DE19937024A1

DE19937024A1 - Verwendung von Acylsulfonamido substituierten Polymethin-Farbstoffen als Fluoreszenz-Farbstoffe und/oder Marker

Info

Publication number: DE19937024A1
Application number: DE19937024A
Authority: DE
Inventors: Geert Deroover; Michael Misfeldt; Lydia Simon
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1999-08-05
Filing date: 1999-08-05
Publication date: 2001-02-08
Also published as: CA2381088A1; US6995262B1; EP1206703A1; WO2001011370A1; CN1369062A; JP2003506567A; AU6986100A; CA2381088C

Abstract

Die Erfindung betrifft neue Polymethinfarbstoffe, enthaltend mindestens eine Acylsulfonamidogruppe gemäß Formel (I) DOLLAR F1 worin n, Y, A und R die in den Ansprüchen angegebene Bedeutung haben, sowie mindestens eine Verbindung der in den Ansprüchen angegebenen Formeln (a) bis (n). Die erfindungsgemäßen Polymethinfarbstoffe eignen sich zur Verwendung als Farbstoffe und/oder Marker, insbesondere zum Anfärben oder Markieren von Biomolekülen.

Description

In den letzten Jahren wurden immer empfindlichere und einfacher zu handhabende Detektionsmethoden entwickelt, die besonders in der Biotechnologie, wo geringe Substanzmengen für eine Analyse zur Verfügung stehen, eingesetzt werden. Hier finden beispielsweise fluoreszente Detektionsmethoden immer weitere Verbreitung. Die Fluoreszenzfarbstoffe werden als Label benutzt, um biologische Substanzen, wie Proteine, DNA, RNA, Kohlenhydrate, Fette oder ganze Zellen zu markieren. Da je doch viele der zu markierenden Substanzen selbst fluoreszente Eigenschaften im Be reich um 400 bis 500 nm aufweisen sollten die zur Markierung einzusetzenden Farb stoffe bei Wellenlängen oberhalb 500 nm, üblicherweise im Bereich zwischen 500 und 1200 nm, absorbieren. In diesem Wellenlängenbereich sind außerdem preiswerte Laser Dioden als Lichtquellen verfügbar.

Die aus dem Stand der Technik bekannten Fluoreszenzfarbstoffe sind häufig mit hydrophilen oder aciden Gruppen substituiert, um die Wasserlöslichkeit bei neu tralem oder leicht basischem pH zu gewährleisten. Dies erleichtert die Markierung von biologischem Material, das überwiegend im wässrigen Medium funktionsfähig ist. Die Farbstoffe sollten außerdem photostabil sein, um auch Meßmethoden, die eine längere Bestrahlung beinhalten, zu ermöglichen. Viele der längerwelligen Farb stoffe weisen jedoch keine ausreichende Photostabilität auf.

Die Farbstoffe werden kovalent oder auch adsorptiv an die biologischen Proben ge bunden. Proteine, z. B. weisen mit der Sulfhydrylgruppe und freien Aminogruppen reaktive Reste auf, an die ein Farbstoffmolekül kovalent gekoppelt werden kann. Des weiteren können sich hydrophile oder lipophile Farbstoffe adsorptiv an die hydro philen und hydrophoben Domänen der Proteine anlagern. Ebenso können über ionische Wechselwirkungen Adsorptionen von ionischen Farbstoffen an Proteine stattfinden.

Die bisher häufig in Bioassays eingesetzten Cyaninfarbstoffe (Waggoner et al. Bioconjugate Chemistry, 4,105-111 (1993), US 5,268,486, WO 97/13810) haben die Eigenschaft zu aggregieren. Es können sich neben dem Monomer noch H-Aggregate und J-Aggregate ausbilden, je nach chemischer Umgebung, (z. B. pH-Wert) des Farb stoffes. Dies wird in der Photographie ausgenutzt, da die Absorptionen der Aggregate hypsochrom bzw. bathochrom gegenüber der Monomerabsorption verschoben sind. Dieser Aggregationseffekt ist für das Biolabeling jedoch unerwünscht, weil er auch hier zu einer oder mehreren zusätzlichen Absorptionsbanden führt.

Häufig werden Multiplexassays durchgeführt, bei denen mit verschiedenen Farb stoffen markierte Proben bei verschiedenen Wellenlängen angeregt werden. Um eine ausreichende Trennung der Anregungs- und Emissionssignale zu erhalten, dürfen die Absorptionen der Farbstoffkonjugate nicht überlappen. Hier ist eine scharfe, reprodu zierbare und von pH-Wert oder Lösungsmitteleinflüssen unabhängige Absorption der Farbstoffe wichtig. Die Aggregationsneigung der häufig verwendeten Cyaninfarb stoffe verringert außerdem die Intensität der Fluoreszenz durch Quenching. Die emittierte Strahlung wird entweder direkt wieder reabsorbiert oder es kommt zu strahlungslosen Verlustprozessen der Energie.

Die aus dem Stand der Technik bekannten Farbstoffe zum Biolabeln, die Cyaninfarb stoffe stellen eine Klasse der Polymethine dar. Daneben sind aus der WO 97/40104 beispielsweise Quadratsäurederivate als Farbstoffe für das Biolabeling bekannt.

Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, neue Fluoreszenzfarbstoffe als Fluoreszenzlabel oder Färbungsfarbstoffe mit verbesserten Eigenschaften gegen über den aus dem Stand der Technik bekannten Cyaninfarbstoffen zur Verfügung zu stellen. Insbesondere sollte die Löslichkeit in biologischen Puffersystemen sowie die Photostabilität verbessert werden und besonders die Aggregationsneigung verringert werden. Gleichzeitig sollten die erfindungsgemäßen Verbindungen sich jedoch auch durch eine höhere Quantenausbeute sowie einen höheren Extinktionskoeffizienten auszeichnen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Polymethinfarbstoffe enthaltend mindestens eine Acylsulfonamidogruppe gemäß Formel (I)

worin
n für 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 oder 9
Y, A für elektronenziehende Reste, vorzugsweise C = O oder -SO₂-, und
R für einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest
stehen und enthaltend mindestens eine Verbindung der folgenden Formeln:

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Poly methinfarbstoffe enthaltend mindestens eine Acylsulfonamidogruppe gemäß Formel (I) zum Anfärben und/oder Biolabeln von Biomolekülen.

Erfindungsgemäße Polymethinfarbstoffe, die nicht nur zum Anfärben sondern zum Biolabeln durch Ausbildung einer kovalenten Bindung verwendet werden sollen, weisen neben einer Gruppe der Formel (I) zusätzlich mindestens eine Gruppe auf, die in der Lage ist eine solche kovalente Bindung auszubilden, derartige Gruppen sind erfindungsgemäß vorzugsweise

Daher betrifft ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung von Polymethinfarbstoffen enthaltend mindestens eine Acylsulfonamidogruppe gemäß Formel (I) und mindestens eine zur kovalenten Bindung befähigte Gruppierung ausgewählt aus der Liste der folgenden Verbindungen:

zum Markieren von Biomolekülen durch kovalente Bindung.

Unter Biomolekülen sind im Sinne der folgenden Anmeldung Proteine sowie DNA und/oder RNA zu verstehen. Außerdem können im Sinne der vorliegenden An meldung auch Zellen als Biomoleküle angesehen werden. Ebenso sind darunter auch kleine organische Moleküle mit biologischer Wirkung zu verstehen.

Polymethinfarbstoffe, die neben einer Verbindung der Formel (I) zusätzlich eine Gruppe ausgewählt aus einer der Formeln (a) bis (n) aufweisen sind aus dem Stand der Technik noch nicht bekannt und stellen neue Verbindungen dar. Diese eignen sich insbesondere zum Biolabeln, da sie befähigt sind kovalente Bindungen auszu bilden.

Unter einer elektronenziehenden Gruppe im Sinne der vorliegenden Anmeldung sind sofern nicht anders beschrieben bevorzugt Gruppen zu verstehen, wie sie in March, Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed., S. 17 und S. 238 beschrieben sind.

