DE19581489B4 - Mit Energieübertragungs-gekuppelten Farbstoffen markierte Sonden - Google Patents

Mit Energieübertragungs-gekuppelten Farbstoffen markierte Sonden Download PDF

Info

Publication number
DE19581489B4
DE19581489B4 DE19581489T DE19581489T DE19581489B4 DE 19581489 B4 DE19581489 B4 DE 19581489B4 DE 19581489 T DE19581489 T DE 19581489T DE 19581489 T DE19581489 T DE 19581489T DE 19581489 B4 DE19581489 B4 DE 19581489B4
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
donor
different
chain
acceptor
markers
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE19581489T
Other languages
English (en)
Other versions
DE19581489T1 (de
Inventor
Richard A. El Cerrito Mathies
Alexander Orinda Glazer
Jingyue Berkley Ju
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of California
University of California Berkeley
Original Assignee
University of California
University of California Berkeley
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of California, University of California Berkeley filed Critical University of California
Publication of DE19581489T1 publication Critical patent/DE19581489T1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE19581489B4 publication Critical patent/DE19581489B4/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81—Packaged device or kit

Abstract

Kombination aus verschiedenen fluoreszierenden Markern, wobei jeder Marker ein an verschiedene Atome einer Kette von Atomen kovalent gebundenes fluoreszierendes Donor-Akzeptor-Paar mit wirksamer Energieübertragung von dem Donor zu dem Akzeptor aufweist und wobei jeder der Marker eine einzige Molekülart darstellt und kovalent an eine nachzuweisende Komponente gebunden werden kann und im. wesentlichen bei der gleichen Wellenlänge absorbiert und bei einer unterschiedlichen Wellenlänge emittiert.

