度を調べるの
にルミネッセンス顕微鏡又は、励起波長の光を選択し且
つルミネッセンスの波長を選定するフィルター若しくは
モノクロメーターを有するフローシトメター又は蛍光分
光光度計の如き他のルミネッセンス検出系が用いられ
る。特定の共役染料の発光波長に相当する波長でのルミ
ネッセンス強度は、染料が結合する抗体に結合した抗原
の量を示す。或る場合、各々が別異の波長で蛍光を発す
る混合物中の物質2種以上からのルミネッセンスを励起
するのに単一励起波長を用いることができ、その各蛍光
波長における個々の蛍光強度を検出することにより各標
識種の量を測定することができる。所望なら、吸光検出
法を用いることができる。本発明の2段法は、ルミネッ
センス若しくは吸光検出系で第一物質−染料複合物が方
向づけられる別の物質の有無を探査するのに染料と結合
した第一物質を用いる任意系に適用されうる。例えば、
染料はDNA若しくはRNA断片に結合して染料結合D
NA若しくはRNAフラグメントを形成し得、次いでそ
れは断片が相補的なDNA若しくはRNA主鎖に方向づ
けられる。同じ試験方法はDNAの相補的主鎖の有無を
探査するのに用いることができる。
広範囲の励起および発光波長を有する特定のシアニンお
よび関連染料が合成されうる故に、種々の励起および発
光波長の染料を必要とする成分混合物分析によく適合す
る。特定の励起および発光波長を有する特定のシアニン
および関連染料は、メチン基の数又はシアニン環構造を
変えることにより合成することができる。このようにし
て、レーザー例えばHeNe若しくはダイオードレーザ
ーの如き特定の励起光源に相当する特定励起波長を有す
る染料を合成することができる。
光度の高いシアニンおよび関連染料分子を蛋白、ペプチ
ド、炭水化物、核酸、誘導核酸、脂質、他の特定の生物
学的分子、生物学的細胞上のアミン、ヒドロキシ、アル
デヒド、スルフヒドリル若しくは他の基並びに可溶性重
合体、重合体粒子、重合体表面材、重合体膜、ガラス表
面材および他の粒子ないし表面材の如き非生物学的物質
に共有反応させることに関する。ルミネッセンスには高
感度の光学的技法が包含されるので、標識が非常に低い
量で存在するときでさえ染料「標識」の有無を探査定量
することができ、かくして染料標識試薬を用いて標識さ
れた物質の量を測定することができる。最も有用な染料
は吸光度が高く(ε=70,000〜250,000l
b/モルcm又はそれ以上)、非常に発光性であり、少
なくとも5〜80%以上の量子収量を有する。該量は染
料そのものに当てはまり、また標識物質に結合した染料
にも当てはまる。
性単一クローン抗体の産生である。単一クローン抗体
は、特定の化学的箇所又は細胞表面上若しくは細胞内
「マーカー」に非常に堅く且つ特異的に結合する蛋白分
子である。それ故、これら抗体は、特定細胞種(例えば
HLA、T細胞、バクテリアおよびウイルス等)および
異常細胞を同定するのに莫大な研究と臨床適用とを有す
る。従来、細胞に結合した抗体は種々の方法による抗体
の標識によって計量されており、そして標識は放射性標
識(ラジオイムノアッセイ)、酵素(ELISA技法)
又は蛍光染料(通常フルオレセイン、ロダミン、Tex
as Red(登録商標)若しくは紅藻素)によって遂
行されてきた。臨床的抗体試薬のほとんどの製造業者な
いしユーザーは放射性トレーサーの使用に伴う問題の排
除を望んでおり、そのためルミネッセンスが最も有望な
代替法の一つと考えられている。実際、多くの業者は今
日、単一クローン抗体で標識されたフルオレセイン、T
exas Red(登録商標)、ロダミンおよび紅藻素
を市場に出している。
/電子工学的装置は複雑さを増している。例えば、フロ
ー血球計算法を用いて個々の細胞上の蛍光抗体量を、細
胞5,000個/秒までの割合で測定することができ、
また顕微鏡および溶液蛍光技法も進歩している。これら
装置は、スペクトルのUV、可視および近IR領域の多
くの波長で蛍光を励起することができる。今日受容され
る有用な蛍光標識試薬のほとんどは400〜580nm
スペクトル領域で励起しうる。例外は、蛋白に共有結合
し得且つ若干長い波長で励起しうる。海洋性生物から単
離されたいくつかのフィコビリプロテインタイプ顔料で
ある。それ故、今日市販されている装置で分析される生
物学的ないし非生物学的物質の標識で新たな標識試薬が
有効となることが必要な580〜約900nm範囲の大
スペクトル窓がある。このスペクトル領域で励起しうる
新しい試薬は、種々の特異性を有する抗体が各々別異の
着色蛍光染料で標識しうる故に細胞上マーカーのマルチ
カラールミネッセンス分析の実施を可能にする。斯くし
て、分析される各細胞に関し同時にいくつかのマーカー
の有無を調べることができる。
物質に共有結合しうる発光(蛍光若しくは燐光)シアニ
ン、メロシアニンおよびスチリル染料そのものに関す
る。メロシアニンおよびスチリル染料は本発明のための
シアニン染料に関連すると認められる。新しい標識試薬
そのものは、特にそれが標識成分に結合しているとき初
めに定義せる波長の光例えば450〜900nmスペク
トル範囲の波長の光で励起しうる。細胞のバックグラウ
ンド蛍光はより低い波長で概ね生じる。それ故、標識試
薬はバックグラウンド蛍光とは区別される。特に有利な
のは633nmの光を吸収する誘導体である。何故な
ら、該誘導体は、安価で、強く、安定で、寿命の長いH
eNeレーザー給源により励起されうるからである。次
いで、標識成分により蛍光ないし燐光放出される、二番
目に定義した波長の光が検出されうる。蛍光若しくは燐
光は一般に励起光より長い波長を有する。検出段階は、
励起波長の散乱光を吸収するための、また検体とともに
用いられる特定の染料標識に相当するルミネッセンスの
対応波長を通過させるためのフィルターを有するルミネ
ッセンス顕微鏡を用いることができる。斯かる光学顕微
鏡については米国特許第4,621,911号に記述さ
れている。
いうわけではない。しかしながら、本発明の染料には、
発光性であるシアニンおよび関連染料が含まれる。それ
らは比較的安定性であり、多くは反応溶液好ましくは水
溶液に可溶である。結合染料そのものは、特にそれが標
識成分に結合しているとき少なくとも50,000好ま
しくは100,000l/モルcmの分子吸光係数
(ε)を有する。吸光係数は分子が光を吸収する能力の
尺度である。本発明の結合染料は少なくとも2%好まし
くは少なくとも10%の量子収量を有する。加えて、本
発明の結合染料は400〜900nm好ましくは600
〜900nmスペクトル範囲の光を吸収し且つ発生す
る。
ールスルホン酸置換染料が、アリールスルホネートない
しアリールスルホン酸基のない類似染料に比べ本質的に
蛍光が強く、改良された光安定性および水溶性を有する
と分かった。用語アリールスルホネートないしアリール
スルホン酸基を本明細書で用いるとき、それは、単一環
芳香族構造又はナフタレン構造の如き融合環構造を含む
芳香族環構造に結合した互換可能なアリールスルホン酸
基若しくはアリールスルホネート基を意味する。単一環
