DE69914328T2

DE69914328T2 - Effiziente aktivierte cyaninfarbstoffe

Info

Publication number: DE69914328T2
Application number: DE1999614328
Authority: DE
Inventors: Parameswara M. Reddy; A. Maged MICHAEL; Firdous Farooqui; B. Naeem HANNA
Original assignee: Beckman Coulter Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1998-06-18
Filing date: 1999-06-18
Publication date: 2004-11-18
Anticipated expiration: 2019-06-19
Also published as: US6110630A; EP1088035B1; EP1088035A1; DE69914328D1; WO1999065993A1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf das allgemeine Gebiet zum Aktivieren von Gruppen und befaßt sich insbesondere mit N-Hydroxynaphthalimid, substituierte Derivate und Verbindungen mit ähnlichen Dicarbonylstrukturanordnungen, wie eine aktivierende Gruppe, und Verfahren zur Verwendung.
Hintergrund
Die Notwendigkeit für einfache und effiziente Verfahren zum Markieren von Oligonukleotiden lag vor, seit die DNA-Synthese ein routinemäßiges Laborverfahren wurde. Zu Anfang waren praktisch alle Oligonukleotidmarkierungen hinsichtlich der Beschaffenheit radioaktiv, einschließlich einer ziemlich einfachen, enzymatischen Reaktion, bestehend aus der Addierung einer radioaktiven Phosphatgruppe aus einem Nukleosidtriphosphat, normalerweise am 5'-Ende des Oligonukleotids.
Jedoch trug die schnelle Erhöhung der Kosten der radioaktiven Abfallbeseitigung zusammen mit einem zunehmenden Bewußtsein der potentiell schädlichen Wirkungen des Aussetzens der Strahlung dazu bei, den Schwerpunkt auf andere Wege zum Markieren synthetischer Oligonukleotide zu verlagern. Außerdem hat sich die Zahl an unterschiedlichen Anwendungen, wo nicht radioaktiv markierte Oligonukleotide und Nukleotide verwendet werden, bedeutend erweitert. Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH), Sequenzierung, enzymatische Verstärkung und Sandwich-Assays in Mikrotiterplattenformat sind einige der Anwendungen, wo nicht radioaktiv markierte Oligonukleotide und Nukleotide nützlich sind.
Momentan werden Nukleotide und synthetische Oligonukleotide im allgemeinen mit zwei Typen von Markern nicht radioaktiv markiert: „biologische" Komponente, wie Biotin, Horse Radish Peroxidase (HRP), usw. und „chemische" Komponenten, wie fluoreszierende (beispielsweise Fluorescein, Rhodamin usw.) oder chemolumineszierende (beispielsweise Lanthanoide) Gruppen, die den Vorteil aufweisen, daß sie ohne weiteres nachweisbar sind.
Die Verwendung von Fluoreszenzmarkierungen mit Antikörpern, DNA-Proben, biochemischen Analoga, Lipiden, Arzneimitteln, Zytokinen, Zellen und Polymeren hat sich über die letzten Jahre erweitert. Die breitere Verwendung von Fluoreszenzproben resultiert teilweise aus der Entwicklung fortgeschrittener Nachweisinstrumente, insbesondere Elektronenbildmikroskopen und Durchflußzytometrie, und teilweise aus der Verfügbarkeit von neuen Fluoreszenzmarkierungsreagenzien.
Cyanin und verwandte Farbstoffe sind „chemische" Komponenten, die mehrere geeignete Eigenschaften zur Verwendung als empfindliche Nachweismarkierungen aufweisen. Diese Farbstoffe sind stark lichtabsorbierend und hoch lumineszierend. Sie können kovalent an Proteine und andere biologische und nicht-biologische Markierungssubstanzen angelagert werden, um diese Materialien fluoreszierend zu machen, so daß sie nachgewiesen werden können. Die markierten Materialien können dann in Assays verwendet werden, die Anregungslichtquellen und Lumineszenzdetektoren einsetzen. Avidin, das mit Cyaninfarbstoffen markiert ist, kann verwendet werden, um biotinylierte Materialien zu quantifizieren, und Antikörper, die mit Cyaninfarbstoffen konjugiert sind, können verwendet werden, um Antigene und Haptene nachzuweisen und zu messen. Außerdem können Cyanin-konjugierte Lektine verwendet werden, um spezielle Kohlenhydratgruppen nachzuweisen. Außerdem können Cyanin-konjugierte Fragmente von DNA oder RNA verwendet werden, um die Gegenwart von komplementären Nukleotidsequenzen in DNA oder RNA zu identifizieren. Die Cyaninfarbstoffe weisen den Vorteil auf, daß durch Synthetisieren struktureller Modifikationen des Chromophorenteils des Moleküls unterschiedliche Fluoreszenzmarkierungsreagenzien hergestellt werden können, die Licht bei mehreren unterschiedlichen Wellenlängen im sichtbaren und nahen infraroten Bereich des Spektrums absorbieren und fluoreszieren. Ebenso weisen Cyanin und verwandte Farbstoffe einen Vorteil auf, in dem sie mit einer Vielzahl an angelagerten funktionellen Gruppen synthetisiert werden können. Diese Vielseitigkeit ermöglicht die Kontrolle über derartige Faktoren, wie die Löslichkeit des Farbstoffes und des markierten Produktes, und hilft, nicht-spezifisches Binden des markierten Materials an irrelevante Komponenten in einem Assaygemisch zu verringern. Diese Vielseitigkeit ermöglicht ebenso die Auswahl der Markierungsreagenzien, die die Funktion des markierten Produktes minimal stören.
Außerdem umfassen geeignete Eigenschaften dieser Farbstoffe die Absorbanz bei längeren Wellenlängen (die die Verwendung preiswerter Detektionssysteme und geringem Hintergrund aus biologischen Proben bei diesen Wellenlängen ermöglichen können), hohe Extinktionskoeffizienten, relativ hohe Quantenausbeuten, kleine Molekulargröße, Leichtigkeit zur chemischen Manipulation ohne Gefährden der Fluoreszenzeigenschaften und günstige Stabilität gegen Reagenzien, pH und Temperatur.
Eines der Hauptmerkmale, die mit der Fluoreszenzmarkierung von Oligonukleotiden in Zusammenhang stehen, ist die Verfügbarkeit von Fluoreszenzfarbstoffen in der einen oder anderen chemischen Form, die sie ausreichend benutzerfreundlich machen würden. Im Idealfall würde die ausgewählte Fluoreszenzmarkierung als ein vollständig geschütztes, modifiziertes CED-Phosphoramidit erhältlich sein. Dies würde dem Nutzer ermöglichen, das markierte Phosphoramidit, resupendiert in Acetonitril, bei der extra Grundstellung (X-Bottle) auf einem DNA-Synthesegerät einfach zu laden. Die Verwendung des „Markierungsverfahrens" auf dem Gerät würde zur direkten und effizienten Aufnahme der Markierung bei der gewünschten Stellung in dem Oligonukleotid, das synthetisiert werden soll, führen. Der Vorteil dieses Versuchs ist, daß die Zahl an Schritten, die beim Erhalten der markierten Oligonukleotide eingeschlossen sind, im Vergleich zu indirekten Markierungsverfahren signifikant verringert wird. Die Hauptunannehmlichkeit ist, daß dieses Verfahren die Verwendung von Farbstoffphosphoramiditen beinhaltet, die wesentlich teuerer und weniger stabil sind, insbesondere im Hinblick auf die Spaltungs- und Entschützungsbedingungen, als ihre Standard-, nicht-modifizierten Gegenstücke.
Folglich sollte ein indirektes Markierungsverfahren verwendet werden, wenn die ausgewählte Fluoreszenzmarkierung als modifiziertes Phosphoramidit nicht erhältlich ist. Dieses Verfahren würde noch erfordern, daß die Fluoreszenzmarkierung in einer Form vorgelegt wird, die mit dem leichten Verknüpfen mit dem synthetischen Oligonukleotid kompatibel ist. Das Problem ist nicht unbedeutend, da OH-Gruppen nicht sehr gute Aufnahmekomponenten bei Verknüpfungsreaktionen sind, und da insbesondere ein Oligonukleotid normalerweise durch zwei OH-Gruppen charakterisiert ist (eine am 3'-Ende und die andere am 5'-Ende). Bei Anwendungen, wie Sequenzierung und PCR, sollte das 5'-Ende oder irgendeine andere Stellung, aber nicht das 3'-Ende markiert werden.
Zum Zeitpunkt der Entstehung erforderte das indirekte Markierungsverfahren die Aufnahme einer primären Aminogruppe, meistens am 5'-Ende des Oligonukleotids. Dies wird typischerweise durch Zugabe eines sogenannten Amino-Verknüpfungs- oder Amino-Modifikations-Phosphoramidits als letzter Schritt in der Synthese unter Verwendung des „Markierungsverfahrens" auf dem Synthesegerät erreicht. Etwas Reinigung wird danach vor dem Auslösen der tatsächlichen Verknüpfungsreaktion mit der Fluoreszenzmarkierung benötigt. Der Hauptvorteil dieses Versuchs ist, daß, wenn einmal gereinigt und 5'-deblockiert ist, die Amino-Oligonukleotid-Zubereitung gemäß der speziellen Bedürfnisse des Nutzers weiter markiert werden kann.
Typischerweise wird die Fluoreszenzmarkierung als eine aktivierte Komponente, beispielsweise NHS-Ester, an das Nukleotid oder Oligonukleotid, in das eine primäre Aminogruppe eingeführt worden ist, normalerweise am 5'-Ende addiert. N-Hydroxysuccinimidylester sind als reaktive Gruppen allgemein bekannt, jedoch sind deren Ausbeuten und Stabilität in wässerigen Medien oftmals nicht optimal. Andere Alternativen umfassen die Verwendung von Carbodiimiden, Anhydriden und anderen aktiven Estern, wie Paranitrophenol, um Carboxylgruppen des Fluoreszenzfarbstoffmoleküls zu aktivierten. Die weniger geeigneten Aspekte von existierender Methodik können einen Mangel an Selektivität des aktivierten Produktes für Stickstoffnukleophile gegenüber konkurrierenden Spezies, deren relativer Komplexität im Hinblick auf die Herstellung (und daher deren verringerte Kostenwirksam keit), die relative Labilität des aktivierten Produktes unter Verknüpfungsbedingungen umfassen.