Unter Alkyl im Sinne der vorliegenden Anmeldung sind sofern nicht anders definiert lineare oder verzweigte, cyclische oder geradkettige, substituierte oder nicht sub stituierte Kohlenwasserstoffe zu verstehen. Insbesondere handelt es sich dabei um Alkylgruppen mit 1 bis 12 C-Atomen, wie beispielsweise Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, t-Butyl-, Neopentyl- und 2-Ethylhexylgruppen. Diese können je doch weiter substituiert sein, besonders bevorzugt mit einer Carboxycarbonylgruppe.

Unter Aryl im Sinne der vorliegenden Anmeldung sind sofern nicht anders definiert aromatische Kohlenwasserstoffgruppen zu verstehen, wobei es sich vorzugsweise um 5- oder 6-gliedrige Ringsysteme handelt, welche monocyclisch aber auch als konden sierte Ringsysteme vorliegen können. Es kann sich dabei sowohl um substituierte als auch um nicht substituierte Ringsysteme handeln. Besonders bevorzugt sind bei spielsweise Phenyl- und Naphthylgruppen.

Es wurde überraschenderweise gefunden, daß bei Verwendung der erfindungsge mäßen Farbstoffe in biologischen Systemen, wie z. B. in Proteinkonjugaten oder in biologischen Puffermedien, die Aggregationsneigung der Polymethine im Vergleich zu Cyaninen oder Quadratsäurefarbstoffen mit Alkylsulfonaten oder Alkylcar boxylaten wie sie in Patenten US 5,268,486, WO 96/00902, WO 97/13810 und WO 97/40104 beschrieben sind, deutlich reduziert werden konnte.

Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäß zu verwendenden Farbstoffe liegt darin, daß durch den Substituenten die chromogenen Eigenschaften der Polymethine nicht ver ändert werden. Bisher wurden z. B. die Funktionalität für eine verbesserte Löslichkeit der Cyaninfarbstoffe durch Einführen von Sulfogruppen in das am Chromophor be teiligte Arylsystem realisiert. Dies hat auch eine Verschiebung der spektralen Eigen schaften zufolge, da die Substituenten elektronenziehende Wirkungen hatten. Die spektralen Eigenschaften von unsubstituierten Arylcyaninen sind beschrieben und so kann man durch die Einführung des Acylsulfonsäurerestes das Farbstoffsystem für den Einsatz in z. B. einem Bioassay direkt übertragen. Dies erspart langwierige Optimierungs- und Screeningarbeit.

Weiterhin weisen die Farbstoffe mit Acylsulfonamidogruppen einen hohen Extinktionskoeffizienten im Vergleich zu Alkylcarboxylaten auf. Dies führt zu einem weiteren Vorteil in der Anwendung als Label:
Bindet man die Farbstoffe kovalent als Label an z. B. ein Protein oder einen Antikörper, dann wird das Konjugat durch das molare Farbstoff/Proteingehaltsver hältnis charakterisiert. Um ein ausreichendes Signal zu erhalten, muß eine bestimmte Menge Farbstoff an das Protein gebunden sein. Je höher der Extinktionskoeffizient des Farbstoffs ist und damit seine Intensität, um so sensitiver ist der Farbstoff als Fluoreszenzlabel, da die Fluoreszenzintensität bei Absorptionen <0.05 vom Extinktionskoeffizient abhängig ist.
F = ϕ K I_o εcd
Φ = Quantenausbeute
I_o = Intensität des eingestrahlten Lichtes
ε = Extinktionskoeffizient
c = Konzentration der Probe
d = Schichtdicke

Da sich die Farbstoffe jedoch bei räumlicher Nähe quenchen, sollte das Farbstoff/Proteinverhältnis nicht zu groß werden. Dies hat einen Verlust der Fluores zenzintensität zufolge. Daher sind Farbstoffe mit hohen Extinktionskoeffizienten be sonders geeignet als Fluoreszenzlabel. Bereits geringe Farbstoffmengen ergeben ein intensives Fluoreszenzsignal bei einem geringen molaren Farbstoff/Proteingehalts- Verhältnis. Quenchprozesse werden also minimiert.

Als erfindungsgemäß einzusetzende Polymethinfarbstoffe eignen sich insbesondere Cyaninfarbstoffe, Merocyanine, Rhodacyanine, Styrolfarbstoffe, Quadratsäurefarb stoffe und der Crotonsäurefarbstoffe, wie sie im folgenden in bevorzugten Aus führungsformen näher beschrieben sind, welche sich alle dadurch auszeichnen, daß sie zur erfindungsgemäßen Verwendung mindestens einen Substituenten gemäß der Formel (I) aufweisen. In einer weiteren Ausführungsform können auch die Poly methinfarbstoffe der Formeln (1) bis (5) aneinander gebunden sein, dabei können so wohl zwei oder mehr gleiche als auch verschiedene Farbstoffe aneinander gebunden sein. Erfindungsgemäße Polymethinfarbstoffe sind vorzugsweise solche der im folgenden aufgeführten Formeln, welche neben einem Substituenten der Formel (I) zusätzlich mindestens einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe der folgenden Verbindungen enthalten:

1. Cyaninfarbstoffe

Als Cyaninfarbstoffe kommen erfindungsgemäß insbesondere solche der Formeln 1a, 1b und/ oder 1c in Frage

in der
Ra₁₀ bis Ra₁₁₀ unabhängig voneinander für einen beliebigen Substituenten stehen können,
n für 0, 1, 2, 3 oder 4 steht,
Ya₁₁, Ya₁₂ und Ya₁₃ abhängig voneinander für substituiertes oder unsubstituiertes C oder N stehen können, wobei die Substituenten auch einen 5- oder 6- gliedrigen, aliphatischen oder aromatischen Carbo- oder Heterocyclus bilden können,
und
Aa₁₁ und Ba₁₁ unabhängig voneinander für O, S, Se, Te, N-Ra₁₁₁, C(Ra₁₁₂)(Ra₁₁₃) oder -C(Ra₁₁₄)=C(Ra₁₁₅)-, wobei Ra₁₁ bis Ra₁₁₅ unabhängig voneinander für H, gegebenenfalls substituiertes Alkyl, gegebenenfalls substituiertes Aryl oder gegebenenfalls substituiertes Alkenyl mit bis zu 20 C-Atomen stehen können,
mit der Maßgabe, daß mindestens einer der Substituenten Ra₁₀ bis Ra₁₁₅ ausgewählt ist aus der Gruppe, die gebildet wird durch -(CH₂)₁-SO₂-Z-SO₂-R, -(CH₂)₁-CO-Z-SO₂-R, -(CH₂)₁-SO₂-Z-CO-R, und -(CH₂)₁-N(R)-SO₃ ^-,
wobei
l für eine Zahl zwischen 1 und 6,
Z für NH oder N^- steht und
R bevorzugt für gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl steht.

Besonders bevorzugte erfindungsgemäß einzusetzende Verbindungen der Formel 1a sind im folgenden aufgeführt.

Bevorzugte Verbindungen der Formel 1a

in der
Rb₁₀ bis Rb₁₁₀ unabhängig voneinander für einen beliebigen Substituenten stehen können,
m für 0, 1, 2, 3 oder 4 steht und
Yb₁₁, Yb₁₂ und Yb₁₃ abhängig voneinander für substituiertes oder unsubsti tuiertes C oder N stehen können, wobei die Substituenten auch einen 5- oder 6-gliedrigen, aliphatischen oder aromatischen Carbo- oder Heterocyclus bilden können,
mit der Maßgabe, daß mindestens einer der Substituenten Rb₁₁ bis Rb₁₁₀ ausgewählt ist aus der Gruppe, die gebildet wird durch -(CH₂)₁-SO₂-Z-SO₂-R, -(CH₂)₁-CO-Z-SO₂-R, -(CH₂)₁-SO₂-Z-CO-R, und -(CH₂)₁-N(R)-SO₃ ^-,
wobei
l für eine Zahl zwischen 1 und 6,
Z für NH oder N^- steht und
R bevorzugt für gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl steht.

In einer bevorzugten Ausführungsform bilden folgende Substituenten einen 5- oder 6-gliedrigen Carbo- oder Heterocyclus, der gegebenenfalls auch annelliert ist:
Der Substituent Rb₁₁ zusammen mit Rb₁₂ und/oder Rb₁₄, der Substituent Rb₁₂ zu sammen mit Rb₁₃ und/oder Rb₁₁, der Substituent Rb₁₄ zusammen mit Rb₁₅ und/oder Rb₁₁, der Substituent Rb₁₈ zusammen mit Rb₁₉ und/oder Rb₁₇, der Substituent Rb₁₇ zusammen mit Rb₁₆ und/oder Rb₁₈, der Substituent Rb₁₉ zusammen mit Rb₁₁₀ und/oder Rb₁₈.

Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel 1b

in der
Rc₁₁ bis Rc₁₁₀ unabhängig voneinander für einen beliebigen Substituenten stehen können,
m für 0, 1, 2, 3 oder 4 steht,
Yc₁₁, Yc₁₂ und Yc₁₃ abhängig voneinander für substituiertes oder unsubstituiertes C oder N stehen können, wobei die Substituenten auch einen 5- oder 6- gliedrigen, aliphatischen oder aromatischen Carbo- oder Heterocyclus bilden können,
und
Bc₁₁ für O, S, Se, Te, N-Rc₁₁₁, C(Rc₁₁₂)(Rc₁₁₃) oder -C(Rc₁₁₄)=C(Re₁₁₅)-, wobei Rc₁₁ bis Rc₁₁₅ unabhängig voneinander für H, gegebenenfalls substituiertes Alkyl, gegebenenfalls substituiertes Aryl oder gegebenenfalls substituiertes Alkenyl mit bis zu 20 C-Atomen stehen können,
mit der Maßgabe, daß mindestens einer der Substituenten Rc₁₀ bis Rc₁₁₅ ausgewählt ist aus der Gruppe, die gebildet wird durch -(CH₂)₁-SO₂-Z-SO₂-R, -(CH₂)₁-CO-Z-SO₂-R, -(CH₂)₁-SO₂-Z-CO-R, und -(CH₂)₁-N(R)-SO₃ ^-,
wobei
l für eine Zahl zwischen 1 und 6,
Z für NH oder N^- steht und
R bevorzugt für gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl steht.

In einer bevorzugten Ausführungsform bilden folgende Substituenten einen 5- oder 6-gliedrigen Carbo- oder Heterocyclus der gegebenenfalls auch annelliert ist:
Der Substituent Rc₁₁ zusammen mit Rc₁₂ und/oder Rc₁₄, der Substituent Rc₁₂ zu sammen mit Rc₁₃ und/oder Rc₁₁, der Substituent Rc₁₄ zusammen mit Rc₁₅ und/oder Rc₁₁.

Vorzugsweise können die Substituenten Rc₁₇ bis Rc₁₁₀ die restlichen Glieder eines carbo- bzw. heterocyclischen Ringsystems bilden, das bis zu 4 Ringen enthalten kann, die gegebenenfalls mehrere Substituenten tragen können. Rc₁₈ kann zusammen mit Rc₁₉ eine π-Bindung bilden und Rc₁₇ und Rc₁₁₀ können Substituenten darstellen.

Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel 1c

2. Merocyanine

Im Sinne der vorliegenden Erfindung eignen sich insbesondere Merocyanine gemäß der Formeln 2a und/oder 2b

in der
Ra₂₁ bis Ra₂₅ unabhängig voneinander für einen beliebigen Substituenten stehen,
Ya₂₁, Ya₂₂, Ya₂₃, Ya₂₄ abhängig voneinander für substituiertes oder un substituiertes C oder N stehen, wobei die Substituenten auch einen 5- oder 6-gliedrigen, aliphatischen oder aromatischen Carbo- oder Heterocyclus bilden können,
m für 0, 1, 2, 3, 4,
o für 0, 1, 2,
Fa₂₁ und Ca₂₁ unabhängig voneinander für C=O, C=S oder C(Ra₂₇)=,
Ba₂₁ und Da₂₁ unabhängig voneinander für gegebenenfalls substituiertes C, N, O oder S steht,
Ra₂₆ für O, S, oder einen weiteren heterocyclischen, gegebenenfalls substituierten 5- oder 6-gliedrigen Ring steht,
k, i, und j unabhängig voneinander für 0 oder 1 stehen,
Ra₂₇, für H oder gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl steht,
Aa₂₁ für O, S, Se, Te, N-Ra₂₈, C(Ra₂₉)(Ra₂₁₀), -C(Ra₂₁₁)=C(Ra₂₁₂)-,
wobei
Ra₂₈ bis Ra₂₁₂ für H oder gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl, oder Alkenyl mit bis zu 20 C-Atomen stehen können,
mit der Maßgabe, daß mindestens einer der Substituenten Ra₂₁ bis Ra₂₅ bzw. Ra₂₇ bis Ra₂₁₂ ausgewählt ist aus der Gruppe, die gebildet wird durch -(CH₂)₁-SO₂-Z- SO₂-R, -(CH₂)₁-CO-Z-SO₂-R, -(CH₂)₁-SO₂-Z-CO-R, und -(CH₂)₁-N(R)-SO₃ ^-,
wobei
l für eine Zahl zwischen 1 und 6,
Z für NH oder N^- steht und
R bevorzugt für gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl steht.

Vorzugsweise bilden die Substituenten Ra₂₂ bis Ra₂₅ die restlichen Glieder eines carbo- bzw. heterocyclischen Ringsystems, das bis zu 4 Ringen enthalten kann, die gegebenenfalls mehrere Substituenten fragen können. Ra₂₂ kann zusammen mit Ra₂₅ eine π-Bindung bilden und Ra₂₃ und Ra₂₄ können Substituenten darstellen.

Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel 2a

in der
Rb₂₁ bis Rb₂₅ unabhängig voneinander für einen beliebigen Substituenten stehen,
Yb₂₁, Yb₂₂, Yb₂₃, Yb₂₄ abhängig voneinander für substituiertes oder unsub stituiertes C oder N stehen, wobei die Substituenten auch einen 5- oder 6-gliedrigen, aliphatischen oder aromatischen Carbo- oder Heterocyclus bilden können,
m für 0, 1, 2, 3 oder 4 steht,
o für 0, 1, 2, 3 oder 4 steht,
Fb₂₁ und Cb₂₁ unabhängig voneinander für C=O, C=S oder C(Rb₂₇)=,
Bb₂₁ und Db₂₁ unabhängig voneinander für gegebenenfalls substituiertes C, N, O oder S steht,
Rb₂₆ für O, S, oder einen weiteren heterocyclischen, gegebenenfalls substituierten 5- oder 6-gliedrigen Ring steht,
k, i, und j unabhängig voneinander für 0 oder 1 stehen,
Rb₂₇ für H oder gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl steht.

Vorzugsweise können folgende Substituenten einen 5- oder 6-gliedrigen Carbo- oder Heterocyclus bilden, der gegebenenfalls auch annelliert ist:
Der Substituent Rb₂₃ zusammen mit Rb₂₄ und/oder Rb₂₂, der Substituent Rb₂₂ zu sammen mit Rb₂₁ und/oder Rb₂₃, der Substituent Rb₂₄ zusammen mit Rb₂₅ und/oder Rb₂₃.

Ab₂₁: O, S, Se, Te, N-Rb₂₈, C(Rb₂₉)(Rb₂₁₀), -C(Rb₂₁₁)=C(Rb₂₁₂)-,
Rb₂₈ bis Rb₂₁₂ können sein Wasserstoff, ggf. substituiertes Alkyl oder gegebenenfalls substituiertes Aryl, gegebenenfalls substituiertes Alkenyl, mit bis zu 20 C-Atomen, oder einer der unten angegebenen Substituenten,
mit der Maßgabe, daß mindestens einer der Substituenten Rb₂₁ bis Rb₂₅ bzw. Rb₂₇ bis Rb₂₁₂ ausgewählt ist aus der Gruppe, die gebildet wird durch -(CH₂)₁-SO₂-Z- SO₂-R, -(CH₂)₁-CO-Z-SO₂-R, -(CH₂)₁-SO₂-Z-CO-R, und-(CH₂)₁-N(R)-SO₃ ^-,
wobei
l für eine Zahl zwischen 1 und 6,
Z für NH oder N steht und
R bevorzugt für gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl steht.

Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel 2b

Rhodacyanine

Als Rhodacyanine im Sinn der vorliegenden Anmeldung werden insbesondere solche der Formeln 3a und/oder 3b eingesetzt.

in der
Ra₃₁ bis Ra₃₁₁ unabhängig voneinander für einen beliebigen Substituenten stehen,
Ya₃₁, Ya₃₂, Ya₃₃, Ya₃₄, Ya₃₅ unabhängig voneinander für substituiertes oder un substituiertes C bzw. N stehen, wobei die Substituenten auch einen 5- oder 6-gliedrigen, aliphatischen oder aromatischen Carbo- oder Heterocyclus bilden können,
p und r unabhängig voneinander für 0, 1 oder 2,
Qa₃₁ für O; N(Ra₃₁₂), S oder Se,
Aa₃₁, Ba₃ unabhängig voneinander für O, S, Se, Te, N-Ra₃₁₃, C(Ra₃₁₄) (Ra₃₁₅) oder -C(Ra₃₁₆)=C(Ra₃₁₇)- stehen, wobei Ra₃₁₂ bis Ra₃₁₇ für H, gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl oder Alkenyl, mit bis zu 20 C-Atomen oder für einen beliebigen Substituenten stehen können,
mit der Maßgabe, daß mindestens einer der Substituenten Ra₃₁ bis Ra₃₁₇ ausgewählt ist aus der Gruppe, die gebildet wird durch -(C11₂)₁-SO₂-Z-SO₂-R, -(CH₂)₁-CO- Z-SO₂-R, -(CH₂)₁-SO₂-Z-CO-R, und-(CH₂)₁-N(R)-SO₃ ^-,
wobei
l für eine Zahl zwischen 1 und 6,
Z für NH oder N^- steht und
R bevorzugt für gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl steht.

In einer bevorzugten Ausführungsform bilden die Substituenten Ra₃₂ bis Ra₃₅ bzw. Ra₃₆ bis Ra₃₉ die restlichen Glieder eines carbo-bzw. heterocyclischen Ringsystems, das bis zu 4 Ringen enthalten kann, die gegebenenfalls mehrere Substituenten tragen können. Ra₃₂ kann zusammen mit Ra₃₅ und/oder Ra₃₆ zusammen mit Ra₃₉ eine π- Bindung bilden und Ra₃₃ und Ra₃₄ bzw. Ra₃₇ und Ra₃₈ können Substituenten dar stellen.

Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel 3a

in der
Rb₃₁ bis Rb₃₁₁ unabhängig voneinander für einen beliebigen Substituenten stehen,
Yb₃₁, Yb₃₂, Yb₃₃, Yb₃₄, Yb₃₅ abhängig voneinander für substituiertes oder un substituiertes C bzw. N stehen, wobei die Substituenten auch einen 5- oder 6-gliedrigen, aliphatischen oder aromatischen Carbo- oder Heterocyclus bilden können,
p und r unabhängig voneinander für 0, 1 oder 2,
Qb₃₁ für O; N(Rb₃₁₂), S oder Se,
Ab₃₁, Bb₃₁ unabhängig voneinander für O, S, Se, Te, N-Rb₃₁₃, C(Rb₃₁₄)(Rb₃₁₅) oder -C(Rb₃₁₆)=C(Rb₃₁₇)- stehen, wobei Rb₃₁₁ bis Rb₃₁₇ für H, gegebenen falls substituiertes Alkyl, Aryl oder Alkenyl, mit bis zu 20 C-Atomen oder für einen beliebigen Substituenten stehen können,
mit der Maßgabe, daß mindestens einer der Substituenten Rb₃₁ bis Rb₃₁₇ ausgewählt ist aus der Gruppe, die gebildet wird durch -(CH₂)₁-SO₂-Z-SO₂-R, -(CH₂)₁-CO- Z-SO₂-R, -(CH₂)₁-SO₂-Z-CO-R, und -(CH₂)₁-N(R)-SO₃ ^-,
wobei
l für eine Zahl zwischen 1 und 6,
Z für NH oder N^- steht und
R bevorzugt für gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl steht.

In einer bevorzugten Ausführungsform bilden die Substituenten Rb₃₆ bis Rb₃₉ die restlichen Glieder eines carbo- bzw. heterocyclischen Ringsystems, das bis zu 4 Ringe enthalten kann, die gegebenenfalls mehrere Substituenten tragen können. Rb₃₆ kann zusammen mit Rb₃₉ eine π-Bindung bilden und Ra₃₇ und Ra₃₈ können Sub stituenten darstellen. Folgende Substituenten können einen 5- oder 6-gliedrigen Carbo- oder Heterocyclus bilden, der ggf. auch annelliert ist:
Der Substituent Rb₃₃ zusammen mit Rb₃₂ und/oder Rb₃₄, der Substituent Rb₃₂ zusammen mit Rb₃₃ und/oder Rb₃₁, der Substituent Rb₃₄ zusammen mit Rb₃₅ und/oder Rb₃₃.

Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel 3b

Styrylfarbstoffe

Besonders bevorzugt einzusetzende Styrylfarbstoffe im Sinne der vorliegenden Er findung sind die Verbindungen der Formeln 4a, 4b, 4c und/oder 4d.

in der
Ra₄₁ bis Ra₄₁₁ unabhängig voneinander für einen beliebigen Substituenten stehen,
Ya₄₁ und Ya₄₂ unabhängig voneinander für substituiertes oder unsubstituiertes C bzw. N, wobei die Substituenten auch einen 5- oder 6-gliedrigen, aliphatischen oder aromatischen Carbo- oder Heterocyclus bilden können,
Aa₄ für O, S, Se, Te, N-Ra₄₁₂, C(Ra₄₁₃)(Ra₄₁₄) oder -C(Ra₄₁₅)=C(Ra₄₁₆)-, steht, wobei Ra₄₁₂ bis Ra₄₁₆ für H, gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl, oder Alkenyl, mit bis zu 20 C-Atomen oder einen beliebigen Substituenten stehen können,
mit der Maßgabe, daß mindestens einer der Substituenten Ra₄₁ bis Ra₄₁₆ ausgewählt ist aus der Gruppe, die gebildet wird durch -(CH₂)₁-SO₂-Z-SO₂-R, -(CH₂)₁-CO- Z-SO₂-R, -(CH₂)₁-SO₂-Z-CO-R, und -(CH₂)₁-N(R)-SO₃ ^-,
wobei
l für eine Zahl zwischen 1 und 6,
Z für NH oder N^- steht und
R bevorzugt für gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl steht.

In einer bevorzugten Ausführungsform bilden die Substituenten Ra₄₈ bis Ra₄₁₁ die restlichen Glieder eines carbo- bzw. heterocyclischen Ringsystems, das bis zu 4 Ringen enthalten kann, die gegebenenfalls mehrere Substituenten tragen können. Ra₄₈ kann zusammen mit Ra₄₁₁ eine π-Bindung bilden und Ra₄₉ und Ra₄₁₀ können Substituenten darstellen.

Folgende Substituenten können einen 5- oder 6-gliedrigen Carbo- oder Heterocyclus bilden, der gegebenenfalls auch annelliert ist:
Der Substituent Ra₄₅ zusammen mit Ra₄₆ oder Ra₄₅ mit Ra₄₄, oder Ra₄₆ mit Ra₄₁, und/oder Ra₄₁ mit Ra₄₂ und/oder Rad mit Ra₄₃.

Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel 4a

in der
Rb₄₁ bis Rb₄₁₁ unabhängig voneinander für einen beliebigen Substituenten stehen,
Yb₄₁ und Yb₄₂ unabhängig voneinander für substituiertes oder unsubstituiertes C bzw. N, wobei die Substituenten auch einen 5- oder 6-gliedrigen, aliphatischen oder aromatischen Carbo- oder Heterocyclus bilden können und
n für 0, 1, 2, 3, 4 oder 5 steht,
mit der Maßgabe, daß mindestens einer der Substituenten Rb₄₁ bis Rb₄₁₁ ausgewählt ist aus der Gruppe, die gebildet wird durch -(CH₂)₁-SO₂-Z-SO₂-R, -(CH₂)₁-CO- Z-SO₂-R, -(CH₂)₁-SO₂-Z-CO-R, und -(CH₂)₁-N(R)-SO₃ ^-,
wobei
l für eine Zahl zwischen 1 und 6,
Z für NH oder N^- steht und
R bevorzugt für gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl steht.