Description

  • Technisches Gebiet
  • Das Gebiet der Erfindung betrifft fluoreszierende Marker und ihre Verwendung.
  • Hintergrund
  • Es besteht ein wachsendes Bedürfnis dafür, in der Lage zu sein, Komponenten oder Bestandteile von Mischungen zu identifizieren und quantitativ zu bestimmen. Je komplexer die Mischung ist, um so größer ist das Interesse, dazu in der Lage zu sein, gleichzeitig eine Vielzahl der vorhandenen Komponenten nachzuweisen. Ein Beispiel für diese Situation ist die Sequenzierung von DNA, wo es erwünscht ist, mit einer Laserquelle bei einer einzigen Wellenlänge in wirksamer Weise eine bis vier Fluoreszenz-markierte Komponenten anzuregen und eine Fluoreszenzsignalemission bei einer Vielzahl von unterscheidbaren Wellenlängen zu erzeugen. Bei dieser Situation sollten die verschiedenen Marker (Sonden oder Label) die elektrophoretische Beweglichkeit der Sequenzen, an welche sie gebunden sind, nicht beeinträchtigen.
  • Derzeit werden vier Methoden für die automatisierte DNA-Sequenzierung angewandt: (1) Die DNA-Fragmente werden mit einem Fluorphor markiert, wonach man die Fragmente in benachbarten Sequenzierungsbahnen laufen läßt (Ansorge et al., Nucleic Acids Res. 15 (1987), 4593-4602); (2) die DNA-Fragmente werden mit vier verschiedenen Fluorophoren markiert und sämtliche Fragmente werden in einer einzigen Bahn elektrophoretisch getrennt und nachgewiesen (Smith et al., Nature 321 (1986), 674-679); (3) jedes der Dideoxynucleoside bei der Terminationsreaktion wird mit einem unterschiedlichen Fluorophor markiert und die vier Gruppen von Fragmenten werden in der gleichen Bahn laufen gelassen (Prober et al., Science 238 (1987), 336-341); oder (4) die Gruppen von DNA-Fragmenten werden mit zwei verschiedenen Fluorophoren markiert und die DNA-Sequenzen mit den Farbstoffverhältnissen codiert (Huang et al., Anal. Chem. 64 (1992), 2149-2154).
  • All diese Methoden besitzen signifikante Nachteile. Die Methode 1 besitzt die möglichen Probleme von unterschiedlichen Beweglichkeiten in den verschiedenen Bahnen sowie einen geringen Durchsatz. Die Methoden 2 und 3 machen es erforderlich, daß die vier Farbstoffe durch eine Laserquelle gut angeregt werden und daß sie deutlich unterschiedliche Emissionsspektren besitzen. In der Praxis ist es sehr schwierig, zwei oder mehrere Farbstoffe zu finden, welche in wirksamer Weise mit einem einzigen Laser angeregt werden können und die gut getrennte Fluoreszenzsignale emittieren.
  • Wenn man Farbstoffe auswählt, die deutlich Rot-verschobene Emissionsspektren besitzen, werden deren Absorptionsmaxima ebenfalls in den roten Bereich bewegt, so daß sämtliche Farbstoffe nicht mehr in wirksamer Weise mit der gleichen Laserquelle angeregt werden können. Weiterhin wird es in dem Maße, in dem mehr unterschiedliche Farbstoffe ausgewählt werden, schwieriger, alle Farbstoffe derart auszuwählen, daß sie die gleiche Beweglichkeitsverschiebung der markierten Moleküle verursachen.
  • Die nachveröffentlichte WO 94/17397 beschreibt einen Reagenzsatz, welcher mindestens zwei fluoreszierende Multimere umfaßt, die mindestens zwei Fluorophore aufweisen, die bei unterschiedlichen Wellenlängen absorbieren und emittieren. Die fluoreszierenden Multimere können durch Intercalation stark an dsDNA binden und können für die gelelektrophoretische Trennung von DNA und bei der Herstellung von stark fluoreszierenden, markierten Sonden mit starker Stokes'scher Verschiebung eingesetzt werden. Die Fluorophore werden also nicht durch kovalente Bindung an die nachzuweisenden oder zu trennenden Komponenten gebunden.
  • Die US 4,996,143 beschreibt fluoreszierende Polynucleotid-Sonden mit Stokes'scher Verschiebung für Hybridisierungs-Assays, welche Sonden Donor- und Akzeptor-Fluorophore für die nicht-strahlende Energieübertragung enthalten. Auch diese Marker werden nicht kovalent an die nachzuweisende Komponente, beispielsweise eine Nucleinsäure, gebunden.
  • P.A. Cardullo et al. (Proc. Natl. Acad Sci. USA, 85 (1988), 8790 bis 8794, befassen sich mit der Untersuchung der Hybridisierung von komplementären Oligonucleotiden durch Fluoreszenz-Energieübertragung. Keine der beschriebenen Ausführungsformen umfaßt Donor- und Akzeptor-Reste, welche kovalent an das gleiche Ende eines Nucleinsäuremoleküls gebunden sind.
  • L. Stryer, Ann. Rev. Biochem., 47 (1978), 819 bis 846, zeigt in der 7 ein Kleeblatt-Diagramm einer mit fluoreszierenden Gruppen in den inneren Positionen und gegebenenfalls an den endständigen Positionen markierten tRMa, ohne daß jedoch offenbart wird, daß man diese tRMA als Marker verwenden kann, der kovalent an eine Komponente einer zu trennenden oder zu untersuchenden Vielkomponenten-Mischung gebunden werden könnte.
  • L. G. Lee et al., Nucleic Acids Research, Vol. 20, No. 10 (1992), 2471 bis 2483, beschreibt die Entwicklung und die Untersuchung einer Kombination aus mit Farbstoffen markierten Terminatoren für die Verwendung beim Sequenzieren unter Verwendung einer modifizierten T7 DNA-Polymerase. Dabei sind einzelne Fluorophore an Dideoxynucleotide gebunden. Allerdings wird nicht mehr als ein solcher Farbstoff zur Verwendung bei einem Sequenzierverfahren offenbart.
  • Die WO 93/09128 A1 offenbart die Hybridisierung von mit Chromophoren und Fluorophoren konjugierten Polynucleotiden zur Erzeugung eines Donor-Donor-Energieübertragungssystems, bei dem ein Energietransfer zwischen zwei Fluorophoren auf einem Oligonucleotid erfolgt. Es wird angegeben, daß eine Übertragung zwischen dem gleichen Donor (gleiche Absorptionswellenlänge) und verschiedenen Akzeptoren (verschiedene Emissionswellenlängen) erfolgen kann, wobei sich eine vorteilhafte große Stokes'sche Verschiebung ergibt.
  • Gegenstand der US 4,855,225 A sind Kombinationen von Oligonucleotiden, die einzelne verschiedene Fluorophore tragen, und die über Primer-Verlängerungsreaktionen zur Sanger-Sequenzierung in "Ein-Spur"-Trennungsverfahren verwendet werden. Nach der Lehre dieses Standes der Technik werden also unterschiedlich fluoreszierende Primer eingesetzt, die die gleiche Mobilität aufweisen.
  • Es besteht daher ein wesentliches Interesse dafür, verbesserte Methoden zu schaffen, mit denen ein Multiplexing der Proben möglich wird, so daß eine Vielzahl der Bestanteile oder Komponenten in dem gleichen System und in einem einzigen Lauf bestimmt werden kann. Es ist weiterhin erwünscht, daß jeder Marker eine starke Absorption bei einer gemeinsamen Wellenlänge besitzt, eine hohe Quantenausbeute der Fluoreszenz aufweist, eine starke Stokes-Verschiebung der Emission zeigt, daß die verschiedenen Emissionen unterscheidbar sind und daß die Marker die gleiche Mobilitätsverschiebung verursachen. Es ist schwierig, diese widersprüchlichen Ziele lediglich durch Markieren der Moleküle mit einem einzigen Farbstoff zu erreichen.
    •
  • Die vorliegende Erfindung schafft Zusammensetzungen und Verfahren zur Analyse einer Mischung unter Verwendung einer Vielzahl von fluoreszierenden Markern (Sonden oder Label). Zur Erzeugung der Marker werden Paare oder Familien von Fluorophoren an ein Grundgerüst gebunden, insbesondere ein Nucleinsäure-Grundgerüst, wobei eines der Mitglieder der Familien bei etwa der gleichen Wellenlänge angeregt wird. Durch Ausnutzen des Phänomens der Energieübertragung wird erreicht, daß die anderen Mitglieder einer jeden Familie bei einer nachweisbar unterschiedlichen Wellenlänge emittieren. Der Bereich der Abstände zwischen den Donor- und Akzeptor-Chromophoren wird derart ausgewählt, daß eine wirksame Energieübertragung erreicht wird. Weiterhin werden gemeinsam verwendete Marker derart ausgewählt, daß sie in einem Trennsystem ungefähr die gleiche Mobilität besitzen. Dies wird dadurch erreicht, daß man die Mobilität der markierten Einheit verändert, indem man den Abstand zwischen den zwei oder mehreren Mitgliedern der Familie der Fluorophore variiert und Marker mit der gleichen Mobilität auswählt. Die vorliegende Erfindung findet insbesondere Anwendung bei Sequenzieren, wo die Fluorophore an universale oder andere Primer gebunden werden und unterschiedliche Fluorophor-Kombinationen für die unterschiedlichen Dideoxynucleoside verwendet werden. Es werden auch Reagenssätze (Kits) von Marker-Kombinationen geschaffen.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 verdeutlicht die Absorptions- und Emissionsspektren von FAM-3-TAM in 1xTBE;
  • 2 zeigt ein CE-Elektropherogramm von FAM-3-TAM. Die Probe wurde durch typische Kapillarelektrophorese-DNA-Sequenzierungsbedingungen mit einer Anregung bei 488 nm analysiert. Die grüne Spur ist das in dem grünen Kanal (525 nm) nachgewiesene Fluoreszenzsignal, während die rote Spur das in dem roten Kanal (590 nm) nachgewiesene Fluoreszenzsignal darstellt. Beide Kanäle werden gleichzeitig nachgewiesen;
  • 3 zeigt die Darstellung des Absorptions- und Emissionsspektrums von FAM-4-ROX in 1xTBE;
  • 4 zeigt ein CE-Elektropherogramm von FAM-4-ROX. Die Probe wurde unter typischen Kapillarelektrophorese-DNA-Sequenzierungsbedingungen mit einer Anregung bei 488 nm analysiert. Die grüne Spur ist das im grünen Kanal (525 nm) nachgewiesene Fluoreszenzsignal, während die rote Spur das in dem roten Kanal (590 nm) nachgewiesene Fluoreszenzsignal betrifft. Beide Kanäle werden gleichzeitig nachgewiesen;
  • 5 zeigt ein CE-Elektropherogramm von FAM-4-ROX und ROX-Primern. Die beiden Primer werden in gleichen Konzentrationen in 80% Formamid vermischt und in die Kapillare injiziert. Die Fluoreszenzsignale werden bei einer Anregung bei 476 nm gleichzeitig in den grünen und roten Kanälen nachgewiesen;
  • 6 zeigt ein CE-Elektropherogramm einer Mischung aus FAM-3-ROX, FAM-4-ROX und FAM-10-ROX und verdeutlicht die Abhängigkeit der Mobilität vom Abstand zwischen Donor und Akzeptor. Die Probe wurde unter typischen Kapillarelektrophorese-DNA-Sequenzierungsbedingungen bei einer Anregung von 488 nm analysiert; und
  • 7 zeigt einen Vergleich der Mobilitätsverschiebung unterschiedlicher Farbstoffprimer an M13 mp 18 A-Fragment-DNA-Proben.
  • BESCHREIBUNG SPEZIFISCHER AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Es werden neue fluoreszierende Marker, Kombinationen von fluoreszierenden Markern und deren Verwendung bei Trennungssystemen, welche die Trennung einer Vielzahl von Komponenten umfassen, bereitgestellt. Insbesondere umfassen die fluoreszierenden Marker Paare von Fluorophoren, welche, mit einer Ausnahme, gemäß der die Fluorophore die gleichen sind, unterschiedliche Fluorophore mit überlappenden Spektren umfassen, wobei die Donoremission die Akzeptorabsorption überlappt, so daß sich eine Energieübertragung von dem angeregten Fluorphor auf das andere Mitglied des Paares ergibt. Es ist nicht wesentlich, daß der angeregte Fluorophor tatsächlich fluoresziert, da es genügt, daß der angeregte Fluorophor dazu in der Lage ist, die Anregungsenergie in wirksamer Weise zu absorbieren und sie in wirksamer Weise auf den emittierenden Fluorophor zu übertragen.
  • Die Donor-Fluorophore der verschiedenen Familien von Fluorophoren können gleichartig oder verschieden sein, sind jedoch dazu in der Lage, in wirksamer Weise durch eine einzige Lichtquelle mit enger Bandbreite, insbesondere eine Laserquelle, angeregt zu werden. Die Donor-Fluorophore besitzen eine signifikante Absorption von im allgemeinen mindestens etwa 10%, vorzugsweise mindestens etwa 20% des Absorptionsmaximums innerhalb von 20 nm voneinander, im allgemeinen innerhalb 10 nm und noch allgemeiner innerhalb 5 nm voneinander. Die emittierenden oder Akzeptor-Fluorophore werden so ausgewählt, daß sie in der Lage sind, die Energie von den Donor-Fluorophoren aufzunehmen und Licht zu emittieren, welches unterscheidbar und nachweisbar unterschiedlich ist. Demzufolge ist man in der Lage, zwischen den Komponenten der Mischung, an die die verschiedenen Marker gebunden worden sind, zu unterscheiden. Im allgemeinen emittieren die Marker bei Emissionsmaxima, die um mindestens 10 nm, vorzugsweise mindestens 15 nm und noch bevorzugter mindestens 20 nm voneinander getrennt sind.
  • Im allgemeinen absorbieren die Donor-Fluorophore im Bereich von etwa 350 bis 800 nm und noch allgemeiner im Bereich von etwa 350 bis 600 nm oder 500 bis 750 nm, während die Akzeptor-Fluorophore Licht im Bereich von etwa 450 bis 1000 nm, im allgemeinen im Bereich von etwa 450 bis 800 nm emittieren. Wie nachfolgend noch erläutert werden wird, kann mehr als ein Paar von absorbieren den Molekülen angewandt werden, so daß man drei oder mehr Moleküle einsetzen kann, wobei die Energie bei höheren Wellenlängen von einem Molekül zum nächsten übertragen wird, um in dieser Weise den Wellenlängenunterschied zwischen der Absorption und der beobachteten Emission im starkem Maße zu vergrößern.
  • Die beiden Fluorophore sind über ein Grundgerüst oder eine Kette, im allgemeinen eine Polymerkette, verbunden, wobei der Abstand zwischen den beiden Fluorophoren variiert werden kann. Die physikalischen Grundlagen der Auslegung der Marker sind so, daß die Übertragung der optischen Anregung von dem Donor auf den Akzeptor von der Beziehung 1/R6 abhängt, worin R für den Abstand zwischen den beiden Fluorophoren steht. Somit muß der Abstand derart ausgewählt werden, daß sich eine wirksame Energieübertragung gemäß dem gut bekannten Foerster-Mechanismus von dem Donor zu dem Akzeptor ergibt. Somit kann der Abstand zwischen den beiden Fluorophoren, der durch die Anzahl der Atome in der die beiden Fluorophore trennenden Kette bestimmt wird, in Abhängigkeit von der Art der Kette variiert werden. Man kann unterschiedliche Ketten oder Grundgerüste verwenden, beispielsweise Nucleinsäuren, sowohl DNA als auch RNA, modifizierte Nucleinsäuren, beispielsweise solche, bei denen Sauerstoffatome durch Schwefel, Kohlenstoff oder Stickstoff, Phosphate durch Sulfat oder Carboxylat etc. ersetzt sind, Polypeptide, Polysaccharide, verschiedene Gruppen, die stufenweise angefügt werden können, wie difunktionelle Gruppen, beispielweise Halogenamine oder dergleichen. Die Fluorophore können durch geeignete Funktionalisierung der verschiedenen, den Marker bildenden Blöcke substituiert sein, wobei der Fluorophor je nachdem, auf dem zur Bildung des Markers verwendeten Block vorliegen oder später angefügt werden kann. Man kann unterschiedliche herkömmliche chemische Verfahren anwenden, um sicherzustellen, daß der geeignete Abstand zwischen den beiden Fluorophoren erreicht wird.
  • Die Molekulargewichte der Marker (Fluorophore plus Grundgerüst, an die sie gebunden sind) betragen im allgemeinen mindestens etwa 250 Dalton und nicht mehr als etwa 5.000 Dalton, im allgemeinen nicht mehr als etwa 2.000 Dalton. Das Molekulargewicht des Fluorophors liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 250 bis 1.000 Dalton, wobei die Molekulargewichte der Akzeptor-Donor-Paare auf unterschiedlichen Markern, die gemeinsam verwendet werden, im allgemeinen um nicht mehr als etwa 20% differieren. Die Fluorophore können im Inneren der Kette, an den Enden oder einer an einem Ende und der andere an einer Innen position gebunden sein. Die Fluorophore können derart ausgewählt werden, daß sie aus einer ähnlichen chemischen Familie stammen, wie Cyaninfarbstoffe, Xanthene oder dergleichen. Somit kann man die Donoren aus der gleichen chemischen Familie, jedes Donor-Akzeptor-Paar aus der gleichen chemischen Familie oder jeden Akzeptor aus der gleichen Familie auswählen.
  • Die erfindungsgemäßen Marker finden insbesondere Anwendung bei verschiedenen Trennungsmethoden, wie der Elektrophorese, der Chromatographie oder dergleichen, bei denen man darauf abzielt, optimierte spektroskopische Eigenschaften, hohe Empfindlichkeit und einen vergleichbaren Einfluß der Marken auf das Wanderungsverhalten der zu analysierenden Komponenten vorliegen zu haben. Von besonderem Interesse ist die Elektrophorese, wie die Gelelektrophorese, die Kapillarelektrophorese etc. Beispiele für chromatographische Methoden sind die HPLC-Chromatographie, die Affinitätschromatographie, die Dünnschichtchromatographie, die Papierchromatographie und dergleichen.
  • Es hat sich gezeigt, daß der Abstand zwischen den beiden Fluorophoren die Beweglichkeit des Markers beeinflußt. Demzufolge kann man unterschiedliche Farbstoffpaare verwenden und durch Variation des Abstands zwischen den verschiedenen Farbstoffpaaren, innerhalb eines Bereichs, der noch eine gute Energieübertragung ermöglicht, eine im wesentlichen konstante Beweglichkeit oder Mobilität der Marken sicherstellen. Die Mobilität steht zu dem spezifischen Abstand nicht in Beziehung, so daß die Wirkung des Abstands auf die Mobilität eines besonderen Markers empirisch bestimmt werden muß. Jedoch kann man aufgrund der Flexibilität des Abstands der Fluorophore in den Markern durch Synthese einiger unterschiedlicher Marker mit unterschiedlichen Abständen und unterschiedlichen Farbstoffpaaren eine Familie von fluoreszierenden Markern schaffen, welche eine gemeinsame Anregung, eine starke und unterscheidbare Emission und im wesentlichen eine gemeinsame Mobilität besitzen. Im allgemeinen unterscheidet sich die Mobilität der Marker voneinander um nicht mehr als etwa 20%, vorzugsweise nicht mehr als etwa 10% und noch bevorzugter nicht mehr als etwa 5%, wenn sie für eine besondere Trennung eingesetzt werden. Die Mobilität kann im allgemeinen dadurch bestimmt werden, daß man die Trennung der Marker als solche durchführt oder die Trennung der Marker, die an ein gemeinsames Molekül gebunden sind, welches für die besondere Trennung wesentlich ist, beispielsweise ein Nucleinsäuremolekül der geeigneten Größe, wenn die angestrebte Anwendung die Sequenzierung ist.
  • Man kann eine große Vielzahl von fluoreszierenden Farbstoffen verwenden. Diese Farbstoffe fallen in verschiedenartige Klassen, wobei Kombinationen von Farbstoffen, die der gleichen Klasse oder unterschiedlichen Klassen angehören, eingesetzt werden können. Eingeschlossen hierin sind Farbstoffe, wie die Xanthenfarbstoffe, beispielsweise Fluoresceine und Rhodamine, Cumarine, beispielsweise Umbelliferon, Benzimidfarbstoffe, beispielsweise Hoechst 33258, Phenanthridinfarbstoffe, beispielsweise Texas Red, und Ethidiumfarbstoffe, Acridinfarbstoffe, Cyaninfarbstoffe, wie Thiazolorange, Thiazolblau, Cy 5 und Cyfr, Carbazolfarbstoffe, Phenoxazinfarbstoffe, Porphyrinfarbstoffe, Chinolinfarbstoffe oder dergleichen. Somit können die Farbstoffe im ultravioletten, sichtbaren oder infraroten Bereich absorbieren. In der Mehrzahl der Fälle besitzen die fluoreszierenden Moleküle ein Molekulargewicht von weniger als etwa 2 kDalton und im allgemeinen weniger als etwa 1,5 kDalton.
  • Der Energiedonor sollte einen starken molaren Absorptionskoeffizienten bei der angestrebten Anregungswellenlänge besitzen, der wünschenswerterweise größer als 104, vorzugsweise größer als etwa 105 cm–1 M–1 ist. Das Anregungsmaximum des Donors und das Emissionsmaximum des Akzeptors (Fluoreszor) sind um mindestens 15 nm oder mehr getrennt. Das spektrale Überlappungsintegral zwischen dem Emissionsspektrum des Donor-Chromophors und dem Absorptionsspektrum des Akzeptor-Chromophors und der Abstand zwichen den Chromophoren werden derart ausgewählt, daß die Wirksamkeit der Energieübertragung von dem Donor auf den Akzeptor sich von 20 bis 100% erstreckt.