Aus den vorhergehenden Gründen besteht eine Notwendigkeit für neue Verfahren zum Aktivieren von Fluoreszenzfarbstoffen, für indirekte Verfahren zum Markieren von Oligonukleotiden, die die Schwierigkeiten des Standes der Technik überwinden. Außerdem kann das Verfahren verwendet werden, um Nukleotide und Oligonukleotide mit einer Vielzahl an Fluoreszenzmarkierungen, einschließlich Cyaninfarbstoffen zu markieren, die in Formen, die für direkte Markierungsverfahren geeignet sind, derzeit nicht erhältlich sind. Außerdem besteht eine Notwendigkeit für Verfahren zum Markieren von Nukleotiden und Oligonukleotiden in sowohl organischen als auch wässerigen Lösungsmitteln.
Zusammenfassung
Die vorliegende Erfindung ist auf die Synthese und Verwendung von N-Hydroxynaphthalimid-aktivierten Derivaten und Verbindungen mit ähnlichen Dicarbonylstrukturanordnungen wie aktivierende Gruppen, die auf die obengenannten Notwendigkeiten zutreffen, gerichtet. Ein Verfahren zum Markieren von Komponenten unter Verwendung von N-Hydroxynaphthalimid und substituierten Derivaten wird ebenso bereitgestellt. Ebenso werden aktivierte Cyaninfarbstoffe und ein Verfahren zum Synthetisieren der aktivierten Farbstoffe offenbart. Außerdem werden ziemlich einfache Verfahren zum Markieren von Oligonukleotiden, Nukleotidtriphosphaten und Dideoxynukleotidtriphosphatterminatoren bereitgestellt. Die aktivierten Farbstoffe machen es möglich, die Oligonukleotide mit Cyaninfarbstoffen zu markieren, die mehrere geeignete Eigenschaften, wie Absorbanz bei längeren Wellenlängen, hohe Extinktionskoeffizienten, relativ hohe Quantenausbeuten und günstige Stabilität gegen Reagenzien, pH und Temperatur, aufweisen. Außerdem ist das Verfahren zum Anlagern des verwendeten N-Hydroxynaphthalimids von Cyaninfarbstoffen an ein Oligonukleotid selektiv für Stickstoff und Thiolnukleophile gegenüber konkurrierenden Spezies, wie Wasser oder Hydroxylgruppen. Folglich ist die Verbindung für indirekte Markierungstechniken, die modifizierte Aminonukleotide nutzen, ideal geeignet. Außerdem wird ein Verfahren zum Umwandeln der Verbindungen zu ihren Trialkylammoniumsalzen bereitgestellt, was die obigen Verfahren zur Verwendung in sowohl wässerigen als auch organischen Lösungsmitteln vielseitig macht. Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, einen aktivierten Farbstoff mit der Formel:
bereitzustellen, worin n 1, 2 oder 3 ist, X S, O, N, CH₂ oder C(CH₃)₂ ist, R₂ Alkyl, Alkylsufonat, Alkylcarboxylat, aktiviertes Alkylsulfonat oder aktiviertes Alkylcarboxylat mit einer ein bis zehn Kohlenstoffatome langen Alkylkette ist, und Rx aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Sulfonyl und Alkyl, ausgewählt ist.
Ebenso wird gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines aktivierten Farbstoffes bereitgestellt. Das Verfahren umfaßt die Schritte des Lösens eines Cyaninfarbstoffes mit mindestens einer Carboxylgruppe in einem Lösungsmittel und das Kombinieren von N-Hydroxynaphthalimid-Rx und eines aktivierenden Mittels, wie Carbodiimidazol (CDI) oder Dicyclohexylcarbodiimd (DCC), mit dem gelösten Cyaninfarbstoff, um einen aktivierten Farbstoff zu bilden. Rx wird aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Sulfonyl und Alkyl, ausgewählt.
Vorzugsweise wird der Cyaninfarbstoff aus der Gruppe, bestehend aus Cy5, Benzo-Cy5, Dibenzo-Cy5, Cy7, Benzo-Cy7 und Dibenzo-Cy7, und anderen Cyaninfarbstoffen mit ausgedehnten aromatischen Ringstrukturen ausgewählt.
Typischerweise umfaßt das Lösungsmittel ein organisches Lösungsmittel. Vorzugsweise umfaßt das Lösungsmittel Dimethylformamid.
Typischerweise beträgt die Menge des N-Hydroxynaphthalimid-Rx, das mit dem Cyaninfarbstoff kombiniert ist, mindestens etwa 2 Moläquivalente. Vorzugsweise liegt die Menge des N-Hydroxynaphthalimid-Rx zwischen etwa 1,5 und etwa 5 Moläquivalenten.
Das Verfahren kann außerdem den zusätzlichen Schritt des Ausfällens des aktivierten Farbstoffes aus dem Gemisch umfassen. Vorzugsweise wird der aktivierte Farbstoff durch Zugabe von Ethylacetat ausgefällt.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Markieren eines Oligonukleotids bereitgestellt, umfassend:
Modifizieren eines Oligonukleotids, ein Amino-, Sulfhydryl- oder Hydroxynukleophil zu enthalten, wodurch ein modifiziertes Oligonukleotid gebildet wird;
Kombinieren des modifizierten Nukleotids mit einem aktivierten Farbstoff mit mindestens einer N-Oxynaphthalimid-Rx-Gruppe, die an eine Carboxylgruppe gebunden ist, wobei die resultierende Gruppe eine Struktur aufweist:
worin Rx aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Sulfonyl und Alkyl, ausgewählt ist.
Typischerweise ist das modifizierte Oligonukleotid ein Amino-Oligonukleotid.
Vorzugsweise wird der aktivierte Farbstoff aus der Gruppe, bestehend aus:
ausgewählt, worin n 1, 2, oder 3, ist, X S, O, N, CH₂ oder C(CH₃)₂ ist, R₂ Alkyl, Alkylsulfonat, Alkylcarboxylat, aktiviertes Alkylsulfonat oder aktiviertes Alkylcarboxylat mit einer etwa ein bis zehn Kohlenstoffatome langen Alkylkette ist und Rx aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Sulfonyl und Alkyl, ausgewählt ist.
Der aktivierte Farbstoff wird typischerweise in einem molaren Überschuß in bezug auf das modifizierte Nukleotid kombiniert.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Markieren einer Komponente bereitgestellt, umfassend das Bereitstellen der Komponente mit mindestens einer Amino-, Sulfhydryl- oder Hydroxygruppe, das Kombinieren der Komponente mit einem aktivierten Teil mit mindestens einer N-Hydroxynaphthalimid-Rx-Gruppe, die an eine Carboxylgruppe gebunden ist, wobei die resultierende Gruppe eine Struktur aufweist:
worin Rx aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Sulfonyl und Alkyl, ausgewählt ist.
Typischerweise wird die Komponente aus der Gruppe, bestehend aus Nukleosiden, Nukleotiden, Nukleosidtriphosphaten, Dideoxynukleosidtriphosphaten, Deoxynukleosidtriphosphaten und derivatisierten Versionen der Vorhergehenden, ausgewählt. Weitere Komponenten umfassen Nukleinsäuren, DNA, derivatisierte Nukleinsäuren, derivatisierte Deoxynukleinsäuren, DNA-Fragmente, RNA-Fragmente, derivatisierte DNA-Fragmente und derivatisierte RNA-Fragmente. Komponenten können ebenso Antikörper, Proteine, Peptide, Enzymsubstrate, Hormone, Lymphokine, Metabolite, Rezeptoren, Antigene, Haptene, Lektine, Avidin, Streptavidin, Toxine, Kohlenhydrate, Oligosaccharide, Polysaccharide und andere Materialien, einschließlich Arzneimittel, Toxine, Blutzellen, mikrobielle Materialien, Teilchen, Kunststoff- oder Glasoberflächen und Polymermembranen, umfassen.
Die aktivierte Komponente kann typischerweise Biotin, Hapten, Cyaninfarbstoffe, Merocyaninfarbstoffe, Styrylfarbstoffe, Fluorophore, wie Fluorescein, Rhodamin, Texas Rot, chemolumineszierende Moleküle, wie Acridiniumester, Dioxitanderivate, elektrolumineszierende Markierungen, wie Moleküle auf Rutheniumbasis, Haptenmoleküle, wie Digoxigenin, Chromophormoleküle, wie Coumarine, und andere Nachweismoleküle sein.
Ebenso wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Markieren eines Nukleotidtriphosphats bereitgestellt. Das Verfahren umfaßt die Schritte des Umwandelns des Nukleosidtriphosphats zu seinem Trialkylammoniumsalz, um ein Nukleosidtriphosphat-Trialkylammoniumsalz zu bilden, und des Kombinierens des Nukleosidtriphopshat-Trialkylammoniumsalzes mit einer aktivierten Komponente mit mindestens einer N-Oxynapthalimid-Rx-Gruppe, die an eine Carboxylgruppe gebunden ist, wobei die resultierende Gruppe eine Struktur aufweist:
worin Rx aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Sulfonyl und Alkyl, ausgewählt ist.
Vorzugsweise wird die aktivierte Komponente aus der Gruppe, bestehend aus Biotin, Hapten, Cyaninfarbstoffen, Merocyaninfarbstoffen, Styrylfarbstoffen, Fluorophoren, wie Fluorescein, Rhodamin, Texas Rot, chemolumineszierenden Molekülen, wie Acridiniumester, Dioxitanderivaten, elektrolumineszierenden Markierungen, wie Moleküle auf Rutheniumbasis, Haptenmolekülen, wie Digoxigenin und Chromophormolekülen, wie Coumarinen, ausgewählt.
Vorzugsweise wird das Verfahren in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt.