In einer bevorzugten Ausführungsform bilden folgende Substituenten einen 5- oder 6-gliedrigen Carbo- oder Heterocyclus, der gegebenenfalls auch annelliert ist:
Der Substituent Rb₄₅ zusammen mit Rb₄₆ und/oder Rb₄₅ mit Rb₄₄, und/oder Rb₄₆ mit Rb₄₁, und/oder Rb₄₁ mit Rb₄₂ und/oder Rb₄₄ mit Rb₄₃.

Der Substituent Rb₄₉ zusammen mit Rb₄₁₀ und/oder Rb₄₈, der Substituent Rb₄₁₀ zusammen mit Rb₄₁₁ und/oder der Substituent Rb₄₈ zusammen mit Rb₄₇.

Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel 4b

in der
Rc₄₁ bis Rc₄₁₀ unabhängig voneinander für einen beliebigen Substituenten stehen,
Yc₄₁ und Yc₄₂ unabhängig voneinander für substituiertes oder unsubstituiertes C bzw. N, wobei die Substituenten auch einen 5- oder 6-gliedrigen, aliphatischen oder aromatischen Carbo- oder Heterocyclus bilden können,
Ac₄₁ für O, S, Se, Te, N-Rc₄₁₁, C(Rc₄₁₂)(Rc₄₁₃) oder -C(Rc₄₁₄)=C(RC₄₁₅)-, steht, wobei Rc₄₁₁ bis Rc₄₁₅ für H, ge gebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl, oder Alkenyl, mit bis zu 20 C-Atomen oder einen beliebigen Substituenten stehen können und
n für 0, 1, 2, 3, 4 oder 5 stehen kann,
mit der Maßgabe, daß mindestens einer der Substituenten Rc₄₁ bis Rc₄₁₅ ausgewählt ist aus der Gruppe, die gebildet wird durch -(CH₂)₁-SO₂-Z-SO₂-R, -(CH₂)₁-CO- Z-SO₂-R, -(CH₂)₁-SO₂-Z-CO-R, und -(CH₂)₁-N(R)-SO₃ ^-,
wobei
l für eine Zahl zwischen 1 und 6,
Z für NH oder N^- steht und
R bevorzugt für gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl steht.

In einer bevorzugten Ausführungsform können folgende Substituenten einen 5- oder 6-gliedrigen Carbo- oder Heterocyclus bilden, der gegebenenfalls auch annelliert ist:
Der Substituent Rc₄₅ zusammen mit Rc₄₆ oder Rc₄₅ mit Rc₄₄, oder Rc₄₆ mit Rc₄₁, und/oder Rc₄₁ mit Rc₄₂ und/oder Rc₄₄ mit Rc₄₃.

Die Substituenten Rc₄₇ bis Rc₄₁₀ bilden die restlichen Glieder eines carbo- bzw. heterocyclischen Ringsystems, das bis zu 4 Ringen enthalten kann, die ge gebenenfalls mehrere Substituenten tragen können. Rc₄₇ kann zusammen mit Rc₄₁₀ eine π-Bindung bilden und Rc₄₈ und Rc₄₉ können Substituenten darstellen.

Besonders bevorzugt einzusetzende Verbindungen der Formel 4c

in der
Rd₄₁ bis Rd₄₁₀ unabhängig voneinander für einen beliebigen Substituenten stehen,
Yd₄₁ und Yd₄₂ unabhängig voneinander für substituiertes oder unsubstituiertes C bzw. N, wobei die Substituenten auch einen 5- oder 6-gliedrigen, aliphatischen oder aromatischen Carbo- oder Heterocyclus bilden können und
n für 0, 1, 2, 3, 4 oder 5 stehen kann,
mit der Maßgabe, daß mindestens einer der Substituenten Rd₄₁ bis Rd₄₁₀ ausgewählt ist aus der Gruppe, die gebildet wird durch -(CH₂)₁-SO₂-Z-SO₂-R, -(CH₂)₁-CO- Z-SO₂-R, -(CH₂)₁-SO₂-Z-CO-R, und -(CH₂)₁-N(R)-SO₃ ^-,
wobei
l für eine Zahl zwischen 1 und 6,
Z für NH oder N^- steht und
R bevorzugt für gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl steht.

In einer bevorzugten Ausführungsform können folgende Substituenten einen 5- oder 6-gliedrigen Carbo- oder Heterocyclus bilden, der gegebenenfalls auch annelliert ist:
Der Substituent Rd₄₅ zusammen mit Rd₄₆ und/oder Rd₄₅ mit Rd₄₄, und/oder Rd₄₆ mit Rd₄₁, und/oder Rd₄₁ mit Rd₄₂ und/oder Rd₄₄ mit Rd₄₃.

Der Substituent Rd₄₉ zusammen mit Rd₄₁₀, und/oder der Substituent Rd₄₈ zusammen mit Rd₄₇.

Besonders bevorzugt einzusetzende Verbindungen der Formel 4d

5. Quadratsäuren

Im Sinn der vorliegenden Erfindung bevorzugt einzusetzende Quadratsäuren sind jene der Formeln 5a, 6b und/oder 5c

in der
Ra₅₁ bis Ra₅₁₀ unabhängig voneinander für einen beliebigen Substituenten stehen können,
Ya₅₁ bis Ya₅₄ unabhängig voneinander für substituiertes oder unsubstituiertes C bzw. N, wobei die Substituenten auch einen 5- oder 6-gliedrigen, aliphatischen oder aromatischen Carbo- oder Heterocyclus bilden können,
s und t unabhängig voneinander für 0, 1, 2 oder 3 stehen,
k für 1 oder 2 steht,
Ya₅₂ für O, S, oder =NRa₅₁₁,
Ya₅₃ für O-Ra₅₁₂, S-Ra₅₁₃ oder N(Ra₅₁₄)(Ra₅₁₅),
wobei Ra₅₁₁ bis Ra₅₁₅ unabhängig voneinander für einen beliebigen Substituenten stehen können,
Aa₅₁ und Ba₅₁ unabhängig voneinander für O, S, Se, Te, N-Ra₅₁₆, C(Ra₅₁₇)(Ra₅₁₈) oder -C(Ra₅₁₉)=C(Ra₅₂₀)-, stehen, wobei Ra₅₁₆ bis Ra₅₂₀ für einen beliebigen Substituenten, vorzugs weise für H, gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl oder Alkenyl, mit bis zu 20 C-Atomen stehen können,
mit der Maßgabe, daß mindestens einer der Substituenten Ra₅₁ bis Ra₅₂₀ ausgewählt ist aus der Gruppe, die gebildet wird durch -(CH₂)₁-SO₂-Z-SO₂-R, -(CH₂)₁-CO- Z-SO₂-R, -(CH₂)₁-SO₂-Z-CO-R, und -(CH₂)₁-N(R)-SO₃ ^-,
wobei
l für eine Zahl zwischen 1 und 6,
Z für NH oder N^- steht und
R bevorzugt für gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl steht.

In einer bevorzugten Ausführungsform bilden die Substituenten Ra₅₂ bis Ra₅₅ bzw. Ra₅₆ bis Ra₅₉ die restlichen Glieder eines carbo- bzw. heterocyclischen Ringsystems, das bis zu 4 Ringen enthalten kann, die gegebenenfalls mehrere Substituenten tragen können. Ra₅₂ kann zusammen mit Ra₅₅ und /oder Ra₅₆ zusammen mit Ra₅₉ eine π- Bindung bilden und Ra₅₃ und Ra₅₄ bzw. Ra₅₇ und Ra₅₈ können Substituenten dar stellen.

Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel 5a

in der
Rb₅₁ bis Rb₅₁₂ unabhängig voneinander für einen beliebigen Substituenten stehen können,
Yb₅₁ bis Yb₅₄ unabhängig voneinander für substituiertes oder unsubstituiertes C bzw. N, wobei die Substituenten auch einen 5- oder 6-gliedrigen, aliphatischen oder aromatischen Carbo- oder Heterocyclus bilden können,
s und t unabhängig voneinander für 0, 1, 2 oder 3 stehen,
k für 1 oder 2 steht,
Yb₅₂ für O, S, oder =NRb₅₁₃,
Yb₅₃ für O-Rb₅₁₄, S-Rb₅₁₅ oder N(Rb₅₁₆)(Rb₅₁₇),
wobei Rb₅₁₃ bis Rb₅₁₇ unabhängig voneinander für einen beliebigen Substituenten stehen können,
mit der Maßgabe, daß mindestens einer der Substituenten Rb₅₁ bis Rb₅₁₇ ausgewählt ist aus der Gruppe, die gebildet wird durch -(CH₂)₁-SO₂-Z-SO₂-R, -(CH₂)₁-CO- Z-SO₂-R, -(CH₂)₁-SO₂-Z-CO-R, und -(CH₂)₁-N(R)-SO₃ ^-,
wobei
l für eine Zahl zwischen 1 und 6,
Z für NH oder N^- steht und
R bevorzugt für gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl steht.