  • Die Trennung von Donor und Akzeptor auf der Grundlage der Anzahl der Atome in der Kette variiert in Abhängigkeit von der Art des Grundgerüsts, davon, ob es starr oder flexibel ist oder ob es Ringstrukturen oder nicht-cyclische Strukturen oder dergleichen umfaßt. Im allgemeinen liegt die Anzahl der Atome in der Kette (wobei die Atome in den Ringstrukturen als die niedrigste Zahl von Atomen der Seite des Rings, der in die Kette eingeschlossen ist, gerechnet wird) unterhalb etwa 200, im allgemeinen unterhalb etwa 150 Atomen, vorzugsweise unterhalb etwa 100 Atomen, wobei die Art des Grundgerüsts die Wirksamkeit der Energieübertragung zwischen Donor und Akzeptor beeinflußt.
  • Wenngleich im allgemeinen Paare von Fluorophoren verwendet werden, können sich auch Situationen ergeben, bei denen bis zu vier unterschiedliche, im allgemeinen nicht mehr als drei unterschiedliche Fluorophore, die an das gleiche Grundgerüst gebunden sind, Anwendung finden. Durch die Verwendung mehrerer Fluorophore kann man die Stokes-Verschiebung in starkem Maße vergrößern, so daß man die Anregung im sichtbaren Wellenlängenbereich bewirken und die Emission im infraroten Wellenlängenbereich im allgemeinen unterhalb etwa 1.000 nm und allgemeiner unterhalb etwa 900 nm erreichen kann. Der Nachweis von Licht im infraroten Wellenlängenbereich besitzt viele Vorteile, da es keine Beeinflussung durch sich aus dem anregenden Licht ergebendem Raman- und Rayleigh-Licht unterliegt. Um die Mobilität konstant zu halten, kann man die gleiche Anzahl von Fluorophoren auf den Markern verwenden, die eine Vielzahl des gleichen Fluorophors aufweisen, welche der Anzahl der Fluorophore auf Markern mit unterschiedlichen Fluorophoren zur Erzeugung einer großen Stokes-Verschiebung entspricht.
  • Die vorliegende Erfindung findet insbesondere Anwendung bei Nucleinsäureketten, welche Nucleinsäureketten als Primer beim Sequenzieren, der Polymerasekettenreaktion, insbesondere für das Sizing, oder andere Systeme, bei denen Primer für die Nucleinsäureverlängerung verwendet werden und angestrebt wird, zwischen den verschiedenen Komponenten der Mischung in Abhängigkeit von den besonderen Markern zu unterscheiden. Beispielsweise kann man beim Sequenzieren universale Primer verwenden, wobei für jedes der bei der Ausdehnung während des Sequenzierens verwendeten verschiedenen Dideoxynucleoside ein unterschiedliches Paar von Fluorophoren eingesetzt wird.
  • Es ist eine große Vielzahl von Nucleosiden erhältlich, welche funktionalisiert sind und bei der Synthese eines Polynucleotids verwendet werden können. Durch Synthese der vorliegenden Nucleinsäure-Marker kann man die spezifischen Stellen definieren, an denen die Fluorophore vorhanden sind. Man kann im Handel erhältliche Syntheseeinrichtungen unter Anwendung üblicher Verfahrensweisen anwenden, so daß man irgendeine Sequenz erhalten kann, bei der das Paar der Fluorophore den geeigneten Abstand aufweist.
  • Wenn unterschiedliche Primer bei der PCR verwendet werden, kann jeder der Primer erfindungsgemäß markiert werden, so daß es ohne weiteres möglich ist, die Anwesenheit der Target-Sequenz, die für jeden der verschiedenen Primer komplementär ist, nachzuweisen. Weitere Anwendungen ergeben sich bei der Identifizierung von Isozymen unter Verwendung von spezifischen Antikörpern, bei der Identifizierung von Lectinen unter Verwendung unterschiedlicher Polysaccharide und dergleichen.
  • Wie bereits angegeben worden ist, finden die in Rede stehenden Marker insbesondere Anwendung beim Sequenzieren. Beispielsweise kann man universale Primer herstellen, wobei der Primer irgendeiner der universalen Primer ist, der durch Binden der beiden Fluorophore an den Primer modifiziert worden ist. So sind verschiedene handelsübliche Primer erhältlich, wie Primer aus pUC/M13, Rgt10, Rgt11 und dergleichen. Siehe auch Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., CSHL (1989), Sektion 13. Die DNA-Sequenzen werden in einem geeigneten Vektor geklont, welcher eine Primer-Sequenz aufweist, die an die zu sequenzierende Sequenz gebunden ist. Es werden unterschiedliche 2',3'-ddNTP verwendet, so daß die Termination an unterschiedlichen Stellen erfolgt in Abhängigkeit von dem besonderen ddNTP, welches in der Kettenverlängerung vorhanden ist. Durch Verwendung der in Rede stehenden Primer wird jedes ddNTP mit einem bestimmten Marker assoziiert. Nach der Extension mit dem Klenow-Fragment können die sich ergebenden Fragmente dann in einer einzigen Bahn durch Elektrophorese oder in einer einzigen Kapillare durch Elektrophorese getrennt werden, wobei man das endständige Nucleotid durch die Fluoreszenz des Markers nachweisen kann.
  • Man kann die in Rede stehenden Marker auch mit Immunkomplexen verwenden, bei denen die Liganden oder Rezeptoren, beispielsweise Antikörper, markiert werden können, um die verschiedenen Komplexe oder Mitglieder der Komplexe nachzuweisen. Wenn die Liganden bei der Trennungsmethode die gleiche Wanderungsfähigkeit besitzen, kann man zur Bestimmung der Anwesenheit eines oder mehrerer solcher Liganden die verschiedenen Antikörper mit den unterschiedlichen Markern, die bei unterschiedlichen Wellenlängen fluoreszieren, markieren, so daß sie auch dann nachweisbar sind, wenn sich eine Überlappung der Zusammensetzungen bei der Trennung ergibt.
  • Es werden Reagenssätze oder Kits geschaffen, welche Kombinationen von Markern, im allgemeinen mindestens zwei, umfassen. Jeder der Marker besitzt das Akzeptor-Donor-Paar, im allgemeinen mit vergleichbaren Grundgerüsten, wobei die Marker längs des Grundgerüsts in der Weise getrennt sind, daß sich eine vergleichbare Mobilität bei der anzuwendenden Trennungsmethode ergibt: Jeder der Marker in einer Gruppe, die gemeinsam verwendet werden sollen, absorbiert etwa die gleiche Wellenlänge und emittiert bei unterschiedlichen Wellenlängen. Jeder der Marker in der Gruppe besitzt etwa die gleiche Wirkung auf die Mobilität bei der Trennungsmethode als Ergebnis einer Variation der Anordnung der unterschiedlichen Fluorophore längs des Grundgerüsts.
  • Die Reagenssätze umfassen im allgemeinen bis zu etwa sechs, allgemein bis zu etwa vier unterschiedliche Marker, die zueinander passen, können jedoch auch zwei oder mehr Sätze von aufeinander angepaßten Markern mit zwei bis sechs unterschiedlichen Markern umfassen.
  • Von besonderem Interesse sind Marker mit einem Nucleinsäure-Grundgerüst, wobei die Marker im allgemeinen mindestens etwa 10 Nucleotide und nicht mehr als etwa 50 Nucleotide, im allgemeinen nicht mehr als etwa 30 Nucleotide aufweisen. Die Marker können auf den Nucleotiden vorliegen, welche zu der komplementären Sequenz hybridisieren, oder können von diesen Nucleotiden getrennt vorliegen. Die Fluorophore sind im allgemeinen über eine geeignete Verbindungskette von etwa 2 bis 20, allgemein 4 bis 16 Atomen in der Kette an das Nucleotid gebunden. Die Kette kann eine Vielzahl von funktionellen Gruppen aufweisen, insbesondere Non-oxocarbonylgruppen, insbesondere Ester- und Amid-, Amino-, Oxygruppen und dergleichen. Die Kette kann aliphatisch, alicyclisch, aromatisch, heterocyclisch oder eine Kombination davon sein und umfaßt im allgemeinen Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff-, Schwefelatome oder dergleichen in der Kette.
  • Die gesamte Nucleinsäuresequenz kann zu der 5'-Primersequenz komplementär sein oder kann lediglich zu dem 3'-Abschnitt der Sequenz komplementär sein. Im allgemeinen sind mindestens etwa 4 Nucleotide vorhanden, allgemeiner mindestens etwa 5 Nucleotide, welche bezüglich der zu kopierenden Sequenz komplementär sind. Die Primer werden mit der zu kopierenden Sequenz in dem geeigneten Plasmid kombiniert, welches die Primersequenz am 3'-Ende des zu kopierenden Strangs aufweist und zugesetztes dNTP mit einer geringen Menge des geeigneten ddntp. Nach der Extension kann die DNA isoliert und zur Trennung auf ein Gel oder eine Kapillare übertragen werden.
  • Die zu verwendenden Reagenssätze oder Kits umfassen mindestens zwei der in Rede stehenden Marker, welche derart aufeinander angepaßt sind, daß sie im wesentlichen die gleiche Absorption des Donor-Moleküls, unterschiedliche Emissionsspektren und im wesentlichen die gleiche Mobilität besitzen. Im allgemeinen beträgt bei einsträngigen Nucleinsäuren der Abstand zwischen den Fluorophoren etwa 1 bis 15, allgemeiner 1 bis 12 und vorzugsweise etwa 2 bis 10 Nucleoside.
  • Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung, ohne sie jedoch einzuschränken.
    •
  • Auslegung und Synthese von mit Energie-Übertraguns-Fluoreszenzfarbstoffen markierten Oligonucleotid-Markern für die Genanalyse
  • Man synthetisiert Deoxyoligonucleotide (mit einer Länge von 12 Basen) mit der Sequenz 5'-GTTTTCCCAGTC-3', welche aus dem universalen Primer M13 ausgewählt ist, mit Donor-Akzeptor-Fluorophor-Paaren, die mit unterschiedlichen Abständen voneinander getrennt sind. Insbesondere enthält das 12-mer eine modifizierte Base, welche durch die Verwendung von 5'-Dimethoxytrityl-5-[N-(trifluoracetylaminohexyl)-3-acrylimido)-2'-deoxyuridin, 3'-[(2-Cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidit (Amino-Modifizierungsmittel C6 dT) (Struktur 1) eingeführt worden ist, welche in der C-5-Position eine Verbindungskette (Linker) mit primärem Amin aufweist.
  • Figure 00150001
  • Der Donor-Farbstoff wird an das 5'-Ende des Oligomers gebunden und der Akzeptor-Farbstoff wird an die primäre Aminogruppe an dem modifizierten T gebunden. Die Abstände zwischen Donor und Akzeptor werden durch Variieren der Position des modifizierten T in dem Oligomer geändert. Die Primer werden als D-N-A bezeichnet, worin D für den Donor, A für den Akzeptor und N für die Anzahl der Basen zwischen D und A stehen. In sämtlichen hergestellten Primern handelt es sich bei D um den Farbstoff FAM, ein Fluorescein-Derivat, der Firma Applied Biosystems Inc. ("ABI"), während als A die Farbstoffe TAM oder ROX der Firma ABI eingesetzt werden, welches beide Rhodamin-Derivate sind. Als repräsentatives Beispiel ist im folgenden die Struktur von FAM-3-TAM dargestellt (Struktur 2).
  • Figure 00150002
  • Die Vorteile des hierin beschriebenen Ansatzes der Energieübertragung sind darin zu sehen, daß (1) mit einer Anregung bei 488 nm eine große Stokes-Verschiebung und wesentlich stärkere Fluoreszenzsignale erzeugt werden können und daß (2) die Mobilität der Primer durch Variation der Abstände zwischen dem Do nor und dem Akzeptor derart eingestellt werden können, daß die gleiche Mobilität erreicht wird. Das sichtbare Spektrum von FAM-3-TAM besitzt sowohl die Absorption von FAM (495 nm) und von TAM (560 nm), wobei jedoch mit einer Anregung bei 488 nm annähernd die gesamte Emission von T ausgeht mit einem Maximum bei 579 nm (1). Dies verdeutlicht die wirksame Fluoreszenzenergieübertragung von FAM auf TAM. Dies kann auch dadurch verdeutlicht werden, daß man den Primer durch eine Kapillarelektrophorese (CE)-Säule führt und den Nachweis in roten und grünen Kanälen bewirkt. Mit einem FAM- und TAM-markierten Primer tritt annähernd die gesamte Emission in dem roten Kanal (590 nm) auf (2), was darauf hinweist, daß die Energie von dem Donor FAM annähernd vollständig auf den Akzeptor TAM übertragen worden ist, wodurch sich eine Stokes-Verschiebung von 91 nm ergibt. Die Beobachtung eines einzigen Peaks weist darauf hin, daß der Primer rein ist. Das gleiche Ergebnis ergibt sich mit FAM-4-ROX, welcher eine noch größere Stokes-Verschiebung von 114 nm erzeugt (3 und 4). Man beobachtet eine Verstärkung der Fluoreszenzsignale bei den Energieübertragungs-Primern im Vergleich zu Primern, die mit einem einzigen Farbstoff markiert worden sind, wobei in diesem Fall ein ABI ROX-Primer in der gleichen Konzentration wie FAM-4-ROX (durch UV gemessen) in die gleiche Kapillare injiziert worden ist. Es ist ersichtlich, daß das sich ergebende Fluoreszenzsignal von FAM-4-ROX mehr als 10-mal größer ist als das des ROX-Primers (5).
  • Für die erfolgreiche Anwendung der mit Donor-Akzeptor-Fluorophoren markierten Primer beim DNA-Sequenzieren ist es wesentlich, daß die Primer die gleiche Mobilitäts-Verschiebung der DNA-Fragmente ergeben und unterschiedliche Fluoreszenzsignale zeigen. Es hat sich gezeigt, daß die Mobilität der Primer von dem Abstand zwischen Donor und Akzeptor abhängt (6). FAM-4-ROX, FAM-3-ROX und FAM-10-ROX wurden auf einer Kapillare getrennt und in den roten und grünen Kanälen nachgewiesen. Im Fall von FAM-10-ROX verringert der vergrößerte Abstand zwischen den Farbstoffen die Menge der Energieübertragung, was zu annähernd gleichen Signalen in beiden Kanälen führt. In dem Maß, in dem der trennende Abstand verringert wird, nimmt das Ausmaß der Energieübertragung zu, was durch das verringerte relative grüne Signal verdeutlicht wird. FAM-3-ROX und FAM-4-ROX zeigen jeweils eine ausgezeichnete Energieübertragung, jedoch sind ihre Mobilitäten deutlich verschieden, was die Möglichkeit eröffnet, die Mobilitätsverschiebung durch Variieren des Abstands gezielt einzustellen. Um eine genaue Anpassung der Mobilität zweier Primer mit unterschiedlichen Emis sionsspektren zu erreichen, wurden auch FAM-3-FAM, FAM-4-FAM und FAM-10-FAM hergestellt. In einer Bibliothek von hergestellten Primern (FAM-N-FAM, FAM-N-TAM, FAM-N-ROX) hat sich gezeigt, daß A-Endgruppen aufweisende sequenzierende Fragmente, die mit FAM-10-FAM und FAM-3-ROX unter Verwendung von Sequenase 2 hergestellt worden sind, sehr ähnliche Mobilitätsverschiebungen zeigen (7), was ihr Potential für die DNA-Sequenzanalyse verdeutlicht. Die Emissionen von FAM-10-FAM bzw. FAM-3-ROX liegen bei 525 nm bzw. 605 nm. Die Raman-Signale von Wasser sind bei diesen beiden Wellenlängen zu vernachlässigen. Somit ergibt sich ein dramatisch gesteigertes Signal/Untergrund-Verhältnis.
  • I. Herstellung von 12-mer Oligonucleotiden, welche ein modifiziertes T und einen FAM-Marker an der 5'-Stellung besitzen
  • Die folgenden drei Primer wurden mit einer DNA-Synthetisiereinrichtung Modell 394 der Firma ABI im 0,2 μMol-Maßstab hergestellt:
    Figure 00170001
    Die modifizierte Base T*, die eine Amino-Verbindungskette aufweist, wird unter Verwendung des Amino-Modifizierungsmittels C6 dT Phosphoramidite (Glen Research) an der definierten Position eingeführt und FAM wird unter Verwendung von 6-FAM-Amidite (ABI) in der letzten Stufe der Synthese eingeführt. Nachdem die Basensequenzen vollständig sind, werden die Oligonucleotide mit 1 ml konzentrierter NH4OH von dem festen Träger (CPG) abgespalten. Die Aminoschutzgruppen an den Basen (A, G, C und T*) werden durch Erhitzen der NH4OH-Lösung während 4 Stunden auf 55°C entfernt. Die Analyse durch Kapillarelektrophorese zeigt, daß die Oligomere zu etwa 80% rein waren und sie wurden direkt in dem nächsten Farbstoff-Kupplungsschritt eingesetzt.
  • II. Befestigung des zweiten Fluoreszenzfarbstoffs an die Amino-Verbindungskette der Oligomeren 1, 2 und 3
  • Als repräsentatives Beispiel ist das Reaktionsschema zur Kupplung des zweiten Farbstoffs (TAM) an das Oligomer im folgenden dargestellt:
    Figure 00180001
    Die mit FAM markierten Oligonucleotide (1, 2 und 3) werden über Nacht bei Raumtemperatur in 40 μl 0,5 mol/l eines Na2CO3/NaHCO3-Puffers mit dem etwa 150-fachen Überschuß von entweder TAM-NHS-Ester, ROX-NHS-Ester oder FAM-NHS-Ester in 12 μl DMSO inkubiert. Der nicht umgesetzte Farbstoff wird durch Größenausschluß-Chromatographie auf einer Sephadex G-25-Säule entfernt. Die mit den beiden Farbstoffen markierten Oligonucleotide wurden dann durch 6 mol/l Harnstoff-TBE, 20% Acrylamidgel-Elektrophorese (40 cm × 0,8 cm) gereinigt. Die reinen Primer wurden von dem Gel gewonnen und mit einer Oligonucleotid-Purification Cartridge entsalzt. Die Kapillargelelektrophorese zeigt, daß die Reinheit der Primer >99% beträgt.
  • III. Herstellung von DNA-Sequenzierungsfragmenten mit FAM-3-ROX und FAM-10-FAM
  • Unter Verwendung von Sequenase 2.0 (USB) wurden M 13mp 18 DNA-Sequenzierungsfragmente mit A-Endgruppen hergestellt. Es wurden zwei Bindungslösungen in 600 μl-Fläschchen hergestellt: (1) 10 μl Reaktionspuffer, 40 μl einsträngiger M 13mp 18-DNA und 6 μl FAM-3-ROX; (2) 6 μl Reaktionspuffer, 20 μl einsträngiger M 13mp 18-DNA und 3 μl FAM-10-FAM. Jedes Fläschchen wurde während 5 Minuten auf 65°C erhitzt und dann während 30 Minuten auf Raumtemperatur ab kühlen gelassen und anschließend während 20 Minuten auf Eis gestellt, um sicherzustellen, daß die kürzeren Primer vollständig zu der Matrize hybridisiert worden sind. Dann gibt man zu jedem auf Eis stehenden Fläschchen 3 μl DTT, 20 μl der ddA-Terminationsmischung und 12 μl verdünnte Sequenase 2.0. Man inkubiert die Reaktionsmischungen anfänglich während 20 Minuten bei 20°C und dann während weiterer 20 Minuten bei 37°C. Man unterbricht die Reaktion durch Zugabe von 50 μl 50 mmol/l EDTA, 40 μl 4 mol/l NH4OH und 300 μl 95% EtOH. Man vermischt die Lösungen gut und stellt während 20 Minuten auf Eis. Man entsalzt die Fragmente zweimal mit 75%-iger kalter EtOH, trocknet im Vakuum und löst in 4 μl 95%-igem (V/V) Formamid und 50 mmol/l EDTA. Man erhitzt die Probe während 3 Minuten zur Denaturierung der DNA und stellt dann bis zur Injektion der Probe in das Kapillarelektrophoresegerät auf Eis. Die elektrokinetische Injektion wird während 30 Sekunden bei 10 kV durchgeführt.
  • Aus den obigen Ergebnissen ist ersichtlich, daß man verwandte Zusammensetzungen, beispielsweise mit zwei Fluorophoren funktionalisierte Polynucleotide derart einstellen kann, daß sich unterschiedliche Emissionswellenlängen bei hohen Emissionsquantenausbeuten ergeben bei im wesentlichen dergleichen Anregungs-Lichtabsorption und Mobilität. In dieser Weise können Mischungen von Komponenten unabhängig voneinander analysiert werden, wenn die unterschiedlichen Komponenten mit Markern, welche unterschiedliche Fluoreszenz-Emissionsbanden aufweisen, unterschiedlich markiert werden können. Weiterhin können die Zusammensetzungen ohne weiteres hergestellt und für eine Vielzahl von Anwendungszwecken eingesetzt werden und zeigen eine gute Stabilität und verbesserte Fluoreszenzeigenschaften.
  • Sämtliche in diese Beschreibung genannten Veröffentlichungen und Patentanmeldungen sind hierin so als Referenz eingefügt, als wenn jede einzelne Veröffentlichung oder Patentanmeldung spezifisch und individuell als Referenz anzufügen angegeben worden wäre.
  • Wenngleich die obige Erfindung aus Gründen der Klarheit und des Verständnisses im Detail durch Erläuterung und mit Beispielen beschrieben worden ist, ist für den Fachmann ersichtlich, daß im Lichte der Lehre der vorliegenden Erfindung bestimmte Änderungen und Modifizierungen gemacht werden können, ohne daß der Geist oder der Umfang der beigefügten Ansprüche verlassen wird.