Ebenso wird ein Verfahren zum Herstellen eines Farbstoff-markierten Dideoxynukleosidtriphosphatterminators bereitgestellt. Das Verfahren umfaßt die Schritte des Kombinierens in einem Reaktionsgemisch eines Tributylammoniumsalzes eines Nukleosidtriphosphatterminators mit mindestens einer Amino-, Sulfhydryl- oder Hydroxygruppe und einem aktivierten Farbstoff mit mindestens einer N-Oxynaphthalimid-Rx-Gruppe, die an eine Carboxylgruppe gebunden ist, wobei die resultierende Gruppe eine Struktur aufweist:
worin Rx aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Sulfonyl und Alkyl, ausgewählt ist.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Diese und andere Merkmale, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden in bezug auf die folgende Beschreibung, den beigefügten Ansprüchen und beiliegenden Zeichnungen besser verstanden, wo:
1 Strukturformeln von vier Cyaninmonosäure-aktiven Estern, Cy5, DBCy5, Cy7 und DBCy7, die N-Oxynaphthalimid als aktivierende Gruppe umfassen, zeigt;
2 ein schematisches Diagramm, das die Schritte zur Herstellung von Cy5-Monosäure-aktivem Ester skizziert, ist;
3 ein schematisches Diagramm, das die Schritte zur Herstellung von Cy7-Monosäure-aktivem Ester skizziert, ist;
4 ein schematisches Diagramm, das die Schritte zur Herstellung von DBCy5-Monosäure-aktivem Ester skizziert, ist;
5 ein schematisches Diagramm, das die Schritte zur Herstellung von DBCy7-Monosäure-aktivem Ester skizziert, ist;
6 eine spektrophotometrische Analyse von Cy5-markierten 24 monomeren Einheiten ist;
7 eine spektrophotometrische Analyse von Cy7-markierten 24 monomeren Einheiten ist;
8 ein Kapillarelektropherogramm von Cy5-markierten 24 monomeren Einheiten ist; und
9 ein schematisches Diagramm, das die Schritte zur Synthese von Sulpho-N-hydroxynaphthalimid skizziert, ist.
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung ist auf die Synthese und Verwendung von N-Hydroxynaphthalimid, substituierten Derivaten und Verbindungen mit ähnlichen Dicarbonylstrukturanordnungen wie aktivierende Gruppen, die auf die obengenann ten Notwendigkeiten zutreffen, gerichtet. Ein Verfahren zum Markieren von Komponenten unter Verwendung von N-Hydroxynaphthalimid und substituierten Derivaten wird ebenso bereitgestellt.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum kovalenten Anlagern lumineszierender Cyanin- und Cyanin-artiger Farbstoffe an biologische Materialien, nicht-biologischen Moleküle und Makromoleküle und Teilchen, um das Material, das lumineszierend markiert worden ist, herzustellen, so daß das markierte Material durch Lumineszenznachweisverfahren nachgewiesen und/oder quantifiziert werden kann.
Außerdem werden ziemlich einfache Verfahren zum Markieren von Oligonukleotiden, Nukleotidtriphosphaten und Dideoxynukleotidtriphosphatterminatoren bereitgestellt. Die aktivierten Farbstoffe machen es möglich, Oligonukleotide mit Cyaninfarbstoffen zu markieren, die mehrere geeignete Eigenschaften, wie Absorbanz bei längeren Wellenlängen, hohe Extinktionskoeffizienten, relativ hohe Quantenausbeute und günstige Stabilität gegen Reagenzien, pH und Temperatur, aufweisen. Außerdem ist das Verfahren zum Anlagern der N-Hydroxynaphthalimid-aktivierten Cyaninfarbstoffe an ein Oligonukleotid selektiv für Stickstoff- und Thiolnukleophile gegenüber konkurrierenden Spezies, wie Wasser oder Hydroxylgruppen. Folglich ist die Verbindung für indirekte Markierungstechniken, die modifizierte Aminonukleotide nutzen, ideal geeignet. Und außerdem wird ein Verfahren zum Umwandeln der Verbindungen zu deren Trialkylammoniumsalzen bereitgestellt, was die obigen Verfahren zur Verwendung in sowohl wässerigen als auch organischen Lösungsmitteln vielseitig macht.
In einem Aspekt gemäß der vorliegenden Erfindung sind Cyaninfarbstoffe entwickelt worden, die Substituentengruppen aufweisen, die unter geeigneten Reaktionsbedingungen mit Amin-(-NH₂), Hydroxy-(-OH) und Sulfhydrylgruppen an Proteinen und anderen Materialien zum Zweck des Fluoreszenz- und Phosphoreszenznachweises von diesen Materialien kovalent reaktiv sind. Außerdem können Amin-, Hydroxy- und Sulfhydrylgruppen zu den Komponenten, wie Polymerteilchen, die von Natur aus weder Sulfhydryl-, Amin- noch Hydroxygruppen enthalten, vor dem Markieren mit aktivierten Cyaninfarbstoffen leicht zugegeben werden.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Markieren mit N-Hydroxynaphthalimid-aktivierten Cyaninfarbstoffen von Nukleosiden, Nukleotiden, Oligonukleotiden, Proteinen und anderen Materialien, einschließlich Nukleinsäuren, DNA, Arzneimitteln, Toxinen, Blutzellen, mikrobiellen Materialien, Teilchen usw. bei einer Amin-, Sulfhydryl- oder Hydroxystelle an diesen Materialien. Die Farbstoffe sind in einem wässerigen oder anderen Medium, in dem das markierte Material enthalten ist, vorteilhaft löslich.
Die folgenden Referenzen sind mit Cyaninfarbstoffen verwandt, die in den folgenden Patenten für andere Verwendungen beschrieben werden: Mihara et al. (US-Pat. Nr. 4,337,063) und Masuda et al. (US-Pat. Nr. 4,404,289; 4,405,711) synthetisierten eine Vielzahl von Cyaninfarbstoffen, die N-Hydroxysuccinimid-aktive Estergruppen besitzen. Siehe ebenso Waggoner et al. (US-Pat. Nr. 5,486,616; 5,569,587; 5,569,766 und 5,627,027).
N-Hydroxynaphthalimidester
Typischerweise können beim Primermarkieren die Cyaninfarbstoff-N-Hydroxysuccinimidester geringe Ausbeuten ergeben, wenn sie mit Oligonukleotiden konjugiert sind. Um die Konjugationsausbeute zu verbessern, wurde festgestellt, daß N-Hydroxynaphthalimid eine wirksame Abgangsgruppe ist. Diese Gruppe wies einmalige Eigenschaften auf, indem es die gewünschte Stabilität in wässerigen Medien aufweist, in denen die Konjugationsreaktionen durchgeführt werden, wobei sie mit dem Aminooligonukleotid noch ausreichend reaktiv ist, was daher zu sehr hohen Ausbeuten führt. Die Einmaligkeit kann vermutlich aufgrund seiner Struktur sein, wo zwei Carbonylgruppen einen sechsgliedrigen Ring bilden, der an die zwei aromatischen Ringe gebunden ist. Im Gegensatz dazu bilden die zwei Carbonylgruppen von N-Hydroxysuccinimid einen fünfgliedrigen Ring. Ähnlich bilden beide Carbonyle von N-Hydroxyphthalimid einen fünfgliedrigen Ring, der an einen aromatischen Ring gebunden ist. Die Strukturen der am meisten bevorzugten N-Hydroxynaphthalimidaktivierten Cyaninfarbstoffe werden in 1 dargestellt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Markieren einer Komponente bereitgestellt, umfassend das Bereitstellen der Komponente mit mindestens einer Amino-, Sulfhydryl- oder Hydroxygruppe und das Kombinieren der Komponente mit einer aktivierten Komponente mit mindestens einer N-Hydroxynaphthalimid-Rx-Gruppe, die an eine Carbonylgruppe gebunden ist, wobei die resultierende Gruppe eine Struktur aufweist:
Rx kann Wasserstoff, Sulfonyl und Alkyl sein.
Der Fachmann kann einschätzen, daß ein N-Oxynaphthalimidester mit einer Amino- oder Sulfhydrylgruppe auf einem Nukleosid, Nukleotid, Feststoffträger, Kohlenhydrat oder Protein umgesetzt werden kann. Wenn Rx eine polare Komponente, wie Sulfonyl, ist, kann der Fachmann die Vielseitigkeit der erhöhten Löslichkeit in Wasser einschätzen.
Sulpho-N-hydroxynaphthalimid kann gemäß dem Schema in 9 synthetisiert werden (E. L. Martin und L. F. Fieser, Organic Synthesis Coll. Vol., 3, 633, 1955; Fieser and Fieser, Reagent for Organic Synthesis, Band 1, Seite 486, 1967).
Typischerweise wird die Komponente aus der Gruppe, bestehend aus Nukleosiden, Nukleotiden, Nukleosidtriphosphaten, Dideoxynukleosidtriphosphaten, Deoxynukleosidtriphosphaten und derivatisierten Versionen der Vorhergehenden, ausgewählt. Weitere Komponenten umfassen Nukleinsäuren, DNA, derivatisierte Nukleinsäuren, derivatisierte Deoxynukleinsäuren, DNA-Fragmente, RNA-Fragmente, derivatisierte DNA-Fragmente und derivatisierte RNA-Fragmente. Die Komponenten können ebenso Antikörper, Proteine, Peptide, Enzymsubstrate, Hormone, Lymphokine, Metabolite, Rezeptoren, Antigene, Haptene, Lektine, Avidin, Streptavidin, Toxine, Kohlenhydrate, Oligosaccharide, Polysaccharide und andere Materialien, einschließlich Arzneimittel, Toxine, Blutzellen, mikrobielle Materialien, Teilchen, Kunststoff- oder Glasoberflächen und Polymermembranen, umfassen.
Die aktivierte Komponente kann typischerweise Biotin, Hapten, Cyaninfarbstoffe, Merocyaninfarbstoffe, Styrylfarbstoffe, Fluorophore, wie Fluorescein, Rhodamin, Texas Rot, chemolumineszierende Moleküle, wie Acridiniumester, Dioxitanderivate, elektrolumineszierende Markierungen, wie Moleküle auf Rutheniumbasis, Haptenmoleküle, wie Digoxigenin, und Chromophormoleküle, wie Coumarine, sein.
Cyaninfarbstoffe
Eine Reihe von neuen fluoreszierenden Markierungsreagenzien, basierend auf Cyaninfarbstoffen, ist entwickelt worden. Wir beschreiben die Synthese und Eigenschaften von diesen Reagenzien. Sie enthalten N-Hydroxynaphthalimidester-reaktive Gruppen, die ohne weiteres mit Antikörpern, Avidin, DNA, Lipiden, Polymeren und anderen Aminogruppen-enthaltenden Materialien konjugiert werden können. Die Markierungsreagenzien sind wasserlöslich, weniger empfindlich gegen pH und zeigen verringerte Farbstoffaggregation unter Markierungsbedingungen.
