DE60116510T2

DE60116510T2 - Cyaninfarbstoffe

Info

Publication number: DE60116510T2
Application number: DE60116510T
Authority: DE
Inventors: G. Ananda Austin LUGADE; Narasimhachari Greensboro NARAYANAN; R. Daniel Lincoln DRANEY
Original assignee: Li Cor Inc
Current assignee: Li Cor Inc
Priority date: 2000-09-19
Filing date: 2001-09-18
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2021-09-19
Also published as: US6995274B2; US7504089B2; CA2424454A1; JP2014065919A; ATE315066T1; EP1319047A1; JP2012021161A; US20060063247A1; WO2002024815A1; JP2004510011A; CA2424454C; DE60116510D1; JP4989013B2; US20040014981A1; EP1319047B1

Description

Cyanfarbstoffe wurden weithin verwendet für die Markierung von biologischen Molekülen in einer Vielzahl von Anwendungen wie z. B. einer DNA-Sequenzierung. US Patent-Nr. 571,388 beschreibt beispielhaft Methoden zur Identifizierung von DNA-Strängen unter Verwendung von Cyanfarbstoffen. Wissenschaftler bevorzugten die Verwendung von Cyanfarbstoffen in biologischen Verfahren, da neben weiteren Gründen viele dieser Farbstoffe im nahen IR (NIR) Bereich des Spektrums (600–1.000 nm) funktionieren. Aus diesem Grund sind solche Cyanfarbstoffe weniger anfällig für Interferenzen mit Autofluoreszenzen der biologischen Moleküle.
Weitere Vorteile der Cyanfarbstoffe beinhalten:

1. Cyanfarbstoffe absorbieren und emittieren fluoreszierendes Licht sehr stark;
2. zahlreiche Cyanfarbstoffe bleichen nicht so schnell unter dem Fluoreszenzmikroskop;
3. von Cyanfarbstoff können Derivate hergestellt werden, die einfache und effektive Kupplungsreagenzien sind;
4. es stehen zahlreiche Strukturen und synthetische Verfahren zur Verfügung, außerdem ist die Klasse der Farbstoffe vielgestaltig; und
5. Cyanfarbstoffe sind verhältnismäßig klein (ein typisches Molekulargewicht liegt bei 1.000 Dalton), so dass sie keine nennenswerten sterischen Interferenzen dergestalt erzeugen, dass die Fähigkeit von markierten biologischen Molekülen, deren Bindungsstellen zu erreichen oder deren Funktion aufzuführen beinträchtigt wäre.

Trotz ihrer Vorteile haben zahlreiche der bekannten Cyanfarbstoffe auch eine Reihe von Nachteilen. Einige bekannte Cyanfarbstoffe sind in der Gegenwart von bestimmten Reagenzien, die gewöhnlich in biologischen Assays auffindbar sind, nicht stabil. Derartige Reagenzien schließen Ammoniumhydroxid, Dithiothreitol (DTT), primäre und sekundäre Amine und Ammoniumpersulfat (APS) ein. Außerdem fehlt einigen bekannten Cyanfarbstoffen eine thermische Stabilität und eine Fotostabilität, die für biologische Anwendungen wie DNA-Sequenzierung oder Genotypisierung notwendig ist.
Es besteht daher ein Bedarf an verbesserten stabilen Cyanfarbstoffen, insbesondere für die Verwendung zur Markierung von biologischen Molekülen.
Die Verfahren, Zusammensetzungen, Farbstoffe und farbstoffmarkierten biologischen Moleküle der vorliegenden Erfindung lösen zumindestens einige der Probleme des oben erwähnten Standes der Technik.
Es ist ein Gesichtspunkt der Erfindung, eine Zusammensetzung der Formel (I) bereitzustellen:
wobei Z für O, S, oder NR₃₅ steht, wobei R₃₅ ein H oder Alkyl ist;
R₁-R₅ jeweils unabhängig ein H, Alkyl, Halo, Carboxyl, Amino oder SO₃Cat⁺ sind, wobei Cat⁺ ein Kation ist und wenigstens einer der R₁-R₅ ein SO₃ ^–Cat⁺ ist;
R₆ und R₇ jeweils ein H oder Alkyl sind oder gegebenenfalls, zusammen mit der
Gruppe, an die sie gebunden sind, einen Ring formen;
m und n unabhängig voneinander je eine ganze Zahl von 0 bis 5 sind;
X und Y jeweils unabhängig O, S, Se, CR₁₉R₂₀ sind, wobei R₁₉ und R₂₀ jeweils unabhängig ein Alkyl sind oder gegebenenfalls zusammen mit dem Kohlenstoff, an den sie gebunden sind, einen Ring formen;
R₈ und R₁₃ jeweils unabhängig ein Alkyl, (CH₂)_rR₂₅ oder (CH₂)_rR₁₆ sind; wobei wenigstens einer von R₈ und R₁₃(CH₂)_rR₁₆ ist und wobei r eine ganze Zahl von 1 bis 50 ist und R₂₅ eine funktionelle Gruppe ist, die nicht direkt mit einer Carboxyl-, Hydroxyl-, Amino- oder einer Thiolgruppe reagiert und R₁₈ eine funktionelle Gruppe ist, die mit einer Carboxyl-, Hydroxyl-, Amino- oder einer Thiolgruppe reagieren kann; und
R₉-R₁₂ und R₁₄-R₁₇ jeweils unabhängig ein H, Alkyl, Halo, Amino, Sulfonat, R₂₁COOH, R₂₁OR₂₂, R₂₁SR₂₂ oder R₂₁COOR₂₂ sind, wobei R₂₁ eine Bindung oder ein Alkylen ist und R₂₂ ein Alkyl ist, oder gegebenenfalls R₁₁ und R₁₂ zusammen mit den Atomen, an die sie gebunden sind, einen aromatischen Ring formen, oder
gegebenenfalls R₁₆ und R₁₇ zusammen mit den Atomen, an die sie gebunden sind, einen aromatischen Ring formen.
Es ist ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung, die Zusammensetzung der Formel (V) bereitzustellen:
wobei Cat⁺ ein Kation ist;
X und Y jeweils unabhängig O, S, Se oder (CH₃)₂C sind; und
R₈ und R₁₃ jeweils unabhängig ein Alkyl, (CH₂)_rR₂₅ oder (CH₂)_r R₁₈ sind;
wobei wenigstens einer von R₈ und R₁₃(CH₂)_rR₁₈ ist und wobei r eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist und R₂₅ eine funktionelle Gruppe ist, die nicht direkt mit einer Carboxyl-, Hydroxyl-, Amino- oder einer Thiolgruppe reagiert und R₁₈ eine funktionelle Gruppe ist, die mit einer Carboxyl-, Hydroxyl-, Amino- oder einer Thiolgruppe reagieren kann;
R₁₁ und R₁₂ entweder ein H oder sulfoniert sind, oder zusammen mit den Atomen, an die sie gebunden sind, einen aromatischen Ring formen; und
R₁₆ und R₁₇ entweder ein H oder sulfoniert sind, oder zusammen mit den Atomen, an die sie gebunden sind, einen aromatischen Ring formen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines Farbstoffes der Formel (I) in einem Verfahren zur Markierung von biologischen Molekülen, welches einen Farbstoff der Formel (I) mit einem biologischen Molekül zur Reaktion bringt. Das hieraus resultierende farbstoffmarkierte biologische Molekül stellt einen weiteren Aspekt der Erfindung dar.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines Farbstoffes der Formel (V) in einem Verfahren zur Markierung von biologischen Molekülen, welches einen Farbstoff der Formel (V) mit einem biologischen Molekül zur Reaktion bringt. Das hieraus resultierende farbstoffmarkierte biologische Molekül stellt einen weiteren Aspekt der Erfindung dar.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft einen Kit zur Markierung von biologischen Molekülen, welche einen Farbstoff der Formel (I) und einen Puffer enthält. Entsprechend betrifft die Erfindung unter einem weiteren Aspekt ein Kit zur Markierung von biologischen Molekülen, welcher einen Farbstoff der Formel (V) und einen Puffer enthält.
Die vorliegende Erfindung stellt neben den vorgenannten weitere Merkmale bereit und es werden die Vorteile der Erfindung durch die nachfolgende detaillierte Beschreibung der derzeit bevorzugten Ausführungsbeispiele, welche in Verbindung mit den begleitenden Beispielen zu lesen sind, weiter beleuchtet. Die detaillierte Beschreibung und die Beispiele sind lediglich Darstellungen der Erfindung und limitieren den Schutzbereich der Erfindung nicht. Der Schutzbereich der vorliegenden Erfindung wird durch die angehängten Ansprüche und Equivalente derselben definiert.
Ein "Alkyl" ist eine gesättigte alipathische Gruppe, welche substituierte und unsubstituierte geradkettige Alkylgruppen, substituierte und unsubstituierte verzweigte Alkylgruppen und substituierte und unsubstituierte zyklische Alkylgruppen einschließt. Der Begriff "Alkyl" umschließt Alkoxy-, Haloalkyl-, Hydroxyalkyl- und Alkyloxyalkyletherspezien. In bevorzugten Ausführungsbeispielen hat eine gerade Kette oder eine verzweigte Alkylkette 50 oder weniger Kohlenstoffatome in ihrem Rückgrat, weiter vorzugsweise hat sie 30 oder weniger und weiter vorzugsweise 10 oder weniger Kohlenstoffatome. Bevorzugte zyklische Alkyle haben von 3 bis 10 Kohlenstoffatome in ihrer Ringstruktur, weiter vorzugsweise haben sie 3 bis 6 Kohlenstoffatome. Der Begriff"Niederalkyl" bedeutet eine Alkylgruppe mit von 1 bis 10 Kohlenstoffatomen in ihrem Rückgrat, vorzugsweise von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen. Zyklische Alkylgruppen können einzel- oder polyzyklisch sein, und dabei zwischen 3 und 12 Atomen pro Ring enthalten, vorzugsweise enthalten sie jedoch zwischen 1 und 9 Atomen im Rückgrat. Bevorzugte Substituenten an einem Alkylrückgrat schließen substituierte und unsubstituierte Alkylradikale, Halo-, Carboxyl-, Amino- und Sulfonatgruppen ein.