Claims (49)

  1. Kombination aus verschiedenen fluoreszierenden Markern, wobei jeder Marker ein an verschiedene Atome einer Kette von Atomen kovalent gebundenes fluoreszierendes Donor-Akzeptor-Paar mit wirksamer Energieübertragung von dem Donor zu dem Akzeptor aufweist und wobei jeder der Marker eine einzige Molekülart darstellt und kovalent an eine nachzuweisende Komponente gebunden werden kann und im. wesentlichen bei der gleichen Wellenlänge absorbiert und bei einer unterschiedlichen Wellenlänge emittiert.
  2. Kombination nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Donor-Fluorophore gleichartig oder verschieden sind.
  3. Kombination nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß jeder der Donor-Fluorophore Licht im Wellenlängenbereich von 350 bis 800 nm absorbiert und jeder der Akzeptoren Licht im Wellenlängenbereich von 450 bis 1000 nm emittiert.
  4. Kombination nach den Ansprüchen 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Molekulargewicht des an die Kette gebundenen fluoreszierenden Donor-Akzeptor-Paars weniger als 5000 Dalton beträgt.
  5. Kombination nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Akzeptor-Donor-Paare Xanthen-Farbstoffe sind.
  6. Kombination nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Xanthen-Farbstoffe Farbstoffe aus der Fluorescein- und Rhodamin-Farbstoffklasse umfassen.
  7. Kombination nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kette eine Polymerkette ist.
  8. Kombination nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerkette eine Nukleinsäurekette ist.
  9. Kombination nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kette ein difunktionelles Molekül ist.
  10. Kombination nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das difunktionelle Molekül ein Halogenamin ist.
  11. Kombination nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kette weniger als 100 Atome aufweist.
  12. Kombination nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kette ein Halogenamin ist.
  13. Kombination gemäß den Ansprüchen 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß einer oder mehrere der fluoreszierenden Marker zusätzlich einen dritten Fluorophor aufweist, so daß die Energie von einem Molekül zu dem nächsten mit einer größeren Wellenlänge übertragen wird und die Anregung des ersten Fluorophors die Fluoreszenz des dritten Fluorophors verursacht.
  14. Verfahren zur Identifizierung und zum Nachweis von Komponenten in einer Vielkomponenten-Mischung unter Verwendung unterschiedlicher fluoreszierender Marker zum. Nachweis von mindestens zwei interessierenden Komponenten, dadurch gekennzeichnet, daß (i) jeder der Marker ein an unterschiedliche Atome einer Kette von Atomen kovalent gebundenes fluoreszierendes Donor-Akzeptor-Paar mit wirksamer Energieübertragung von dem Donor zu dem Akzeptor aufweist; und (ii) jeder der Marker eine einzige Molekülart darstellt und im wesentlichen bei der gleichen Wellenlänge absorbiert und bei einer unterschiedlichen Wellenlänge emittiert; welches Verfahren darin besteht: die unterschiedlichen Marker kovalent an verschiedene Komponenten der Vielkomponenten-Mischung zu binden und jede der markierten Komponenten nachzuweisen durch Bestrahlen mit Licht bei der Absorptions-Wellenlänge des Donors und Nachweis der Fluoreszenz jedes der Marker. 15: Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Donor-Fluorophore gleichartig oder verschieden sind.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß jeder der Donoren Licht im Wellenlängenbereich von 350 bis 800 nm absorbiert und jeder der Akzeptoren im Wellenlängenbereich von 450 bis 1000 nm emittiert.
  16. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Akzeptor-Donor-Paar Xanthen-Farbstoffe sind.
  17. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Xanthen-Farbstoffe Farbstoffe aus der Fluorescein- und Rhodamin-Farbstoffklasse umfassen.
  18. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Marker Oligonucleotide sind.
  19. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren zum Sequenzieren von DNA verwendet wird.
  20. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Vielkomponenten-Mischung eine DNA-Didesoxy-Sequenzierungs-Mischung ist.
  21. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Kette ein Polymerkette ist.
  22. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerkette eine Nucleinsäurekette ist.
  23. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerkette keine Nucleinsäurekette ist.
  24. Verfahren zur Trennung von Bestandteilen einer Vielkomponenten-Mischung, in der jede der unterschiedlichen interessierenden Komponenten mit unterschiedlichen Markern markiert ist, welche Marker dadurch gekennzeichnet sind, daß: (i) jeder Marker ein an verschiedene Atome einer Oligonucleotid-Kette kovalent gebundenes fluoreszierendes Donor-Akzeptor-Paar mit wirksamer Energieübertragung von dem Donor zu dem Akzeptor aufweist; (ii) jeder der Marker eine einzige Molekülart darstellt und im wesentlichen bei der gleichen Wellenlänge absorbiert und bei einer unterschiedlichen Wellenlänge emittiert; und (iii) jeder der unterschiedlichen Marker im wesentlichen die gleiche Mobilität bei der Trennung aufweist als Ergebnis der Variation des Abstands des Do nor-Akzeptor-Paares längs der Oligonucleotid-Kette; welches Verfahren darin besteht: die unterschiedlichen Marker kovalent an verschiedene Komponenten der Vielkomponenten-Mischung zu binden, die Komponenten in einzelne Fraktionen zu trennen und jede der markierten Komponenten nachzuweisen durch Bestrahlen mit Licht bei der Absorptions-Wellenlänge des Donors und Nachweis der Fluoreszenz jedes der Marker.
  25. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennung durch Elektrophorese erfolgt.
  26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Donor-Fluorophore gleichartig oder verschieden sind.
  27. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß der Donor Licht im Wellenlängenbereich von 350 bis 800 nm absorbiert und der Akzeptor Licht im Wellenlängenbereich von 450 bis 1000 nm emittiert.
  28. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß das Akzeptor-Donor-Paar Xanthen-Farbstoffe sind.
  29. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß die Xanthen-Farbstoffe Farbstoffe aus der Fluorescein- und Rhodamin-Farbstoffklasse umfassen.
  30. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren zum Sequenzieren von DNA verwendet wird.
  31. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Vielkomponenten-Mischung eine DNA-Didesoxy-Sequenzierungs-Mischung ist.
  32. Verfahren nach Anspruch 14 oder Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß das Licht eine einzige Wellenlänge aufweist.
  33. Verfahren zum Sequenzieren einer Nucleinsäuresequenz unter Verwendung von Primern durch Incubieren einer einsträngigen Nucleinsäure mit Didesoxynucleotiden zur Terminierung der durch das Incubieren an ein beson deres Nucleotid gebildeten Kette,. welches Verfahren darin besteht: (i) Incubieren der Nucleinsäuresequenz mit einer DNA-Polymerase in Gegenwart des Primers, von dNTP und eines andersartigen Didesoxynucleotids in unterschiedlichen Reaktionsgefäßen zur Erzeugung von einsträngigen DNA-Fragmenten; und (ii) Trennen der einsträngigen DNA-Fragmente aus der erhaltenen Mischung und Bestimmen der Sequenz mit Hilfe der auf dem Gel vorhandenen Banden; dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenzierungs-Fragmente Primer aufweisen, welche ein kovalent an verschiedene Atome einer Kette von Atomen gebundenes fluoreszierendes Donor-Akzeptor-Paar mit wirksamer Energieübertragung von dem Donor zu dem Akzeptor aufweisen, wobei jeder der Primer eine einzige Molekülart darstellt und jeder der Primer bei im wesentlichen der gleichen Wellenlänge absorbiert und bei einer unterschiedlichen Wellenlänge emittiert und jeder der Primer im wesentlichen die gleiche Mobilität bei der Trennung zeigt, was sich durch Variation des Abstands und der Fluorophore des Donor-Akzeptor-Paars längs der Nucleinsäurekette ergibt.
  34. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß eines der Mitglieder des fluoreszierenden Donor-Akzeptor-Paars an das 5'-Ende des Primers gebunden ist.
  35. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß vier Primer mit unterschiedlichen Donor-Akzeptor-Paaren eingesetzt werden.
  36. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß das fluoreszierende Donor-Akzeptor-Paar durch nicht mehr als 30 Nucleotide getrennt ist.
  37. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei fluoreszierende Donor-Akzeptor-Paare Xanthen-Farbstoffe sind.
  38. Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß die Xanthen-Farbstoffe Farbstoffe aus der Fluorescein- und Rhodamin-Farbstoffklasse umfassen.
  39. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennung durch Elektrophorese erfolgt.
  40. Verfahren zum Sequenzieren einer Nucleinsäure unter Verwendung von Primern zum Incubieren einer einsträngigen Nucleinsäure und unter Verwendung von mindestens zwei unterschiedlich markierten Didesoxynucleotiden zur Terminierung der durch das Incubieren an ein besonderes Nucleotid gebildeten Kette, welche Methode darin besteht: (i) Incubieren der Nucleinsäure mit einer DNA-Polymerase in Gegenwart eines Primers, von dNTP und eines der mindestens zwei unterschiedlich markierten Didesoxynucleotide in unterschiedlichen Reaktionsgefäßen; (ii) Trennen der erhaltenen Mischung aus einsträngigen DNA-Sequenzierungs-Fragmenten und Bestimmen der Sequenz mit Hilfe der auf dem Gel vorhandenen Banden; dadurch gekennzeichnet, daß die unterschiedlich markierten Didesoxynucleotiden kovalent an Marker gebunden sind, die ein kovalent an verschiedene Atome einer Kette von Atomen gebundenes fluoreszierendes Donor-Akzeptor-Paar mit wirksamer Energieübertragung von dem Donor zu dem Akzeptor aufweisen, worin jeder der Marker bei im wesentlichen der gleichen Wellenlänge absorbiert und bei einer unterschiedlichen Wellenlänge emittiert.
  41. Verfahren nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, daß vier markierte Didesoxynucleotide mit unterschiedlichem Akzeptor-Donor-Paaren eingesetzt werden.
  42. Verfahren nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, daß die Kette ein difunktionelles Molekül ist.
  43. Verfahren nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, daß das difunktionelle Molekül ein Halogenamin ist.
  44. Verfahren nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, daß die Kette eine Verbindungskette aufweist.
  45. Verfahren nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungskette ein Halogenamin ist.
  46. Verfahren nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet; daß mindestens zwei fluoreszierende Donor-Akzeptor-Paare Xanthen-Farbstoffe sind.
  47. Verfahren nach Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, daß die Xanthen-Farbstoffe Farbstoffe aus der Fluorescein- und Rhodamin-Farbstoffklasse umfassen.
  48. Verfahren nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennung durch Elektrophorese erfolgt.
  49. Reagenzsatz zur Verwendung bei einem der Verfahren gemäß den Ansprüchen 14 bis 49, umfassend eine Kombination von unterschiedlichen fluoreszierenden Markern nach einem der Ansprüche 1 bis 13.
DE19581489T 1994-02-01 1995-01-30 Mit Energieübertragungs-gekuppelten Farbstoffen markierte Sonden Expired - Lifetime DE19581489B4 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/189,924 US5654419A (en) 1994-02-01 1994-02-01 Fluorescent labels and their use in separations
US189924 1994-02-01
PCT/US1995/001205 WO1995021266A1 (en) 1994-02-01 1995-01-30 Probes labelled with energy transfer coupled dyes