Die Cyanin- und verwandte Farbstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung sind besonders für die Analyse eines Gemisches aus Komponenten angepaßt, wobei Farbstoffe einer Vielzahl von Anregungs- und Emissionswellenlängen erfordert werden, da spezielle Cyanin- und verwandte Farbstoffe einen breiten Bereich von Anregungs- und Emissionswellenlängen aufweisen. Spezielle Cyanin- und verwandte Farbstoffe mit speziellen Anregungs- und Emissionswellenlängen können durch Verändern der Anzahl an Methingruppen oder durch Modifikation der Cyaninringstrukturen synthetisiert werden. Daher ist es möglich, Farbstoffe mit besonderen Wellenlängen zu synthetisieren, um einer besonderen Anregungslichtquelle, wie einem Laser, d. h. einem HeNe-Laser oder einem Diodenlaser, zu entsprechen.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die kovalente Reaktion von hochlumineszierenden und stark lichtabsorbierenden Cyanin- und verwandten Farbstoffmolekülen unter Reaktionsbedingungen mit Amin-, Hydroxy-, Aldehyd-, Sulfhydryl- oder anderen Gruppen an Proteinen, Peptiden, Kohlenhydraten, Nukleinsäuren, derivatisierten Nukleinsäuren, Lipiden, bestimmten anderen biologischen Molekülen, biologischen Zellen sowie nicht-biologischen Materialien, wie löslichen Polymeren, Poly merteilchen, Polymeroberflächen, Polymermembranen, Glasoberflächen und anderen Teilchen und Oberflächen.
Cyaninfarbstoffe weisen mehrere geeignete Eigenschaften auf, um als empfindliche Nachweismarkierungen zu dienen: Absorbanz bei längeren Wellenlängen (die die Verwendung von preiswerten Nachweissystemen und geringem Hintergrund aus biologischen Proben bei diesen Wellenlängen ermöglicht), hoher Extinktionskoeffizient, relativ hohe Quantenausbeute, kleine Molekulargröße, Leichtigkeit zur chemischen Manipulation ohne Gefährden der Fluoreszenzmerkmale und günstige Stabilität gegen Reagenzien, pH und Temperatur.
Die Spektraleigenschaften der erfindungsgemäßen Farbstoffe werden durch die Funktionalisierung, die in dieser Beschreibung beschrieben wird, nicht beträchtlich verändert. Die Spektraleigenschaften von markierten Verbindungen unterscheiden sich ebenso nicht sehr von dem Grundfarbstoffmolekül, das nicht mit der Verbindung konjugiert worden ist. Die Farbstoffe, die in dieser Erfindung allein oder mit einem markierten Material konjugiert beschrieben werden, weisen im allgemeinen große Extinktionskoeffizienten (~100.000 bis 250.000) auf und emittieren Licht in dem Spektralbereich von 400 bis 900 nm. Daher können sie als Markierungsreagenzien zum Lumineszenznachweis besonders wertvoll sein.
Die Cyaninfarbstoffe weisen eine allgemeine Struktur auf, wo das Chromophor der Cyaninfarbstoffe aus einer Reihe von konjugierten Doppelbindungen besteht, die zwei quartäre Stickstoffatome an den terminalen Enden aufweisen, die eine positive Ladung teilen. Gemäß der Anzahl der Doppelbindungen können die Cyaninfarbstoffe als Monocarbocyanin (n = 1, ebenso als Trimethincarbocyanin bekannt), Dicarbocyanin (n = 2, ebenso als Pentamethincarbocyanin bekannt) und Tricarbocyanin (n = 3, ebenso als Heptamethincarbocyanin bekannt) klassifiziert werden. Eine chemisch reaktive Alkylkette kann an den Farbstoff angelagert werden, die Alkyl, Alkylsulfonat oder Alkylcarboxylat sein kann.
Cyaninfarbstoffe mit den gewünschten Spektraleigenschaften können aus mehreren empirischen Regeln vorhergesagt werden. Wenn zunächst eine X-Gruppe von Gem dimethyl als Referenz verwendet wird, verschiebt die O-Substitution die Absorptions- und Emissionsmaxima etwa 50 nm zu der kürzeren Wellenlänge, während eine S-Substitution die Absorptions- und Emissionsmaxima etwa 25 nm zu der längeren Wellenlänge verschiebt. Zweitens wird jede konjugierte Doppelbindung, n, die an das Chromophore addiert wurde, die Absorptions- und Emissionsmaxima etwa 100 nm zu der längeren Wellenlänge verschieben. Daher beträgt die maximale Absorption etwa 550 nm für n = 1, etwa 650 nm für n = 2 und etwa 750 nm für n = 3. Drittens wird jede aromatische Gruppe auf der Seite des Moleküls die Absorption etwa 15 nm zu der längeren Wellenlänge verschieben. Viertens wiesen die R-Gruppen, wie Alkyl, Alkylsulfonat und Alkylcarboxylat, wenige Wirkung auf die Absorptions- und Emissionsmaxima auf.
Eine chemisch reaktive Alkylkette wird an den Stickstoff in dem Indol- oder Benzoindolteil des Farbstoffes angelagert. Die Einführung von mindestens einer reaktiven funktionellen Gruppe, wie einer Carboxylat- oder Sulfonatgruppe, in die Cyaningrundstruktur ermöglicht die kovalente Anlagerung des Farbstoffes an ein Nukleotid durch die Verwendung von abgeleiteten aktiven Estern. Eine optimale Länge der angelagerten Alkylkette mit einer reaktiven funktionellen Gruppe, die die Basenpaarung oder die Aufnahme von Nukleotiden in Polynukleotiden nicht beeinträchtigen wird, kann empirisch bestimmt werden. Die Länge der angelagerten Alkylkette ist vorzugsweise etwa 3 bis etwa 12 Kohlenstoffatome lang. Eine am stärksten bevorzugte Alkylkette ist etwa 6 Kohlenstoffatome lang.
Die am stärksten bevorzugten aktivierten Fluoreszenzfarbstoffe werden in 1 gezeigt. Das erste Farbstoffpaar, Cy5 (1) und DBCy5 (2), sind Dicarbocyaninfarbstoffe, während das zweite Farbstoffpaar, Cy7 (3) und DBCy7 (4), Tricarbocyaninfarbstoffe sind. Der Unterschied zwischen den beiden Farbstoffpaaren ist die Gegenwart einer zusätzlichen Doppelbindung in Cy7 (3) und DBCy7 (4), in Bezug auf Cy5 (1) und DBCy5 (2). Folglich wiesen die Dicarboncyaninfarbstoffe Absorptions- und Emissionsmaxima von etwa 100 nm kürzer als deren Tricarbocyaningegenstücke auf. Der Unterschied zwischen Cy5 und Cy7 gegenüber DBCy5 und DBCy7 ist der, daß die letzten beiden Farbstoffe zwei extra Benzengruppensubstitutionen, bezogen auf die Indolcyaninen Cy5 und Cy7, aufweisen. Folglich sind die Absorptions- und Emissionsmaxima der Benzoindolcyanine, DBCy5 und DBCy7, etwa 30 nm länger als ihre Indolcyaningegenstücke, Cy5 und Cy7. Die Sulfonatgruppen an den aromatischen Ringen der Farbstoffe weisen wenig oder keine Wirkung auf den Chromophor auf, aber erhöhen die Hydrophilie und Ladungsdichte der Moleküle. Cy5 und Cy7 sind von Amersham und BDL kommerziell erhältlich. Alternativ können Cyaninfarbstoffe neu synthetisiert werden, wie zuvor beschrieben (R. J. Mujumder et al., Bioconjugate Chemistry, 4(2): 105 (1993); und S. R. Mujumder et al., Bioconjugate Chemistry, 7(2): 356 (1996); die beide hierin als Verweise aufgenommen wurden) oder wie in den 2 bis 5 gezeigt.
Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, einen aktivierten Farbstoff mit der Formel:
bereitzustellen, worin n 1, 2 oder 3 ist, X S, O, N, CH₂ oder C(CH₃)₂ ist, R₂ Alkyl, Alkylsufonat, Alkylcarboxylat, aktiviertes Alkylsulfonat oder aktiviertes Alkylcarboxylat mit einer ein bis zehn Kohlenstoffatome langen Alkylkette ist, und Rx aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Sulfonyl und Alkyl, ausgewählt ist.
Ebenso wird gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines aktivierten Farbstoffes bereitgestellt. Das Verfahren umfaßt die Schritte des Lösens eines Cyaninfarbstoffes mit mindestens einer Carboxylgruppe in einem Lösungsmittel, und das Kombinieren von N-Hydroxynaphthalimid-Rx oder substituierten Derivaten und einem aktivierenden Mittel mit dem gelösten Cyaninfarbstoff, um einen aktivierten Farbstoff zu bilden, wobei Rx aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Sulfonyl und Alkyl, ausgewählt ist. Das aktivierende Mittel kann CDI oder DCC sein. Vorzugsweise wird der Cyaninfarbstoff aus der Gruppe, bestehend aus Cy5, Benzo-Cy5, Dibenzo-Cy5, Cy7, Benzo-Cy7 und Dibenzo-Cy7, ausgewählt.
Typischerweise umfaßt das Lösungsmittel ein organisches Lösungsmittel. Vorzugsweise umfaßt das Lösungsmittel Dimethylformamid. Typischerweise beträgt die Menge an N-Hydroxynaphthalimid, das mit dem Cyaninfarbstoff kombiniert ist, mindestens etwa zwei Moläquivalente. Vorzugsweise liegt die Menge von N-Hydroxynaphthalimid-Rx zwischen etwa 1,5 und etwa 5 Moläquivalenten.
Das Verfahren kann außerdem den zusätzlichen Schritt des Ausfällens des aktivierten Farbstoffes aus dem Gemisch umfassen. Vorzugsweise wird der aktivierte Farbstoff durch Zugabe von Ethylacetat ausgefällt.
Nukleotide
Die Nukleotide umfassen mindestens eine Phosphatgruppe oder deren Analogon, einen Zucker und eine heterocyclische Base. Ein Triphosphat oder nahes Analogon ist wichtig, um ein akzeptables Substrat für ein Enzym, wie DNA-Polymerase, bereitzustellen. Folglich werden Triphosphate am stärksten bevorzugt.