Die Begriffe "Alkenyl" und "Alkynyl" betreffen ungesättigte alipathische Substituenten, die in Länge und möglichen Substitutionen der Alkylradikale den oben beschriebenen analog sind, die jedoch mindestens eine Doppel- bzw. Dreifachbindung enthalten.
Der Begriff "Amino" betrifft eine -NRR'-Gruppe, wobei R und R' gleich oder verschieden sein können und entweder H oder Alkyl sein können. Vorzugsweise ist wenigstens einer aus R und R' ein H. Gegebenenfalls kann ein zusätzlicher Substituent hinzugefügt werden, um ein quarternäres Ammoniumion zu erzeugen.
Der Begriff "aromatischer Ring", wie er hierin verwendet wird, umfasst 5 bis 12 gegliederte aromatische monozyklische oder fusionierte polyzyklische Einheiten, die zwischen 0 bis 4 Heteroatome einschließen, welche aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff, Schwefel, Selen und Stickstoff ausgewählt werden. Beispielhafte Arylgruppen umfassen Benzen, Pyrrol, Furan, Thiophen, Imidazol, Oxazol, Thiazol, Triazol, Pyrazol, Pyridin, Pyrazin, Pyridazin, Pyrimidin, Naphtalen, Benzathiazolin, Benzothiophen, Benzofurane, Indol, Bezindol, Quinolin usw. Die Arylgruppen können an einer oder mehreren Positionen mit Halo, Alkyl, Alkoxy, Alkoxycarbonyl, Haloalkyl, Cyan, Sulfonat, Aminosulfonyl, Aryl, Sulfonyl, Aminocarbonyl, Carboxy, Acylamin, Alkylsulfonyl, Amino sowie substituierten oder unsubstituierten Substituenten ersetzt werden.
Der Begriff "biologische Moleküle" bedeutet ein natürliches oder synthetisches Molekül zur Verwendung in einem biologischen System. Bevorzugte biologische Moleküle umfassen ein Protein, ein Peptid, ein Enzymsubstrat, ein Hormon, einen Antikörper, ein Antigen, ein Hapten, ein Avidin, ein Streptavidin, ein Kohlenhydrat, ein Oligosaccharid, ein Polysaccharid, eine Nukleinsäure, eine Deoxynucleinsäure, ein Fragment einer DNA, ein Fragment einer RNA, Nukleotidtriphosphate, azyklische Terminationstriphosphate und PNA.
Der Begriff "Cyanfarbstoffe" bezieht sich allgemein auf eine Verbindung, die zwei substituierte oder unsubstituierte Stickstoff enthaltende heterozyklische Ringe enthält, welche über eine ungesättigte Brücke verbunden sind.
Der Begriff "Verbindungsgruppe" betrifft eine Einheit, die in der Lage ist, mit einer komplementären funktionellen Gruppe des Biomoleküls (vorzugsweise einem Carboxyl-, Hydroxyl-, Thiol- oder Aminogruppe) zu reagieren, wobei eine derartige Reaktion eine "Verbindung", welche einen Farbstoff an das biologische Molekül anheftet, bildet. Siehe auch R. Haugland, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular probes, Inc. (1992). Im Rahmen dieser Erfindung stellt R₁₈ eine Verbindungsgruppe dar, bevor eine Anheftungsreaktion stattfindet, R₃₀ steht für eine erfolgte Anheftung zwischen dem Farbstoff und dem biologischen Molekül. Bevorzugte Verbindungsgruppen schließen Phosphoramiditgruppen, NHS-Ester, Carboxylsäure, Thiocyanat und Isothiocyanat mit ein.
Der Begriff "sulfoniert" betrifft eine CO₃-Gruppe, die gegebenenfalls an ein Kation gebunden ist.
Der Begriff "Sulfo-Phenoxyfarbstoff" ist ein Cyanfarbstoff wobei die ungesättigte Brücke des Cyanfarbstoffes mit einer Esterbindung an einen Benzenring substituiert ist, wobei der Benzenring mit einer sulfonierten Gruppe, vorzugsweise an der Position 4 des Benzenrings substituiert ist.
Alle anderen Kürzel oder Abkürzungen haben die entsprechende Bedeutung wie in publizierten Zeitschriften betreffend organische Chemie verwendet wird.
Ein bevorzugter Cyanfarbstoff ist die Verbindung der Formel (I):
Vorzugsweise ist Z ein Heteroatom mit wenigstens einem freien Elektronenpaar. In einem besonders bevorzugten Ausführungsbeispiel ist Z ein O, S oder NR₃₅, wobei R₃₅ ein H oder Alkyl ist. Sofern R₃₅ ein Alkyl ist, ist es bevorzugt, dass R₃₅ ein Niederalkyl ist. Vorzugsweise ist Z derart aufgebaut, dass nur ein Atom in direkter Verbindung zwischen dem Benzenring, der an Z gebunden ist, und der Polyenkette der Formel
die ebenfalls an Z gebunden ist, liegt. Seitenketten an der Verbindung zwischen dem Benzenring und der Polyenkette sind akzeptabel. In solchen Ausführungsbeispielen, die Seitenketten einschließen, sind Niederalkylseitenketten bevorzugt.
R₁ bis R₅ sind jeweils unabhängig voneinander ein H, Alkyl, Halo, Carboxyl, Amino, oder SO₃ ^–Cat⁺, wobei Cat⁺ ein Kation ist und wenigstens einer der Reste R₁ bis R₅ ein SO₃ ^–Cat⁺ ist. Es wird bevorzugt, dass R₃ ein SO₃ ^–Cat⁺ ist. Es wird weiterhin insbesondere bevorzugt, dass Cat⁺ ein H⁺ oder ein Alkalimetallion wie Na⁺ ist.
R₆ und R₇ sind jeweils ein H, Alkyl oder gegebenenfalls bilden sie zusammen mit einer
Gruppe, an welche sie gebunden sind, einen Ring. Vorzugsweise bilden R₆ und R₇ zusammen mit den Atomen, an welche sie gebunden sind, einen Ring. Es wird weiterhin bevorzugt, dass der Ring 4 bis 10 beteiligte Atome hat, weiter bevorzugt sind 5 bis 6 beteiligte Atome. In einem bevorzugten Ausführungsstil ist der Ring, der R₆ und R₇ einschließt, vorzugsweise substituiert und zwar vorzugsweise mit einem Sulfonatradikal.
Die ganzen Zahlen m und n sind jeweils unabhängige ganze Zahlen von 0 bis 5. Die Summe von m und n ist vorzugsweise 2. Weiter vorzugsweise ist die Summe von m und n 1. Weiter vorzugsweise sind sowohl m wie auch n 0. In dem Maße, wie die Summe von m und n zunimmt, tut dies auch die Wellenlänge des Farbstoffes. Grundsätzlich kann eine Hinzufügung jeder Doppelbindung in der Polyenkette die Wellenlänge um etwa 40 bis 120 nm erhöhen. Da sich die Absorption, begleitet von einer Veränderung von Trimethin zu Pentamethin oder Pentamethin zu Heptamethin verändert, zeigt sich typischerweise eine bathochrome Verschiebung (Rückverschiebung) von etwa 100 nm. Wenn zum Beispiel m und n beide 0 sind, ist die Wellenlänge des bevorzugten Farbstoffes bei etwa 770 nm. Wenn m und n beide 1 sind, ist die Wellenlänge des bevorzugten Farbstoffes bei etwa 950 nm. Die besonders bevorzugten Farbstoffe funktionieren in einem NIR-Spektrum (600–1.000 nm).
X und Y sind jeweils unabhängig voneinander ein U, S, Se oder CR₁₉R₂₀, wobei R₁₉ und R₂₀ jeweils unabhängig voneinander ein Alkyl sind oder ggf. zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an welches sie gebunden sind, einen Ring formen. Vorzugsweise sind X und Y ein Heteroatom wie O, S und Se. Sofern X oder Y CR₁₉R₂₀ sind, ist es bevorzugt, dass beide, sowohl R₁₉ und R₂₀, ein Niederalkyl sind, weiter bevorzugt ist, dass beide, R₁₉ und R₂₀, ein Methyl sind.
R₈ und R₁₃ sind jeweils unabhängig voneinander ein Alkyl, (CH₂)_rR₂₅ oder (CH₂)_rR₁₈, wobei wenigstens einer der beiden R₈ und R₁₃(CH₂)_rR₁₈ ist und wobei r eine ganze Zahl von 1 bis 50 ist und R₂₅ eine funktionelle Gruppe ist, die nicht direkt mit einem Carboxyl-, Hydroxyl-, Amino- oder einer Thiolgruppe reagiert und R₁₈ eine funktionelle Gruppe ist, die mit einem Carboxyl-, Hydroxyl-, Amino- oder Thiolgruppe reagieren kann. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist einer der beiden R₈ und R₁₃ ein (CH₂)_rR₁₈ und der andere ist ein (CH₂)_rR₂₅. In anderen Worten, es ist bevorzugt, dass einer der beiden, R₈ oder R₁₃, mit dem biologischen Molekül reagiert und eine Bindung, zu dem biologischen Molekül ausbildet, während der andere Rest nicht reagiert. Die R₁₈-Gruppe muss in der Lage sein, eine kovalente Bindung mit dem biologischen Molekül, welches zu markieren ist, auszubilden. Es ist besonders bevorzugt, dass die R₁₈-Gruppen ein Sulfhydryl, Carboxyl, Amino, Haloalkyl, Phosphoramidityl, N-Hydroxysuccinimidylester, Sulfo-N-Hydroxysuccinimidylester, Isothiocyanat, Iod-Acetamidyl und Maleimidyl einschließen. Besonders bevorzugte R₂₅-Gruppen schließen Hydroxyl, Thioacetyl und Sulfonat ein. R₉ bis R₁₂ und R₁₄ bis R₁₇ sind jeweils unabhängig voneinander ein H, Alkyl, Halo, Amino, Sulfonat, R₂₁COOH, R₂₁OR₂₂, R₂₁SR₂₂, oder R₂₁COOR₂₂, wobei R₂₁ eine Bindung oder ein Alkylen ist und R₂₂ ein Alkyl ist oder wahlweise R₁₁ und R₁₂ zusammen mit den Atomen, an welche sie gebunden sind, einen aromatischen Ring bilden oder weiter wahlweise R₁₆ und R₁₇ zusammen mit den Atomen, an welche sie gebunden sind, einen aromatischen Ring bilden. In einer bevorzugten Ausführungsform sind einer der Reste R₁₁ und R₁₆ oder beide sulfoniert. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform, in welcher R₁₁ und R₁₂ zusammen mit den Atomen, an welche sie gebunden sind, einen aromatischen Ring formen, ist der Ring an wenigstens einer Position mit einer Sulfonatgruppe substituiert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, in welcher R₁₆ und R₁₇ zusammen mit den Atomen, an welche sie gebunden sind, einen aromatischen Ring bilden, ist der Ring an wenigstens einer Position mit einer Sulfonatgruppe, einer Halogruppe, einem Alkylsubstituenten oder einem Aminosubstituenten substituiert.