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE19581489T1 DE19581489T1 (de) 1997-01-02
DE19581489B4 true DE19581489B4 (de) 2004-07-15

Family

ID=22699330

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE29521620U Expired - Lifetime DE29521620U1 (de) 1994-02-01 1995-01-30 Fluoreszierende Marker und diese enthaltender Reagenzsatz
DE69530286T Expired - Lifetime DE69530286T2 (de) 1994-02-01 1995-01-30 Mit energieübertragungsvermittelnden verbindungen markierte proben
DE19581489T Expired - Lifetime DE19581489B4 (de) 1994-02-01 1995-01-30 Mit Energieübertragungs-gekuppelten Farbstoffen markierte Sonden

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE29521620U Expired - Lifetime DE29521620U1 (de) 1994-02-01 1995-01-30 Fluoreszierende Marker und diese enthaltender Reagenzsatz
DE69530286T Expired - Lifetime DE69530286T2 (de) 1994-02-01 1995-01-30 Mit energieübertragungsvermittelnden verbindungen markierte proben

Country Status (9)

Country Link
US (3) US5654419A (de)
EP (1) EP0743987B1 (de)
JP (2) JP3895369B2 (de)
AT (1) ATE236994T1 (de)
AU (1) AU692230B2 (de)
CA (1) CA2182516C (de)
DE (3) DE29521620U1 (de)
ES (1) ES2197193T3 (de)
WO (1) WO1995021266A1 (de)