Der Zucker ist im allgemeinen ein Pentose-Furanosezucker, wie Ribose, Arabinose oder Deoxyribose. Vorzugsweise ist der Zucker ein Kettenterminator, der dem 2'-Deoxyribofuranoseteil der natürlichen DNA-Polymerasesubstrate entspricht. Nukleotide, die Kettenterminatoren sind, weisen im allgemeinen Ribofuranosezucker auf, dem es an einer Hydroxygruppe an der 3'-Stellung mangelt, die zur Kettenverlängerung eingesetzt werden kann. Alternativ kann ein Ribofuranoseanalogon, wie Arabinose, für den Zuckeranteil des Nukleotids verwendet werden. Die folgenden modifizierten Furanosezucker können einen Anteil der Nukleotide der vorliegenden Erfindung umfassen: 2'3'-Dideoxy-β-D-ribofuranosyl, β-D-Arabinofuranosyl, 3'-Deoxy-β-D-ribofuranosyl, 3'-Amino-2'3'-dideoxy-β-D-ribofuranosyl, 2'3'-Dideoxy-3'-fluor-β-D-ribofuranosyl und 2'3'-Dideoxy-2'3'-didehydro-β-D-ribofuranosyl. Außerdem können acyclische Gruppen, wie 2-Oxyethoxymethyl, ebenso als Zuckeranteile in kettenterminierenden Nukleotiden verwendet werden.
Der heterocyclische Basenteil der Nukleotide ist im allgemeinen eine Purin- oder Pyrimidinbase. Vorzugsweise ist der Basenteil fähig, Wasserstoffbindungen, wie sie zur genauen Basenpaarung benötigt werden, während der enzymatischen DNA-Synthese zu bilden. Dieser strukturelle Teil kann ebenso den Fluoreszenzfarbstoff tragen. Die 5-Stellung an den Pyrimidinen und die 7-Stellung an den Purinen können einen relativ massigen Substituenten ohne signifikante Beeinträchtigung des gesamten Bindens oder des Erkennens der komplementären Basen während der Sequenzierungsreaktionen tragen. Folglich umfaßen die bevorzugten heterocyclischen Basen: Uracil, Cytosin, 7-Deazaadenin, 7-Deazaguanin und 7-Deazahypoxanthin. Die unnatürlichen 7-Deazapurine werden so eingesetzt, daß der Fluoreszenzfarbstoff ohne Zugabe einer Nettoladung zu dem Basenteil oder Destabilisieren der Glykosidbindung angelagert werden kann. Außerdem können andere heterocyclische Basen, die als Wasserstoffdonatoren und -akzeptoren funktionell äquivalent sind, verwendet werden.
Linker
Ein Linker kann eingesetzt werden, der einfach eine Aminogruppe allein oder eine Kette mit einer Hauptkette ist, enthaltend derartige Atome, wie Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel. Der Linker ist vorzugsweise eine Alkinylaminogruppe, in der ein Ende der Dreifachbindung durch einen substituierten oder unsubstituierten Diradikalteil von 1 bis 20 Atomen an ein Amin gebunden ist, wie in den US-Patenten Nr. 5,047,519 und 5,150,507. Das andere Ende der Dreifachbindung ist an die heterocyclische Base an der 5-Stellung für Pyrimidine oder der 7-Stellung für Purine kovalent angelagert.
Der Linker muß das Nukleotidbinden an oder die Aufnahme durch DNA-Polymerase nicht signifikant beeinträchtigen. Unter Berücksichtigung des Teils, der zur chemisch reaktiven Alkylkette aus dem Farbstoff beiträgt, plus den zusätzlichen Diradikalteil, der zwischen der Base und der reaktiven Alkylkette liegt, umfaßt die minimale Zahl an Atomen der Hauptkette der Kette etwa 10 Atome. Während längere Verbindungsketten möglich sind, beträgt die bevorzugte Länge der Kettenverknüpfung der Base und des Fluoreszenzfarbstoffes etwa 13 bis etwa 20, was einer Kette von etwa 10 bis etwa 12 Atomen entspricht.
Farbstoffanlagerung an Nukleotide
Fluoreszenzfarbstoffe können an Nukleotidmonomere durch Kombinieren von Aminonukleotiden mit aktivierten Carbonsäureestern der Farbstoffe angelagert werden. Die Herstellung der aktivierten Cyaninfarbstoffe wird durch die Umsetzung der Farbstoffe mit einem aktivierenden Mittel, wie Carbonyldiimidazol (CDI, 2 Moläquivalente/Carbonylgruppe), in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 5 Stunden, gefolgt von der Zugabe von 2 Äquivalenten von N-Hydroxynaphthalimid, erreicht. Die Lösung wird über Nacht gerührt, in Ethylacetat gegossen, und die resultierende Ausfällung wird durch Filtration gesammelt, um die aktivierten Ester zu erhalten.
Konjugation von Aminonukleosidtriphosphaten an die aktivierten Markierungen in organischem Medium
Die Nukleosidtriphosphate werden typischerweise wie Natrium- oder Kalium- oder Lithiumsalze synthetisiert. Als solche sind sie normalerweise in organischen Lösungsmitteln nicht löslich. Folglich sollte das Verknüpfen von aktivierten Markierungen in wässerigen Systemen durchgeführt werden, die nicht wünschenswerte Hydrolyse der teuren aktivierten Markierungen verursachen können und ebenso zu geringeren Ausbeuten führen.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird das Konzept zum Umwandeln des Triphosphats zu Trialkylammoniumsalzen bereitgestellt, so daß sie in organischen Lösungsmitteln löslich werden. Dies kann beispielsweise durch Umwandeln eines Natriumsalzes des Nukleosidtriphosphats zu einem Tributylammoniumsalz und dann Durchführen der Verknüpfung mit Cy5-N-Oxynaphthalimid in einem organischen Lösungsmittel, wie DMF, erreicht werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung ergibt die Umwandlung von Nukleosidtriphosphaten zu deren Tributylammoniumsalzen Konjugationsprodukte in wesentlich höherer Ausbeute im Vergleich zu Zubereitungen in einem wässerigen Lösungsmittel. Ferner kann durch die Durchführung der Reaktion in einem organischen Lösungsmittel ein Fachmann typischerweise die Hydrolyseprobleme beseitigen, die gesehen werden, wenn die Reaktion in einem wässerigen Lösungsmittel durchgeführt wird. Ein weiterer Vorteil beim Durchführen dieser Reaktion in einem organischen Lösungsmittel ist, daß weniger Überschuß des teuren Markierungsreagenz benötigt wird, daher kann es wirtschaftlicher sein.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ebenso ein Verfahren zum Markieren eines Nukleosidtriphosphats bereitgestellt. Das Verfahren umfaßt die Schritte des Umwandelns des Nukleosidtriphosphats zu seinem Trialkylammoniumsalz, um ein Nukleosidtriphosphattrialkylammoniumsalz zu bilden, und das Kombinieren des Nukleosidtriphosphattrialkylammoniumsalzes mit einem aktivierten Teil mit mindestens einer N-Oxynaphthalimid-Rx-Gruppe, die an eine Carboxylgruppe gebunden ist, wobei die resultierende Gruppe eine Struktur aufweist:
worin Rx aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Sulfonyl und Alkyl, ausgewählt ist. Das Trialkylammoniumsalz ist vorzugsweise ein C₁-C₁₆-Trialkylammoniumsalz. Geeignete C₁-C₁₆-Alkylgruppen umfassen Methyl, Ethyl, i-Propyl, n-Butyl, n-Octyl, n-Decanyl, n-Hexadecyl und dergleichen. Das am stärksten bevorzugte Trialkylammoniumsalz ist ein Tributylammoniumsalz.
Vorzugsweise wird der aktivierte Teil aus der Gruppe, bestehend aus Biotin, Hapten, Cyaninfarbstoffen, Merocyaninfarbstoffen, Styrylfarbstoffen, Fluorophoren, wie Fluo rescein, Rhodamin, Texas Rot, chemolumineszierenden Molekülen, wie Acridiniumester, Dioxitanderivaten, elektrolumineszierenden Markierungen, wie Moleküle auf Rutheniumbasis, Haptenmoleküle, wie Digoxigenin, und Chromophormoleküle, wie Coumarinen, ausgewählt.
Vorzugsweise wird das Verfahren in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt.
Oligonukleotide
Wie hierin verwendet, umfaßt der Ausdruck „Oligonukleotid" synthetische Deoxy- und Ribo-oligonukleotide sowie modifizierte Oligonukleotide, d. h. wo 3'OH, 5'OH, Zucker oder heterocyclische Base modifiziert werden, sowie die Modifikation der Phosphathauptkette (beispielsweise Methylphosphonate, Phosphorthioate und Phosphoramidate). Außerdem können die Oligonukleotide Oligonukleotide umfassen, die eine angelagerte Reportergruppe umfassen, beispielsweise Biotin, Avidin, Haptene, Farbstoffe, fluoreszierende, chemolumineszierende, enzymatische oder radioaktive Markierungen und Feststoffträger anders als die Festsstoffträger, aus denen das Oligonukleotid synthetisiert wird.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Markieren eines Oligonukleotids bereitgestellt, umfassend das Modifizieren eines Oligonukleotids, ein Amino-, Sulfhydryl- oder Hydroxynukleophil zu enthalten, wodurch ein modifiziertes Oligonukleotid gebildet wird, und das Kombinieren des modifizierten Nukleotids mit einem aktivierten Farbstoff mit mindestens einer N-Hydroxynaphthalimid-Rx-Gruppe, die an eine Carboxylgruppe gebunden ist, wobei die resultierende Gruppe eine Struktur aufweist:
worin Rx aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Sulfonyl und Alkyl, ausgewählt ist. Typischerweise ist das modifizierte Oligonukleotid ein Aminooligonukleotid, das am 5'-Ende modifiziert wurde.
Vorzugsweise wird der aktivierte Farbstoff aus der Gruppe, bestehend aus:
ausgewählt, worin n 1, 2 oder 3 ist, X S, O, N, CH₂ oder C(CH₃)₂ ist, R₂ Alkyl, Alkylsulfonat, Alkylcarboxylat, aktiviertes Alkylsulfonat oder aktiviertes Alkylcarboxylat mit einer ein bis zehn Kohlenstoffatome langen Alkylkette ist, und Rx aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Sulfonyl und Alkyl, ausgewählt ist.