Ein weiterer bevorzugter Cyanfarbstoff hat die Formel (V):
Cat⁺ ist ein Kation. Vorzugsweise ist Cat⁺ ein H⁺ oder ein Metallion. Weiter vorzugsweise ist Cat⁺ ein Alkalimetallion, weiter vorzugsweise Na⁺. X und Y sind jeweils unabhängig voneinander O, S, Se oder (CH₃)₂C.
R₈ und R₁₃ sind jeweils unabhängig voneinander ein Alkyl, (CH₂)_rR₂₅ oder (CH₂)_rR₁₈, wobei wenigstens einer der Reste R₈ und R₁₃ ein (CH₂)_rR₁₈ ist und wobei r eine ganze Zahl von 1 bis 50 ist und R₂₅ eine funktionelle Gruppe ist, die nicht direkt mit einem Carboxyl-, Hydroxyl-, Amino- oder einer Thiolgruppe reagiert, und R₁₈ eine funktionelle Gruppe ist, die mit einer Carboxyl-, Hydroxyl-, Amino- oder Thiolgruppe reagieren kann. In einer bevorzugten Ausführungsform ist einer der Reste R₈ und R₁₃ ein (CH₂)_rR₁₈ und der andere ist ein (CH₂)_rR₂₅. In anderen Worten, es wird bevorzugt das eine der beiden Reste R₈ und R₁₃ mit dem biologischen Molekül reagiert, um eine Bindung zu dem biologischen Molekül auszubilden, während der andere dies nicht tut. Die R₁₈-Gruppe muss in der Lage sein, eine kovalente Bindung mit dem zu markierenden biologischen Molekül auszubilden. Besonders bevorzugte R₁₈-Gruppen schließen daher Sulfhydryl, Carboxyl, Amino, Haloalkyl, Phosphoramidityl, N-Hydroxy-succinimidylester, Sulfo-N-Hydroxysuccinimidylester, Isothiocyanat, Iod-Acetamidyl und Maleimidyl ein. Besonders bevorzugte R₂₅-Gruppen schließen Hydroxyl, Thioacetyl und Sulfonat ein.
R₁₁ und R₂₅ sind entweder H, Sulfonat oder bilden zusammen mit den Atomen, an welche sie gebunden sind, einen aromatischen Ring. In einer bevorzugten Ausführungsform ist R₁₁ Sulfonat. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform, in welcher R₁₁ und R₁₂ zusammen mit den Atomen, an welche sie gebunden sind, einen aromatischen Ring bilden, ist der Ring an wenigstens einer Position mit einer Sulfonatgruppe substituiert.
R₁₆ und R₁₇ sind entweder H, Sulfonat oder bilden zusammen mit den Atomen, an welche sie gebunden sind, einen aromatischen Ring. In einer bevorzugten Ausführungsform ist R₁₆ sulfoniert. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform, in welcher R₁₆ und R₁₇ zusammen mit den Atomen, an welche sie gebunden sind, einen aromatischen Ring formen, ist der Ring in wenigstens einer Position mit einer Sulfonatgruppe substituiert.
Die bevorzugten Cyanfarbstoffe können effizient mittels kommerziell verfügbarer Ausrüstung, die von Firmen wie Toshiba, Phillips, Blue Sky Research und NEC erworben werden kann, angeregt werden.
Die bevorzugten Cyanfarbstoffe zeigen eine ausreichende Löslichkeit in wässrigen Lösungen, dass sie, sobald sie einmal an ein lösliches biologisches Molekül angelagert sind, dieses biologische Molekül seine Löslichkeit beibehält. Die bevorzugten Farbstoffe zeigen außerdem eine gute Löslichkeit in organischen Medien, wodurch eine beträchtliche Vielseitigkeit in synthetischen Ansätzen, um gewünschte biologische Moleküle zu markieren, bereitgestellt wird.
Die bevorzugten Cyanfarbstoffe haben in der Anwesenheit von Ammoniumhydroxid und DTT eine erhöhte chemische Stabilität.
Die bevorzugten Cyanfarbstoffe zeigen außerdem eine verbesserte Photostabilität und Thermostabilität im Vergleich zu bekannten Phenoxy-Cyanfarbstoffen.
Herstellung der bevorzugten Cyanfarbstoffe
Die bevorzugten Cyanfarbstoffe werden unter Verwendung von im Stand der Technik wohl bekannten Methoden hergestellt.
Grundsätzlich werden Cyanfarbstoffe entsprechend der Verfahren, die in Hamer, F.M., Cyanine Dyes and Related Compounds, Weissberger, M.A., ed. Wiley Interscience, N.Y. 1964, gelehrt werden, hergestellt. Darüber hinaus beschreiben die US-Patente mit den Nr. 4,337,063; 4,404,289 und 4,405,711 eine Synthese für eine Vielzahl von Cyanfarbstoffen, die N-Hydroxysuccinimid-aktive Estergruppen haben. Das US-Patent Nr. 4,981,977 beschreibt eine Synthese für Cyanfarbstoffe mit Carbonsäuregruppen.
Das US-Patent Nr. 5,268,486 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von arylsulfonierten Cyanfarbstoffen. Das US-Patent Nr. 6,027,709 offenbart Verfahren zur Herstellung von Cyanfarbstoffen, die Phosphoramiditgruppen haben. Das US-Patent Nr. 6,048,982 offenbart Verfahren zur Herstellung von Cyanfarbstoffen, die reaktive Gruppen haben, welche aus der Gruppe bestehend aus Isothiocyanat, Isocyanat, Phosphoramidit, Monochlorotriazin, Dichlorotriazin, mono- oder dihalogensubstituiertes Pyridin, mono- oder dihalogensubstituiertes Diazin, Aziridin, Sulfonylhalid, saures Halid, Hydroxysuccinimidester, Hydroxysulfosuccinimidester, Imidoester, Glyoxal und Aldehyd ausgewählt werden.
Ein üblicher Syntheseweg beinhaltet die Herstellung von substituierten oder unsubstituierten quarternären Indolsulfonatsalzen gemäß dem Stand der Technik wohlbekannten Verfahren, von denen einige in den Beispielen dieser Beschreibung näher erläutert sind. Besonders bevorzugte quarternäre Indolsalze schließen unter anderem das quarternäre Indolsulfonatsalz und das quarternäre Salz des Benzindolalkohols mit ein, welche in dieser Beschreibung beispielhaft erläutert sind.
Die beiden synthetisierten Salze werden dann mit einer kommerziell erhältlichen Schiff'schen Base (von Aldrich) wie N-[(3-(Anilinomethylen)-2-chlor-1-cyclohexen-1-yl)methylen]Anilin-monohydrchlorid zur Reaktion gebracht, wobei Techniken und Reaktionsbedingungen, die dem Stand der Technik wohl bekannt sind, gewählt werden, einige von jenen sind in den Beispielen dieser Erfindung näher erläutert. Das Produkt wird dann mit einer Hydroxybenzensulfolsäure zur Reaktion gebracht, um einen Farbstoff gemäß der vorliegenden Erfindung zu ergeben. Der Farbstoff kann weiter modifiziert werden, um andere Farbstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung zu bilden, indem zum Beispiel der Farbstoff mit konunerziell erhältlichen Phosphoramiditen wie 2-Cyanoehtyltetraisoproylphosphordiamidit unter Einsatz von im Stand der Technik wohl bekannten Techniken und Reaktionsbedingungen zur Reaktion gebracht werden, wobei einige von jenen in den Beispielen dieser Erfindung näher erläutert sind.
Das Markieren von biologischen Molekülen
Die Cyanfarbstoffe der vorliegenden Erfindung können an biologische Moleküle, wie sie vorstehend definiert wurden, angelagert werden. Der Cyanfarbstoff kann über eine Verbindungsgruppe an das biologische Molekül gekoppelt werden, zum Beispiel unter Einsatz von Phosphoramiditchemie, bei welcher sich schlussendlich eine Phosphorbindung zwischen dem Farbstoff und dem biologischen Molekül ausbildet. Beispiele für diese Markierungsmethoden sind im US-Patent Nr. 6,027,709 zu finden, wobei zahlreiche bevorzugte Verbindungsgruppen, Verknüpfungsverfahren und biologische Moleküle, die leicht zu markieren sind, offenbart werden. Grundsätzlich wird es bevorzugt, ein Phosphoramidit eines Cyanfarbstoffes herzustellen, um DNA-Moleküle in einer Maschine zur DNA-Synthese zu markieren. Es wird hierbei bevorzugt, den Farbstoff an das 5-Ende eines geschützten, an einen festen Träger gebundenen Oligonukleotides mittels Standardphosphoramiditchemie anzulagern. Synthesen mit einem 200 nM-Maßstab liefern typischerweise Rohausbeuten von farbstoffmarkierten Oligonukleotiden im Bereich von 50–60 nM.