芳香族構造若しくは融合環芳香族構造はポリメチン、シ
アニン、メロシアニン若しくはスチリルタイプ染料中に
存在しうる。
を有する多くの染料は、特に、緩衝液ないし生理的食塩
水における如く無機塩も亦存在するとき水溶液中で二量
体ないしそれ以上の結合体を形成しやすい。これらの結
合体は通常単量体吸収の短波長側にシフトした吸収バン
ドを有し、概ね非常に弱い蛍光種である。水溶液でのシ
アニン染料の結合体易形成傾向は特に写真工業で周知で
ある〔West W.& Pierce S.、J.Ph
ys.Chem.,69;1894(1965);St
urmer D.M.、Spec.Top in He
terocyclic Chemistry,30(1
974)〕。
溶液中結合体を形成しやすい。然るに、アリールスルホ
ネート染料はこれらの結合体形成傾向を最低限で有する
と分かった。アリールスルホネート染料を蛍光標識試薬
の形成に用いるとき、それは、蛋白又は抗体の如き他の
分子に高い表面密度で結合する場合結合体形成傾向が低
下する。塩溶液(例 150mM塩化ナトリウム)中特
定染料分子が結合体を形成する傾向は、同じ染料分子が
蛋白の表面上で結合体を形成する傾向の尺度として採用
されうる。それ故、染料分子が水性塩溶液中結合体を形
成する傾向が最低限であることが望ましい。第2図に示
すデーターを用いて、特定のアリールスルホネート化染
料が水性塩溶液中高濃度でさえ結合体を形成する傾向が
低いことを例示することができる。
アニン染料の単量体吸収スペクトルおよび二量体吸収ス
ペクトルを示す。これらのスペクトルを生じさせるのに
用いられる染料N,N’−ジ−スルホブチルインドジカ
ルボシアニンはアリールスルホネート基を有さず、ミリ
モル範囲未満の濃度でさえ二量体を容易に形成する。二
量体スペクトルは濃度の異なる染料スペクトルから算定
された(West &Pearce、1965の方法参
照)。燐酸塩緩衝剤入り食塩溶液中3ミリモルの濃度で
は、単量体および二量体バンドの吸収はほぼ等しかっ
た。
N,N’−ジエチルインドジカルボシアニン−5,5’
−ジスルホン酸のスペクトルを第2図に示す。この染料
は濃度10ミリモルまでの食塩溶液中結合体の兆候を何
ら示さなかった。
れた反応条件で結合する効率を測定することは常法であ
る。試験染料はN,N’−ジカルボキシペンチルインド
ジカルボシアニン−5,5’−ジスルホン酸のビス−N
−ヒドロキシスクシンイミドであった。第3図は、この
スルホシアニン染料活性エステルがpH9.2の炭酸塩
緩衝液中で羊免疫グロブリンと効率よく反応し、反応溶
液中相対的染料ないし抗体濃度に依って1未満〜20以
上の範囲にわたる染料:抗体モル比を有する共有標識抗
体分子を形成することを例示する。データーに最小2乗
法を適用して得た勾配は、斯かる条件下この染料の標識
効率が約80%であることを示している。同様の調査
で、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)が
約20%の効率を以て反応した。
の活性エステルの反応性は羊免疫グロブリン(IgG)
を標識することによって調べられた。蛋白(4mg/m
l)を0.1モル炭酸塩緩衝液(pH9.2)に溶かし
た。無水ジメチルホルムアミドに溶解せる反応性染料の
アリコートを蛋白試料に加えて初期の染料:蛋白モル比
を得た。30分後、ゲル透過クロマトグラフィー(Se
phadex G−50)により羊結合染料から蛋白を
分離した。得られた染料:蛋白モル比を分光光度計で調
べ、これを第3図に示す。
収スペクトルは、遊離単量体染料のスペクトルと密接に
対応するバンドを示す。高度標識され(染料:蛋白比の
高い)或は、水性溶液中凝集傾向の高い染料で標識され
た抗体分子は往々、水性溶液中単量体染料吸収バンドよ
りも短波長で現われる新しい吸収ピークを有することが
見出されている。新しい吸収ピークの波長はしばしば、
染料の二量体吸収スペクトル特性を示す領域に入る(第
1図参照)。
収ピーク比は高い。この、より短い波長吸収ピークは第
4図中約590nmで見ることができる。第4図中、よ
り長い波長(645nm)ピークは、抗体に結合した単
量体染料分子による。第4図の抗体吸収スペクトルをも
たらすのに用いた標識試薬N,N’−ジカルボブチルイ
ンドジカルボシアニン−5,5’−酢酸のビス−N−ヒ
ドロキシスクシンイミドエステルはアリールスルホネー
ト基を有さず、水性塩溶液中でまた、それが反応した抗
体上で二量体を容易に形成する。重要なこととして、こ
れら抗体の蛍光励起スペクトルは、短波長ピークでの標
識抗体の励起が、長波長ピークで励起する程多くは蛍光
を比例的に生成しないことを示す。この考察は、短波長
吸収ピークが抗体分子上の非蛍光二量体ないし結合体の
形成によるという概念と調和する。
に使用したアリールスルホネートシアニン染料が、二量
体の特徴的吸収波長におけるはるかにより小さな吸収ピ
ーク(第5図参照)によって判断される如く抗体分子上
で容易には結合しないことを見出した。これは、抗体お
よび他の「非結合性」標識試薬が蛍光のより強い標識蛋
白を産生すべきなので重要である。実際、アリールスル
ホシアニンは平均染料/抗体比が比較的高いときでさえ
鮮明な蛍光抗体を産生する(第6図参照)。
ン染料で標識された羊免疫グロブリンを示す。第5図
は、新規なスルホインドジカルボシアニン染料と結合し
た蛋白を示す。前者の試料において増加した二量体の存
在(第1図参照)は明らかである。両調製物で染料:蛋
白モル比はほぼ同じであるけれども、第5図に示す蛋白
は第4図に示す試料よりも蛍光が強かった。
は他の蛋白を有するには、蛋白上染料分子当りの平均量
子収量ができるだけ高いことが重要である。一般に、蛋
白上染料分子の表面密度が高くなる(すなわち染料/蛋
白比が増加する)につれ、染料の平均量子収量が低下す
る。この効果は時折、標識度の高い蛋白の表面上染料相
互作用の結果として生じるケンチングに起因してきた。
確かに、蛋白表面上非蛍光二量体の形成はこのケンチン
グに寄与しうる。第6図は、染料/蛋白比が高くなるに
つれアリールスルホシアニン染料の平均量子収量が緩徐
に低下することを示している(菱形印を繋ぐ曲線)。こ
れとは対照的に、丸印を繋ぐ曲線は、染料/蛋白比が高
くなるにつれ非アリールスルホシアニン染料(N,N’
−ジ−スルホブチルインドジカルボシアニン−5−イソ
チオシアネート)の結合に関する平均量子収量の非常に
迅速な低下があることを示している。それ故、第6図に
例示されるスルホシアニン染料は、他の染料に比較し
て、特に抗体分子当り染料分子1〜10個の標識範囲で
より鮮明な蛍光抗体を産生する。
子収量はこれら生物分子から得られる蛍光信号の尺度で
ある。燐酸塩緩衝剤入り食塩溶液中の新規なスルホイン
ドジカルボシアニン染料で標識された羊免疫グロブリン
(IgG)からのデーターは第6図の菱形印を繋いだ曲
線で示される。第6図の丸印を繋いだ曲線は、比較のた
めインドジカルボシアニン−イソチオシアネート反応性
染料で標識した蛋白を示す。第6図で、染料/蛋白比0