Die aktivierten Farbstoffe können mit Amino-oligonukleotiden in einem Carbonat-Bicarbonatpuffer kombiniert werden. Die Reaktion kann bei Raumtemperatur für etwa 1 bis 16 Stunden stattfinden. Die Farbstoff-markierten Nukleotide können dann durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ebenso ein Verfahren zum Markieren eines Oligonukleotids in einem organischen Lösungsmittel bereitgestellt. Das Verfahren umfaßt die Schritte des Umwandelns des Oligonukleotids mit mindestens einer Amino-, Sulfhydryl- oder Hydroxygruppe zu seinem Trialkylammoniumsalz, um ein Oligonukleotidtrialkylammoniumsalz zu bilden, und das Kombinieren des Oligonukleo tidtrialkylammoniumsalzes mit einem aktivierten Teil mit mindestens einer N-Oxynaphthalimid-Rx-Gruppe, die an eine Carboxylgruppe gebunden ist, wobei die resultierende Gruppe eine Struktur aufweist:
worin Rx aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Sulfonyl und Alkyl, ausgewählt ist. Das Trialkylammoniumsalz ist vorzugsweise ein C₁-C₁₆-Trialkylammoniumsalz. Geeignete C₁-C₁₆-Alkylgruppen umfassen Methyl, Ethyl, i-Propyl, n-Butyl, n-Octyl, n-Decanyl, n-Hexadecyl und dergleichen. Das am stärksten bevorzugte Trialkylammoniumsalz ist ein Tributylammoniumsalz.
Anwendungen von Cyaninfarbstoffmarkierungen bei der DNA-Sequenzierung
Das Kettenabbruchverfahren des Sequenzierens basiert auf in vitro DNA-Synthesereaktionen in Gegenwart einer Primer-DNA-Matrize, von 2'Deoxyribonukleosidtriphosphaten (dNTPs) und Kettenterminatoren, beispielsweise Dideoxyribonukleosidtriphosphate (ddNTPs). Wenn der Kettenterminator durch eine DNA-Polymerase in eine wachsende Polynukleotidkette aufgenommen wird, wird die Verlängerung beendet. Die DNA-Produkte sind daher eine Reihe von Polynukleotidketten, die zu der Matrize mit einem spezifischen Kettenterminator am 3'-Ende komplementär sind.
Folglich ist eine bevorzugte Verwendung für die Fluoreszenz-markierten Nukleotide und Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung die DNA-Sequenzierung, was das Markieren von Dideoxyterminatoren, Nukleosidtriphosphaten oder Oligonukleotidprimern mit einer Fluoreszenzmarkierung beinhaltet. Am stärksten bevorzugt wird jede Purin- und/oder Pyrimidinbase, enthaltend Kettenterminator, der in der Sequenzierungsreaktion verwendet wird, mit einem unterschiedlichen Cyaninfarbstoff markiert. Vorzeitig terminierte DNA-Fragmente, die aus den Sequenzierungsreaktionen unter Verwendung derartiger Farbstoff markierter Kettenterminatoren resultieren, werden dann an deren 3'-Enden unterschiedlich markiert. Da jede Base ihren eigenen erkennbaren angelagerten Cyaninfarbstoff aufweist, kann eine einzelne Se quenzierungsreaktion und eine einzelne Trennungsbahn verwendet werden, um eine Matrize unter Verwendung eines Primers zu sequenzieren.
Farbstoff markierte Deoxy- und Dideoxy-Nukleosidtriphosphate können durch die hierin oben beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Das bevorzugte Verfahren umfaßt die Schritte des Kombinierens in einem Reaktionsgemisch eines Tributylammoniumsalzes eines Kettenabbruchnukleosidtriphosphats und eines aktivierten Farbstoffes mit mindestens einer N-Oxynaphthalimid-Rx-Gruppe.
Obwohl die Farbstoffe, die hierin beschrieben werden, zum größten Vorteil bei der Herstellung von Fluoreszenz-markierten Kettenterminatoren verwendet werden, können sie ebenso verwendet werden, um Polynukleotide intern zu markieren. In einer Version dieser Verfahrensweise werden vier separate Sequenzierungsreaktionen ausgelöst, wobei jede einen einzelnen Kettenterminator und ein einzelnes Farbstoff-markiertes Nukleosidtriphosphat, das kein Kettenterminator ist, aufweist. Die Fluoreszenzfarbstoff markierten DNA-Fragmente, die in jeder Sequenzierungsreaktion hergestellt werden, können abgetrennt und einzeln nachgewiesen werden. Alternativ werden die Sequenzierungsreaktionsprodukte kombiniert und die Komponenten des mehrfarbigen Gemisches werden abgetrennt und in einem einzelnen elektrophoretischen Kanal oder einer Kapillare nachgewiesen.
Die markierten Nukleotide, die hierin beschrieben werden, können ebenso zum Markieren von Primern verwendet werden. Die Erhältlichkeit der aktivierten Derivate der Farbstoffe, wie in dieser Anmeldung beschrieben, ermöglicht es, Nukleosidphosphoramidite zu konstruieren, die mit unterschiedlichen Cyaninfarbstoffen markiert werden. Wenn in einem automatisierten Synthesegerät verwendet, ermöglicht ein derartiges Reagenz, daß der endgültige 5'-Rest und der Fluoreszenzreporter gleichzeitig eingeführt werden.
Insbesondere wird ein aktivierter Cyaninfarbstoff an ein Oligonukleotid, in das eine primäre Aminogruppe eingeführt worden ist, normalerweise am 5'-Ende addiert. Die Synthese von derart modifizierten Oligonukleotiden wird typischerweise durch die Zugabe eines sogenannten Aminoverknüpfungs- oder Aminomodifikatorphosphora midits als letzter Schritt in der Oligonukleotidsynthese unter Verwendung des „Markierungsverfahrens" auf dem Synthesegerät erreicht. Die Fluoreszenzmarkierung wird als ein aktivierter Teil, beispielsweise N-Hydroxynaphthalimid-Rx-Ester, zu dem Oligonukleotid, in das eine primäre Amino- oder Thiolgruppe eingeführt worden ist, zugegeben.
Die Fluoreszenzfarbstoff-markierten Primer können dann in separaten Sequenzierungsreaktionen, die einen einzelnen Kettenterminator in das Reaktionsgemisch einschließen, verwendet werden. Die Fluoreszenzfarbstoff-markierten DNA-Fragmente, die in separaten Sequenzierungsreaktionen erzeugt wurden, können elektrophoretisch abgetrennt und einzeln nachgewiesen werden. Alternativ können die Reaktionsprodukte kombiniert und in einen einzelnen elektrophoretischen Kanal oder eine Kapillare getrennt werden.
Amplifikation
Die Floureszenz-markierten Nukleotide und Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung können ebenso verwendet werden, um Produkte von DNA-Amplifikationsverfahren, wie die Polymerasekettenreaktion (PCR), zu identifizieren. Bei „Multiplex"-PCR-Reaktionen können Primer mit spezifischer Sequenz, die durch die Fluoreszenfarbstoff-markierten Nukleotide der vorliegenden Erfindung unterschiedlich markiert werden, verwendet werden, um die Amplifikation von mehreren unterschiedlichen Sequenzen von Interesse zu lenken. Die Sequenzen von Interesse können dann durch deren Fluoreszenzemission und/oder deren Größe identifiziert werden.
Die folgenden Beispiele zeigen nachstehend wichtige Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens.
BEISPIELE
Chemikalien/Reagenzien
Chemikalien und Lösungsmittel wurden verwendet, wie sie vom Verkäufer erhalten wurden. Die folgenden Reagenzien wurden von Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI) erhalten: Essigsäure, Essigsäureanhydrid, Carbonyldiimidazol (CDI), Dichlormethan, Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), Diethylether, Dimethylformamid (DMF), Ethylacetat (EtOAc), Isopropylalkohol, Malonaldehydbis(phenylimin)monohydrochlorid, Methanol, Pyridin, Kieselgelplatten, Natriumbicarbonat, Natriumcarbonat, Tributylamin, Triethylamin, Trimethylphosphat. DEAE Sephadex A-25 war von Pharmacia (Piscataway, NJ). N-Hydroxynaphthalimid und Glutaconaldehyddianilhydrochlorid waren von ACROS (Pittsburgh, PA).
Verfahren
Alle Vorgänge wurden entweder unter einer inerten Atmosphäre von kommerziellem gereinigtem Stickstoff oder wasserfreien Bedingungen mit einem Drierite-Röhrchen durchgeführt. Die wasserfreien Lösungsmittel wurden von Aldrich erworben und wurden ohne weitere Reinigung verwendet. Reaktionsprodukte wurden normalerweise durch Rotationsverdampfung von flüchtigen Lösungsmitteln bei reduziertem Druck unter Verwendung einer Wasserstrahlpumpe konzentriert.
UV-Vis-Spektren wurden unter Verwendung eines Beckmann-DU-70-Spektrophotometers mit einer Quarzzelle mit einem 1 cm langen Weg aufgezeichnet.
Protonkernspinresonanz-(NMR-)-Spektren wurden auf einem Brucker-300-Spektrometer (300 MHz) aufgezeichnet. Wenn nicht anders angegeben, wurden NMR-Spektren mit DMSO-d6 als Lösungsmittel und Tetramethylsilan (TMS) als interner Standard laufengelassen. Chemische Verschiebungen werden im Deltawert (6) und Kopplungskonstanten, J, in Hertz (Hz) angegeben.
Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) wurde unter Verwendung eines Systems zur Lösungsmittelzufuhr vom Beckmann-Modell 100A, das mit einem Diodenarraydetektor ausgestattet war, durchgeführt.
Kapillarelektrophorese-(CE-)-Trennungen wurden auf einem Beckmann P/ACE^TM2000, ausgestattet mit UV-Detektor, oder einem Beckmann P/ACE^TM5500, ausgestattet mit LIF-Detektor, durchgeführt. Die Diodenlaser von 635, 67 und/oder 750 nm von Beckmann wurden mit dem P/ACE^TM5500-System verwendet. Kapillarsäulen waren blankes Quarzgut, typischerweise 27 cm Länge und 20 bis 25 μm Innendurchmesser (Polymicro Technologies, Phoenix, AZ). Laufpuffer waren 100 mM oder 150 mM Natriumsalz von Borsäure, pH 10,2 bzw. 8,5.