Families Citing this family (281)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5935522A (en) * 1990-06-04 1999-08-10 University Of Utah Research Foundation On-line DNA analysis system with rapid thermal cycling
US7273749B1 (en) 1990-06-04 2007-09-25 University Of Utah Research Foundation Container for carrying out and monitoring biological processes
US7081226B1 (en) 1996-06-04 2006-07-25 University Of Utah Research Foundation System and method for fluorescence monitoring
US6238931B1 (en) * 1993-09-24 2001-05-29 Biosite Diagnostics, Inc. Fluorescence energy transfer in particles
US5538848A (en) 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
US6821727B1 (en) 1993-11-15 2004-11-23 Applera Corporation Hybridization assay using self-quenching fluorescence probe
US6028190A (en) * 1994-02-01 2000-02-22 The Regents Of The University Of California Probes labeled with energy transfer coupled dyes
US5654419A (en) * 1994-02-01 1997-08-05 The Regents Of The University Of California Fluorescent labels and their use in separations
US6426190B1 (en) 1995-04-20 2002-07-30 Carnegie Mellon University Difference detection methods using matched multiple dyes
US6127134A (en) * 1995-04-20 2000-10-03 Carnegie Mellon University Difference gel electrophoresis using matched multiple dyes
US6008373A (en) 1995-06-07 1999-12-28 Carnegie Mellon University Fluorescent labeling complexes with large stokes shift formed by coupling together cyanine and other fluorochromes capable of resonance energy transfer
US5861287A (en) * 1995-06-23 1999-01-19 Baylor College Of Medicine Alternative dye-labeled primers for automated DNA sequencing
US5994063A (en) * 1995-06-23 1999-11-30 Metzker; Michael L. Substituted 4,4-difluoro-4-bora-3A,4A-diaza-s-indacene compounds for homogenous amplification/detection assays
US5728528A (en) * 1995-09-20 1998-03-17 The Regents Of The University Of California Universal spacer/energy transfer dyes
US6214555B1 (en) * 1996-05-01 2001-04-10 Visible Genetics Inc. Method compositions and kit for detection
US7388092B2 (en) 1996-05-03 2008-06-17 Applera Corporation Oligonucleotides and analogs labeled with energy transfer dyes
US5863727A (en) * 1996-05-03 1999-01-26 The Perkin-Elmer Corporation Energy transfer dyes with enhanced fluorescence
US5800996A (en) * 1996-05-03 1998-09-01 The Perkin Elmer Corporation Energy transfer dyes with enchanced fluorescence
US5945526A (en) * 1996-05-03 1999-08-31 Perkin-Elmer Corporation Energy transfer dyes with enhanced fluorescence
US7825237B2 (en) * 1996-05-03 2010-11-02 Applied Biosystems, Llc Oligonucleotides and analogs labeled with energy transfer dyes
JP4281877B2 (ja) * 1996-06-04 2009-06-17 ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデーション 生物学的プロセスを実行し且つモニタリングするためのシステムと方法
PT912766E (pt) 1996-06-04 2009-07-16 Univ Utah Res Found Monitorização da hibridização durante a pcr
US5736333A (en) * 1996-06-04 1998-04-07 The Perkin-Elmer Corporation Passive internal references for the detection of nucleic acid amplification products
US6117635A (en) * 1996-07-16 2000-09-12 Intergen Company Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon
US5853992A (en) * 1996-10-04 1998-12-29 The Regents Of The University Of California Cyanine dyes with high-absorbance cross section as donor chromophores in energy transfer labels
US5840879A (en) * 1996-12-06 1998-11-24 Wang; Edge R. Reagents and solid supports for improved synthesis and labeling of polynucleotides
US5804386A (en) * 1997-01-15 1998-09-08 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Sets of labeled energy transfer fluorescent primers and their use in multi component analysis
JP3935509B2 (ja) 1997-02-12 2007-06-27 ワイ． チャン，ユージーン ポリマー分析のための方法および製品
US6403311B1 (en) 1997-02-12 2002-06-11 Us Genomics Methods of analyzing polymers using ordered label strategies
AU9476298A (en) * 1997-09-11 1999-03-29 Seq, Ltd. Method for dna sequencing analysis
US7745142B2 (en) * 1997-09-15 2010-06-29 Molecular Devices Corporation Molecular modification assays
US20050227294A1 (en) * 1997-09-15 2005-10-13 Molecular Devices Corporation Molecular modification assays involving lipids
US7632651B2 (en) * 1997-09-15 2009-12-15 Mds Analytical Technologies (Us) Inc. Molecular modification assays
JPH1189598A (ja) * 1997-09-18 1999-04-06 Hitachi Software Eng Co Ltd 蛍光標識プローブ及びハイブリダイゼーション検出方法
US6008379A (en) * 1997-10-01 1999-12-28 The Perkin-Elmer Corporation Aromatic-substituted xanthene dyes
US6485901B1 (en) 1997-10-27 2002-11-26 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions pertaining to linear beacons
AU1366299A (en) * 1997-10-27 1999-05-17 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions pertaining to pna molecular beacons
US5936087A (en) 1997-11-25 1999-08-10 The Perkin-Elmer Corporation Dibenzorhodamine dyes
US6583168B1 (en) 1997-11-25 2003-06-24 Applera Corporation Sulfonated diarylrhodamine dyes
US6080868A (en) 1998-01-23 2000-06-27 The Perkin-Elmer Corporation Nitro-substituted non-fluorescent asymmetric cyanine dye compounds
JP2002502034A (ja) * 1998-02-03 2002-01-22 アマーシャム・ファルマシア・バイオテック・インコーポレーテッド エネルギー転移色素
WO1999041607A2 (de) * 1998-02-14 1999-08-19 Gmd Forschungszentrum Informationstechnik Gmbh Fluoreszenz-energie-transfer für die aufklärung der 3d-struktur von biomakromolekülen
DE19811730A1 (de) * 1998-03-18 1999-09-23 November Ag Molekulare Medizin Verfahren und Vorrichtung zum Identifizieren einer Markierung
DE19811729C2 (de) * 1998-03-18 2000-05-18 November Ag Molekulare Medizin Verfahren und Vorrichtung zum Nachweis einer Nukleotidsequenz
US6361942B1 (en) 1998-03-24 2002-03-26 Boston Probes, Inc. Method, kits and compositions pertaining to detection complexes
US6780591B2 (en) 1998-05-01 2004-08-24 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
US7875440B2 (en) 1998-05-01 2011-01-25 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
US6037130A (en) * 1998-07-28 2000-03-14 The Public Health Institute Of The City Of New York, Inc. Wavelength-shifting probes and primers and their use in assays and kits
US6210896B1 (en) 1998-08-13 2001-04-03 Us Genomics Molecular motors
US6967250B1 (en) * 1998-08-31 2005-11-22 Amersham Biosciences Corp Energy transfer dyes
AU1724000A (en) 1998-11-12 2000-05-29 Nyxis, Inc. Diagnostic assay for cancer
GB9827908D0 (en) * 1998-12-19 1999-02-10 Univ Manchester Nucleic acid sequencing method
US7033753B1 (en) * 1999-01-15 2006-04-25 University Of Rochester Compositions and methods for nonenzymatic ligation of oligonucleotides and detection of genetic polymorphisms
US6245511B1 (en) 1999-02-22 2001-06-12 Vialogy Corp Method and apparatus for exponentially convergent therapy effectiveness monitoring using DNA microarray based viral load measurements
US6136541A (en) * 1999-02-22 2000-10-24 Vialogy Corporation Method and apparatus for analyzing hybridized biochip patterns using resonance interactions employing quantum expressor functions
US20040111219A1 (en) * 1999-02-22 2004-06-10 Sandeep Gulati Active interferometric signal analysis in software
US6573047B1 (en) 1999-04-13 2003-06-03 Dna Sciences, Inc. Detection of nucleotide sequence variation through fluorescence resonance energy transfer label generation
US7655443B1 (en) * 1999-05-07 2010-02-02 Siemens Healthcare Diagnostics, Inc. Nucleic acid sequencing with simultaneous quantitation
US7056661B2 (en) 1999-05-19 2006-06-06 Cornell Research Foundation, Inc. Method for sequencing nucleic acid molecules
US6472141B2 (en) * 1999-05-21 2002-10-29 Caliper Technologies Corp. Kinase assays using polycations
US6287774B1 (en) * 1999-05-21 2001-09-11 Caliper Technologies Corp. Assay methods and system
US6818395B1 (en) 1999-06-28 2004-11-16 California Institute Of Technology Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences
EP1206699A4 (de) * 1999-07-27 2005-01-19 Univ Utah Res Found Homogenes fluoreszenzverfahren zum bestimmen struktureller modifikationen von biomolekülen
US7138254B2 (en) 1999-08-02 2006-11-21 Ge Healthcare (Sv) Corp. Methods and apparatus for performing submicroliter reactions with nucleic acids or proteins
US6358684B1 (en) 1999-08-27 2002-03-19 Pe Corporation UV excitable fluorescent energy transfer dyes
US6218124B1 (en) 1999-08-27 2001-04-17 Pe Corporation Method for detecting oligonucleotides using UV light source
US6982146B1 (en) * 1999-08-30 2006-01-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services High speed parallel molecular nucleic acid sequencing
AU7086800A (en) * 1999-08-30 2001-03-26 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The High speed parallel molecular nucleic acid sequencing
US6221600B1 (en) 1999-10-08 2001-04-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Combinatorial oligonucleotide PCR: a method for rapid, global expression analysis
JP2003527833A (ja) 1999-10-14 2003-09-24 クロンテック・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド 花虫類に由来する発色団／蛍光体、およびそれらの使用法
AU784319B2 (en) * 1999-11-02 2006-03-09 Willy A. Flegel Molecular structure of RHD negative locus
US6372907B1 (en) * 1999-11-03 2002-04-16 Apptera Corporation Water-soluble rhodamine dye peptide conjugates
US6191278B1 (en) 1999-11-03 2001-02-20 Pe Corporation Water-soluble rhodamine dyes and conjugates thereof
EP1250452A1 (de) 1999-12-02 2002-10-23 DNA Sciences, Inc. Verfahren zur bestimmung der variation einzelner nukleotide und genotypisierung
US6221604B1 (en) 2000-02-07 2001-04-24 Pe Corporation Electron-deficient nitrogen heterocycle-substituted fluorescein dyes
US6436641B1 (en) * 2000-04-17 2002-08-20 Visible Genetics Inc. Method and apparatus for DNA sequencing
US6465644B1 (en) 2000-05-02 2002-10-15 Applera Corporation Sulfonated [8,9] benzophenoxazine dyes and the use of their labelled conjugates
US6355433B1 (en) 2000-06-02 2002-03-12 Dna Sciences, Inc. Determination of nucleotide sequence variations through limited primer extension
US7846733B2 (en) 2000-06-26 2010-12-07 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for transcription-based nucleic acid amplification
WO2002004680A2 (en) * 2000-07-07 2002-01-17 Visigen Biotechnologies, Inc. Real-time sequence determination
US20070172866A1 (en) * 2000-07-07 2007-07-26 Susan Hardin Methods for sequence determination using depolymerizing agent
US6984522B2 (en) 2000-08-03 2006-01-10 Regents Of The University Of Michigan Isolation and use of solid tumor stem cells
EP1322785A4 (de) * 2000-09-11 2005-11-09 Univ Columbia Kombinatorische fluoreszenzenergietransfer-tags und deren verwendungen
US20060057565A1 (en) * 2000-09-11 2006-03-16 Jingyue Ju Combinatorial fluorescence energy transfer tags and uses thereof
US6627748B1 (en) 2000-09-11 2003-09-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Combinatorial fluorescence energy transfer tags and their applications for multiplex genetic analyses
ATE490346T1 (de) * 2000-09-18 2010-12-15 Medimmune Llc In vitro testverfahren zur bestimmung der immunogenizität eines impfstoffes
US6815164B2 (en) 2000-10-06 2004-11-09 Nugen Technologies, Inc. Methods and probes for detection and/or quantification of nucleic acid sequences
WO2002029003A2 (en) 2000-10-06 2002-04-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Massive parallel method for decoding dna and rna
US9708358B2 (en) 2000-10-06 2017-07-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Massive parallel method for decoding DNA and RNA
US6448407B1 (en) 2000-11-01 2002-09-10 Pe Corporation (Ny) Atropisomers of asymmetric xanthene fluorescent dyes and methods of DNA sequencing and fragment analysis
WO2002040701A2 (en) * 2000-11-08 2002-05-23 The Scripps Research Institute Energy transfer labels with mechanically linked fluorophores
US7211414B2 (en) * 2000-12-01 2007-05-01 Visigen Biotechnologies, Inc. Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity
US20020072053A1 (en) * 2000-12-08 2002-06-13 Mcnally Alan J. Immunoassay based on DNA replication using labeled primer
CA2430329A1 (en) * 2000-12-13 2002-06-20 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for generation of multiple copies of nucleic acid sequences and methods of detection thereof
BR0205268A (pt) 2001-03-09 2004-11-30 Nugen Technologies Inc Processos e composições para a mplificação de sequências de rna
EP1368497A4 (de) 2001-03-12 2007-08-15 California Inst Of Techn Verfahren und vorrichtung zur analyse von polynukleotidsequenzen durch asynchrone basenverlängerung
US20020177157A1 (en) * 2001-05-24 2002-11-28 Yuling Luo Pairs of nucleic acid probes with interactive signaling moieties and nucleic acid probes with enhanced hybridization efficiency and specificity
US9261460B2 (en) 2002-03-12 2016-02-16 Enzo Life Sciences, Inc. Real-time nucleic acid detection processes and compositions
US7668697B2 (en) 2006-02-06 2010-02-23 Andrei Volkov Method for analyzing dynamic detectable events at the single molecule level
US20030087309A1 (en) * 2001-08-27 2003-05-08 Shiping Chen Desktop drug screening system
US6982165B2 (en) * 2001-09-24 2006-01-03 Intel Corporation Nucleic acid sequencing by raman monitoring of molecular deconstruction
US6852492B2 (en) 2001-09-24 2005-02-08 Intel Corporation Nucleic acid sequencing by raman monitoring of uptake of precursors during molecular replication
US6972173B2 (en) * 2002-03-14 2005-12-06 Intel Corporation Methods to increase nucleotide signals by raman scattering
US7238477B2 (en) * 2001-09-24 2007-07-03 Intel Corporation Methods to increase nucleotide signals by Raman scattering
US20030124599A1 (en) * 2001-11-14 2003-07-03 Shiping Chen Biochemical analysis system with combinatorial chemistry applications
AU2002357322A1 (en) * 2001-12-19 2003-07-09 The University Of Chicago Rapidly maturing fluorescent proteins and methods for using the same
US9353405B2 (en) 2002-03-12 2016-05-31 Enzo Life Sciences, Inc. Optimized real time nucleic acid detection processes
US7118871B2 (en) * 2002-04-22 2006-10-10 Lawler Joseph F Reagents for monitoring nucleic acid amplification and methods of using same
WO2003100101A1 (en) * 2002-05-28 2003-12-04 U.S. Genomics, Inc. Methods and apparati using single polymer analysis
JP4457001B2 (ja) * 2002-05-31 2010-04-28 セクレタリー・デパートメント・オブ・アトミック・エナジー ドナー／アクセプター部分が相補鎖上となる標的核酸検出のｍｅｔ／ｆｒｅｔに基づく方法
US7115370B2 (en) 2002-06-05 2006-10-03 Capital Genomix, Inc. Combinatorial oligonucleotide PCR
AU2003280470A1 (en) * 2002-07-01 2004-01-19 Guava Technologies, Inc. Fluorescent dyes, energy transfer couples and methods
US7074597B2 (en) * 2002-07-12 2006-07-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Multiplex genotyping using solid phase capturable dideoxynucleotides and mass spectrometry
EP1389638A1 (de) * 2002-08-06 2004-02-18 Roche Diagnostics GmbH Verbesserte Proben für FRET
US20070184453A1 (en) * 2002-10-02 2007-08-09 Roche Molecular Systems, Inc Fret process
US7226414B2 (en) * 2002-10-09 2007-06-05 Biotex, Inc. Method and apparatus for analyte sensing
ATE509946T1 (de) 2002-11-12 2011-06-15 Zakrytoe Aktsionernoe Obschestvo S Evrogens Fluoreszenzproteine und chromoproteine aus nicht- aequorea-hydrozoa-spezies sowie verfahren zur verwendung davon
US20050032081A1 (en) * 2002-12-13 2005-02-10 Jingyue Ju Biomolecular coupling methods using 1,3-dipolar cycloaddition chemistry
ATE474922T1 (de) 2002-12-26 2010-08-15 Zakrytoe Aktsionernoe Obschest Fluoreszenzproteine aus copepoda-spezies und verfahren zur verwendung davon
US7166458B2 (en) * 2003-01-07 2007-01-23 Bio Tex, Inc. Assay and method for analyte sensing by detecting efficiency of radiation conversion
JP2006521092A (ja) * 2003-04-04 2006-09-21 エフ．ホフマン−ラ　ロシュ　アーゲー マルチカラーリアルタイムｐｃｒ用の改良されたシステム
WO2004092418A2 (en) 2003-04-14 2004-10-28 Nugen Technologies, Inc. Global amplification using a randomly primed composite primer
US7491830B2 (en) 2003-05-09 2009-02-17 Applied Biosystems Inc. Phenyl xanthene dyes
EP1627025B1 (de) * 2003-05-09 2016-10-12 Applied Biosystems, LLC Fluoreszierende kunststoffe mit gehalt an lipidlöslichen rhodaminfarbstoffen
US7236812B1 (en) 2003-09-02 2007-06-26 Biotex, Inc. System, device and method for determining the concentration of an analyte
US7169560B2 (en) 2003-11-12 2007-01-30 Helicos Biosciences Corporation Short cycle methods for sequencing polynucleotides
JP2007534308A (ja) * 2003-11-19 2007-11-29 アレロジック・バイオサイエンシズ・コーポレーション 複数のフルオロフォアで標識したオリゴヌクレオチド
JP2007524407A (ja) 2003-12-29 2007-08-30 ニューゲン テクノロジーズ， インコーポレイテッド 核酸のメチル化状態を分析するための方法、ならびに核酸の断片化、標識化および固定化のための方法
JP2007518107A (ja) 2004-01-13 2007-07-05 ユー．エス． ジェノミクス， インコーポレイテッド ポリマーを使用する溶液中の分析物の検出および定量化
US10337054B2 (en) 2004-02-02 2019-07-02 Quantum-Si Incorporated Enrichment of nucleic acid targets
ATE510928T1 (de) 2004-02-19 2011-06-15 Univ Alberta Leptinpromotor-polymorphismen und verwendungen davon
CA2557177A1 (en) 2004-02-19 2005-09-01 Stephen Quake Methods and kits for analyzing polynucleotide sequences
WO2005084367A2 (en) * 2004-03-03 2005-09-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Photocleavable fluorescent nucleotides for dna sequencing on chip constructed by site-specific coupling chemistry
WO2005089524A2 (en) * 2004-03-19 2005-09-29 U.S. Genomics, Inc. Compositions and methods for detection of single molecules
EP1732944B1 (de) * 2004-04-07 2012-09-05 The University of Chicago Monomere, rotfluoreszierende proteine
WO2006073436A2 (en) * 2004-04-29 2006-07-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Mass tag pcr for multiplex diagnostics
US8883486B2 (en) 2004-05-04 2014-11-11 Universite De Montreal Arrestin biosensor
US7476734B2 (en) 2005-12-06 2009-01-13 Helicos Biosciences Corporation Nucleotide analogs
CA2566806A1 (en) 2004-05-25 2006-01-19 Helicos Biosciences Corporation Methods and devices for nucleic acid sequence determination
US20090087848A1 (en) * 2004-08-18 2009-04-02 Abbott Molecular, Inc. Determining segmental aneusomy in large target arrays using a computer system