In einer bevorzugten Ausführungsform können folgende Substituenten einen 5- oder 6-gliedrigen Carbo- oder Heterocyclus bilden, der gegebenenfalls auch annelliert ist:
Der Substituent Rb₅₅ zusammen mit Rb₅₆ und/oder Rb₅₅ mit Rb₅₄, und/oder Rb₅₆ mit Rb₅₁, und/oder Rb₅₁ mit Rb₅₂ und/oder Rb₅₄ mit Rb₅₃.

Der Substituent Rb₅₉ zusammen mit Rb₅₈ oder Rb₅₁₀ zusammen mit Rb₅₁₁, der Substituent Rb₅₁₁ zusammen mit Rb₅₁₂ und/oder der Substituent Rb₅₈ zusammen mit Rb₅₇.

Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel 5b

in der
Rc₅₁ bis Rc₅₁₁ unabhängig voneinander für einen beliebigen Substituenten stehen können,
Yc₅₁ bis Yc₅₄ unabhängig voneinander für substituiertes oder unsubstituiertes C bzw. N, wobei die Substituenten auch einen 5- oder 6-gliedrigen, aliphatischen oder aromatischen Carbo- oder Heterocyclus bilden können,
s und t unabhängig voneinander für 0, 1, 2 oder 3 stehen,
k für 1 oder 2 steht,
Yc₅₂ für O, S, oder =NRc₅₁₂,
Yc₅₃ für O-Rc₅₁₃, S-Rc₅₁₄ oder N(Rc₅₁₅)(Rc₅₁₆),
Ac₅₁ für O, S, Se, Te, N-Rc₅₁₇, C(Rc₅₁₈)(Rc₅₁₉) oder -C(Rc₅₂₀)=C(Rc₅₂₁)-, steht, wobei Rc₅₁₂ bis Rc₅₂₁ für einen beliebigen Substituenten, vorzugsweise für H, gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl oder Alkenyl, mit bis zu 20 C-Atomen stehen können,
mit der Maßgabe, daß mindestens einer der Substituenten Rc₅₁ bis Rc₅₂₁ ausgewählt ist aus der Gruppe, die gebildet wird durch -(CH₂)₁-SO₂-Z-SO₂-R, -(CH₂)₁-CO- Z-SO₂-R, -(CH₂)₁-SO₂-Z-CO-R, und -(CH₂)₁-N(R)-SO₃ ^-,
wobei
l für eine Zahl zwischen 1 und 6,
Z für NH oder N^- steht und
R bevorzugt für gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl steht.

In einer bevorzugten Ausführungsform können folgende Substituenten einen 5- oder 6-gliedrigen Carbo- oder Heterocyclus bilden, der gegebenenfalls auch annelliert ist:
Der Substituent Rc₅₅ zusammen mit Rc₅₆ und/oder Rc₅₅ mit Rc₅₄, und/oder Rc₅₆ mit Rc₅₁, und/oder Rc₅₁ mit Rc₅₂ und/oder Rc₅₄ mit Rc₅₃.

Die Substituenten Rc₅₇ bis Rc₅₁₀ bilden vorzugsweise die restlichen Glieder eines carbo- bzw. heterocyclischen Ringsystems, das bis zu 4 Ringen enthalten kann, die gegebenenfalls mehrere Substituenten tragen können. Rc₅₈ kann zusammen mit Rc₅₉ eine π-Bindung bilden und Rc₅₇ und Rc₅₁₀ können Substituenten darstellen.

Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel 5c

Substituenten im Sinne der vorliegenden Anmeldung sind beispielsweise Halogene, wie insbesondere F, Cl oder Br zu verstehen, desweiteren Alkoxy-, Alkylthio-, Aryl oxy-, Arylthio-, Acylamino-, Alkylsulfonamido-, Alkylsulfamoyl-, Alkylcarbamoyl-, Arylsulfonamido-, Arylsulfamoyl-, Arylcarbamoyl-, Alkyl-, Alkenyl-, Aryl-, Hetaryl-, Arylen-, Hetarylen-, Alkylen-, Alkoxycarbonyl-, Ureido- oder Cyan gruppen. Weiterhin bevorzugt sind substituierte sowie nicht substituierte Cyclo alkyl-, und auch substituierte sowie nicht substituierte Aryl-, insbesondere Phenyl gruppen besonders bevorzugte Substituenten sind gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl, Sulfoalkyl, Carboxyalkyl, -(CH₂)₁-SO₂-Z-SO₂-R, -(CH₂)₁-CO-Z-SO₂-R, -(CH₂)₁-SO₂-Z-CO-R, -(CH₂)₁-N(R)-SO₃ ^- _, wobei l für eine Zahl zwischen 1 und 6 und Z für NH oder N^- steht und R bevorzugt für gegebenenfalls substituiertes Alkyl oder Aryl steht.

Unter Alkenyl im Sinne der vorliegenden Erfindung sind lineare oder verzweigte, cyclische oder geradkettige, substituierte oder nicht substituierte ungesättigte Kohlen wasserstoffreste zu verstehen wie beispielsweise Ethenyl, 2-Propenyl, Isopropenyl.

Unter carbo- bzw. heterocyclischen Ringsystemen sind im Sinne der vorliegenden Anmeldung sind Ringsysteme bestehend aus vorzugsweise 4, 5, 6, 7 oder 8 Kohlen stoffatomen, wobei bis zu 3 Kohlenstoffatome durch Heteroatome wie insbesondere N, O, SE, oder S ersetzt sein können. Es kann sich bei den Ringsystemen um aliphatische oder aromatische Ringe handeln, vorzugsweise können 2, 3 oder 4 gleiche oder verschiedene Ringe auch als kondensiertes System vorliegen. Unter car bocyclischen aromatischen Gruppen im Sinn der vorliegenden Anmeldung sind vor zugsweise 5- oder 6-gliedrige kondensierte und/oder substituierte Ringsysteme insbe sondere Phenyl- und Naphthyl zu verstehen. Unter ungesättigten heterocyclischen Gruppen sind vorzugsweise 5- oder 6-gliedrige Ringsysteme, welche monocyclisch aber auch als kondensierte Ringsysteme vorliegen können, zu verstehen. Als Hetero atome kommen dabei insbesondere N, S und O in Frage. Ein Ringsystem kann vor zugsweise zwischen 1 und 3 Heteroatome aufweisen, wobei es sich um die gleichen oder verschiedene Heteroatome handeln kann. Bevorzugt sind: Furyl, Indolyl, Thienyl, Pyrrolyl und Carbazolyl. Diese Gruppen können unsubstituiert oder vor zugsweise substituiert sein. Dabei können auch carbocyclische aromatische Gruppen und ungesättigte heterocyclische Gruppen selber als Substituenten auftreten, darunter soll auch die mögliche Kondensation verschiedener Ringsysteme verstanden werden.

Erfindungsgemäß insbesondere bevorzugte Verbindungen einer der Formeln 1 bis 5 sind im folgenden aufgeführt:

Erfindungsgemäß können die Farbstoffe auch an Antikörper konjugiert werden und z. B. in der Flow Cytometrie eingesetzt werden. Ein Vorteil dieser Polymethinfarb stoffe besteht darin, daß für nahezu jede Wellenlänge zwischen 500 und 900 nm ein Farbstoff maßgeschneidert werden kann. Dies führt dazu, daß auch Mehrfarbende tektion möglich ist. In der Flow Cytometrie können z. B. verschiedene Antikörper mit jeweils einem Fluoreszenzfarbstoff gelabelt werden und dann in einem Experiment mit einem geeigneten Detektionssystem simultan detektiert werden. Die spezifischen Antikörper erkennen dann verschiedene Epitope auf den Zellen. Eine Quantifizierung der Analyte ist mit diesen Systemen ebenfalls möglich. Der Einsatz mehrerer fluoreszenzgelabelter Antikörper liefert so einen höheren Informationsgehalt pro Experiment. Dies bedeutet einen Kostenvorteil, insbesondere z. B. für klinische Tests.