Im Stand der Technik sind zahlreiche Mittel zum Koppeln von Farbstoffen an verschiedene Typen von biologischen Molekülen bekannt. Für einen umfassenden Überblick der Markierungsverfahren für Oligonukleotide siehe R. Haugland in Excited States of Biopolymers, Steiner ed., Plenum Press (1983), Fluorogenic Probe Design and Synthesis: A Technical Guide, PE Applied Biosystems (1996), und G.T. Herman, Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996).
Für die Antikörpermarkierung wird es bevorzugt, dass eine solche Markierung in einem Puffer eines organischen Lösungsmittels unter basischen pH-Bedingungen und bei Raumtemperatur ausgeführt wird. Es wird weiter bevorzugt, dass der markierte Antikörper mittels Gelpermeationschromatographie unter Verwendung von Anlagen wie einer SEPHADEX G-50 Säule zur Entfernung von ungebundenem Farbstoff gereinigt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Markierung von biologischen Molekülen reagiert die R₁₈-Gruppe von entweder der R₈ oder der R₁₃-Gruppe aus einem der bevorzugten Cyanfarbstoffe mit einer Thiol-, einer Hydroxyl-, einer Carboxyl- oder einer Aminogruppe an einem biologischen Molekül, so dass eine Anlagerung (R₃₀) zwischen dem Farbstoff und dem biologischen Molekül ausgebildet wird. Üblicherweise wird diese Reaktion in einer Mischung aus wässrigem Puffer und einem organischen Lösungsmittel wie DMF bei pH 8 bis 9 ausgeführt. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel, in welchem Phosphoramiditchemie eingesetzt wird, wird eine Festphasensynthese, wie sie in US-Patent Nr. 6,027,709 offenbart ist, bevorzugt. Biologische Moleküle können entsprechend der vorliegenden Erfindung markiert werden, indem ein Kit verwendet wird. In einer bevorzugten Ausführungsform eines Kits enthält dieser Kit einen Farbstoff von entweder der Formel (I) oder (V) und einen Puffer. Vorzugsweise enthält der Kit einen Kopplungspuffer wie 1 M KH₂PO₄ (pH 7,0). Weiter vorzugsweise hat der Puffer einen geeigneten niedrigen Fluoreszenzhintergrund.
Gegebenenfalls kann der Kit einen zusätzlichen Reinigungskit enthalten. Nach der Markierung eines biologischen Moleküls mit einem der bevorzugten Farbstoffe kann das markierte biologische Molekül von jeglichen Nebenprodukten und jeglichen freien hydrolisierten Produkten, die bei normaler Hydrolyse entstehen, abgetrennt werden. Für biologische Moleküle, die 13 oder weniger Aminosäuren enthalten, können Verunreinigungen mit einer preparativen Dünnschicht-Chromatographie (TLC) entfernt werden. PANVERA liefert einen TLC-Peptidreinigungskit, der insbesondere dafür entworfen wurde, farbstoffmarkierte Peptide oder Proteine zu reinigen.
Für größere biologische Moleküle wie etwa große Peptide oder Proteine kann eine SEPHADEX G-15 oder G-25-Säule unerwünschte Derivate entfernen. PANVERA liefert einen Gelfiltrationskit für Proteine, der dafür ausgelegt ist, farbstoffmarkierte Peptide oder Proteine von freien Farbstoffen abzutrennen. Die farbstoffmarkierten biologischen Moleküle, die nach dem Entsalzen erhalten werden, können oft ohne weitere Reinigungsschritte direkt eingesetzt werden. In einigen Fällen kann es notwendig sein, die Aktivität der verschiedenen Farbstoffprodukte unter Verwendung von HPLC oder gewöhnlicher Chromatographie aufzulösen und zu bestimmen. Sobald es markiert ist, hat ein bevorzugtes, farbstoffmarkiertes biologisches Molekül die Formel (XV):
Alle Substituenten entsprechen den im vorgehenden erläuterten Definitionen. B ist ein biologisches Molekül und R₃₀ ist (CH₂)_rL, wobei r eine ganze Zahl von 1 bis 50 ist und L eine Verbindungsgruppe. Vorzugsweise ist B ein Protein, ein Peptid, ein Enzymsubstrat, ein Hormon, ein Antikörper, ein Antigen, ein Hapten, ein Avidin, ein Streptavidin, ein Kohlenhydrat, ein Oligosaccharin, ein Polysaccharid, eine Nukleinsäure, eine Desoxynukleinsäure, ein Stück einer DNA, ein Stück einer RNA, ein Nukleotidtriphosphat, ein azyklisches Terminationstriphosphat und PNA. Für eine Auflistung von bevorzugten Terminationsmarkern bei der Verwendung zur DNA-Sequenzierung siehe US-Patent Nr. 5,332,66.
Vorzugsweise liegt r zwischen 1 bis 5. Weiter vorzugsweise ist L ein Phosphoramidityl oder eine andere Verbindungsgruppe, von denen einige in der US-Patentschrift Nr. 6,027,709 exemplarisch beschrieben sind. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist L ein Biphosphatdiamidit.
Ein anderes bevorzugtes farbstoffmarkiertes biologisches Molekül hat die Formel (XX):
Alle Substituenten entsprechen den im vorangehend erläuterten Definitionen. B ist ein biologisches Molekül und R₃₀ ist (CH₂)_rL, wobei r eine ganze Zahl von 1 bis 50 ist und L eine Verbindungsgruppe. Vorzugsweise liegt r im Bereich von 1 bis 5. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist L ein Phosphatdiester, wenn sich die Verbindung bildet. Beispiele für ähnlich bevorzugte Ausführungsbeispiele sind in der US-Patentschrift Nr. 6,027,709 offenbart.
DNA-Sequenzierung
Die farbstoffmarkierten biologischen Moleküle der vorliegenden Erfindung können in biologischen Verfahren wie DNA-Sequenzierung verwendet werden. Das markierte biologische Molekül, zum Beispiel ein Oligonukleotid, kann beispielsweise als Primer in einer DNA-Sequenzierung gemäß dem Sängerverfahren, als verlängerter Primer zur Genotypisierung oder als Hybridisierungsprobe eingesetzt werden. Ausgewählte wohlbekannte Techniken und Reaktionsbedingungen zur DNA-Sequenzierung sind in den Beispielen dieser Beschreibung detailliert ausgeführt.
Die bekannten Verfahren zur DNA-Sequenzierung schließen die Maxam-Gilbert chemische Degradierungsmethode, beschrieben bei Maxam et al., Meth. in Enzym. 5:499 (1980) und die Sänger Dideoxy-Kettenterminationstechnik, beschrieben bei Sänger et al., P.N.A.S. USA 74:5463 (1977) ein. In beiden Methoden werden DNA-Fragmente, die mit ³²P markiert sind, erzeugt, welche dann mittels Gelelektrophorese analysiert werden. Radioaktiv markierter Phosphor wird üblicherweise nicht mehr in diesen Verfahren eingesetzt; Farbstoffe haben seinen Platz eingenommen.
DNA-Sequenzierungen sind weiterhin in Übersichtsartikeln zusammengefasst. Siehe zum Beispiel Middendorf L. R., Humphrey, P. G., Narayanan, N., und Roemer, R.C., "Sequencing Technology" in: Biotechnology. Rehm, H.-J. und Reed, G. (Verleger), Wiley-VCH Publishers, Deutschland (Kapitel eingereicht); B. Barrell, The FASEB Journal, 5, 40 (1991); und G. L. Trainor, Anal. Chem. 62, 418 (1990), sowie weiteren hierin zitierten Referenzen. Die am weitesten verbreitete DNA-Sequenzierungsmethode ist die enzymatische Kettenabbruchmethode nach Sänger, wie vorangehend erwähnt, die für mehrere verschiedene Sequenzierstrategien angepasst wurde. Die Sequenzierungsreaktionen werden entweder in Lösungen unter Verwendung von verschiedenen DNA-Polymerasen sowie der thermophilen Taq DNA-Polymerase durchgeführt [M. A. Innes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:9436 (1988)] oder speziell modifizierten T7 DNA-Polymerasen ("SEQUENASE") [S. Tabor und C. C. Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 4767 (1987)] durchgeführt oder in Verbindung mit Polymerfestphasen eingesetzt. Vergleiche zum Beispiel S. Stahl et al., Nucleic Acids Res., 16, 3025 (1988); M. Uhlen, PCT Anmeldung WO 89/09282; Cocuzza et al., PCT Anmeldung WO 91/11533; und Jones et al., PCT Anmeldung WO 92/03575.
Beispiele
Der nachfolgende Abschnitt zeigt eine der bevorzugten Synthesen zur Herstellung verschiedenartiger Zusammensetzungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, sowie experimentelle Daten zu bestimmten dieser Verbindungen. Dieser Abschnitt erläutert außerdem Beispiele zum Einsatz der Verbindungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden. Die Beispiele beabsichtigen die Erfindung näher zu erläutern, sind jedoch nicht limitierend.
Beispiel 1: Synthese eines intermediären Cyanfarbstoffes
Schritt a): Synthese eines quarternären Indolsulfatsalzes:
Eine Mischung aus 160 g (1.000 mM) 1,1,2-Trimethyl-1H-Indol (Alderich) und 340,4 g (256 ml; 2.500 mM; Alderich) Butansulton wurde bei 125° Celsius in einem 1-Liter RB-Kolben mit 400 ml Bichlorbenzen unter einer Stickstoffatmosphäre erhitzt. Nach 16 h wurde die Reaktion gestoppt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Die auskristallisierten Feststoffe wurden aus dem Reaktionsgemisch abgefiltert und mit Äther (150 ml) gewaschen. Die so erhaltenen Feststoffe wurden in minimalem Volumen Methanols (300 ml) gelöst und anschließend durch die Zugabe von Aceton (1.600 ml) ausgefällt. Der Feststoff wurde gefiltert und mit Aceton gewaschen (150 ml × 2). Er wurde unter Vakuum getrocknet und es wurde hierbei 261,3 g (88,5 %) des quarternären Salzes erhalten. Es war ausreichend rein, um für die nächsten Schritte verwendet zu werden.