Synthese von aktivierten Cyaninfarbstoffen
Aktivierte Monosäuren von Cy5, Cy7, DBCy5 und DBCy7 wurden, wie in den 2 bis 5 dargestellt, synthetisiert. Die experimentellen Verfahrensweisen für die endgültigen und kritischen Schritte zur Herstellung von N-Hydroxynaphthalimid-aktiven Farbstoffen wurden wie folgt durchgeführt.
Carboxylalkylsulfocyaninfarbstoff wurde in trocknem DMF (100 mg Farbstoff/2 ml) gelöst. Carbonyldiimidazol (2 Moläquivalente/Carbonylgruppe) wurde zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 5 h unter Stickstoffatmosphäre gerührt. N-Hydroxynaphthalimid (2 Moläquivalente) wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht (~16 h) gerührt. Nach dem Verdünnen des Gemisches mit trockenem Ethylacetat wurde der Überstand dekantiert. Der aktive Ester wurde durch erneutes Lösen in trocknem DMF und Ausfällen mit Ethylacetat gereinigt. Nahezu quantitative Ausbeuten an Cyanin-aktiven Estern wurden erhalten.
Koniugation von N-Hydroxynaphthalimid-aktivierten Farbstoffen an Oligonukleotide
Diese Beispiele beschreiben, wie N-Hydroxynaphthalimid-aktivierte Monosäuren von Cy5 und Cy7 zu einem Oligonukleotid-24-mer an einen 5'-Aminoterminus konjugiert wurden. Die gewünschte Oligonukleotidsequenz wurde auf einem automatisierten Oligonukleotidsynthesegerät (Oligo 1000, Beckmann-Coulter Inc., Fullerton, CA) synthetisiert. Die folgenden Schritte wurden dann durchgeführt:

1. 5'-Aminomodifikator C6 (Glen Research 10-1906-90, Sterling, VA) wurde für 10 Minuten an das Gerät gekoppelt und der Cyclus wurde beendet.
2. Monomethyltrityl (MMT) wurde aus dem Aminomodifikator entfernt und die Kopplungsleistung wurde gemessen.
3. Spaltung und Entschützen des Oligonukleotids wurde unter Verwendung von Ammoniak/Methylamin (1/9) durchgeführt.
4. Das Oligonukleotid wurde durch CE und Umkehrphasen-HPLC analysiert.
5. Die Abs_260nm des aminomodifizierten Oligonukleotids wurde genommen. Dann wurde das Oligonukleotid zur Trockne eingedampft.
6. Das Oligonukleotid wurde dann mit 250 μl Triethylammoniumbicarbonatpuffer (pH 8,2–8,6) und dann mit 250 μl deionisiertem Wasser zur Trockne koeingedampft.
7. Das Oligonukleotid wurde in 350 μl deionisiertem Wasser gelöst, 50 μl 1 M Bicarbonatpuffer (pH 9,0) wurden sowie der aktivierte Cy5-Farbstoff (3 mg in 100 μl trockenem DMF gelöst) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde gut gemischt und über Nacht bei Raumtemperatur in der Dunkelheit stehengelassen.
8. Das Produkt wurde durch eine NAP-25-Säule (Sephadex G-25 von Pharmacia) unter Verwendung von 0,01 M NH₄Oac-Puffer (pH 7,0) geleitet, und das Oligonukleotid wurde gesammelt.
9. Ungefähr 100 μl der obigen Lösung wurden durch Umkehrphasen-C18-HPLC analysiert.
10. Die restliche Lösung wurde vollständig verdampft, in 200 μl Wasser gelöst und unter Verwendung von semiprep-C18-Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Die Elutionsbedingungen waren wie folgt: Puffer B: 100% AcCN, und Puffer A: 0,01 M NH₄OAc-Puffer (pH 7,0), 0 bis 20 min Gradient zu 15%B, 20 bis 25 min Gradient zu 25%B, 25 bis 27 min Gradient zu 50%B, 27 bis 30 min 50%B, 30 bis 35 min 0%B.
11. Das Eluat aus der HPLC wurde vollständig zur Trockne eingedampft, in Wasser gelöst und die Abs 260 nm wurde abgelesen.

Das gereinigte markierte Oligo wurde durch CE, CE-LIF, UV und HPLC analysiert. Einige repräsentative analytische Daten werden in den 6 bis 8 dargestellt.
Vergleich von N-Hydroxynaphthalimid-aktivierten Cy5 mit anderen aktivierten Estern
Wie die folgenden Daten zeigen, ergab N-Hydroxynaphthalimid-aktiviertes Cy5 höhere Ausbeuten als entweder N-Hydroxynaphthalimid oder N-Hydroxysuccinimid. Dieses Ergebnis kann auf die zunehmende Stabilität des aktivierten Esters in wässerigen Medien, in denen die Konjugationsreaktion durchgeführt wird, zurückgeführt werden. Die zunehmende Stabilität von N-Hydroxynaphthalimid-aktiviertem Cy5 wurde in einem separaten Experiment (nachstehend gezeigt) bestätigt.
Vergleich der Wirksamkeiten von N-Hydroxynaphthalimid-aktiviertem Cy5 mit N-Hydroxynaphthalimid- und N-Hydroxysuccinimid-aktiviertem Cy5 beim Konjugieren an ein 24-Basen-Oligonukleotid
Stabilität von aktiviertem Cy5 in DMF/HC03-Puffer, pH 9,0 (1 : 4) durch HPLC
Biotin-aktiverte Ester
Die folgenden experimentellen Ergebnisse zeigen, daß N-Hydroxynaphthalimidaktivierte Ester ebenso verwendet werden können, um ein 5'-Aminooligonukleotid mit Biotin zu markieren.
Vergleich der Wirksamkeiten von N-Hydroxynaphthalimid-aktiviertem Biotin mit N-Hydroxysuccinimid-aktiviertem Biotin bei der Konjugation an 24-Basen-Oligonukleotide
Es ist offensichtlich, daß Naphthalimid-aktive Ester zu höheren Ausbeuten führten. Es erfordert die Verwendung von weniger überschüssigem Reagenz, um die gewünschten Ausbeuten zu erhalten.
Konjugation von N-Hydroxynaphthalimid-aktiviertem Cy5 an ein Aminonukleosid
Die folgende Tabelle vergleicht die experimentellen Ergebnisse, die erhalten wurden, wenn zwei unterschiedlich aktivierte Ester von Cy5 an 5'-Amino-5'-deoxythymidin in wässerigen Medien konjugiert wurden. Wie in den folgenden Daten gezeigt, ergab N-Hydroxynaphthalimid-aktivertes Cy5 (Cy5-NAPH) höhere Ausbeuten als ein N-Hydroxysuccinimid-aktiviertes Cy5 (Cy5-NHS).
Vergleich der Wirksamkeiten von N-Hydroxynaphthalimid-aktivertem Cy5 mit N-Hydroxysuccinimid-aktiviertem Cy5 bei der Konjugation an ein 5'-Amino-5'-deoxythymidin
Es ist bemerkenswert, daß Cy5-NHS zu Anfang schnell reagiert und gleichzeitig durch eine nicht wünschenswerte spontane wässerige Hydrolyse geht, wodurch sich die aktiven Spezies schneller abreichern. Andererseits ist Cy5-NAPH gegen wässerige Hydrolyse stabiler und bleibt daher in wässerigen Medien aktiv, was schließlich zu höheren Ausbeuten führt.
Umwandlung von Nukleosidtriphosphatnatriumsalz oder -ammoniumsalz zu Nukleosidtributylammoniumsalz (zur Verwendung beim Koppeln in organischen Lösungsmitteln)
Die folgende Verfahrensweise wurde verwendet, um Nukleosidtriphosphate herzustellen, die mit N-Hydroxynaphthalimid-aktivierten Estern von Cyaninfarbstoffen in organischen Medien markiert werden können.

1. Viermal Vorwaschen von Ionenaustauschharz (Dowex 50w-8X, H⁺-Form, 200 bis 400 mesh) mit (1 : 1) Metanol.
2. Packen des Harzes in eine Säule, viermal Waschen mit Wasser und dann viermal mit Pyridin, um das Harz in eine Pyridiniumform umzuwandeln.
3. Lösen des Nukleosidtriphosphats in Wasser, Aufbringen auf die Säule und Eluieren der Pyridiniumform von Triphosphat mit Wasser.
4. Überprüfen der Fraktionen durch TLC.
5. Vereinen der Fraktionen in einem Rundkolben und Zugeben von 6 Moläquivalenten von Tributylamin.
6. Verdampfen bei 30°C. Zweimal Koverdampfen des öligen Sirups mit Pyridin und dann zweimal mit DMF. Lösen des resultierenden Tributylammoniumsalzes in DMF/Pyridin (2 : 1) und Lagern im Tiefkühlschrank.
7. Das Tributylammoniumsalz ist bereit zum Koppeln an die aktivierten Farbstoffe in einem organischen Medium.

Synthese von Farbstoff markierten Dideoxynukleosidtriphosphatterminatoren in einem organischen Medium
Das folgende Reaktionsschema faßt die Verfahrensweise, die verwendet wurde, um Dideoxynukleosidtriphosphate an Cyaninfarbstoffe in organischen Lösungsmitteln zu koppeln, zusammen.

Der aktive Ester (2,0 μmol) des Fluoreszenzfarbstoffes wurde in eine Ampulle gegeben. Eine Lösung des Tributylammoniumsalzes vom Triphosphatnukleotidterminator in wasserfreiem DMF (0,02 M, 1,0 μmol) wurde zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 5 μl Diisopropylethylamin (DIEA). Die Ampulle wurde verwirbelt und bei Raumtemperatur 15 h in der Dunkelheit stehengelassen. Das Reaktionsgemisch wurde durch CE-LIF analysiert, um die Bildung des Konjugats zu beobachten. Das Produkt wurde durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung der folgenden Bedingungen gereinigt:

Säule	Beckmann C18-Ultrasphere (10 mm × 25 mm)
Fließgeschwindigkeit	4 ml/min
Wellenlänge	260 nm und 598 nm
Elutionsmittel	Lösungsmittel A: 0,1 M NH₄OAc Lösungsmittel B: Acetonitril
Gradient

Das Produkt, das aus HPLC gesammelt wurde, wurde durch CE-LIF, Fluorometer und Enzymdigestion mit alkalischer Phosphatase analysiert.