Desweiteren können mittels Labeling von miteinander wechselwirkenden Biomolekulen durch Fluoreszenzresonanzenergietransfer auch qualitative bzw. quantitative Nachweisverfahren durchgeführt werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der Farbstoffe zum Labeln von DNA, RNA oder Nukleotidanaloga wie PNA und können hier für Nukleinsäureassays eingesetzt werden können. Üblicherweise werden hier aktivierte Farbstoffmoleküle an Nukleotide, Nukleoside, Nukleotidanaloga oder Oligonukleotide bzw. deren Analoga gebunden. Die Bindung erfolgt über eine nukleophile Gruppe der Nukleotide bzw. Analoga, welche mit dem aktivierten Farb stoff reagiert. Übliche nukleophile Gruppen sind Aminogruppen, Thiolgruppen, Hy droxylgruppen oder andere Gruppen. Die aktivierten Gruppen sind in der Regel Derivate von Carboxylgruppen, wie N-Hydroxysuccinimidester, Isothiocyanate, Maleimide oder Iodacetamidderivate. Außerdem kann eine nukleophile Gruppe auch mit einem Phosphoamiditrest reagieren und so eine kovalente Bindung zwischen dem Farbstoffmolekül und dem Biomolekül entstehen.

Als weitere Anwendung können die Farbstoffe auch an feste Phasen, wie z. B. poly mere Beads gebunden werden oder in diese eingelagert werden. Die polymeren Beads können funktionalisiert werden und ihrerseits als Fluoreszenzlabel in der Bio analytik fungieren.

Wie bereits beschrieben sind Polymethinfarbstoffe enthaltend eine Gruppe der Formel (I) bereits aus der Fotografie bekannt, sie sind erhältlich wie beispielsweise in EP 0 534 283, EP 0 530 511, DE 10 81 311 beschrieben.

Demgegenüber sind Polymethinfarbstoffe enthaltend eine Gruppe der Formel (I) und gleichzeitig eine Gruppe die sie befähigt kovalente Bindungen auszubilden, ausge wählt aus der Gruppe der folgenden Verbindungen:

neu und im Stand der Technik noch nicht beschrieben. Im folgenden sind daher Synthesevorschriften aufgezeigt, wie derartig "aktivierte" Farbstoffe erhalten werden können:

Synthesevorschriften für die Herstellung von erfindungsgemäßen Farbstoffen F und J

1. Synthese von F

A

0,15 mol 3,4-Dihydroxy-3-cyclobuten-1,2-dion wird 12 h in 150 mL absolutem Ethanol unter Rückfluß erhitzt.

Das Reaktionsgemisch wird eingedampft.

Die Reinigung des Öls erfolgt durch Säulenchromatografie.
Eluent: Methyl-tert.-butylether/iso-Octan 50 : 50
Stationäre Phase: AMICON 35-70 mic.
Ausbeute: 48%

C

0,055 mol A, 0,0068 mol B und 0,0078 mol Triethylamin werden in 50 mL absolutem Ethanol am Rückfluß gekocht. Nach 35 min. wird 0,107 mol Triethylamin zugegeben. Nach 3,5 h kühlt man ab. Man gibt Ethylacetat zu und dekantiert nach kräftigem Rühren. Diese Verfahrensschritte werden noch 3mal wiederholt. Man ge winnt ein Öl (C).

Hydrolyse zu D

Das Öl C wird in 0,145 mol (C₄H₉)₄NOH (1 M in Methanol) unter Rückfluß erhitzt. Nach 30 min kühlt man ab. 500 mL Aceton und 16 mL konzentriertes HCl werden zugegeben. Man filtriert den ausgefallenen Feststoff ab.
Ausbeute: 28 g

E

0,63 mol 2,3,3-Trimethylindolenin und 0,5 mol Br(CH₂)₅COOH werden 3 h in einer geringen Menge Acetonitril unter Rückfluß erhitzt. Die Temperatur des Reaktions gemisches beträgt 130°C. Man gibt 0,5 mol Essigsäure zu und kühlt auf 100°C ab. Anschließend gibt man 250 mL Methylethylketon zu und kühlt weiter im Eisbad auf 15°C ab. Man filtriert den ausgefallenen Feststoff ab und trocknet bei 50°C.
Ausbeute: 75%

G

3,5 mol Phenylhydrazin-4-sulfonsäure und 1,9 L Essigsäure werden auf 105°C erhitzt. Im Verlauf von 30 min tropft man 4,8 mol 3-Methyl-2-butanon zu. Nach 1 h 50 min entfernt man die Heizquelle und gibt man 4,2 mol Kaliumacetat in 3,5 L Methanol zu. Man kühlt weiter im Eisbad ab und filtriert den ausgefallenen Feststoff ab. Mit Ethylacetat wird nachgewaschen.
Ausbeute: 77%

H

26,8 mol Chloracetylchlorid und 25,5 mol Methansulfonamid werden in 10,2 L Butylacetat langsam am Rückfluß gekocht. Nach 8 h kühlt man auf 20°C ab. Der ausgefallene Feststoff wird abfiltriert und in 4 L Butylacetat gerührt. Der ausge fallene Feststoff wird bei 50°C im Umlufttrockenschrank getrocknet.
Ausbeute: 74%

B

2,5 mol G und 2,5 mol H werden in 1,3 L Sulfolan auf 130°C erwärmt. Nach 5 h und 50 min kühlt man auf 50°C ab. Man gibt 2,5 L Aceton zu und kühlt weiter bis auf Raumtemperatur. Der ausgefallene Feststoff wird abfiltriert und mit Aceton nachge waschen. Man rührt den ausgefallenen Feststoff in 1,6 L warmem entmineralisiertem Wasser. Man gibt 1,6 L Ethanol zu und kühlt ab. Der ausgefallene Feststoff wird ab filtriert und mit Ethanol nachgewaschen.
Ausbeute: 53%

F

In einem Kolben mit Dean-Stark-Abscheider werden 4,7 g D, 3,5 g E und 1,4 mL Triethylamin in n-Butanol/Toluol am Rückfluß gekocht. Nach 2,5 h kühlt man ab. Man extrahiert 3 mal mit Wasser. Das Reaktionsgemisch wird eingedampft und da nach erneut in Ethanol gelöst. Man gibt 3 g Kaliumacetat zu und filtriert ab. Man nimmt den ausgefallenen Feststoff in Wasser auf und gibt Aceton zu. Man dekantiert und gibt erneut Aceton zu. Diese Verfahrensschritte werden wiederholt, bis Aus fällung auftritt. Der ausgefallene Feststoff wird abfiltriert.

2. Synthese von J

I

0,1 mol G und 0,12 mol Br(CH₂)₅COOH werden in 35 mL Sulfolan auf 130°C er wärmt. Nach 3 h gibt man 100 mL Dimethylacetamid zu und kühlt auf Raum temperatur ab. Man filtriert den ausgefallenen Feststoff ab und wäscht auf dem Filter mit Dimethylacetamid nach. Man kocht den ausgefallenen Feststoff in Aceton. Nach dem Abkühlen filtriert man und trocknet im Umlufttrockenschrank bei 50°C.
Ausbeute: 90%

J

4,7 g D und 3,5 g I werden 2 h und 10 min in 80 mL n-Butanol/Pyridin (7 : 1) am Rückfluß gekocht. Man kühlt auf Raumtemperatur ab und filtriert den ausgefallenen Feststoff ab. Auf dem Filter wird mit n-Butanol bzw. Aceton nachgewaschen. Man nimmt den ausgefallenen Feststoff in 7 mL entmineralisiertem Wasser auf und gibt unter Rühren 30 mL Acetonitril zu. Man dekantiert die flüssige Phase und gibt unter Rühren abermals Acetonitril zu. Man dekantiert die flüssige Phase und rührt das Öl mit 40 mL gesättigter Natriumchlorid-Lösung. Die feine Suspension wird zentri fugiert und die flüssige Phase dekantiert. Man löst den ausgefallenen Feststoff in Methanol und filtriert das Natriumchlorid ab. Das Filtrat wird eingedampft. Man trocknet bei 50°C.
Ausbeute: 1,57 g (18,5%)

Allgemeine Vorschrift zur Herstellung von Succinimidylestern aus Polymethinfarb stoffen mit Carboylfunktionen

Die vorliegende Vorschrift beschreibt die Herstellung von Succinimidylestern aus Polymethinfarbstoffen mit mindestens einer Carboxylfunktion. Diese Ester können dann zum Labeln von Biomolekülen wie Proteinen, Antikörpern oder Nukleinsäuren benutzt werden.