Schritt b): Synthese des quarternären Salzes des Benzindolalkohols:
Das quarternäre Salz wurde entsprechend dem Verfahren der US-Patentschrift Nr. 6,027,709 hergestellt. Hierbei wurden 92,0 g 1,1,2-Trimethyl-1H-Benzindol (Arcos) verwendet, um 113,0 g (60 % Ausbeute) reines quarternäres Salz des Benzindolalkohols zu erhalten.
Schritt c): Synthese des IRB 800-Chlorfarbstoffes:
Eine Mischung, die quarternären Salze des Benzindolalkohols (39 g; 100 mM) und quarternäres Salz des Indolsulfonats (20,5 g; 100 mM) in Alkohol (400 ml) enthielt, wurde unter Stickstoffatmosphäre für 10 bis 15 Minuten gerührt, um eine einheitliche Lösung zu erhalten. Zu dieser Lösung wurde dann Schiff'sche Base (35,9 g; 100 mM; Aldrich) und anschließend 100 ml Ethanol zugegeben. Die dunkelrot gefärbte Lösung wurde auf 60° Celsius erhitzt. Bei dieser Temperatur wurde Natriumacetat (21,32 g; 130 mM) und anschließend 12,80 g Kaliumacetat (130 mM) zugegeben. Die Temperatur wurde angehoben, um einen heftigen Rückfluss zu erhalten (110–115° Celsius) und wurde bei besagtem Rückfluss für 35 bis 40 Minuten gehalten. Dann wurde die Reaktion abgestoppt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Sobald sich ein öliges Produkt ausbildete und am Boden absetzte, wurde die Reaktionsmischung in ein Eisbad (1 l) gegossen. Das Wasser wurde abgegossen und der Vorgang wurde wiederholt, bis das Waschwasser klar war. Das ölige Produkt wurde mit Äther (150 ml × 3) und dann mit Ethylacetat (150 ml × 3) zerrieben. Das teilweise feste Produkt wurde in Methanol (350 ml) aufgelöst und das Methanol wurde anschließend in einem Rotationsverdampfer verdampft. Der feste Farbstoff wurde vakuumgetrocknet. Er wurde weiterhin mittels einer Säulenchromatographie (Silicagel 60, 35–75 mm; Lösungsgradient: 10 % Methanol in Acetonitril bis 30 % Methanol in Acetonitril) aufgereinigt, um einen reinen Chlorfarbstoff (29,0 g; 40 % Ausbeute) zu ergeben.
Beispiel 2: Synthese eines Cyanfarbstoffes
Synthese eines Sulfophenoxyfarbstoffes:
Es wurden 2,95 g (12,70 mM) 4-Hydroxybenzensulfonsäure in 40 ml trockenem DMF aufgelöst. Nach Zugabe von 1,08 g (60 %; 26,8 mM) Natriumhydrid wurde die Mischung für 10 Minuten unter Stickstoffatmosphäre bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde IRD 800-Chlorfarbstoff (7,41 g; 10 mM), welcher in 25 ml trockenem DMF aufgelöst war, zu der Reaktionsmischung gegeben und für weitere 45 bis 50 Minuten gerührt. Das Absorptionsmaximum von 788 nm am Ende dieser Zeitspanne deutet auf eine hypsochrome Verschiebung von 13 nm (ChlorfarbstoffAbsorption bei 801 nm) hin und damit auf die Bildung des Sulfophenoxyfarbstoffes. Es wurde Trockeneis zu der Reaktionsmischung gegeben und das DMF unter Vakuum entfernt. Der Rohfarbstoff wurde mittels Säulenchromatographie gereinigt (Silicagel 60; Lösungsgradient: 10 % Methanol in Acetonitril bis 30 % Methanol in Acetonitril), um 4 g reinen Farbstoff zu erhalten (45 % Ausbeute).
Beispiel 3: Synthese eines Sulfo-Phenoxyphosphoramididcyanfarbstoffes
Synthese eines Sulfophenoxyfarbstoffes:
Es wurden 1,4 g (1,59 mM) des oben erwähnten Sulfophenoxyfarbstoffes in 20 ml trockenem Methylenchlorid gelöst und die Lösung wurde in einem gerührten Eis-Acetonbad unter Stickstoffatmosphäre gekühlt. Nach der Zugabe von 0,6 g (1,01 ml; 3,18 mM) 2-Cyanoethyltetraisoproponylphosphorbiamidit und 0,05 g (1,3 ml; 0,64 mM) 1-H-Tetrazollösung (0,5 M) bei 0° Celsius wurde die Lösung bei Raumtemperatur für 2 bis 2,5 h gerührt. Es wurde Methylenchlorid, welches 1 % Triethylamin enthält, zu der Reaktionsmischung gegeben und die Reaktionsmischung dann Waschschritten mit 5 % Natriumbicarbonat (50 ml × 2) und Wasser (50 ml × 2) unterzogen. Nach einem Trockenschritt über anhydriertem Natriumsulfat wurde die Lösung gefiltert und das Filtrat auf 5 ml konzentriert. Die konzentrierte Lösung wurde bei 0° Celsius zu Hexan (50 ml) unter Rühren und unter Stickstoffatmosphäre zugegeben. Der dabei erhaltene dickflüssige Rückstand wurde nach Dekantieren des Hexans mit Äther (50 ml) zermalen, um ein festes Pulver zu ergeben. Dieses wurde unter Vakuum getrocknet, um ein grünes Pulver des Sulfophenoxyphosphoramidits (1,0 g; 58 % Ausbeute) zu ergeben.
Beispiel 4: Synthese eines intermediären Cyanfarbstoffes
Schritt a): Synthese von 5-Fluorindol:
Eine Mischung, die 4-Fluorphenylhydracinhydrochlorid (5,0 g; 30,75 mM; Aldrich), 3-Methyl-2-butanon (2,7 g; 43 mM; Aldrich) und Essigsäure (30 ml) enthält, wurde für 30 Minuten unter Stickstoffatmosphäre gerührt, um eine klare Lösung zu erhalten. Die Lösung wurde dann unter Rückfluss auf 130° Celsius erhitzt. Das Auftreten eines UV- Vis-Absorptionsmaximums bei 255 nm und das Verschwinden des Pikes bei 282 nm bestätigt die Bildung des Indols. Nach 40 Minuten wurde die Reaktion abgestoppt und die Mischung in zerkleinertes Eis gegossen (100 g). Der Rückstand wurde in Ethylacetat (100 ml × 2) extrahiert, mit Wasser (100 ml × 2) gewaschen und die Ethylacetatschicht wurde über anhydriertem Sodiumsulfat getrocknet. Nach der Filtration wurde das Ethylacetat entfernt und der Rückstand getrocknet, um 4,15 g Indol (76 % Ausbeute) zu ergeben.
Schritt b): Synthese des 5-Fluorindol carboxylierten Salzes:
Eine Mischung, die 5-Fluorindol (3,0 g; 16,9 mM), 6-Bromcarbonsäure (5,38 g; 27,6 mM; Aldrich) in 90 ml Butyronitril enthält, wurde unter Rückfluss und Stickstoffatmosphäre auf 140–145° Celsius erhitzt. Die Quarternisierung war nach 35 bis 40 h vollständig. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und mit Äther zerrieben und schließlich unter Vakuum getrocknet, um einen Feststoff (6,0 g; Ausbeute 95 %) zu ergeben.
Schritt c): Synthese des quarternären Salzes von Benzindolsulfonats:
Dieses Salz wurde entsprechend dem Verfahren, welches als Schritt a) von Beispiel 1 beschrieben wurde und die Synthese von dem quarternären Salz des Indolsulfonates wiedergibt, hergestellt.
Schritt d): Synthese des Chlorfarbstoffes:
Das Produkt aus Schritt c) wurde in einen Chlorfarbstoff umgewandelt entsprechend dem Verfahren, welches in Schritt c) von Beispiel 1 beschrieben ist. Dabei wurden 0,4 g (1 mM) 5-Fluorindol carboxyliertes Salz und 0,35 g (1 mM) Benzindolsulfonat eingesetzt, um 0,27 g (35 % Ausbeute) des Chlorfarbstoffes zu erhalten.
Beispiel 5: Synthese eines Cyanfarbstoffes:
Synthese eines unsymmetrischen Sulfophenoxyfarbstoffes:
Der Chlorfarbstoff aus Beispiel 4 wurde in einen Sulfophenoxyfarbstoff umgewandelt gemäß dem Verfahren, welches in Beispiel 2 beschrieben ist. Dabei wurden 0,7 g (0,91 mM) des Chlorfarbstoffes verwendet, um 0,4 g (48 % Ausbeute) des reinen Sulfophenoxyfarbstoffes zu erhalten.
Beispiel 6: Synthese eines NHS-Estercyanfarbstoffes
Synthese des NHS-Esterfarbstoffes:
Ein Carboxyalkylfarbstoff (0,27 g; 0,3 mM), der 5-Fluorindol und eine zentrale Sulfophenoxygruppe enthält, wurde in einer Mischung aus trockenem DMF (3,0 ml) und trockenem Pyridin (0,3 ml) aufgelöst. Disuccinimidylcarbonat (DSC, Aldrich, 0,15 g; 0,44 mM) wurde zu der Mischung gegeben und diese bei 60° Celsius für 2 h unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Nachdem die Mischung mit Äther (15 ml) verdünnt wurde und der Überstand abgeschüttet wurde, wurde das Produkt erneut in trockenem DMF (2 ml) aufgelöst. Es wurde tropfenweise Äther (15 ml) unter Rühren zugegeben, um ein festes Präzipitat zu erhalten. Dieses wurde abgefiltert, unter Vakuum getrocknet, um 0,25 g des reaktiven Farbstoffes (84 % Ausbeute) zu ergeben. Die Bildung von aktivem Ester wurde mittels HPLC bestätigt.