JP2008511058A (ja) * 2004-08-18 2008-04-10 アボツト・モレキユラー・インコーポレイテツド コンピュータシステムを用いるデータ品質および／または部分異数染色体の決定
WO2006130165A2 (en) * 2004-09-02 2006-12-07 Vialogy Corp. Detecting events of interest using quantum resonance interferometry
JP2008513782A (ja) * 2004-09-17 2008-05-01 パシフィック バイオサイエンシーズ オブ カリフォルニア， インコーポレイテッド 分子解析のための装置及び方法
US7170050B2 (en) 2004-09-17 2007-01-30 Pacific Biosciences Of California, Inc. Apparatus and methods for optical analysis of molecules
US20080113354A1 (en) * 2004-11-12 2008-05-15 Yanggu Shi Methods and Compositions for High Sensitivity Fluorescent Mutation Detection with Mismatch Cutting Dna Endonucleases
US7220549B2 (en) 2004-12-30 2007-05-22 Helicos Biosciences Corporation Stabilizing a nucleic acid for nucleic acid sequencing
US7482120B2 (en) 2005-01-28 2009-01-27 Helicos Biosciences Corporation Methods and compositions for improving fidelity in a nucleic acid synthesis reaction
EP1882188A2 (de) * 2005-04-20 2008-01-30 Board of Regents, The University of Texas System Ultraempfindlicher nachweis von prionen durch zyklische amplifikation mit automatischer proteinfehlfaltung
DK1907571T3 (en) 2005-06-15 2017-08-21 Complete Genomics Inc NUCLEIC ACID ANALYSIS USING INCIDENTAL MIXTURES OF NON-OVERLAPPING FRAGMENTS
WO2007002204A2 (en) 2005-06-21 2007-01-04 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Pyrosequencing methods and related compostions
US7666593B2 (en) 2005-08-26 2010-02-23 Helicos Biosciences Corporation Single molecule sequencing of captured nucleic acids
WO2007030521A1 (en) * 2005-09-06 2007-03-15 Invitrogen Corporation Control of chemical modification
US7939258B2 (en) 2005-09-07 2011-05-10 Nugen Technologies, Inc. Nucleic acid amplification procedure using RNA and DNA composite primers
US7405281B2 (en) * 2005-09-29 2008-07-29 Pacific Biosciences Of California, Inc. Fluorescent nucleotide analogs and uses therefor
US7741467B2 (en) * 2005-10-05 2010-06-22 Roche Molecular Systems, Inc. Non-fluorescent energy transfer
EP1951900B1 (de) 2005-10-07 2016-06-15 Callida Genomics, Inc. Selbstzusammengesetzte einzelmolekül-arrays und verwendungen davon
WO2007052102A2 (en) * 2005-11-04 2007-05-10 Evrogen, Jsc Modified green fluorescent proteins and methods for using same
WO2007056250A2 (en) * 2005-11-04 2007-05-18 U.S. Genomics, Inc. Heterogeneous assay of analytes in solution using polymers
US20090088332A1 (en) * 2005-11-21 2009-04-02 Jingyue Ju Multiplex Digital Immuno-Sensing Using a Library of Photocleavable Mass Tags
US8703734B2 (en) 2005-12-12 2014-04-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Nanoprobes for detection or modification of molecules
WO2007070572A2 (en) 2005-12-12 2007-06-21 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Probe for nucleic acid sequencing and methods of use
DK1994149T3 (da) * 2006-01-25 2011-01-17 Evrogen Ip Nye fluorescerende proteiner og fremgangsmåder til anvendelse deraf
US8563703B2 (en) 2006-01-25 2013-10-22 Evrogen IP Joint Stock Company Fluorescent proteins and methods for using same
CA2643700A1 (en) 2006-02-24 2007-11-22 Callida Genomics, Inc. High throughput genome sequencing on dna arrays
SG10201405158QA (en) 2006-02-24 2014-10-30 Callida Genomics Inc High throughput genome sequencing on dna arrays
US7397546B2 (en) 2006-03-08 2008-07-08 Helicos Biosciences Corporation Systems and methods for reducing detected intensity non-uniformity in a laser beam
CA2650691C (en) 2006-04-28 2015-10-06 Children's Hospital Medical Center Fusogenic properties of saposin c and related proteins and peptides for application to transmembrane drug delivery systems
EP2074222A4 (de) * 2006-09-06 2010-03-03 Univ Texas Verfahren und zusammensetzungen zum nachweis von proteinfaltungsstörungen
WO2008094316A2 (en) * 2006-09-22 2008-08-07 Stowers Institute Of Medical Research Novel branchiostoma derived fluorescent proteins
US7910302B2 (en) 2006-10-27 2011-03-22 Complete Genomics, Inc. Efficient arrays of amplified polynucleotides
US20090111705A1 (en) 2006-11-09 2009-04-30 Complete Genomics, Inc. Selection of dna adaptor orientation by hybrid capture
GB2457402B (en) 2006-12-01 2011-10-19 Univ Columbia Four-color DNA sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators
US7881933B2 (en) * 2007-03-23 2011-02-01 Verizon Patent And Licensing Inc. Age determination using speech
US7816135B2 (en) 2007-07-05 2010-10-19 Becton, Dickinson And Company Method of analyzing lymphocytes
US9115163B2 (en) 2007-10-19 2015-08-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York DNA sequence with non-fluorescent nucleotide reversible terminators and cleavable label modified nucleotide terminators
EP4310194A2 (de) 2007-10-19 2024-01-24 The Trustees of Columbia University in the City of New York Entwurf und synthese von spaltbaren fluoreszierenden nukleotiden als reversible terminatoren zur dna-sequenzierung durch synthese
WO2009059305A2 (en) * 2007-11-01 2009-05-07 The University Of Chicago Red fluorescent proteins with enhanced bacterial expression, increased brightness and reduced aggregation
US8034568B2 (en) 2008-02-12 2011-10-11 Nugen Technologies, Inc. Isothermal nucleic acid amplification methods and compositions
WO2009117698A2 (en) 2008-03-21 2009-09-24 Nugen Technologies, Inc. Methods of rna amplification in the presence of dna
US7973146B2 (en) * 2008-03-26 2011-07-05 Pacific Biosciences Of California, Inc. Engineered fluorescent dye labeled nucleotide analogs for DNA sequencing
JP2011515102A (ja) 2008-03-28 2011-05-19 パシフィック バイオサイエンシーズ オブ カリフォルニア， インコーポレイテッド 核酸シーケンシング用組成物及び方法
JP5924937B2 (ja) 2008-07-25 2016-05-25 エックス−ボディ インコーポレイテッド タンパク質スクリーニング法
WO2010059206A2 (en) * 2008-11-19 2010-05-27 Pacific Biosciences Of California, Inc. Modular nucleotide compositions and uses therefor
US8603792B2 (en) 2009-03-27 2013-12-10 Life Technologies Corporation Conjugates of biomolecules to nanoparticles
WO2010117420A2 (en) 2009-03-30 2010-10-14 Pacific Biosciences Of California, Inc. Fret-labeled compounds and uses therefor
US8632975B2 (en) 2009-06-05 2014-01-21 Life Technologies Corporation Nucleotide transient binding for sequencing methods
US9566335B1 (en) 2009-09-25 2017-02-14 The Governing Council Of The University Of Toronto Protein sequencing method and reagents
US8518643B2 (en) * 2010-02-04 2013-08-27 Pacific Biosciences Of California, Inc. Method to improve single molecule analyses
US20120034603A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Tandem Diagnostics, Inc. Ligation-based detection of genetic variants
US20130261003A1 (en) 2010-08-06 2013-10-03 Ariosa Diagnostics, In. Ligation-based detection of genetic variants
US8906612B2 (en) 2010-08-25 2014-12-09 Pacific Biosciences Of California, Inc. Scaffold-based polymerase enzyme substrates
JP5985503B2 (ja) * 2010-12-16 2016-09-06 バイオ−ラッド ラボラトリーズ インコーポレーティッド 定量的増幅のためのユニバーサルリファレンス色素
WO2012090073A2 (en) 2010-12-30 2012-07-05 The Netherlands Cancer Institute Methods and compositions for predicting chemotherapy sensitivity
US20120190021A1 (en) 2011-01-25 2012-07-26 Aria Diagnostics, Inc. Detection of genetic abnormalities
US10131947B2 (en) 2011-01-25 2018-11-20 Ariosa Diagnostics, Inc. Noninvasive detection of fetal aneuploidy in egg donor pregnancies
WO2012118745A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 Arnold Oliphant Assay systems for detection of aneuploidy and sex determination
EP2694678A2 (de) 2011-04-04 2014-02-12 Netherland Cancer Institute Verfahren und zusammensetzungen zur vorhersage der resistenz gegenüber einer antikrebsbehandlung
AU2012240240A1 (en) 2011-04-04 2013-05-09 Netherlands Cancer Institute Methods and compositions for predicting resistance to anticancer treatment with protein kinase inhibitors
CN103945864A (zh) 2011-04-25 2014-07-23 先进生物学实验室股份有限公司 截短的hiv包膜蛋白(env)、其相关方法和组合物
CN107190078A (zh) * 2011-05-06 2017-09-22 凯杰有限公司 包含内部标记引物的核酸的测序、扩增和检测方法
WO2012162429A2 (en) 2011-05-23 2012-11-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Dna sequencing by synthesis using raman and infrared spectroscopy detection
AU2012309824A1 (en) 2011-09-12 2013-04-18 Abbvie Biotherapeutics Inc. Artificial NK cells and uses thereof
JP2014531908A (ja) 2011-10-14 2014-12-04 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 構造アッセンブリによる配列決定
WO2013056841A1 (en) 2011-10-19 2013-04-25 Inra (Institut National De La Recherche Agronomique) A method for diagnosing tse
US9206418B2 (en) 2011-10-19 2015-12-08 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for directional nucleic acid amplification and sequencing
CN104093890B (zh) 2012-01-26 2016-04-20 纽亘技术公司 用于靶向核酸序列富集和高效文库产生的组合物和方法
WO2013123258A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Pacific Biosciences Of California, Inc. Polymerase enzyme substrates with protein shield
US10458915B2 (en) 2012-05-18 2019-10-29 Pacific Biosciences Of California, Inc. Heteroarylcyanine dyes
US9315864B2 (en) 2012-05-18 2016-04-19 Pacific Biosciences Of California, Inc. Heteroarylcyanine dyes with sulfonic acid substituents
US9968901B2 (en) 2012-05-21 2018-05-15 The Scripps Research Institute Methods of sample preparation
US9914967B2 (en) 2012-06-05 2018-03-13 President And Fellows Of Harvard College Spatial sequencing of nucleic acids using DNA origami probes
JP6181751B2 (ja) 2012-06-18 2017-08-16 ニューゲン テクノロジーズ， インコーポレイテッド 望まれない核酸配列のネガティブ選択のための組成物および方法
US20150011396A1 (en) 2012-07-09 2015-01-08 Benjamin G. Schroeder Methods for creating directional bisulfite-converted nucleic acid libraries for next generation sequencing
EP2820418B1 (de) 2012-07-20 2017-12-06 President and Fellows of Harvard College Zellbasierte bioassays zur qualitätskontrolle für nutrizeutische und medizinische produkte
US9476089B2 (en) 2012-10-18 2016-10-25 President And Fellows Of Harvard College Methods of making oligonucleotide probes
WO2014139979A1 (en) 2013-03-12 2014-09-18 Ventana Medical Systems, Inc. Quantum dot in situ hybridization
EP2971064B1 (de) 2013-03-12 2019-10-16 Ventana Medical Systems, Inc. Näherungstest für in-situ-detektion von zielen
US10648026B2 (en) 2013-03-15 2020-05-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Raman cluster tagged molecules for biological imaging
US9822408B2 (en) 2013-03-15 2017-11-21 Nugen Technologies, Inc. Sequential sequencing
US9540685B2 (en) 2013-03-15 2017-01-10 President And Fellows Of Harvard College Methods of identifying homologous genes using FISH
US9849198B2 (en) 2013-07-02 2017-12-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Discrete imaging of hepatic oxidative and nitrosative stress with two-channel nanoparticles for in vivo drug safety screening
WO2015021079A1 (en) 2013-08-05 2015-02-12 Pacific Biosciences Of California, Inc. Protected fluorescent reagent compounds
EP3068883B1 (de) 2013-11-13 2020-04-29 Nugen Technologies, Inc. Zusammensetzungen und verfahren zur identifizierung einer duplikatsequenzierungslesung
US9745614B2 (en) 2014-02-28 2017-08-29 Nugen Technologies, Inc. Reduced representation bisulfite sequencing with diversity adaptors
KR20170036801A (ko) 2014-08-19 2017-04-03 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵산의 프로빙 및 맵핑을 위한 ｒｎａ-가이드된 시스템
EP3191604B1 (de) 2014-09-09 2021-04-14 Igenomx International Genomics Corporation Verfahren und zusammensetzungen zur schnellen nukleinsäurebibliothekenherstellung
KR102417849B1 (ko) 2014-11-21 2022-07-07 나노스트링 테크놀로지스, 인크. 무효소 및 무증폭 시퀀싱
EP3224621B1 (de) 2014-11-25 2019-06-12 Ventana Medical Systems, Inc. Nähe-tests unter verwendung von chemischer ligation und hapten transfer
US10302972B2 (en) 2015-01-23 2019-05-28 Pacific Biosciences Of California, Inc. Waveguide transmission
EP3258952A4 (de) 2015-02-04 2018-12-05 Pacific Biosciences Of California, Inc. Multimere geschützte fluoreszierende reagenzien
US11130986B2 (en) 2015-05-20 2021-09-28 Quantum-Si Incorporated Method for isolating target nucleic acid using heteroduplex binding proteins
US10174363B2 (en) 2015-05-20 2019-01-08 Quantum-Si Incorporated Methods for nucleic acid sequencing
EP3376996B1 (de) 2015-11-20 2022-09-07 Pacific Biosciences of California, Inc. Geschützte farbstoffmarkierte reagenzien
US10676788B2 (en) 2015-11-20 2020-06-09 Pacific Biosciences Of California, Inc. Modified nucleotide reagents
CN113321943A (zh) 2015-11-20 2021-08-31 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 标记的核苷酸类似物、反应混合物以及测序方法和系统
JP7457457B2 (ja) 2016-05-16 2024-03-28 ナノストリング テクノロジーズ，インコーポレイティド サンプル中の標的核酸を検出する方法
EP3475446A1 (de) 2016-06-27 2019-05-01 Juno Therapeutics, Inc. Verfahren zur identifizierung von peptidepitopen, moleküle zur bindung derartiger epitope und verwendungen davon
MA45491A (fr) 2016-06-27 2019-05-01 Juno Therapeutics Inc Épitopes à restriction cmh-e, molécules de liaison et procédés et utilisations associés
US10578610B2 (en) 2016-09-20 2020-03-03 Washington University Peptide regulators of mitochondrial fusion and methods of use
US10415080B2 (en) 2016-11-21 2019-09-17 Nanostring Technologies, Inc. Chemical compositions and methods of using same
KR20230052995A (ko) 2016-12-19 2023-04-20 퀀텀-에스아이 인코포레이티드 시퀀싱 반응을 위한 중합 효소
US11760733B2 (en) 2017-04-23 2023-09-19 Washington University Small molecule regulators of mitochondrial fusion and methods of use thereof
MX2019013111A (es) 2017-05-05 2019-12-16 Quantum Si Inc Sustratos que tienen reactividad de superficie modificada y propiedades antiincrustantes en reacciones biologicas.
US11441174B2 (en) 2017-06-02 2022-09-13 Affymetrix, Inc. Array-based methods for analysing mixed samples using differently labelled allele-specific probes
US11603557B2 (en) 2017-06-02 2023-03-14 Affymetrix, Inc. Array-based methods for analysing mixed samples using differently labelled allele-specific probes
TWI829642B (zh) 2017-07-24 2024-01-21 美商寬騰矽公司 高強度經標記之反應物組合物及用於定序之方法
GB201715684D0 (en) 2017-09-28 2017-11-15 Univ Gent Means and methods for single molecule peptide sequencing
US11099202B2 (en) 2017-10-20 2021-08-24 Tecan Genomics, Inc. Reagent delivery system
US11851679B2 (en) 2017-11-01 2023-12-26 Juno Therapeutics, Inc. Method of assessing activity of recombinant antigen receptors
WO2019104070A1 (en) 2017-11-21 2019-05-31 Nanostring Technologies, Inc. O-nitrobenzyl photocleavable bifunctional linker
AU2019271028A1 (en) 2018-05-14 2020-12-03 Nanostring Technologies, Inc. Chemical compositions and methods of using same
TW202032125A (zh) 2018-11-15 2020-09-01 美商寬騰矽公司 用於蛋白質定序之方法及組合物
MX2021008867A (es) 2019-01-23 2021-08-19 Quantum Si Inc Composiciones reactantes marcadas de intensidad alta y metodos de secuenciamiento.
JP2022539560A (ja) 2019-06-28 2022-09-12 クアンタム－エスアイ インコーポレイテッド 配列決定反応のための重合酵素
JP2022551523A (ja) 2019-10-11 2022-12-09 クアンタム－エスアイ インコーポレイテッド 気相における表面修飾
AU2021210878A1 (en) 2020-01-21 2022-09-15 Quantum-Si Incorporated Compounds and methods for selective C-terminal labeling
EP4114978A2 (de) 2020-03-06 2023-01-11 Singular Genomics Systems, Inc. Sequenzierung verknüpfter gepaarter stränge
WO2022015600A2 (en) 2020-07-13 2022-01-20 Singular Genomics Systems, Inc. Methods of sequencing complementary polynucleotides
AU2021343471A1 (en) 2020-09-16 2023-05-04 Nanostring Technologies, Inc. Chemical compositions and methods of using the same
US20220228200A1 (en) 2021-01-19 2022-07-21 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for internally controlled in situ assays
US11486001B2 (en) 2021-02-08 2022-11-01 Singular Genomics Systems, Inc. Methods and compositions for sequencing complementary polynucleotides
US11884977B2 (en) 2021-03-12 2024-01-30 Singular Genomics Systems, Inc. Nanoarrays and methods of use thereof
WO2022192671A1 (en) 2021-03-12 2022-09-15 Singular Genomics Systems, Inc. Nanoarrays and methods of use thereof
US11578320B2 (en) 2021-04-27 2023-02-14 Singular Genomics Systems, Inc. High density sequencing and multiplexed priming
EP4347877A1 (de) 2021-06-01 2024-04-10 10X Genomics, Inc. Verfahren und zusammensetzungen zum nachweis von analyten und zur sondenauflösung
CN117751197A (zh) 2021-06-02 2024-03-22 10X基因组学有限公司 使用不对称可环化探针的样品分析
CN117651855A (zh) 2021-07-13 2024-03-05 10X基因组学有限公司 用于制备具有可控厚度的聚合基质的方法
WO2023015192A1 (en) 2021-08-03 2023-02-09 10X Genomics, Inc. Nucleic acid concatemers and methods for stabilizing and/or compacting the same
EP4326898A1 (de) 2021-08-16 2024-02-28 10X Genomics, Inc. Sonden mit einem geteilten strichcodebereich und verfahren zur verwendung
WO2023129898A2 (en) 2021-12-27 2023-07-06 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for rolling circle amplification
WO2023141588A1 (en) 2022-01-21 2023-07-27 10X Genomics, Inc. Multiple readout signals for analyzing a sample
WO2023164570A1 (en) 2022-02-23 2023-08-31 Insitro, Inc. Pooled optical screening and transcriptional measurements of cells comprising barcoded genetic perturbations
US11795505B2 (en) 2022-03-10 2023-10-24 Singular Genomics Systems, Inc. Nucleic acid delivery scaffolds
WO2023192616A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for targeted masking of autofluorescence
US20240026427A1 (en) 2022-05-06 2024-01-25 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for in situ analysis of v(d)j sequences
US20240002902A1 (en) 2022-05-06 2024-01-04 10X Genomics, Inc. Analysis of antigen and antigen receptor interactions
WO2023220300A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for in situ sequencing
WO2023245190A1 (en) 2022-06-17 2023-12-21 10X Genomics, Inc. Catalytic de-crosslinking of samples for in situ analysis
US20240101978A1 (en) 2022-08-12 2024-03-28 10X Genomics, Inc. Puma1 polymerases and uses thereof
US20240084373A1 (en) 2022-08-16 2024-03-14 10X Genomics, Inc. Ap50 polymerases and uses thereof
WO2024081869A1 (en) 2022-10-14 2024-04-18 10X Genomics, Inc. Methods for analysis of biological samples