0.05 mmol Farbstoff werden mit Disuccinimidylcarbonat (1.5 Equivalente pro Carboxylgruppe) in 40 mL DMF gelöst und eine Spatelspitze Dimethylaminopyridin zugegeben. 3 Std. wird bei 40°C gerührt. Nach Abkühlen wird der Überstand in 1 ml Aliquots auf Glasvials verteilt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abgedampft und bis zur Verwendung im Dunkeln bei 4°C gelagert.

Das Rohprodukt wird direkt zum Labeln von Proteinen benutzt.

Allgemeine Vorschrift zum Labeln von Proteinen

Zum Labeln wird das Rohprodukt (1 Aliquot) in 1 ml DMF gelöst. 50 µl dieser Lösung werden zu 1,5 mL (= 1 mg) Anti-HSA-Lösung in 0.1 M Carbonatpuffer pH 9.2 pipettiert. Die Reaktionslösung wird 2 Stunden bei RT gerührt.

Anschließend trennt man das Konjugat vom ungebundenen Farbstoff mittels Gelper meationschromatographie über eine Sephadex G50 Säule ab, die zuvor mit PBS, pH 7.4 equilibriert wurde.

Allgemeine Vorschrift zum Labeln von Oligonukleotiden mit Farbstoff

Die Farbstoffe können auch für das Markieren von DNA oder RNA-Nukleotiden oder Nukleotidanaloga eingesetzt werden.

50 mmol aktivierter Farbstoff, z. B. Isothiocyanat K werden in 50 ml DMF oder Acetonitril gelöst. 10 nmol NH₂-Oligonukleotid werden in 150 µl 50 mM Carbonat puffer, pH 9.2 vorgelegt und langsam 75 nmol Farbstoff hinzupipettiert. Die Lösung wurde 3 bis 5 Std. bei 25°C gerührt unter Lichtausschluß.

Aufreinigung des Oligonukleotids

Die Reinigung des gelabelten Oligonukleotids von ungebundenem Farbstoff und un gelabelter DNA erfolgte über RP-HPLC über eine C8-Säule. Es wurde mit einem linearen Gradienten, z. B. von 70% Wasser bis 100% Methanol über 30 min. eluiert.

Die Fraktionen, die bei 254 nm und dem Absorptionsmaximum des Farbstoffs gleichzeitig absorbieren wurden gesammelt und im Vacuum vom Lösungsmittel ent fernt.

Zur weiteren Verwendung des modifizierten Oligonukleotids kann dieses noch durch Ethanolpräzipitation von überschüssigen Salzen getrennt werden.

Beispiele

Tabelle 1 zeigt die relativen Quantenausbeuten der Farbstoffe bei ähnlichen molaren Farbstoff/Protein-Verhältnissen. Als Protein wurde HSA (Human Serum Albumin) verwendet.

Tabelle 1

Bestimmung des molaren Farbstoff/Proteinkoeffizienten

Die Proteinkonzentration wird mittels der BCA-Methode von Pierce (Literatur: Bradford, M. M.; Anal. Biochem. (1976) 72, 248-254) bestimmt. Eine Eichkurve für anti-HSA wurde zuvor erstellt.

Die Farbstoffkonzentration wird über das Absorptionsspektrum bestimmt.

Bestimmung der Quantenausbeute

Die Bestimmung der Quantenausbeute erfolgt relativ zu Cy5.

Bestimmung des Extinktionskoeffizienten

Der Extinktionskoeffizient wurde unter Annahme der Gültigkeit des Beer'schen Gesetzes bestimmt.

Labeln von aktiviertem Farbstoff F an Anti-HSA

Zum Labeln wird das Rohprodukt (1 Aliquot) in 1 ml DMF gelöst. 50 µl dieser Lösung werden zu 1,5 mL (= 1 mg) Anti-HSA-Lösung in Carbonatpuffer pH 9.2 pipettiert. Die Reaktionslösung wird 2 Stunden bei RT unter Lichtausschluß gerührt.

Anschließend trennt man das Konjugat vom ungebundenen Farbstoff mittels Gelpermeationschromatographie über eine Sephadex G25 Säule ab. Als Elutions puffer wird PBS, pH 7.4 benutzt.

In analoger Weise wurden Proteinkonjugate von den anderen Farbstoffen, die in Tabelle 1 angegeben sind, hergestellt.

Tabelle 1 zeigt, daß die erfindungsgemäßen Farbstoffe höhere Quantenausbeuten und Extinktionskoeffizienten aufweisen als z. B. Cy5. Daher sind sie besonders geeignet als Fluoreszenzmarker in der Bioanalytik.

Die Farbstoffkonjugate der erfindungsgemäßen Farbstoffe zeigen geringere Aggre gationsneigung als bisher übliche Polymethinfarbstoffe. Dies wird in Tabelle 2 deut lich.

Tabelle 2

Die Intensität der Absorption im Absorptionsmaximum des Monomers ist ein relatives Maß für die Konzentration des Monomers in der Lösung. Gleiches gilt für die Konzentration des Aggregates. Diese kann mit der Intensität der Absorption im Absorptionsmaximum des Aggregates, welches hypsochrom gegenüber dem Mono mer verschoben ist, korreliert werden.

Tabelle 2 zeigt das Verhältnis der Intensitäten der Absorptionsmaxima des Monomers und Aggregates. Die steigende Salzkonzentration bewirkt eine Zunahme der Aggregatbildung. Der erfindungsgemäße Farbstoff J zeigt gegenüber CY5 eine deutlich geringere Aggregatbildung. Quadratsäurefarbstoffe wie Sq-1 bis Sq-3 haben keine stabile Eigenschaften hinsichtlich der Aggregatsbildung. Diese nimmt mit steigender Salzkonzentration zu.

Die erfindungsgemäßen Farbstoffe F und J zeigen dagegen stabile Eigenschaften.

Lichtstabilität

Die Lichtstabilität wurde bestimmt, indem Farbstofflösungen dem Tageslicht ausgesetzt wurden. Die Absorption der Lösungen variierte zwischen 1,4 und 1,6 O.D. Die Abnahme der Absorption im Laufe der Zeit ist ein Maß für die Lichtstabilität der Farbstoffe. Es wurden diese Bedingungen gewählt, weil auch das Handling der Farbstoffe manuelle Arbeitsschritte beinhaltet, die die Farbstoffe dem Tageslicht aussetzen. Bei CY5 ist deutlich erkennbar, daß sich bereits nach 30 min. Die Ab sorption um 12% gefallen ist. Dies ist bei den erfindungsgemäßen Farbstoffen nicht der Fall, so daß diese auch benutzerfreundlicher sind, durch Erhalt einer stabilen Ab sorption.

Lichtstabilität der Farbstoffe

Claims

1. Polymethinfarbstoffe enthaltend mindestens einen Substituenten der Formel (I)
worin
n für 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 oder 9 bedeuten,
Y, A für elektronenziehende Reste, vorzugsweise C=O oder -SO₂-, und
R für einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest stehen
und mindestens einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe, die gebildet wird durch

2. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Polymethinfarbstoff um einen Cyaninfarbstoff, Merocyanin, Rhodacyanin, Styrolfarbstoff, Quadratsäurefarbstoff und/oder Crotonsäurefarbstoff handelt.

3. Verwendung von mindestens einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 oder 2 zum Markieren von Biomolekülen durch kovalente Bindung.

4. Verwendung von mindestens einem Polymethinfarbstoff enthaltend eine Gruppierung der Formel (I) zum Anfärben von Biomolekülen.

5. Verwendung von mindestens einer der folgenden Verbindungen
zum Markieren von Biomolekülen.