での量子収量は緩衝液中反応性染料(遊離染料)のメチ
ルアミン付加物に関する値を示す。
質を検出定量するのに有用な試薬である。非常に少ない
数の発光分子が最適環境下で検出することができる。B
arakとWebbは、SITカメラを用いて細胞のL
DL受理に関連した50個未満の蛍光脂質類似物を可視
化した(J.Cell Biol.90:595−60
4(1981)〕。粒子若しくは特定細胞に関連した1
0,000個未満のフルオレセイン分子の検出にフロー
血球計算法を用いることができる〔Muirhead、
HoranおよびPoste、Bio/Technol
ogy 3:337−356(1985)〕。蛍光プロ
ーブ応用のいくつかの特定例は、(1)蛍光フロー血球
計算法、蛍光賦活細胞分類および蛍光鏡検法という技法
による細胞混合物中の細胞の部分母集団の同定および分
離、(2)蛍光免疫アッセイの技法で別の種に結合する
物質(例えば抗原−抗体反応物)の濃度測定および
(3)蛍光染色の技法によるゲルおよび他の不溶性担体
中の物質のローカリゼイションである。これらの技法に
ついては、Herzenberg等、「細胞免疫学(C
ellular Immunology)」、第3版、
第22章;Blackwell Scientific
Publications、1978(蛍光賦活細胞分
類)およびGoldman、「蛍光抗体法(Fluor
escence Antibody Method
s)」、ニューヨーク所在Academic Pres
s、1968(蛍光鏡検法および蛍光染色(fluor
escence microscopy and flu
orescence staining))並びに A
pplications of Fluorescenc
e in the Biomedical Science
s、編集Taior等、Alan Liss Inc.、
1986に記載されている。
選定に多くの制約がある。一つの制約は蛍光物質の吸収
および放出特性である。なぜなら、多くのリガンド、受
容体および、検体例えば血液、尿素、脳脊髄液中の物質
は蛍光を発し、蛍光標識の蛍光の正確な測定を干渉する
からである。この現象はオートフルオレッセンス又はバ
ックグラウンド蛍光と呼ばれる。別の考慮すべき点は、
蛍光物質の、リガンドおよび受容体並びに他の生物学的
ないし非生物学的物質への結合能力と斯かる蛍光物質に
対する結合の効果である。多くの状況で、別の分子への
結合は蛍光物質の蛍光特性における実質的変化をもたら
し得、或る場合蛍光物質の量子効率を実質的に損ない或
いは低下させる。蛍光物質との結合が、標識分子の機能
を不活性にすることも可能である。三つ目の考慮すべき
点は、鋭敏検出の場合高くあるべき蛍光物質の量子効率
である。四つ目の考慮すべき点は、できるだけ大きくあ
るべき蛍光物質の吸光能又は吸光率である。また、蛍光
分子が近接状態にあるとき互いに干渉してセルフケンチ
ングを生じるか否かが関係する。更に、蛍光物質が他の
化合物と或は該蛍光物質そのものにより或は該物質が結
合している化合物との関連において容器壁と非特異結合
するか否かも関係する。
蛍光化合物の入手性と密接に結付く。特に、長波長可視
領域(黄〜近赤外)で発光する蛍光物質が入用である。
なぜなら、これら発色団の励起はオートフルオレッセン
スをあまり生ぜず、またスペクトルの全可視および近赤
外領域を使用しうるとき別異の波長で発光する多数の発
色団が同時分析できるからである。広く用いられている
蛍光化合物フルオレセインは緑領域では有用なエミッタ
ーであるけれども、特定の免疫検定および細胞分析系で
はフロオレセイン吸収波長での励起により生じるバック
グラウンドオートフルオレッセンスが検出感度を制限す
る。しかしながら、慣用の赤蛍光標識ロダミンはフルオ
レセインより効果が低いと分かった。Texas Re
d(登録商標)は578nmで励起しうる有用な標識試
薬であり、610nmで最大限に蛍光を発する。
と高い量子収量の故に重要な貢献をなしてきた。斯かる
発色団含有蛋白は多くの蛋白に共有結合し得、而して鏡
検法およびフロー血球計算法での蛍光抗体アッセイに用
いられる。フィコビリプロテインは、(1)蛋白標識法
が比較的複雑であり、(2)蛋白標識効率が通常高くな
く(典型的には平均0.5フィコビリプロテイン分子/
蛋白)、(3)フィコビリプロテインが天然物で、その
調製および精製が複雑であり、(4)フィコビリプロテ
インが高価であり、(5)680nmで最大限蛍光を発
するアロフィコシアニンより更に赤領域スペクトルで蛍
光を発する標識試薬として有効なフィコビリプロテイン
が現存せず、(6)フィコビリプロテインが比較的化学
的に不安定であり、(7)それが比較的容易に光褪色
し、(8)フィコビリプロテインが33,000〜24
0,000範囲の分子量を持つ大蛋白であり、代謝産
物、薬物、ホルモン、誘導ヌクレオチドおよび、抗体を
含む多くの蛋白の如き標識が望ましい多くの物質より大
きいという欠点を有する。後者の欠点は特に重大であ
る。なぜなら、大きなフィコビリプロテインで標識され
た抗体、アビジン、DNAハイブリダイゼーションプロ
ーブ、ホルモンおよび小分子は複合錯体の寸法によって
課せられた立体的制限故にそのターゲットに結合し得
ず、またターゲットへの結合物の結合速度が低分子量結
合物に対して緩徐だからである。
も亦、長い波長での高い量子効率、吸収および放出特性
を示し、簡単な結合手段を有し且つ非特異的干渉の事実
上ない蛍光物質の使用から実質的益を受ける。
きな吸光率および高い量子収量を有する蛍光アリールス
ルホネート化シアニンおよび関連染料を用いる。蛍光シ
アニンおよび関連染料は、抗体、抗原、アビジン、スト
レプトアビジン、蛋白、ペプチド、誘導ヌクレオチド、
炭水化物、脂質、生物学的細胞、バクテリア、ウイル
ス、血液細胞、組織細胞、ホルモン、リンフォカイン、
トレース生物分子、トキシンおよび薬物の如き生物学的
物質を標識するのに用いることができる。また、蛍光染
料は、可溶性重合体、重合体ないしガラス粒子、薬物、
導体、半導体、ガラスないし重合体表面材、重合体膜お
よび他の固体粒子の如き非生物学的物質を標識するのに
も用いることができる。標識される成分は、他の物質を
含む混合形で存在しうる。標識反応が生じる混合物は液
体混合物特に水混合物でありうる。検出段階は顕微鏡ス
ライドの如き液体若しくは乾燥状態の混合物を以て生じ
うる。
ミン若しくはヒドロキシ部位或る場合にはスルフヒドリ
ル若しくはアルデヒド部位で共有結合する反応性基のシ
アニン分子への編入により変性すべきシアニン染料を必
要とする。本発明はまた、シアニンおよび関連染料構造
の試験液体への溶解性を高めて(1)標識反応での取扱
いを容易にし、(2)標識される蛋白の表面上での染料
結合の防止を助成し且つ(3)生物学的物質および表面
材ないしアッセイ装置への標識物質の非特異的結合の防
止を助成すべくシアニンおよび関連染料構造の使用ない
し変性を用いる。
識試薬に勝る重要な利点を供する。先ず第一に、400
〜約1100nm範囲のスペクトル領域で吸光ないし発