Beispiel 7: Synthese eines Cyanfarbstoffes
Schritt a): Synthese des quarternären Salzes von 1-(4-Sulfonatpothyl)-2,3,3-Trimethylindolenin:
Eine Mischung aus 1,2,3-Trimethylindolenin (15,9 g, 100 mM) und 1,4-Butansulton (27,2 g; 200 mM) wurde in 250 ml 1,2-Dichlorbenzen auf 140° Celsius 16 h erhitzt. Der dabei entstehende gummiartige Rückstand wurde durch Abschütten des Lösungsmittels abgetrennt und in einer minimalen Menge Methanol gelöst und anschließend mit Aceton gefällt. Das pinkfarbene Präzipitat wurde abgefiltert und unter Vakuum getrocknet. Ausbeute: 85 %.
Schritt b): Synthese des quarternären Salzes von 1-(6-Carboxypentyl)-2,3,3-Trimethylindolenin:
Eine Mischung aus 1,2,3-Trimethylindolenin (8 g; 50 mM) und 6-Chromhexansäure (19 g; 100 mM) wurde in 250 ml Butyronitryl für 36 h unter Rückfluss erhitzt. Der entstehende gummiartige Rückstand, der nach Entfernung des Lösungsmittels durch einen Rotationsverdampfer erhalten wurde, wurde in einer minimalen Menge Chloroform gelöst und mit Äther ausgefällt. Das Präzipitat wurde mit Äther zerbröselt, um ein locker fallendes trockenes Pulver zu erhalten. Ausbeute: 70 %.
Schritt c): Synthese des Chlorfarbstoffes:
Eine Mischung aus 5 mM der jeweiligen quarternären Salze aus Schritt a) und Schritt b) wurde mit N-[(3-Anilinethylen)-2-chlor-1cyclohexen-1-yl)-methylen]Anilin Monohydrochlorid (1,30 g; 5 mM), Natriumacetat (1,1 g; 13 mM) in 30 ml trockenem Ethanol unter Rückfluss für 1 h erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde abgekühlt, um das Ethanol durch einen Rotationsverdampfer zu entfernen. Der Rückstand wurde auf einer C18 Umkehrphase Silicagelsäule chromatographisch aufgetrennt (Methanol-Wasser 3:2), um 30 % des gewünschten Chlorfarbstoffes zu erhalten.
Schritt d): Synthese des Sulfophenoxyfarbstoffes:
Es wurde aus 4-Hydroxybenzensulfolsäure eine Dinatriumsalzlösung hergestellt: Hierbei wurde zu einer Suspension aus 60 % Natriumhydrid (120 mg; 3 mM; 100 % NHA) in 10 ml trockenem DMF, die auf 0° C unter Stickstoffatmosphäre gekühlt war, wurde eine DMF-Lösung (10 ml) des 4-Hydroxybenzensulfolsäuredihydrates (2 mM, Aldrich) zugegeben. Nach 10 Minuten wurde der Reaktionsinhalt auf Raumtemperatur erwärmt und für 20 Minuten belassen. Dann wurde der Reaktionsinhalt in einen Kolben, der 1 mM des Chlorfarbstoffes in 30 ml DMF enthielt, überführt und bei Raumtemperatur heftig gerührt. Die Reaktion wurde unter einem UV-Vis-Absorptionsspektrum überwacht, wobei sich eine hypsochromatische Verschiebung von 782 nm auf 789 nm zeigte. Nach 30 Minuten wurde die Reaktion mit Trockeneis abgeschreckt. Das DMF wurde in einem Rotationsverdampfer verdampft. Das Präzipitat zusammen mit Äther bildete das Rohprodukt als trockenes Pulver, welches dann unter Verwendung einer Umkehrphase C18-Silicagelsäule mit 40 % wässrigem Methanoläther aufgereinigt wurde. Ausbeute: 57 %. Das reine Produkt wurde mittels Protonen NMR charakterisiert.
Schritt e): Synthese des NHS-Esters des Sulfophenoxyfarbstoffes:
2,6 mg des Sulfophenoxyfarbstoffes (0,0031 mM) wurden in 250 μl trockenem DMF in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen aufgelöst, zu welchem 4,5 mg N-Hydroxysuccinimid (0,039 mM; Aldrich) und 10 mg DCC (0,05 mM; Aldrich) zugegeben wurden. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 16 h gerührt und das Fortschreiten der Reaktion mittels HPLC überwacht. Überschüssige Reagenzien wurden mittels einer Ätherfällung entfernt und das trockene Roh-NHSE wurde durch Zentrifugation des Präzipitates gesammelt und anschließend mittels HPLC RPC 18 Präparationssäulen (INERTSIL, ODS 3,5 μl, 250 × 4, 6 mm) gereinigt. Es wurde mit einem Lösungsgradienten aus Puffer AB 90–10 % zu Puffer B 100 % eluiert (A = 4 % Acetonitryl 0,1 M TEEAc und B = 80 % Acetonitryl in 0,1 M TEEAc). Die Fraktionen wurden zusammengenommen und das Lösungsmittel unter Verwendung einer Vakuumzentrifuge entfernt, um 2 mg des puren Esters zu liefern. Die Anwesenheit des NHS-Esters wurde mittels HPLC bestätigt.
Beispiel 8: Synthese eines NHS-Estercyanfarbstoffes
Synthese des NHS-Esterfarbstoffes:
Der Carboxyalkylfarbstoff aus Beispiel 7 (2,6 mg; 0,0031 mM) wurde in trockenem DMF (250 μl) aufgelöst. Zu dieser Lösung wurde N-Hydroxysuccinimid (Aldrich; 4,5 mg; 0,039 mM) und Dicyclohexylcarbodiimid (DCC; Aldrich, 10 mg; 0,05 mM) zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 16 h gerührt. Die Reaktion wurde mittels HPLC überwacht und der NHS-Ester über eine RP-Säule (INERTSIL, ODS 3,5 μ, 250 × 4,6 mm) gereinigt und mit einem Lösungsmittelgradienten im Bereich von 10 % b zu 100 % a eluiert (a = 4 % Acetonitril in 0,1 Mol Triethylammoniumacetat; b = 80 % Acetonitril in 0,1 Mol Triethylammoniumacetat). Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt, um 2 mg des reinen NHS-Esters zu ergeben. Die Anwesenheit von reaktiven NHS-Estergruppen wurde mittels HPLC bestätigt.
Beispiel 9: Synthese eines farbstoffmarkierten azyklischen-UTP
Der Farbstoff aus Beispiel 8 konnte erfolgreich an azyklische Terminations-ATP, -GTP, -CPT und UTP angelagert werden. Die unmarkierten Terminatoren wurden von NEN LIFE SCIENCE PRODUCTS, Inc., Boston, M.A., erhalten. Die farbstoffmarkierten Terminatoren wurden zu < 95 % Reinheit mittels HPLC aufgereinigt. Ihre Konzentration wurde durch eine UV-sichtbare Absorptionsspektrumsmessung im wässrigen Phosphatpuffer bestimmt. Die markierten Analoga wurden in der DNA-Sequenzierung eingesetzt und es wurde eine hochqualitative Sequenzleiter mit integrierten farbstoffmarkierten Analoga erhalten. Das farbstoffmarkierte azyklische UTP ist oben dargestellt.
Beispiel 10: DNA-Markierung
Das Phosphoramidit des Sulfophenoxyfarbstoffes aus Beispiel 2 wurde zur Markierung von DNA-Molekülen, die in einer DNA-Synthesemaschine hergestellt wurden, verwendet. Der Farbstoff wurde an das 5'-Ende des geschützten, feststoffgebundenen Oligonukletides angelagert unter Verwendung der Phosphoramiditdeprotektionschemie. Für Synthesen im Bereich von 200 nM liegen typische Rohausbeuten des phenoxyfarbstoffmarkierten Oligonukleotides bei 65 bis 95 nM. Die sulfophenoxyfarbstoffmarkierten Oligonukleotide wurden zu 100 bis 150 nM erhalten.
Beispiel 11: Stabilität des Sulfophenoxyfarbstoffes in NH₄OH und Dithiothreitol (DTT):
Der Sulfophenoxyfarbstoff des Beispiels 2 und ein entsprechender Kontrollphenoxyfarbstoff (je 200 mM) wurden mit 400 μl konzentriertem Ammoniumhydroxid behandelt und bei Raumtemperatur für 1 h inkubiert. Es wurde eine zweite Menge von 400 μl konzentriertem Ammoniumhydroxid zugegeben und für weitere 0,5 h gerührt. Dies sind die Bedingungen, die eingesetzt werden, um Schutzgruppen von farbstoffmarkierten Primern zu entfernen. Die Reaktion wurde in 15-minütigen Intervallen mittels TLC überwacht. Im Fall von Phenoxyfarbstoff zeigte sich die Bildung einer blau gefärbten Unreinheit nach 15 Minuten. Die Intensität der Unreinheit nahm im Lauf der Zeit zu. Nach 1,5 h war fast die Hälfte des Farbstoffes zerfallen in eine blaue Farbe. Der blaue Bereich wurde isoliert und einer Absorptions- und Emissionsmessung unterzogen. Die blaugefärbte Unreinheit zeigte ein Absorptionsmaximum bei 655 nm und eine Emission bei 747 nm. Unter identischen Bedingungen bildete der Sulfophenoxyfarbstoff keine blaugefärbten Spots, die mittels TLC oder Absorption nachgewiesen werden konnten.