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4855225A (en) * 1986-02-07 1989-08-08 Applied Biosystems, Inc. Method of detecting electrophoretically separated oligonucleotides
US4996143A (en) * 1985-12-23 1991-02-26 Syngene, Inc. Fluorescent stokes shift probes for polynucleotide hybridization
WO1993009128A1 (en) * 1991-11-07 1993-05-13 Nanotronics, Inc. Hybridization of polynucleotides conjugated with chromophores and fluorophores to generate donor-to-donor energy transfer system
WO1994017397A1 (en) * 1993-01-27 1994-08-04 The Regents Of The University Of California Dna complexes with dyes designed for energy transfer as fluorescent markers

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1273552A (en) * 1985-12-23 1990-09-04 Michael J. Heller Fluorescent stokes shift probes for polynucleotide hybridization assays
US4868103A (en) * 1986-02-19 1989-09-19 Enzo Biochem, Inc. Analyte detection by means of energy transfer
JP2901004B2 (ja) * 1989-04-12 1999-06-02 株式会社日立製作所 Ｄｎａの塩基配列決定法
US5188934A (en) * 1989-11-14 1993-02-23 Applied Biosystems, Inc. 4,7-dichlorofluorescein dyes as molecular probes
US5342789A (en) * 1989-12-14 1994-08-30 Sensor Technologies, Inc. Method and device for detecting and quantifying glucose in body fluids
CA2033692A1 (en) * 1990-01-25 1991-07-26 Wilhelm Bannwarth Energy transfer systems
US5326692B1 (en) * 1992-05-13 1996-04-30 Molecular Probes Inc Fluorescent microparticles with controllable enhanced stokes shift
WO1992014845A1 (en) * 1991-02-26 1992-09-03 Worcester Foundation For Experimental Biology Diagnosing cystic fibrosis and other genetic diseases using fluorescence resonance energy transfer (fret)
JP3097205B2 (ja) * 1991-09-05 2000-10-10 株式会社日立製作所 電気泳動分離検出方法
US5654419A (en) * 1994-02-01 1997-08-05 The Regents Of The University Of California Fluorescent labels and their use in separations

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4996143A (en) * 1985-12-23 1991-02-26 Syngene, Inc. Fluorescent stokes shift probes for polynucleotide hybridization
US4855225A (en) * 1986-02-07 1989-08-08 Applied Biosystems, Inc. Method of detecting electrophoretically separated oligonucleotides
WO1993009128A1 (en) * 1991-11-07 1993-05-13 Nanotronics, Inc. Hybridization of polynucleotides conjugated with chromophores and fluorophores to generate donor-to-donor energy transfer system
WO1994017397A1 (en) * 1993-01-27 1994-08-04 The Regents Of The University Of California Dna complexes with dyes designed for energy transfer as fluorescent markers

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cardullo R.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 8790-8794 *
LEE, L.G. u.a., Nucleic Acids Res. (1992) 20(10) 2471-2483 *
Stryer L., Ann. Rev. Biochem. 47 (1978) 819-846 *

Also Published As

Publication number Publication date
JPH09508525A (ja) 1997-09-02
DE69530286D1 (de) 2003-05-15
AU1736795A (en) 1995-08-21
JP2007000151A (ja) 2007-01-11
WO1995021266A1 (en) 1995-08-10
DE69530286T2 (de) 2004-04-01
ATE236994T1 (de) 2003-04-15
EP0743987A4 (de) 1998-04-15
US5654419A (en) 1997-08-05
EP0743987A1 (de) 1996-11-27
ES2197193T3 (es) 2004-01-01
US5707804A (en) 1998-01-13
EP0743987B1 (de) 2003-04-09
CA2182516C (en) 2003-11-25
DE29521620U1 (de) 1997-11-13
CA2182516A1 (en) 1995-08-10
JP3895369B2 (ja) 2007-03-22
AU692230B2 (en) 1998-06-04
DE19581489T1 (de) 1997-01-02
US5688648A (en) 1997-11-18
JP4602956B2 (ja) 2010-12-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE19581489B4 (de) Mit Energieübertragungs-gekuppelten Farbstoffen markierte Sonden
DE69720763T2 (de) Sätze von, mit fluoreszierenden energieübertragungsverbindungen, markierten primern und deren verwendung in mehrkomponentenanalyse
DE69736434T2 (de) Energieübertragungsfarbstoffe mit verbesserter Fluoreszenz
DE60118655T2 (de) Sonden und Methoden zum Nachweis von Nukleinsäuren
DE69822855T2 (de) Durch aromatische gruppen substituierte xanthenfarbstoffe
DE69836885T2 (de) Nachweis von Nukleinsäuren durch Fluoreszenz quenching
US6028190A (en) Probes labeled with energy transfer coupled dyes
DE60101939T2 (de) Mit stickstoffheterozyklen substituierte elektronenmangel-fluoresceinfarbstoffe
DE60031489T2 (de) Universalproben und Methoden zum Nachweis von Nukleinsäuren
DE69334173T2 (de) Verfahren zum Nachweis einer Zielnukleinsäure
DE69726454T2 (de) Sequenzierung von nukleinsäuren unter verwendung von an festphasen gebundenen terminatoren
DE60310532T2 (de) Bestimmung von nukleinsäuren
DE602005000485T2 (de) Nukleinsäurenachweisverfahren mittels mehreren Paaren von Donorflurophoren und Quenchemolekülen in derselben Sonde
DE69837125T3 (de) Nachweis von Nukleinsäuren durch Aufhebung der Fluoreszenz
EP0663922B1 (de) Infrarot-farbstoff-markierte nucleotide und ihre verwendung in der nucleinsäure-detektion
EP0490281B1 (de) 3'- Amino- oder thiolmodifizierte, Fluoreszenzfarbstoff-gekoppelte Nukleoside, Nukleotide und Oligonukleotide sowie ein Verfahren zur Herstellung und ihre Verwendung
DE60108897T2 (de) Methoden für externe kontrollen zur nukleinsäure amplifizierung
EP0962497B1 (de) Rhodamin-Derivate und deren Verwendung in diagnostischen Systemen
DE69914328T2 (de) Effiziente aktivierte cyaninfarbstoffe
EP1230398B1 (de) Farbstoffmarkiertes oligonukleotid zum markieren eines nukleinsäuremoleküls
DE19515552A1 (de) Simultane Sequenzierung von Nukleinsäuren
WO2018114674A1 (de) Zweiteilige mediatorsonde
JP2003221515A (ja) ４，７−ジクロロローダミン色素
DE69912139T2 (de) Energieübertragungsfarbstoffe
DE60308454T2 (de) Fluoreszenzmarkierten Hybridisierungssonden mit reduzierter Hintergrundfluoreszenz

Legal Events

Date Code Title Description
8110 Request for examination paragraph 44
8125 Change of the main classification

Ipc: C12Q 1/68

8607 Notification of search results after publication
8364 No opposition during term of opposition
R071 Expiry of right