光するシアニンおよび関連染料が合成される。斯くし
て、これら染料の反応性誘導体は、複数の標識物質を同
時測定することが必要なアッセイ用に調製されうる。こ
の種のマルチカラー(若しくはマルチパラメーター)分
析は簡素化、コスト効果或は、粒子の複雑な混合物中の
各粒子上の異なる標識種の比(例えばマルチパラメータ
ーフロー血球計算法若しくは蛍光顕微鏡による複雑な混
合物中の個々の血液細胞上の抗原マーカーの比)の決定
に望ましい。第二に、多くのシアニンおよび関連染料は
強く光を吸収し且つ蛍光を発する。第三に、多くのシア
ニンおよび関連染料は比較的光安定性で、蛍光顕微鏡下
迅速には漂白しない。第四に、簡単且つ効果的な結合試
薬であるシアニンおよび関連染料誘導体を製造すること
ができる。第五に、多くの構造および合成方法が有効で
あり、またこの種の染料は多目的である。それ故、試薬
を多少水溶性にするのに多くの構造上の変性を行なうこ
とができる。そのチャージは、それが結合する分子をか
き乱さないようまた非特異的結合が低下しうるよう変化
しうる。第六に、フィコビリプロテインとは異なって、
シアニン染料は比較的小さく(分子量=1,000)、
そのためその結合域に迅速到達し或はその機能を遂行す
る標識分子能力を目立つほど立体障害しない。
くの潜在的利点を供する。斯かる染料は、液体特に水性
液体中での成分1種ないし2種以上の選択的標識に用い
ることができる。次いで、標識成分は光学的方法又はル
ミネッセンス方法により検出することができる。別法と
して、標識成分は、それが強い親和性を有する別の成分
の染色に用いられ、而して後者の成分は光学的ないしル
ミネッセンス方法で検出される。この場合、染料は標識
成分のアミン、ヒドロキシ、アルデヒド若しくはスルフ
ヒドリル基と反応する。例えば、標識成分は抗体であり
得、それが強い親和性を有する染色された成分は生物学
的細胞、抗原若しくはハプテン、又は抗原若しくはハプ
テンを含有する生物学的細胞ないし粒子でありうる。別
の例では、標識成分はアビジンで、染色される成分はビ
オチニル化物質でありうる。また、ポリメチンシアニン
タイプ染料と結合したレクチンを用いて特定の炭水化物
基を検出定量することができる。加えて、発光シアニン
および関連染料はDNA若しくはRNAフラグメントに
結合しうる。DNA若しくはRNA標識フラグメント
は、DNAないしRNAを含有する試料中特定の相補ヌ
クレオチド序列の有無および量を調べる蛍光ハイブリダ
イゼーションプローブとして用いることができる。ま
た、該染料はホルモンないしリガンド(例 ホルモン、
蛋白、ペプチド、リンフォカイン、代謝産物)に結合
し、次いで該ホルモンないしリガンドは受容体に結合し
うる。
記述 Miraha等(米国特許第4,337,063号)並
びにMasuda等(米国特許第4,404,289
号、同第4,405,711号および同第4,414,
325号)は、N−ヒドロキシスクシンイミド活性エス
テル基を有する種々のシアニン染料を合成している。こ
れらの特許は、上記試薬が写真感光剤として用いられう
ることを示している。該試薬の見込まれる蛍光性質は上
記特許に記述されておらず、事実そのプロセスには蛍光
が必要とされない。上記特許に列挙された染料のほとん
どは弱い蛍光しか発せず、特に光安定性でなく、その溶
解特性も、標識物資の蛍光検出を伴う多くの用途に最適
でない。
9,202号)は、共有反応性分子として用いることの
できる多くのシアニン染料誘導体を提示している。この
試薬に用いられる反応性基は、モノ−若しくはジクロロ
トリアジン基が属するアジン基である。該英国特許は写
真フィルム感光剤としての上記試薬の開発および使用に
関する。蛍光はそのプロセスに必要でなく、記述された
試薬のほとんどは蛍光を発しない。この英国特許は、標
識物質を検出ないし定量することを目的とした反応性シ
アニン染料の開発および使用に関するものでない。
ス検出方法により検出され且つ/或は定量されうるよう
発光性とするため発光シアニンおよびシアニンタイプ染
料を生物学的物質、非生物学的分子および巨大分子並び
に粒子に共有結合させる方法に関する。
液体に可溶の染料で、該染料を成分上のアミンないしヒ
ドロキシ基場合によってアルデヒドないしスルフヒドリ
ル基と共有結合させる置換基を含有するシアニン、メロ
シアニンおよびスチリル染料よりなる群から選ばれる染
料を加えてそれが上記成分を標識するようにする方法に
関する。標識成分はルミネッセンス若しくは光吸収方法
により検出され且つ/或は定量される。標識成分が抗
体、DNAフラグメント、ホルモン、リンフォカイン又
は薬物であるときは、該標識成分を、それが結合する別
の成分の有無を調べるのに用いることができ、而して該
別の成分を検出し且つ/或は定量することができる。
段階を用いることができる。例えば、検出段階は、液体
を初めに定義した波長の光で照明する光学的検出段階と
することができる。次いで、標識成分により蛍光ないし
燐光を発せられる別の定義波長での光が検出される。検
出はまた、光学的吸光によるものとしうる。例えば、検
出段階は、液体に初めの定義波長の光を通し次いで液体
により伝導される光波長を確認することを含む。
若しくは関連発色団の結合を化学的に検出する化学分析
を含みうる。共有標識試薬を創生すべく変性されうるシ
アニン、メロシアニンおよびスチリル染料の基本構造を
以下に示す: シアニン
ある: シアニン
選ばれ、そして、mは1,2,3および4よりなる群か
ら選ばれる整数である。
励起カラーを決定する。環式アジン構造も亦、部分的に
励起構造を決定しうる。しばしば、mのより高い値は増
加ルミネッセンスないし吸光度に寄与する。4より高い
mの値では、化合物は不安定になる。そこでは、環構造
での変性により更にルミネッセンスが付与されうる。m
=2のとき、励起波長は約650nmで、該化合物は正
しく蛍光を発生する。最大発光波長は最大励起波長より
概ね15〜100nm大きい。
R6 およびR7 基の少なくとも一つ(好ましくは一つの
み場合により二つないし三つ以上)は、染料を標識成分
に結合させるための反応基である。或る試薬に関して
は、各分子上R1 ,R2 ,R3,R4 ,R5 ,R6 およ
びR7 基の少なくとも一つは、発色団の溶解性を高め或
は標識成分の標識の選択性ないし染料による標識成分の
標識位置に影響する基でありうる。
びR10(存在時)の少なくとも一つはスルホネート基の
少なくとも一つを含む。用語スルホネート基はスルホン
酸を含むものとする。なぜなら、スルホネート基はイオ
ン化スルホン酸に過ぎないからである。
R1,R2,R3,R4,R5,R6およびR 7基を形成しう
る反応基として、イソチオシアネート、イソシアネー
ト、モノクロロトリアジン、ジクロロトリアジン、モノ
−ないしジ−ハロゲン置換ピリジン、モノ−ないしジ−
ハロゲン置換ジアジン、マレイミド、アジリジン、スル
ホニルハリド、酸ハリド、ヒドロキシスクシンイミドエ
ステル、ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、イ