Die vorliegende Erfindung, die hierin beschrieben wurde, weist viele Vorteile auf. Die Vorteile umfassen die Entdeckung von N-Hydroxynaphthalimid und substituiertem N-Hydroxynaphthalimid als aktivierende Mittel. Ebenso eingeschlossen sind Verfahren zum Synthetisieren aktivierter Ester zum Markieren von Verbindungen in einer einfachen, schnellen, effizienten Weise mit hohen Ausbeuten. Außerdem vermindern die Verfahren, die zum Synthetisieren markierter Nukleotide in organischen Medien bereitgestellt werden, die spontane Hydrolyse der aktiven Spezies. Die Velseitigkeit dieser aktivierenden Mittel in einer Vielzahl von Anwendungen, insbesondere wenn an Cyaninfarbstoffe gekoppelt, macht diese Verbindungen besonders wertvoll.
Obwohl die vorliegende Erfindung in beträchtlichen Einzelheiten in bezug auf bestimmte bevorzugte Versionen beschrieben worden ist, sind andere Versionen möglich.

Claims

Aktivierter Farbstoff mit der Formel
wobei n 1, 2 oder 3 ist, X S, O, N, CH₂ oder C(CH₃)₂ ist, R₂ Alkyl, Alkylsulfonat, Alkylcarboxylat, aktiviertes Alkylsulfonat oder aktiviertes Alkylcarboxylat mit einer ein bis zehn Kohlenstoffatome langen Alkylkette ist und Rx aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Sulfonyl und Alkyl, ausgewählt ist.
Verfahren zum Herstellen eines aktivierten Farbstoffs, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: das Lösen eines Cyaninfarbstoffs mit mindestens einer Carboxylgruppe in einem Lösungsmittel und das Kombinieren von N-Hydroxynaphthalimid-Rx mit dem gelösten Cyaninfarbstoff, um einen aktivierten Farbstoff zu bilden, wobei N-Hydroxynaphthalimid-Rx eine Formel aufweist:
und Rx aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Sulfonyl und Alkyl, ausgewählt ist, und einem aktivierenden Mittel wie Carbonyldiimidazol oder Dicyclohexylcarbodiimid.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Cyaninfarbstoff aus der Gruppe, bestehend aus
ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Lösungsmittel ein organisches Lösungsmittel umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Lösungsmittel Dimethylformamid umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Menge von N-Hydroxynaphthalimid-Rx, die mit dem Cyaninfarbstoff kombiniert wird, mindestens 2 Moläquivalente beträgt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Menge von N-Hydroxynaphthalimid-Rx von 1,5 bis 5 Moläquivalenten reicht.
Verfahren nach Anspruch 2, ferner umfassend den zusätzlichen Schritt des Ausfällens des aktivierten Farbstoffs aus dem Gemisch.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der aktivierte Farbstoff durch Hinzufügen von Ethylacetat ausgefällt wird.
Verfahren zum Markieren eines Oligonukleotids, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: das Modifizieren eines Oligonukleotids, ein Amino-, Sulfhydryl- oder Hydroxynukleophil zu enthalten, um hierdurch ein modifiziertes Oligonukleotid zu bilden, das Kombinieren des modifizierten Oligonukleotids mit einem aktivierten Farbstoff mit mindestens einer N-Oxynaphthalimid-Rx-Gruppe, die an eine Carboxylgruppe gebunden ist, wobei die resultierende Gruppe eine Struktur aufweist:
wobei Rx aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Sulfonyl und Alkyl, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das modifizierte Oligonukleotid ein Aminooligonukleotid ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der 5'-Terminus des Oligonukleotids modifiziert ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der aktivierte Farbstoff aus der Gruppe, bestehend aus
ausgewählt ist, wobei n 1, 2 oder 3 ist, X S, O, N, CH₂ oder C(CH₃)₂ ist, R₂ Alkyl, Alkylsulfonat, Alkylcarboxylat, aktiviertes Alkylsulfonat oder aktiviertes Alkylcarboxylat mit einer ein bis zehn Kohlenstoffatomen langen Alkylkette ist, und Rx aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Sulfonyl und Alkyl, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der aktivierte Farbstoff in einem molaren Überschuß relativ zu dem modifizierten Nukleotid kombiniert wird.
Verfahren zur Markierung einer Komponente, umfassend: das Bereitstellen der Komponente mit mindestens einer Amino-, Sulfhydryl- oder Hydroxygruppe und das Kombinieren der Komponente mit einer aktivierten Einheit mit mindestens einer N-Oxynaphthalimid-Rx-Gruppe, die an eine Carboxylgruppe gebunden ist, wobei die resultierende Gruppe die Struktur aufweist:
wobei Rx aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Sulfonyl und Alkyl, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Komponente aus der Gruppe, bestehend aus Antikörpern, Proteinen, Peptiden, Enzymsubstraten, Hormonen, Lymphokinen, Metaboliten, Rezeptoren, Antigenen, Haptenen, Lectinen, Avidin, Streptavidin, Toxinen, Kohlenhydraten, Oligosacchariden, Polysacchariden und anderen Materialien, einschließlich Nukleinsäuren, DNA, derivatisierten Nukleinsäuren, derivatisierten Desoxynukleinsäuren, DNA-Fragmenten, RNA-Fragmenten, derivatisierten DNA-Fragmenten, derivatisierten RNA-Fragmenten, Arzneimitteln, Toxinen, Blutzellen, mikrobiellen Materialien, Teilchen, Kunststoff- oder Glasoberflächen, Polymermembranen, Nukleotiden, Desoxynukleotiden und Didesoxynukleotiden, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die aktivierte Einheit aus der Gruppe, bestehend aus Biotin, Hapten, Cyaninfarbstoffen, Merocyaninfarbstoffen, Styrylfarbstoffen, Fluorophoren wie Fluorescein, Rhodamin, Texas Rot, chemilumineszenten Molekülen wie Acridiniumestern, Dioxitanderivaten, elektrolumineszenten Markierungen wie Moleküle auf Rutheniumbasis, Haptenmoleküle wie Digoxigenin und chromophoren Molekülen wie Coumarinen, ausgewählt ist.
Verfahren zum Markieren eines Nukleosidtriphosphats, umfassend das Kombinieren eines Nukleosidtriphosphats mit mindestens einer Amino-, Sulfhydryl- oder Hydroxygruppe mit einer aktivierten Einheit mit mindestens einer N-Oxynaphthalimid-Rx-Gruppe, die an eine Carboxylgruppe gebunden ist, wobei die resultierende Gruppe die Struktur aufweist:
wobei Rx aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Sulfonyl und Alkyl, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die aktivierte Einheit aus der Gruppe, bestehend aus Biotin, Hapten, Cyaninfarbstoffen, Merocyaninfarbstoffen, Styrylfarbstoffen, Fluorophoren wie Fluorescein, Rhodamin, Texas Rot, chemilumineszenten Molekülen wie Acridiniumestern, Dioxitanderivaten, elektrolumineszenten Markierungen wie Moleküle auf Rutheniumbasis, Haptenmolekülen wie Digoxigenin und chromophoren Molekülen wie Coumarinen, ausgewählt ist.
Verfahren zum Markieren eines Nukleosidtriphosphats, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: das Bereitstellen des Nukleosidtriphosphats mit mindestens einer Amino-, Sulfhydryl- oder Hydroxygruppe, das Überführen des Nukleosidtriphosphats in dessen Trialkylammoniumsalz, um ein Nukleosidtriphosphattrialkylammoniumsalz zu bilden, und das Kombinieren des Nukleosidtriphosphattrialkylammoniumsalzes mit einer aktivierten Einheit mit mindestens einer N-Oxynaphthalimid-Rx-Gruppe, die an eine Carboxylgruppe gebunden ist, wobei die resultierende Gruppe eine Struktur aufweist:
wobei Rx aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Sulfonyl und Alkyl, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Trialkylammoniumsalz ein Tributylammoniumsalz ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die aktivierte Einheit aus der Gruppe, bestehend aus Biotin, Hapten, Cyaninfarbstoffen, Merocyaninfarbstoffen, Styrylfarbstoffen, Fluorophoren wie Fluorescein, Rhodamin, Texas Rot, chemilumineszenten Molekülen wie Acridiniumestern, Dioxitanderivaten, elektrolumineszenten Markierungen wie Moleküle auf Rutheniumbasis, Haptenmolekülen wie Digoxigenin und chromophoren Molekülen wie Coumarinen, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Verfahren in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt wird.
Verfahren zum Herstellen eines Farbstoff-markierten Didesoxynukleotidtriphosphatterminators, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: das Kombinieren in einem Reaktionsgemisch eines Tributylammoniumsalzes eines Triphosphatnukleotidterminators, welcher mindestens eine Amino-, Sulfhydryl- oder Hydroxygruppe aufweist, und eines aktivierten Farbstoffs mit mindestens einer N-Oxynaphthalimid-Rx-Gruppe, die an eine Carboxylgruppe gebunden ist, wobei die resultierende Gruppe eine Struktur aufweist:
wobei Rx aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Sulfonyl und Alkyl, ausgewählt ist.
Verfahren zum Markieren eines Oligonukleotids, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: das Überführen des Oligonukleotids, welches mindestens eine Amino-, Sulfhydryl- oder Hydroxygruppe aufweist, in dessen Trialkylammoniumsalz, um ein Oligonukleotidtrialkylammoniumsalz zu bilden, und das Kombinieren des Oligonukleotidtrialkylammoniumsalzes mit einer aktivierten Einheit mit mindestens einer N-Oxynaphthalimid-Rx-Gruppe, die an eine Carboxylgruppe gebunden ist, wobei die resultierende Gruppe eine Struktur aufweist:
wobei Rx aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Sulfonyl und Alkyl, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei die aktivierte Gruppe aus der Gruppe, bestehend aus Biotin, Hapten, Cyaninfarbstoffen, Merocyaninfarbstoffen, Styrylfarbstoffen, Fluorophoren wie Fluorescein, Rhodamin, Texas Rot, chemilumineszenten Molekülen wie Acridiniumestern, Dioxitanderivaten, elektrolumineszenten Markierungen wie Moleküle auf Rutheniumbasis, Haptenmolekülen wie Digoxigenin und chromophoren Molekülen wie Coumarinen, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei das Verfahren in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei das Trialkylammoniumsalz ein Tributylammoniumsalz ist.