Um den Effekt von DTT zu untersuchen, wurden 200 nM Farbstoff mit 400 μl DTT in Acetonitryl behandelt und bei Raumtemperatur gerührt. Nach einem Rühren über Nacht (16 h) zeigte die TLC die Bildung von neuen Flecken. Diese wurden isoliert und einer Absorptionsmessung unterzogen. Die drei Flecken absorbierten bei 786 nm, 738 nm bzw. 392 nm. Die Absorption bei 737 nm deutet auf die Bildung eines neuen Farbstoffes hin, ausgelöst durch den Zerfall des Phenoxyfarbstoffes, der bei 787 nm absorbiert. Deutliche Verunreinigungsflecken zeigten sich erst nach 7 bis 8 h. Unter identischen Bedingungen zeigte der Sulfophenoxyfarbstoff keine Flecken, die bei 738 nm absorbierten.
Beide Farbstoffe (Phenoxy und Sulfophenoxy) zeigten keine große Variation in ihren Eigenschaften wie dem Absorptionsmaximum und dem Extinktionskoeffizient. Der Sulfophenoxyfarbstoff emittiert jedoch bei 828 nm und zeigt damit eine bessere Abgrenzung vom Absorptionsmaximum bei 788 mm. Somit ist eine größere Stoke's-Verschiebung (40 nm) erhältlich mit dem Sulfophenoxyfarbstoff als mit dem Phenoxyfarbstoff dessen Stoke's-Verschiebungswert sich auf 25 nm beläuft. Diese Daten zeigen, dass die Stabilität des Sulfophenoxyfarbstoffes über dem vergleichbaren Phenoxyfarbstoff liegt.
Die vorangegangene detaillierte Beschreibung einschließlich der Beispiele sind als Illustrationen und nicht als Limitierungen zu verstehen und es ist weiter zu verstehen, dass die nachfolgenden Ansprüche, einschließlich aller Äquivalente, den Schutzumfang der Erfindung definieren.

Claims

Eine Verbindung der Formel (I):
wobei Z für O, S, oder NR₃₅ steht, wobei R₃₅ ein H oder Alkyl ist; R₁-R₅ jeweils unabhängig ein H, Alkyl, Halo, Carboxyl, Amino oder SO₃ ^–Cat⁺ sind, wobei Cat⁺ ein Kation ist und wenigstens einer der R₁-R₅ ein SO₃ ^–Cat⁺ ist; R₆ und R₇ jeweils ein H oder Alkyl sind oder gegebenenfalls, zusammen mit der
Gruppe, an die sie gebunden sind, einen Ring formen; m und n unabhängig voneinander je eine ganze Zahl von 0 bis 5 sind; X und Y jeweils unabhängig O, S, Se, CR₁₉R₂₀ sind, wobei R₁₉ und R₂₀ jeweils unabhängig ein Alkyl sind oder gegebenenfalls zusammen mit dem Kohlenstoff an den sie gebunden sind, einen Ring formen; R₈ und R₁₃ jeweils unabhängig ein Alkyl, (CH₂)rR₂₅ oder (CH₂)rR₁₆ sind; wobei wenigstens einer von R₈ und R₁₃ (CH₂)rR₁₆ ist und wobei reine ganze Zahl von 1 bis 50 ist und R₂₅ eine funktionelle Gruppe ist, die nicht direkt mit einer Carboxyl-, Hydroxyl-, Amino- oder einer Thiolgruppe reagiert und R₁₈ eine funktionelle Gruppe ist, die mit einer Carboxyl-, Hydroxyl-, Amino- oder einer Thiolgruppe reagieren kann; und R₉-R₁₂ und R₁₄-R₁₇ jeweils unabhängig ein H, Alkyl, Halo, Amino, Sulfonat, R₂₁COOH, R₂₁OR₂₂, R₂₁SR₂₂ oder R₂₁COOR₂₂ sind, wobei R₂₁ eine Bindung oder ein Alkylen ist und R₂₂ ein Alkyl ist, oder gegebenenfalls R₁₁ und R₁₂ zusammen mit den Atomen, an die sie gebunden sind, einen aromatischen Ring formen, oder gegebenenfalls R₁₆ und R₁₇ zusammen mit den Atomen, an die sie gebunden sind, einen aromatischen Ring formen.
Die Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei Z für O oder S steht.
Die Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei R₃ für SO₃ ^–Cat⁺ steht, und besagtes Cat⁺ entweder ein Metallion, vorzugsweise ein Alkalimetallion oder H⁺ ist.
Die Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei R₆ und ₇ eine Alkylgruppe sind, die von 1– 10 Kohlenstoffatome in ihrem Rückgrad hat, vorzugsweise von 1–6 Kohlenstoffatome.
Die Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei R₆ und R₇ zusammen mit der
Gruppe, an die sie gebunden sind, einen Ring formen.
Die Verbindung gemäß Anspruch 5, wobei der Ring, der R₆ und R₇ einschließt, mit Sulfonat substituiert ist.
Die Verbindung gemäß Anspruch 5, wobei der Ring, der R₆ und R₇ einschließt, 4 bis 10 Elemente, vorzugsweise 5 bis 6 Elemente hat.
Die Verbindung gemäß Anspruch 5, wobei der Ring, der R₆ und R₇ einschließt, ein Heteroatom beinhaltet.
Die Verbindung gemäß Anspruch 5, wobei der Ring in wenigstens einer Position mit einem Alkyl, einer Amino- oder einer Sulfonatgruppe substituiert ist.
Die Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei die Summe aus m + n weniger als 3 ist, vorzugsweise m + n zusammen 0 sind.
Die Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei wenigstens X oder Y entweder O, S oder Se sind.
Die Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei wenigstens X oder Y CR₁₉R₂₀ ist, vorzugsweise X und Y beide CR₁₉R₂₀ sind.
Die Verbindung gemäß Anspruch 12, wobei wenigstens einer von R₁₉ oder R₂₀ eine Alkylgrupp, die 10 Kohlenstoffatome in Ihrem Rückgrad hat, ist, vorzugsweise R₁₉ und R₂₀ beide ein Methyl sind.
Die Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei R₁₈ aus der Gruppe bestehend aus Sulfhydryl, Carboxyl, Amino, Haloalkyl, Phosphoramidityl, N-Hydroxy Succinimidylester, Sulfo-N-Hydroxy Succinimidylester, Isothiocyanat, Iod-Acetamidyl und Maleimidyl ausgewählt ist.
Die Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei r eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist.
Die Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei R₈ und R₁₃ beide (CH₂)rR₁₈ sind.
Die Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei R₉-R₁₂ je ein H sind.
Die Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei einer von R₉-R₁₂ sulfoniert ist.
Die Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei wenigstens einer von R₉-R₁₂ ein Alkyl, Halo, Amino, Sulfonat, R₂₁COOH, R₂₁OR₂₂, R₂₁SR₂₂ oder R₂₁COOR₂₂ sind, wobei R₂₁ eine Bindung oder ein Alkylen ist und R₂₂ ein Alkyl ist.
Die Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei R₁₄-R₁₇ je ein H sind.
Die Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei einer von R₁₄-R₁₇ sulfoniert ist.
Die Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei wenigstens einer von R₁₄-R₁₇ein Alkyl, Halo, Amino, Sulfonat, R₂₁COOH, R₂₁OR₂₂, R₂₁SR₂₂oder R₂₁COOR₂₂ sind, wobei R₂₁ eine Bindung oder ein Alkylen ist und R₂₂ ein Alkyl ist.
Eine Verbindung der Formel (V):
wobei Cat⁺ ein Kation ist; X und Y jeweils unabhängig o, S, Se oder (CH₃)₂C sind; und R₈ und R₁₃ jeweils unabhängig ein Alkyl, (CH₂)rR₂₅ oder (CH₂)rR₁₈ sind; wobei wenigstens einer von R₈ und R₁₃ (CH₂)rR₁₈ ist und wobei reine ganze Zahl von 1 bis 20 ist und R₂₅ eine funktionelle Gruppe ist, die nicht direkt mit einer Carboxyl-, Hydroxyl-, Amino- oder einer Thiolgruppe reagiert und R₁₈ eine funktionelle Gruppe ist, die mit einer Carboxyl-, Hydroxyl-, Amino- oder einer Thiolgruppe reagieren kann; R₁₁ und R₁₂ entweder ein H oder sulfoniert sind, oder zusammen mit den Atomen, an die sie gebunden sind, einen aromatischen Ring formen; und R₁₆ und R₁₇ entweder ein H oder sulfoniert sind, oder zusammen mit den Atomen, an die sie gebunden sind, einen aromatischen Ring formen.
Die Verbindung gemäß Anspruch 23, wobei Cat⁺ ein H⁺ oder ein Matallion ist.
Die Verbindung gemäß Anspruch 23, wobei R₁₈ ein Sulfhydryl, Sulfo-N-Hydroxy Succinimidylester, Isothioryanat, Amino, Phosphoramidityl, N-Hydroxy Succinimidylester, Iod-Acetamidyl und Maleimidyl ist.
Die Verbindung gemäß Anspruch 23, wobei r eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist.
Die Verbindung gemäß Anspruch 23, wobei R₈ und R₁₃ beide (CH₂)rR₁₈ sind.