ミドエステル、ヒドラジン、アジドニトロフェニル、ア
ジド、3−(2−ピリジルジチオ)プロピオンアミド、
グリオキサルおよびアルデヒドを含有する基の如き反応
部分が含まれうる。
リル基を有する成分の標識に特に有用なR1,R2,
R3,R4,R5,R6およびR7基の特定例として次のも
のが含まれる。
lの如き残基である)、
スルフヒドリルを有する成分の標識に特に有用なR1,
R2,R3,R4,R5,R6およびR7基の特定例は次のも
のである:
R1,R2,R3,R4,R5,R6およびR7基の特定例と
して
の標識成分の望ましくない非特異性結合を減じ、或いは
また蛍光のケンチングをもたらしうる標識成分上の反応
性発色団2種以上の相互作用を低下させるために、
R1,R2,R3,R4,R5,R6およびR7基を周知の極
性ないし帯電化学基から選定することができる。例は−
E−Fであり、ここでFはヒドロキシ、スルホネート、
スルフェート、カルボキシレート、置換アミノ又は第四
アミノを示し、Eは−(CH2)n(n=0,1,2,3
又は4)の如きスペーサー基を示す。有用な例にはアル
キルスルホネート−(CH2)3SO3-および−(C
H2)4−SO3-が含まれる。
ポリメチン鎖の炭素原子2個以上の間のブリッジを形成
する環式化学基1個以上を含みうる。これらのブリッジ
は染料の化学的安定性若しくは光安定性を高めるのに役
立ち得、また染料の吸光ないし発光波長を変えたり量子
収量の吸光係数を変化させるのに用いられうる。改良さ
れた溶解特性はこの変性によって達成することができ
る。
ペプチド、酵素基質、ホルモン、リンフォカイン、代謝
産物、レセプタ、抗原、ハプテン、レクチン、アビジ
ン、ストレプタビジン、トキシン、炭水化物、寡糖類、
多糖類、核酸、デオキシ核酸、誘導核酸、誘導デオキシ
核酸、DNAフラグメント、RNAフラグメント、誘導
DNAフラグメント、誘導RNAフラグメント、天然薬
物、ウイルス粒子、バクテリア粒子、ウイルス成分、イ
ースト成分、血液細胞、血液細胞成分、生物細胞、非細
胞血液成分、バクテリア、バクテリア成分、天然ないし
合成脂質嚢、合成薬物、毒薬、環境汚染物質、重合体、
重合体粒子、ガラス粒子、ガラス表面材、プラスチック
粒子、プラスチック表面材、重合体膜、導体および半導
体でありうる。
しうるシアニン又は関連発色団を調製することができ、
而して検出工程は、このスペクトル波長で発光するヘリ
ウムネオンレーザーを用いることができる。また、或る
成分との反応時700nmと900nmとの間で最大限
に光を吸収しうるシアニン又は関連染料を調製すること
ができ、而して検出工程は、スペクトルのこの領域で光
を放出するレーザーダイオードを用いることができる。
反応条件が用いられる限り蛋白その他生物学的若しくは
非生物学的分子、巨大分子、表面材又は粒子上の特定官
能基を標識するのに比較的特異性である。
リル染料並びにそれらの生成物の特性 本発明の染料のスペクトル特性は、本明細書に記載の官
能化によっては認めうるほど変化しない。標識蛋白その
他の化合物のスペクトル特性も亦、蛋白その他の物質に
結合してないベース染料分子とさほど異ならない。単独
若しくは標識物質に結合した本発明に記載の染料は概
ね、大きな吸光係数(ε=100,000〜250,0
00)と、或る場合には0.4程度の高い量子収量を有
し、そして400〜900nmのスペクトル範囲で光を
発生する。斯くして、それらは発光検出用試薬を標識す
るものとして特に価値がある。
ことができる。検出方法は、初めに定義された波長の光
で標識物質を含む混合物を照明する光源を用いることが
できる。該混合物により伝達され或は該混合物により蛍
光ないし発光される第二波長で光を検出する既知装置が
用いられる。斯かる検出装置に蛍光分光計、吸収分光測
光、蛍光顕微鏡、透過光顕微鏡ないしフロー血球計算
器、ファイバーオプチックセンサーおよび免疫検定装置
が含まれる。
分への染料結合を検出するのに化学的分析方法を用いる
こともできる。化学的分析方法には赤外スペクトロメト
リー、NMRスペクトロメトリー、吸収スペクトロメト
リー、蛍光スペクトロメトリー、質量スペクトロメトリ
ーおよびクロマトグラフィー方法が含まれうる。
pHの影響 0.1M炭酸塩緩衝液中の羊γ−グロブリン(4mg/
ml)試料を室温で10倍モル過剰の下記スルホインド
ジカルボシアニン活性エステル(m=2)と室温で混合
した:
0上でのゲル透過クロマトグラフィーにより蛋白試料を
非共有結合染料から分離した。蛋白の最大標識は10分
後に生じて、pH8.5、8.9および9.4でインキ
ュベートした試料に関し夫々5.8、6.4および8.
2の最終的染料/蛋白モル比をもたらした。染料/蛋白
比を5とするのに必要な時間および異なるpHでの生成
物の量子収量を次表に示す:pH 時間(sec) 量子収量 8.5 115 0.09 8.9 53 0.09 9.4 6.5 0.17 上記データーは、この染料で標識した蛋白がpH9未満
よりもpH9.4において良好であることを示してい
る。緩衝液のpHが高いほど、結合反応は非常に迅速で
あるが、標識効率が優れ、生成物の蛍光度が高い。量子
収率は標識蛋白上の染料分子当りの平均量子収量を表わ
す。
合 pH7.4の燐酸塩緩衝剤入り塩水(PBS)に溶解せ
る羊γ−グロブリン(1mg/ml)を、0.1M炭酸
ナトリウムを用いてpH9.4に調節した。種々の染料
/蛋白モル比を得るためにこの蛋白溶液のアリコートに
シアニン染料標識剤(例1の構造、m=1)を加えた。
室温で30分のインキュベーション後、PBSを溶離剤
とするセファデックスG−50ゲル透過クロマトグラフ
ィーにより分離した。生成物中蛋白に共有結合した染料
のモル比は、初期染料/蛋白比3、6、12、24およ
び30に関し夫々1.2、3.5、5.4、6.7およ
び11.2であった。
ランの標識 デキストラン分子当り平均16個のアミノ基を含有する
N−アミノエチル−カルボキシアミドメチル(AEC
M)デキストランを平均分子量70000のデキストラ
ンから合成した〔Inman、J.K.,J.Immu
nol.114:704−709(1975)〕。pH
9.4の、0.1M炭酸塩緩衝液に溶解せるAECM−
デキストラン(1mg/250μl)の一部分をスルホ
インドジカルボシアニン活性エステル(例1の構造、m
=2)0.2mgに加えて染料/蛋白モル比10を得
た。混合物を室温で30分間攪拌した。次いで、溶離緩
衝液として酢酸アンモニウム(50mM)を用いたセフ
ァデックスG−50ゲル透過クロマトグラフィーにより
デキストランを非結合染料から分離した。各デキストラ
ン分子に平均2.2個の染料分子が共有結合した。
標識 1.1M炭酸塩緩衝液(pH9.4)中のネズミIgG
(1mg/ml)に対し特異な羊γ−グロブリンとスル
ホインドジカルボシアニン活性エステル(例1の構造、
m=2)とを染料分子/蛋白分子比8で混合した。室温
で3分間のンキュベーション後、標識混合物を、燐酸塩
緩衝剤入り塩水(pH7.4)で平衡させたセファデッ
クスG−50上でのゲル濾過により分離した。回収され
た蛋白には、各蛋白に共有結合した平均4.4の染料分
子が含まれた。
シアニン染料によるヒトリンパ球の染色ないし顕微鏡可
視化 新たに単離した抹消血リンパ球をマウス抗−β2−ミク
ログロブリン(0.25μg106細胞)により0℃で
30分間処理した。細胞をDMEM緩衝液で二回洗浄
し、次いでスルホインドジカルボシアニン標識羊抗−マ
ウスIgG抗体(1μg/106細胞)で処理した。0
℃で30分間のインキュベーション後、細胞を遠心処理
して過剰の抗体を除去し、細胞を再度DMEM緩衝液で
洗浄した。蛍光顕微鏡で分析すべく細胞のアリコートを
スライド上に固定させた。顕微鏡下、スライド上のリン
パ球を610〜630nmの光で照射し、イメージデジ
タル化装置およびテレビモニターに取付けたCOTU赤
色感知性増強テレビカメラによって650〜700nm
の蛍光を検出した。この方法で染色した細胞は顕微鏡下
蛍光を示した。対照実験で、一次マウス抗−β2−ミク
ログロブリン抗体の使用を省いたほかは上記の如く染色
および分析を行なった。対照試料は顕微鏡下で蛍光を示
さず、而してスルホインドシアニン標識羊抗−マウス抗
体がリンパ球への有意な非特異性結合をもたらさないこ
とを示した。
ジカルボシアニン染料の単量体吸収スペクトルおよび二
量体スペクトルを示す。
ボシアニン−5,5’−ジスルホン酸染料のスペクトル
を示す。
インドジカルボシアニン−5,5’−ジスルホン酸のビ
ス−N−ヒドロキシスクシンイミド染料による羊免疫グ
ロブリンの標識反応における染料/蛋白モル比を示す。
ジカルボシアニン−5,5’−酢酸のビス−N−ヒドロ
キシスクシンイミドエステルで標識された抗体の吸収ス
ペクトルを示す。
ニン染料と結合した蛋白の吸収スペクトルを示す。
ルスルホシアニン染料の量子収量(菱形印)変化と非ア
リールスルホシアニン染料のそれ(丸印)との比較を示
す。
Claims (4)
- 【請求項1】 下記水性液体中の成分に共有結合反応性
の、芳香族核に結合したスルホン酸基若しくはスルホネ
ート基少なくとも1個を有するシアニン、メロシアニン
およびスチリル染料よりなる群から選ばれる発光染料を
結合して含む、水性液体中の発光標識成分。 - 【請求項2】 前記染料が、前記成分上のアミン、アル
デヒド、スルフヒドリルまたはヒドロキシ基と共有結合
で反応できる置換基を有する、請求項1の発光標識成
分。 - 【請求項3】 前記成分が、抗体、蛋白、ペプチド、酵
素基質、ホルモン、リンフォカイン、代謝産物、レセプ
タ、抗原、ハプテン、レクチン、トキシン、炭水化物、
寡糖類、多糖類、核酸、ヌクレオチド、誘導ヌクレオチ
ド、デオキシ核酸、誘導核酸、誘導デオキシ核酸、DN
Aフラグメント、RNAフラグメント、誘導DNAフラ
グメント、誘導RNAフラグメント、天然薬物、ウイル
ス粒子、ウイルス成分、イースト成分、血液細胞、血液
細胞成分、生物細胞、非細胞血液成分、バクテリア、バ
クテリア成分、天然および合成脂質嚢、合成および天然
薬物、毒薬、環境汚染物質、重合体、重合体粒子、ガラ
ス粒子、ガラス表面材、プラスチック粒子、プラスチッ
ク表面材、重合体膜、導体および半導体よりなる群から
選ばれる、請求項1又は2の発光標識成分。 - 【請求項4】 芳香族核に結合したスルホン酸基若しく
はスルホネート基少なくとも1個を有するシアニン、メ
ロシアニンおよびスチリル染料よりなる群から選ばれる
発光染料に共有結合したアミン、アルデヒド、スルフヒ
ドリルまたはヒドロキシ基を有する、ヌクレオチド、誘
導ヌクレオチド、核酸、デオキシ核酸、誘導核酸、誘導
デオキシ核酸、DNAフラグメント、RNAフラグメン
ト、誘導DNAフラグメントおよび誘導RNAフラグメ
ントからなる群から選択される発光標識成分。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006526137A (ja) * | 2003-05-28 | 2006-11-16 | ジーイー・ヘルスケア・ユーケイ・リミテッド | 内部標準の存在下で色素を標識することによる閉じた膜構造上の細胞表面タンパク質の示差分析 |
JP2009180513A (ja) * | 2008-01-29 | 2009-08-13 | Fujitsu Ltd | ターゲット評価方法および装置 |
Families Citing this family (51)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5571388A (en) * | 1984-03-29 | 1996-11-05 | Li-Cor, Inc. | Sequencing near infrared and infrared fluorescense labeled DNA for detecting using laser diodes and suitable labels thereof |
US5783673A (en) * | 1990-05-21 | 1998-07-21 | Coulter Corporation | Method of preferential labelling of a phycobiliprotein with an aminereactive dye for use in a multiple color assay and product for such use |
US5208336A (en) * | 1990-10-19 | 1993-05-04 | Sterling Drug Inc. | Selenomerocyanines and processes for preparation and methods of use and compositions thereof |
JP3285609B2 (ja) * | 1991-06-21 | 2002-05-27 | キヤノン株式会社 | 標識複合体、及びそれを用いる分析法 |
EP0641438A1 (en) * | 1991-11-21 | 1995-03-08 | Glyko, Inc. | Fluorophore-assisted therapeutic drug monitoring |
JP3260884B2 (ja) * | 1993-02-05 | 2002-02-25 | キヤノン株式会社 | 標識複合体、それを用いる分析法、生体関連物質の検出および定量の方法 |
US5534416A (en) * | 1993-04-13 | 1996-07-09 | Molecular Probes, Inc. | Fluorescent viability assay using cyclic-substituted unsymmetrical cyanine dyes |
JP3368011B2 (ja) * | 1993-10-04 | 2003-01-20 | キヤノン株式会社 | 核酸検出法 |
CA2194150A1 (en) * | 1994-06-30 | 1996-01-11 | Linda G. Lee | N-heteroaromatic ion and iminium ion substituted cyanine dyes for use as fluorescence labels |
DE4445065A1 (de) | 1994-12-07 | 1996-06-13 | Diagnostikforschung Inst | Verfahren zur In-vivo-Diagnostik mittels NIR-Strahlung |
US6426190B1 (en) * | 1995-04-20 | 2002-07-30 | Carnegie Mellon University | Difference detection methods using matched multiple dyes |
US5616502A (en) * | 1995-05-19 | 1997-04-01 | Molecular Probes, Inc. | Non-specific protein staining using merocyanine dyes |
WO1997004311A2 (en) * | 1995-07-20 | 1997-02-06 | Advanced Bioconcept, Inc. | Cell sorting with fluorescent peptides |
US6821952B1 (en) | 1995-07-20 | 2004-11-23 | Perkinelmer Las, Inc. | Fluorescent vasoactive intestinal peptide (VIP) |
IT1276833B1 (it) * | 1995-10-09 | 1997-11-03 | Sorin Biomedica Cardio Spa | Coloranti fluorescenti della famiglia della solfo benz e indocianina |
DE19612650C1 (de) * | 1996-04-02 | 1997-07-31 | Evotec Biosystems Gmbh | Verfahren zur Fluoreszenzmarkierung von Molekülen |
DK0898596T3 (da) * | 1996-04-19 | 2001-12-17 | Amersham Pharm Biotech Uk Ltd | Farvestoffer af kvadrattypen og deres anvendelse ved en fremgangsmåde til sekvensbestemmelse |
US5688966A (en) * | 1996-07-26 | 1997-11-18 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Compounds and method for synthesizing sulfoindocyanine dyes |
US6294667B1 (en) | 1996-10-07 | 2001-09-25 | Amersham International Plc | Analysis of carbohydrates |
JP3625250B2 (ja) * | 1998-05-14 | 2005-03-02 | 松下電器産業株式会社 | 色素標識重合抗体およびその製造方法 |
US6027709A (en) * | 1997-01-10 | 2000-02-22 | Li-Cor Inc. | Fluorescent cyanine dyes |
CA2297216C (en) * | 1997-07-28 | 2008-02-05 | Nycomed Amersham Plc | Cyanine dyes |
GB9716476D0 (en) * | 1997-08-04 | 1997-10-08 | Amersham Int Plc | Dye intermediate and method |
GB9812596D0 (en) * | 1998-06-11 | 1998-08-12 | Amersham Pharm Biotech Uk Ltd | Energy transfer assay method |
US6110630A (en) * | 1998-06-18 | 2000-08-29 | Beckman Coulter, Inc. | Efficient activated cyanine dyes |
EP1325084A2 (de) * | 1998-12-05 | 2003-07-09 | Otto Samuel Wolfbeis | Pyridin- und chinolin-farbstoffe als marker für biomoleküle, polymere, arzneistoffe und partikel |
DE19954934A1 (de) * | 1999-11-16 | 2001-05-17 | Otto S Wolfbeis | Verfahren zur Solubilisierung von optischen Markern |
DE19911421A1 (de) * | 1999-03-11 | 2000-10-05 | Dyomics Gmbh | Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe |
DE19921234B4 (de) * | 1999-05-07 | 2005-07-28 | Few Chemicals Gmbh | Cyanin-Farbstoffe |
DE19937024A1 (de) * | 1999-08-05 | 2001-02-08 | Bayer Ag | Verwendung von Acylsulfonamido substituierten Polymethin-Farbstoffen als Fluoreszenz-Farbstoffe und/oder Marker |
JP2001288197A (ja) | 2000-04-10 | 2001-10-16 | Fuji Photo Film Co Ltd | 蛍光ヌクレオチド |
DE10018199A1 (de) * | 2000-04-12 | 2001-10-31 | Few Chemicals Gmbh | Fluoreszenzmarker |
EP1319047B1 (en) * | 2000-09-19 | 2006-01-04 | Li-Cor, Inc. | Cyanine dyes |
DE10046215B4 (de) * | 2000-09-19 | 2004-04-15 | Institut für Chemo- und Biosensorik Münster e.V. i.Ins. | Fluorochrome und deren Verwendung |
JP3429282B2 (ja) | 2001-02-02 | 2003-07-22 | リサーチ・インターナショナル・インコーポレーテッド | 自動化されたシステム、及びサンプルの分析方法 |
JP4676654B2 (ja) | 2001-07-19 | 2011-04-27 | 富士フイルム株式会社 | 蛍光ヌクレオチド及びそれを用いた標識法 |
US7172907B2 (en) * | 2003-03-21 | 2007-02-06 | Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. | Cyanine dye labelling reagents with meso-substitution |
US7496245B2 (en) | 2004-08-20 | 2009-02-24 | Research International, Inc. | Misalignment compensating optical sensor and method |
WO2006034036A1 (en) * | 2004-09-16 | 2006-03-30 | Applera Corporation | Fluorescent dye compounds, conjugates and uses thereof |
DE102005004745A1 (de) * | 2005-01-31 | 2006-08-10 | Dyomics Gmbh | Verfahren zu Nachweis und Quantifizierung von Proteinen |
US8173819B2 (en) * | 2005-09-02 | 2012-05-08 | Visen Medical, Inc. | Nicotinic and picolinic acid derived near-infrared fluorophores |
US7781187B2 (en) * | 2005-12-30 | 2010-08-24 | Corning Incorporated | Fluorescent dyes |
US7651869B2 (en) | 2006-03-14 | 2010-01-26 | Research International, Inc. | Optical assay apparatus and methods |
ATE535525T1 (de) * | 2006-03-31 | 2011-12-15 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Cyaninfarbstoff vom pyrazoltyp |
JP5328660B2 (ja) * | 2006-11-01 | 2013-10-30 | ユーティー−バッテル・エルエルシー | 血球計算法による治療のための手段および方法 |
US9097667B2 (en) * | 2007-12-14 | 2015-08-04 | Biotium, Inc. | Fluorescent compounds |
JP5565547B2 (ja) * | 2009-01-13 | 2014-08-06 | 株式会社マンダム | 損傷dnaの定量方法及び被験物質の評価方法 |
CN103073909B (zh) * | 2013-01-30 | 2014-03-26 | 河南大学 | 水溶性不对称吲哚菁荧光染料及其制备方法 |
GB201516987D0 (en) | 2015-09-25 | 2015-11-11 | Illumina Cambridge Ltd | Polymethine compounds and their use as fluorescent labels |
EP3646032B1 (en) * | 2017-06-27 | 2024-08-07 | Coriolis Pharma Research GmbH | Polysorbate quantification assay |
CN117460790A (zh) * | 2021-08-18 | 2024-01-26 | 富士胶片株式会社 | 荧光性化合物及使用了该荧光性化合物的荧光标记生物物质 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB1529202A (en) * | 1976-02-20 | 1978-10-18 | Ciba Geigy Ag | Spectral sensitising dyes |
JPS55116259A (en) * | 1979-03-01 | 1980-09-06 | Fuji Photo Film Co Ltd | Microimmunoassay method |
JPS5747493A (en) * | 1980-09-02 | 1982-03-18 | Fuji Photo Film Co Ltd | Method of determining a trace amount of enzyme |
JPS5745460A (en) * | 1980-09-02 | 1982-03-15 | Fuji Photo Film Co Ltd | Inspection sheet for measuring trace component and inspecting method using said sheet |
DE3170135D1 (en) * | 1980-09-02 | 1985-05-30 | Fuji Photo Film Co Ltd | Method for immunochemical measurement of trace components |
-
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006526137A (ja) * | 2003-05-28 | 2006-11-16 | ジーイー・ヘルスケア・ユーケイ・リミテッド | 内部標準の存在下で色素を標識することによる閉じた膜構造上の細胞表面タンパク質の示差分析 |
JP2009180513A (ja) * | 2008-01-29 | 2009-08-13 | Fujitsu Ltd | ターゲット評価方法および装置 |
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Publication number | Publication date |
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---|---|---|
JP2898264B2 (ja) | 発光アリールスルホネートシアニン染料を用いた物質の標識ないし検出方法 | |
US5268486A (en) | Method for labeling and detecting materials employing arylsulfonate cyanine dyes | |
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