Ein Verfahren zur Markierung eines Biomolekühls in welchem ein Farbstoff der Formel (I)
verwendet wird, umfassend den Schritt den Farbstoff der Formel (I) mit dem Biomolekül zur Reaktion zu bringen, wobei Z für O, S, oder NR₃₅ steht, wobei R₃₅ ein H oder Alkyl ist; R₁-R₅ jeweils unabhängig ein H, Alkyl, Halo, Carboxyl, Amino oder SO₃ ^–Cat⁺ sind, wobei Cat⁺ ein Kation ist und wenigstens einer der R₁-R₅ ein SO₃ ^–Cat⁺ ist; R₆ und R₇ jeweils ein H oder Alkyl sind oder gegebenenfalls, zusammen mit der
Gruppe, an die sie gebunden sind, einen Ring formen; m und n unabhängig voneinander je eine ganze Zahl von 0 bis 5 sind; X und Y jeweils unabhängig O, S, Se, CR₁₉R₂₀ sind, wobei R₁₉ und R₂₀ jeweils unabhängig ein Alkyl sind oder gegebenenfalls zusammen mit dem Kohlenstoff an den sie gebunden sind, einen Ring formen; R₈ und R₁₃ jeweils unabhängig ein Alkyl, (CH₂)rR₂₅ oder (CH₂)rR₁₆ sind; wobei wenigstens einer von R₈ und R₁₃ (CH₂)rR₁₆ ist und wobei reine ganze Zahl von 1 bis 50 ist und R₂₅ eine funktionelle Gruppe ist, die nicht direkt mit einer Carboxyl-, Hydroxyl-, Amino- oder einer Thiolgruppe reagiert und R₁₈ eine funktionelle Gruppe ist, die mit einer Carboxyl-, Hydroxyl-, Amino- oder einer Thiolgruppe reagieren kann; und R₉-R₁₂ und R₁₄-R₁₇ jeweils unabhängig ein H, Alkyl, Halo, Amino, Sulfonat, R₂₁COOH, R₂₁OR₂₂, R₂₁SR₂₂ oder R₂₁COOR₂₂ sind, wobei R₂₁ eine Bindung oder ein Alkylen ist und R₂₂ ein Alkyl ist, oder gegebenenfalls R₁₁ und R₁₂ zusammen mit den Atomen, an die sie gebunden sind, einen aromatischen Ring formen, oder gegebenenfalls R₁₆ und R₁₇ zusammen mit den Atomen, an die sie gebunden sind, einen aromatischen Ring formen.
Das Verfahren gemäß Anspruch 28, wobei das Biomolekühl wenigstens ein Hydroxyl, Carboxyl, Thio oder Amino hat und R₈ oder R₁₃ des Farbstoffes der Formel (I) sich an eine oder mehrere Hydroxyl- , Carboxyl-, Thio- oder Aminogruppen des Biomolekühls anlagert.
Das Verfahren gemäß Anspruch 29, wobei entweder R₈ oder R₁₃ an das Biomolekühl angelagert sind, jedoch zu einem Zeitpunkt nur einer der beiden R₈ oder R₁₃ an das Biomolekühl angelagert sein können, wobei besagtes Biomolekühl entweder natürlichen Ursprunges oder synthetisch ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 30, wobei das Biomolekühl aus der Gruppe bestehend einem Protein, einem Peptid, einem enzymatischen Substrat, einem Hormon, einem Antikörper, einem Antigen, einem Hapten, einem Avidin, einem Streptavidin, einem Kohlenhydrat, einem Oligosaccharide, einem Polysaccharid, einer Nukleinsäure, einer Desoxinukleinsäure, einem DNA Fragment, einem RNA Fragment, einem Nucleotidtriphosphat, einem azyklischen Terminatortriphosphat und PNA aus ausgewählt ist.
Ein Farbstoff-markiertes Biomolekühl, vorzugsweise entsprechend dem Verfahren gemäß Anspruch 28 hergestellt, welches die Formel (XV) hat:
wobei Z für O, S, oder NR₃₅ steht, wobei R₃₅ ein H oder Alkyl ist; R₁-R₅ jeweils unabhängig ein H, Alkyl, Halo, Carboxyl, Amino oder SO₃ ^–Cat⁺ sind, wobei Cat⁺ ein Kation ist und wenigstens einer der R₁-R₅ ein SO₃ ^–Cat⁺ ist; R₆ und R₇ jeweils ein H oder Alkyl sind oder gegebenenfalls, zusammen mit der
Gruppe, an die sie gebunden sind, einen Ring formen; m und n unabhängig voneinander je eine ganze Zahl von 0 bis 5 sind; X und Y jeweils unabhängig O, S, Se, CR₁₉R₂₀ sind, wobei R₁₉ und R₂₀ jeweils unabhängig ein Alkyl sind oder gegebenenfalls zusammen mit dem Kohlenstoff an den sie gebunden sind, einen Ring formen; R₈ ein Alkyl oder (CH₂)rR₂₅ ist, wobei r eine ganze Zahl von 1 bis 50 ist und R₂₅ eine funktionelle Gruppe ist, die nicht direkt mit einer Carboxyl-, Hydroxyl-, Amino- oder einer Thiolgruppe reagiert; und R₉-R₁₂ und R₁₄-R₁₇ jeweils unabhängig ein H, Alkyl, Halo, Amino, Sulfonat, R₂₁COOH, R₂₁OR₂₂, R₂₁SR₂₂ oder R₂₁COOR₂₂ sind, wobei R₂₁ eine Bindung oder ein Alkylen ist und R₂₂ ein Alkyl ist, oder gegebenenfalls R₁₁ und R₁₂ zusammen mit den Atomen, an die sie gebunden sind, einen aromatischen Ring formen, oder gegebenenfalls R₁₆ und R₁₇ zusammen mit den Atomen, an die sie gebunden sind, einen aromatischen Ring formen; B ein Biomolekühl ist; und R₃₀ für (CH₂)rL steht, wobei r eine ganze Zahl von 1 bis 50 ist und L für eine Verbindungsgruppe steht.
Das Farbstoff-markiertes Biomolekühl gemäß Anspruch 32, wobei R₁₈ aus der Gruppe bestehend aus Hydroxyl, Sulfhydryl, Carboxyl, Amino, Haloalkyl, Phosphoramidityl, N-Hydroxy Succinimidylester, Sulfo-N-Hydroxy Succinimidylester, Isothioryanat, Iod-Acetamidyl und Maleimidyl ausgewählt ist.
Ein Verfahren zur Markierung eines Biomolekühl in welchem ein Farbstoff der Formel (V)
verwendet wird, umfassend den Schritt den Farbstoff der Formel (V) mit dem Biomolekül zur Reaktion zu bringen, wobei Cat⁺ ein Kation ist; X und Y jeweils unabhängig O, S, Se oder (CH₃)₂C sind; und R₈ und R₁₃ jeweils unabhängig ein Alkyl, (CH₂)rR₂₅ oder (CH₂)rR₁₈ sind; wobei wenigstens einer von R₈ und R₁₃(CH₂)rR₁₈ ist und wobei reine ganze Zahl von 1 bis 20 ist und R₂₅ eine funktionelle Gruppe ist, die nicht direkt mit einer Carboxyl-, Hydroxyl-, Amino- oder einer Thiolgruppe reagiert und R₁₈ eine funktionelle Gruppe ist, die mit einer Carboxyl-, Hydroxyl-, Amino- oder einer Thiolgruppe reagieren kann; R₁₁ und R₁₂ entweder ein H oder sulfoniert sind, oder zusammen mit den Atomen, an die sie gebunden sind, einen aromatischen Ring formen; und R₁₆ und R₁₇ entweder ein H oder sulfoniert sind, oder zusammen mit den Atomen, an die sie gebunden sind, einen aromatischen Ring formen.
Das Verfahren gemäß Anspruch 34, wobei das Biomolekühl wenigstens ein Hydroxyl, Carboxyl, Thio oder Amino hat und R₈ oder R₁₃ des Farbstoffes der Formel (I) sich an eine oder mehrere Hydroxyl- , Carboxyl-, Thio- oder Aminogruppen des Biomolekühls anlagert.
Das Verfahren gemäß Anspruch 34, wobei sich nur entweder R₈ oder R₁₃ an das Biomolekühl anlagern.
Das Verfahren gemäß Anspruch 34, wobei R₈ oder R₁₃ beide an das Biomolekühl anlagern.
Das Verfahren gemäß Anspruch 34, wobei das Biomolekühl natürlichen Ursprunges ist oder ein synthetischen Biomolekühl ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 38, wobei das Biomolekühl aus der Gruppe bestehend einem Protein, einem Peptid, einem enzymatischen Substrat, einem Hormon, einem Antikörper, einem Antigen, einem Hapten, einem Avidin, einem Streptavidin, einem Kohlenhydrat, einem Oligosaccharide, einem Polysaccharid, einer Nukleinsäure, einer Desoxinukleinsäure, einem DNA Fragment, einem RNA Fragment, einem Nucleotidtriphosphat, einem azyklischen Terminatortriphosphat und PNA aus ausgewählt ist.
Ein Farbstoff-markiertes Biomolekühl, vorzugsweise entsprechend dem Verfahren gemäß Anspruch 34 hergestellt, welches die Formel (XX) hat:
wobei Cat⁺ ein Kation ist; X und Y jeweils unabhängig O, S, Se oder (CH₃)₂C sind; und R₈ ein Alkyl oder (CH₂)rR₂₅ ist; wobei r eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist und R₂₅ eine funktionelle Gruppe ist, die nicht direkt mit einer Carboxyl-, Hydroxyl-, Amino- oder einer Thiolgruppe reagiert; R₁₁und R₁₂ entweder ein H oder sulfoniert sind, oder zusammen mit den Atomen, an die sie gebunden sind, einen aromatischen Ring formen; und R₁₆ und R₁₇ entweder ein H oder sulfoniert sind, oder zusammen mit den Atomen, an die sie gebunden sind, einen aromatischen Ring formen; B ein Biomolekühl ist; und R₃₀ für (CH₂)rL steht, wobei r eine ganze Zahl von 1 bis 50 ist und L für eine Verbindungsgruppe steht.
Das Farbstoff-markiertes Biomolekühl gemäß Anspruch 40, wobei R₁₈ aus der Gruppe bestehend aus Hydroxyl, Sulfhydryl, Carboxyl, Amino, Haloalkyl, Phosphoramidityl, N-Hydroxy Succinimidylester, Sulfo-N-Hydroxy Succinimidylester, Isothioryanat, Iod-Acetamidyl und Maleimidyl ausgewählt ist.
Eine Farbstoffverbindung der Formel: