JP2002502034A - エネルギー転移色素 - Google Patents

エネルギー転移色素

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JP2002502034A JP2000529606A JP2000529606A JP2002502034A JP 2002502034 A JP2002502034 A JP 2002502034A JP 2000529606 A JP2000529606 A JP 2000529606A JP 2000529606 A JP2000529606 A JP 2000529606A JP 2002502034 A JP2002502034 A JP 2002502034A
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アマーシャム・ファルマシア・バイオテック・インコーポレーテッド
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Abstract

(57)【要約】 新規クラスのエネルギー転移色素、その調製、および生物組織における標識としての使用を開示する。当該色素は、好ましくは、種々の生体物質に結合し得るカセットの形である。それから作成され得る色素および試薬により、広範囲の可視スペクトル全体の種々の蛍光適用に使用し得る大きなストークシフトを有する種々の蛍光標識が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明の分野 本発明は、新規クラスのエネルギー転移色素、その調製および生物学的システ
ムにおける標識としての使用に関係する。
【０００２】 本発明の背景 以下に関連する分野について記載する。これらのどれも添付の特許請求の範囲
に対する先行技術として認容するものではない。
【０００３】 英国特許出願番号２３０１８３３Ｂは、とりわけ、複合体を開示し、その複合
体には、 i)第一吸収および放射スペクトルを有する第一蛍光色素、 ii)第二吸収および放射スペクトルを有する第二蛍光色素、ここで、第二蛍光色 素の放射最大の波長は、第一蛍光色素の放射最大の波長よりも長く、第二蛍光色
素の吸収スペクトルの一部は、第一蛍光色素の放射スペクトルの一部と重複し、 iii)１ないし２０炭素原子を含むアルキル鎖からなる群より選択される少なくと
も１つのリンカー基、それらは、所望により、ポリエーテル連結として１ないし
８酸素原子か、またはポリアミン連結として１ないし８窒素原子か、またはポリ
アミド連結として１ないし４ＣＯ-ＮＨ基を含み、そして、第一蛍光色素と第二 蛍光色素との間の共鳴エネルギー転移の転移のため第一および第二蛍光色素に共
有結合する、２までのビシクロ[2,2,2]オクチル基を含み、および iv)標的化合物と共有結合を形成し得る少なくとも１つの標的結合基 が含まれ、ここで、少なくとも１つの第一または第二蛍光色素はシアニン色素で
あり、第一および第二蛍光色素とリンカー基を合せた分子量は、約２０，０００
ダルトン未満であり、生物学的システムに結合し得るエネルギー転移色素である
と開示している。色素の蛍光性により、生物学的システムに含まれるプロセスの
モニターが可能となる。それらはシーケンシングおよび核酸検出における使用で
ある。
【０００４】 本発明の要約 現在、新規クラスのエネルギー転移色素が、シーケンシング反応および他の適
用に含まれる標識物質に使用されることが判っている。色素は好ましくは“カセ
ット”形であり、種々の生体物質に結合し得る。カセットには、少なくとも２つ
の蛍光色素部分との共有結合体構造または複合体、リンカー基、および好ましく
は生体物質または他の標的物質に複合体を結合する反応基を含む。反応基を、特
定標的物質における官能基との共有結合の形成に適当となるよう選択する。色素
は、１つの色素の放射スペクトルが２番目の色素の吸収スペクトルと重複するよ
うに選択する。そのため、エネルギー転移が色素間で生ずる。
【０００５】 故に、本発明は、式(Ｉ)
【化７】 [Ｒ1は、エネルギー転移配置においてアクセプターまたはドナーとして適当な第
一色素であり、 Ｒ5は、第一色素を用いるエネルギー転移配置におけるドナーまたはアクセプタ ーとして適当である第二色素であり、 Ａは、炭素、窒素および酸素からなる群より選択される５,６,７,８,９,１０,１
１,１２,１３,１４,１５,１６,１７,１８,１９または２０の直線状連結原子を有
する鎖を含み、当該鎖は、望ましいならば、エネルギー転移を妨げない当業者に
既知の基に、所望により置換されていてもよく、例えば、Ｃ1,2,3 または 4直線状
または分枝状アルキルまたはフェニルであり、所望により、ＯＨ、ハロゲン、メ
チル、エチル基から独立して選択される１,２,３または４置換基で置換されてい
てもよく、好ましくは、Ａは、直線状連結原子の鎖であり、 Ｒ3は、水素か、またはエネルギー転移色素を、標的物質、例えば上記の生体物 質に結合させるのに適当な反応もしくは官能基であり、そして Ｄは、Ｒ5をリンカー鎖Ａに結合させる原子または基であって、ＡとＲ5の間の共
有結合には硫黄原子を含まず、また好ましくは、Ｄ中には硫黄原子は存在せず、
例えば、Ｒ5とＡの間の直接の共有結合において側鎖基はないといったことであ り、 Ｒ1およびＲ5がフルオレセイン／ローダミン対であるとき、Ａ中には好ましくは
９,１０,１１,１２,１３,１４,１５,１６または１７のリンカー原子、より好ま しくは９,１０,１１,１２,１３,１４または１５のリンカー原子が存在し、Ｒ1お
よびＲ5がシアニン色素であるとき、好ましくは６,７,８,９,１０,１１または１
２のリンカー原子、より好ましくは８,９または１０が存在し、好ましくは、Ａ は、Ｃ6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 または 17炭素鎖である。] のエネルギー転移色素を提供する。
【０００６】 鎖または基中の原子数の値の特定範囲の記載は、上記のように範囲内の各整数
を明示したリスティングであると範囲の末端の点を特定する範囲の記載であると
を問わず、両末端値を含む範囲内のすべての整数値を特定した説明を含む。更に
、より広い範囲内の各小範囲の特定詳細を含む。例えば、範囲１-６は、他の小 範囲を含むと共に小範囲１-４および３-６を含む。
【０００７】 反応または官能基Ｒ3は、エネルギー転移色素を、標的物質、好ましくは標的 生体物質および当業者に既知のようなものに結合させるのに適当な任意の基であ
る。好ましくは、Ｒ3は、カルボキシル、コハク酸イミジルエステル、硫黄-コハ
ク酸イミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミドおよびホスホラミダイ
トならびにカルボキシル、コハク酸イミジルエステル、硫黄-コハク酸イミジル エステル、イソチオシアネート、マレイミドおよびホスホラミダイトと共有結合
する基からなる群より選択される。
【０００８】 Ｒ1に適当な色素は、Ｓに連結可能な反応または官能基を含む色素である。結 合基Ｄは、硫黄以外のＲ5とＡの連結に適当な任意の基である。好ましくは、Ｄ はＰＯ3またはＮＨ-ＣＯである。
【０００９】 本発明のエネルギー転移色素の色素部分、例えばＲ1およびＲ5は、更に本明細
書中で示すように選択され、エネルギー転移配置(arrangement)に参与するフル オロホアである。
【００１０】 好ましくは、本発明のエネルギー転移色素は、総分子量１０,０００または５,
０００ダルトン未満、より好ましくは３,０００または２０００ダルトン未満、 またより好ましくは１,５００または１,２００ダルトン未満を有する。
【００１１】 本発明のエネルギー転移色素に関して、“エネルギー転移配置”なる語は、２
つの蛍光色素が選択され、色素間のエネルギー転移に適当な吸収および放射スペ
クトルを有し、重要な物理的近接および連結で位置付けられ、そのため、第一色
素(ドナー)の光発散(photoexitation)により、第一色素から第二色素(アクセプ ター)へのエネルギー転移が生ずることを意味する。１つまたはそれ以上の付加 的な色素部分を含む付加的エネルギー転移もまた生じ得る。
【００１２】 そのため、“エネルギー転移色素”は、２つの色素部分の間にエネルギー転移
が生ずる少なくとも２つの色素部分を有する蛍光色素複合体を意味する。
【００１３】 エネルギー転移配置における“アクセプター”なる語は、ドナー色素部分によ
り放射する波長で、すなわち、アクセプターの吸収スペクトルはドナーの放射ス
ペクトルと重複する波長でエネルギーを吸収する色素部分を意味する。
【００１４】 エネルギー転移配置における“ドナー”なる語は、光からエネルギーを吸収し
、アクセプター色素部分の吸収スペクトル内の少なくとも一部における周波数の
光を放射する色素部分を意味する。
【００１５】 “直線状または分枝状アルキル”なる語は、直鎖状または分枝状飽和脂肪族炭
化水素を意味する。典型的なアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプ
ロピル、ブチル、イソブチル、四級ブチル、ペンチル、へキシルなどを含む。ハ
ロゲンなる語は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を意味する。
【００１６】 本発明の文書中、“標的物質”なる語は、エネルギー転移色素が共有結合する
か、または色素が結合する化合物または構造を意味する。
【００１７】 “生体物質”なる語は、生物により生産される化合物または生物中に存在する
化合物を意味し、ポリペプチド、核酸分子、炭水化物および脂質が含まれるが、
これらに限定されない。その化合物は、エネルギー転移色素の共有結合に適当な
基を含むように誘導体化される。当該語は、本発明の色素が未処理生体で使用さ
れなければならないことを意味するものではない。しばしば色素は、核酸抽出物
のような抽出物または組織切片のような保存サンプルを含むサンプルと共に、ま
たは核酸シーケンシング反応において使用するためである。
【００１８】 好ましくは、エネルギー転移色素は、式(II)： Ｒ1-Ｓ-(ＣＨＲ2)m-ＣＨ(Ｒ3)-ＮＨ-ＣＯ-(ＣＨＲ4)n-ＮＨ-ＣＯ-Ｒ5 [式中、Ｒ1は、エネルギー転移配置においてアクセプターまたはドナーとして適
当な第一色素であり、 Ｒ2は、水素、Ｃ1,2,3 または 4直線状または分枝状アルキルまたはフェニル(所望
により上記のように置換されている)であり、 Ｒ3は、水素であるか、またはチオール以外の反応または官能基であり、 Ｒ4は、水素、Ｃ1,2,3 または 4直線状または分枝状アルキル、または置換されて いるかもしくは置換されていないフェニルであり、 Ｒ5は、第一色素を用いるエネルギー転移配置においてドナーまたはアクセプタ ーとして適当である第二色素であり、 ｍは、１,２または３であり、 ｎは、１,２,３,４,５,６,７,８または９である。] である。
【００１９】 好ましくは、ドナー色素は、フルオレセインまたはシアニン色素である。好ま
しくは、Ｒ1は、色素によるＡのチオール含有部分への共有結合に適当な反応ま たは官能基を含む。チオール基に結合する場合、好ましい反応基は、ヨードアセ
トアミド-およびマレイミド-基を含む。
【００２０】 好ましくは、アクセプターはローダミンまたはシアニン色素である。好ましく
は、Ｒ5は、色素による、Ａの相当する官能または反応基部分の結合に適当な反 応または官能基を含む。例えば、Ｒ5による、アミノで終わるリンカー鎖Ａへの 結合の場合、カルボキシルまたは活性化カルボキシル基を含む色素が好ましい。
リンカー鎖との共有結合形成に適当な反応および官能基含有色素の選択は、当業
者によく知られている。
【００２１】 適当なフルオレセインドナー色素には、５-および６-カルボキシフルオレセイ
ンおよび６-カルボキシ-４',５'-ジクロロ-２',７'-ジメトキシフルオレセイン が含まれるが、これらに制限されない。
【００２２】 適当なシアニンドナー色素には、ＣｙＡ(３-(-カルボキシペンチル)-３'-エチ
ル-５,５'-ジメチルオキサカルボシアニン)、Ｃｙ３(３-(-カルボキシペンチル)
-１'-エチル-３,３,３',３'-テトラメチル-５,５'-ジスルホネート-カルボシア ニンが含まれるが、これらには制限されない。
【００２３】 適当なローダミンアクセプター色素は、６-カルボキシローダミン(ローダミン
１１０)、５-カルボキシローダミン-６Ｇ(Ｒ６Ｇ-５またはＲＥＧ-５)、６-カル
ボキシローダミン-６Ｇ(Ｒ６Ｇ-６またはＲＥＧ-６)、Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメ チル-６-カルボキシローダミン(ＴＡＭＲＡまたはＴＭＲ)、６-カルボキシ-Ｘ- ローダミン(ＲＯＸ)を含むが、これらに制限されない。
【００２４】 適当なシアニンアクセプターには、Ｃｙ３．５(３-(-カルボキシフェニル)-１
'-エチル-３,３,３'３'-テトラメチル-４,５,４',５'-(１,３-ジスルホネート) ジベンゾカルボシアニン)、Ｃｙ５(１-(-カルボキシペンチル)-１'-エチル-３, ３,３',３'-テトラメチル-５,５'-ジスルホネート-ジカルボシアニン、Ｃｙ５. ５(１-(-カルボキシペンチル)-１'-エチル-３,３,３',３'-テトラメチル-４,５,
４',５'-(１,３-ジスルホネート)-ジベンゾ-ジカルボシアニン、Ｃｙ７(１-(-カ
ルボキシペンチル)-１'-エチル-３,３,３',３'-テトラメチル-５,５'-ジスルホ ネート-トリカルボシアニンが含まれるが、これらに制限されない。本発明のエ ネルギー転移色素における使用に適当なシアニン色素は、米国特許出願番号４，
２６８，４８６(Waggoner et al；任意の図面を含むすべてを引用により本明細 書に加える)に開示する。
【００２５】 上記のおよび付加的な色素は、例えばSouthwick et al., 1990, Cytometry 11
:418-430; Mujumdar et al., 1993, Bioconjugate Chemistry 4:105-111;および
Waggoner and Ernst, Fluorescent Reagents for Flow Cytometry, Part 1: Pri
nciples of Clinical Flow Cytometry (1993)に記載されている。
【００２６】 所望により、複合体は、適当なリンカー基を介してＲ5に結合し、Ｒ5を有する
エネルギー転移配置中にある第三色素、例えばシアニン色素を含む。 適当に、Ｒ2は水素またはメチルであり、好ましくは水素である。 ｍが１以外であるとき、幾つかのＲ2基が存在することは当業者ならば明らか である。その状況では、Ｒ2基は同一かまたは異なる。好ましいＲ2は水素である
。
【００２７】 同様に、Ｒ4は好ましくは水素またはメチル、好ましくは水素である。ｎが１ 以外であるとき、Ｒ4基は、同一かまたは異なる。 Ｒ3は、上記定義の通りであり、好ましくは、コハク酸イミジルエステルまた は硫黄-コハク酸イミジルエステルのようなカルボキシルまたは活性化カルボキ シル基である。 適当には、Ｒ1／Ｒ5がフルオレセイン／ローダミン対であるとき、ｍ＋ｎは７
,８,９または１０であり、Ｒ1およびＲ5がシアニン色素であるとき、３,４また は５である。 適当には、ｍは１,２または３、好ましくは１である。適当には、フルオレセ イン／ローダミン対の場合、ｎは１,２,３,４,５,６,７,８または９および好ま しくは５である。
【００２８】 本発明の好ましい化合物は、
【化８】 [式中、Ｓｕ＝Ｎ-ヒドロキシコハク酸イミジル]
【００２９】 更なる態様では、本発明は、式(Ｉ)または(II)のエネルギー転移色素を含む生
体物質に関係する。
【００３０】 適当な生体物質には、抗体、抗原、ペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、
ヌクレオチド、オキシまたはデオキシポリ核酸および必要ならば誘導された細胞
が含まれるがこれらに制限されない。そのため、それらには、エネルギー転移色
素の結合に適当な１つまたはそれ以上の基、例えば、アミノ、ヒドロキシ、チオ
ホスホリル、メルカプトまたはカルボキシ基が含まれる。
【００３１】 更なる態様では、本発明は、少なくとも以下の３つのカップリング反応を用い
本発明のエネルギー転移色素の調製方法を提供する： (ｉ)色素Ｒ1とチオールを含むＡの部分とのカップリング、それはＲ3をも含み[ 式中、Ａ、Ｒ1およびＲ3は上記定義の通り。]、 (ii)反応(ｉ)の生成物と、結合基の形成に適当な反応基、当該Ｄにより置換され
るＡの残存部分とのカップリング、および (iii)反応(ii)の生成物と色素Ｒ5とのカップリング、それによって、結合基、当
該Ｄを形成する。
【００３２】 本エネルギー転移色素およびこれら色素の種々の部分に関連して、“カップリ
ング”なる語は、２つの部分を連結、例えば、色素部分をエネルギー転移色素の
Ａ部分と連結する共有結合の形成を意味する。
【００３３】 カップリング反応の１つにおいて用いられる任意の部分に幾つかの反応基が存
在するとき、その反応に関与しない基はブロックされもしくは保護され、次いで
その後の適当な反応段階で脱保護されることが必要となる。
【００３４】 色素Ｒ1は、チオール基との反応に適当な置換基を通常含むか、またはその基 をを含むように修飾される。例えば、ヨードアセトアミドは、フルオレセイン色
素の置換基に適当であり、マレイミドは、シアニン色素に適当な置換基である。
【００３５】 蛍光性標識エネルギー転移色素を用い、ポリマー粒子、細胞、ガラスビーズ、
抗体、タンパク質、ペプチド、酵素、炭水化物、脂質およびヌクレオチドまたは
核酸(ＤＮＡおよびＲＮＡ)、ならびに抗体、細胞、薬剤、抗体、細菌、ウイルス
および他の微生物のような標的生物学的化合物に特異性を有し共有結合を形成し
得る、標識複合体の官能基と共有結合を形成し得る少なくとも１つの第一反応基
(または上記のように複合体における反応基との共有結合を形成し得る官能基)お
よび少なくとも１つの第二反応基(またはこの場合のような官能基)を含有するか
、またはその含有を誘導する類似体のような担体物質に色素を共有結合すること
により試薬を形成する。
【００３６】 担体が官能基を有するとき、当該官能基は、抗原または相補的ＤＮＡ配列への
結合にそれぞれ適当な抗体またはＤＮＡとなり得る。担体物質が、反応基である
とき、単体は、例えばＤＮＡまたは抗体への結合に適当なポリマー粒子または抗
原となり得る。ここで記載したような担体物質に蛍光色素を共有結合する技術は
、当分野に既知であり、文献において容易に利用可能である。
【００３７】 担体物質は、更に、アミノ、メルカプト、カルボキシ、カルボニルまたはヒド
ロキシル基、ならびにアミノ、チオホスホリル、メルカプト、カルボキシル、カ
ルボニルもしくはヒドロキシル基を含むよう誘導されたオキシもしくはデオキシ
ポリ核酸のうち１つを含むように誘導されたヌクレオチドを含む。
【００３８】 本発明の標識複合体の反応基と相補的、すなわち共有結合可能な担体物質の官
能基には、アミノ、メルカプト、カルボキシル、カルボニルおよびヒドロキシル
基を含む。
【００３９】 本発明は、標識プロセスにも関連し、そのプロセスは、第一ステップで、本発
明のエネルギー転移色素が第一部分と共有結合しそれにより第一部分を標識し、
次いで、標識第一部分を第二部分との結合に使用し、標識第二部分を形成する。
適当には、第一部分は、特異的結合対(特異的結合パートナー)の１メンバーであ
る。当該プロセスの第二ステップでは、次いで、蛍光標識した特異的結合パート
ナーを、特異的親和性を有する特異的結合対の第二メンバー(第二部分)への結合
用プローブとして使用する。
【００４０】 特異的結合対には、任意の名付けられたリガンドおよびレセプターである多種
の分子を含み得る。そのリガンドレセプター対の例には、抗体、および当該抗体
に特異的な相当する抗原が含まれる。その標識した抗体の標的が細胞であるとき
、方法の第二ステップを用い、細胞の蛍光強度を測定することにより当該形の細
胞に結合する標識抗体の量を測定する。この方法により、第一ステップにおいて
本発明の蛍光化合物で共有結合的に標識したモノクローナル抗体および他の部分
を抗原プローブとして用いた。
【００４１】 多くの他の例が当業者に既知である。そのため付加的リガンドレセプター対に
は、例えば、ビオチン-(ストレプト)アビジン、ホルモン、レセプターホルモン 、ＤＮＡ相補的ＤＮＡ、ＤＮＡ-ＲＮＡ、ＤＮＡ-結合タンパク質、酵素基質など
が含まれる。特異的結合親和性を有する任意の２つの分子を用い、本発明のエネ
ルギー転移色素を特異的結合対の１メンバーの標識に用い、次いで、相補的メン
バーの検出に使用し得ると理解される。
【００４２】 本発明のエネルギー転移色素により、多パラメーター分析に特に有用であり、
分子量が重要なことに有意に低い、価値ある一群の蛍光標識が提供され、物質は
細胞構造を通過する蛍光複合体で標識される。それ自体、色素はＤＮＡプローブ
の使用に十分適する。多パラメーター分析は、複数サンプルに実施し得、標的生
体化合物の存在を検出する。各サンプルは、別の色素またはエネルギー転移色素
で標識される既知の方法で標識される。
【００４３】 例えば、標的生体化合物が含まれると思われる、あるサンプルを、フルオレセ
インのような蛍光色素、Cascade Blue、BODIPY色素、またはmonomethine rigidi
zed色素、またはＣＹ３Ｏ(ＳＯ3)2、またはＣＹ３(ＳＯ3)2と共にインキュベー ションし、それらはすべて５００-５７５ｎｍ波長の範囲(緑色から橙色)で放射 する。標的生体化合物を含むと思われる、第二サンプル(サンプル１と同じ化合 物または異なる化合物)を本発明のエネルギー転移色素、例えばフルオレセイン-
ＣＹ３ＮＨ2(４８８ｎｍの光を吸収し、５７４ｎｍの蛍光(橙色)を放射する)と 共にインキュベーションする。他の標的化合物を含むと思われる、更なるサンプ
ルを、フルオレセイン-ＣＹ３-ＣＹ５およびフルオレセイン-ＣＹ３-ＣＹ７(両 方とも、４８８ｎｍの光を吸収するが、それぞれ６７２ｎｍと７８２ｎｍの蛍光
(赤色から赤外線近くまで)を放射する)のような本発明の他の色素と共にインキ ュベーションする。蛍光標識を標的化合物に結合させるのに適当な時間後、結合
していない標識を洗浄により除去し標識したサンプルを混合する。
【００４４】 検出は、単一の波長励起源、すなわち、レーザーライン４８８ｎｍで可能であ
る。それぞれ別の標識をしたサンプルは、特有標識の放射波長で様々な色の蛍光
を発し、個々の標識は相互に識別され得る。
【００４５】 当業者の認識によると、本発明の蛍光エネルギー転移標識色素は、直接及び間
接的免疫アッセイを含む種々の免疫蛍光技術および他の既知の蛍光検出法に使用
し得る。各標識反応の条件、例えば、ｐＨ、温度および時間は当分野で知られて
いるが、一般的に室温が好ましい。アミンと反応させるならば、ｐＨ９．４が好
ましい。ｐＨは、既知技術により特定反応基の最適反応条件に応じて調整される
。
【００４６】 本発明のエネルギー転移色素およびそれらから作成され得る試薬により、大き
なストークシフトを伴う様々な蛍光標識が提供される。当業者の認識によると、
本発明の色素は、広範囲の可視スペクトル全体への種々の蛍光の適用に使用し得
る。
【００４７】 本発明の他の特徴および利点は、以下の好ましい実施態様の詳細および特許請
求の範囲から明らかとなる。
【００４８】 好ましい実施態様の詳細 下記実施例は本発明のエネルギー転移色素の調製の解説のために提供する。こ
れら実施例は、決して本発明の範囲を制限するものではない。
【００４９】 実施例１ ＦＡＭ-システイン-リンカーＲＯＸエネルギー転移色素の調製 ｉ)ＦＡＭ-システインカップリング反応 下記混合物をマイクロ遠心チューブ内で調製する；０．２５Ｍ Ｌ-システイン
(塩基なし)３００ｌ、１Ｍリン酸カリウムｐＨ８ ２００ｌ、ＤＭＦ中の５０ｍ ｇ／ｍｌ ５-ヨードアセトアミド-フルオレセイン(Molecular Probes)溶液８０ ０ｌおよび水７００ｌ。反応混合物を室温で１時間遮光してインキュベーション
した。
【００５０】 ii)ＦＡＭ-システイン-リンカーカップリング反応 ｉ)の粗反応混合物に、水６００ｌ、１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８．３ ４
００ｌおよびＤＭＦ中の６-アミノカプロン酸のトリフルオロアセチル保護ＮＨ Ｓエステル溶液７５ｍｇ／ｍｌ １ｍｌを添加した。反応混合物を室温で１時間 遮光してインキュベーションした。
【００５１】 iii)ＦＡＭ-システイン-リンカーの脱保護 ii)の反応混合物を、Ｓｐｅｅｄ-Ｖａｃ装置中で乾燥し、濃縮水酸化アンモニ
ウム１０ｍｌを当該チューブに加える。混合後、当該反応物を室温で２時間イン
キュベーションし、次いでＳｐｅｅｄ-Ｖａｃ装置で乾燥した。
【００５２】 iv)ＦＡＭ-システインリンカーの精製 精製を、ＤｅｌｔａＰａｋカラム(１５ミクロン、Ｃ１８逆相、７．８×３０ ０ｍｍ)および酢酸トリエチルアンモニウムｐＨ７．０と酢酸トリエチルアンモ ニウムｐＨ７．０中の５０％アセトニトリルとの勾配を用い、ＨＰＬＣにより行
った。４９６ｎｍ吸収の画分を回収し、ＳｐｅｅｄＶａｃ装置で一夜乾燥した。
【００５３】 ｖ)ＦＡＭ-システイン-リンカーＲＯＸカップリング反応 マイクロ遠心チューブに下記のものを加える： ３ｍｇに相当するＤＭＦ中のＨＰＬＣ精製したＦＡＭ-システインリンカー(４９
６ｎｍ吸収で測定されるように)１５０μｌ、水１００μｌ、１Ｍ炭酸ナトリウ ム緩衝液ｐＨ８．３ ５０μｌおよび５'-ＲＯＸ-ＮＨＳエステル(Molecular Pro
bes)(ＤＭＦ中２５ｍｇ／ｍｌ)。反応混合物を一夜室温でインキュベーションし
た。
【００５４】 注：他のローダミンアクセプター色素を上記反応物中ＲＯＸと置換し、連続適
用で使用する４種のエネルギー転移色素を生ずる。
【００５５】 ｖi)ＦＡＭ-システイン-リンカーＲＯＸの精製 ｖ)の生成物エネルギー転移色素は、ＤｅｌｔａＰａｋカラム(１５ミクロン、
３００Ａ、Ｃ１８逆相、７．８×３００ｍｍ)および酢酸トリエチルアンモニウ ムｐＨ７．０と酢酸トリエチルアンモニウムｐＨ７．０中の５０％アセトニトリ
ルとの勾配を用い、逆相ＨＰＬＣにより精製した。４９６ｎｍおよび５７６ｎｍ
の吸収の画分を回収し、プールし、ＳｐｅｅｄＶａｃ装置で一夜乾燥した。生成
物を水に溶解し、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＬＳ-５０Ｂ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎ
ｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを用い分光分析的に評価した。４８８ｎｍの励 起により、強いピークがＲＯＸ放射を特徴とする６０３ｎｍで観察され、顕著な
エネルギー転移が示唆された。吸収スペクトルには、フルオレセインおよびＲＯ
Ｘの両方を特徴するバンドが見られた。
【００５６】 ｖii)カルボン酸誘導体のＮＨＳエステルへの変換 上記エネルギー転移色素のシステインカルボキシルを、下記方法により誘導さ
れるＮＨＳエステルに変換し得る。
【００５７】 上記酸誘導体を１０ｍｇ／ｍｌ濃度でＤＭＦに溶解する。丸底フラスコ中の攪
拌溶液に、１．５ｍｏｌｅ当量のジシクロヘキシルカルボジイミド(ＤＣＣ)およ
び１．５ｍｏｌｅ当量のＮ-ヒドロキシコハク酸イミドを加える。当該混合物を 含むフラスコを密封し、ホイルで覆う。反応物をアルゴン気流中室温で４時間攪
拌する。次いで、遊離酸がＮＨＳエステルに変換するのをモニターする適当な標
準を用いＴＬＣによりチェックする(ＴＬＣはジクロロメタン-メタノール-酢酸
４：１：１)。次いで、活性化色素を、４倍量の酢酸エチルを加えることにより 溶液から沈殿させる。生じたペレットを酢酸エチルで２回リンスし、最終的に真
空の下乾燥した。ＮＨＳエステルは、標準的な条件を用い適当な標的物質(例え ば、オリゴヌクレオチドに連結するアミノ)に連結し得る。
【００５８】 本明細書に記載するすべての特許および刊行物は、本発明に適合する分野の当
業者の技術レベルを示す。本開示で引用する文献はすべて、それぞれすべての引
用により各文献が組込まれるかのようにこれを引用することにより明細書に加え
る。
【００５９】 当業者ならば、本発明が当該対象の実施に適応し、上記目的および利点ならび
にそれに付帯するものを容易に理解し得る。今のところ好ましい実施態様の典型
として、本明細書に記載した色素、置換基および標的物質を例示し、本発明の範
囲の制限を目的とするものではない。この点の変化および他の使用は、当業者に
容易に行え、それらは本発明の真意に含まれ、特許請求の範囲により定義される
。
【００６０】 様々な置換および修飾を、本発明の範囲および真意から外れることなく、本明
細書に開示の発明に行い得る。例えば、本エネルギー転移色素が、種々の色素部
分、リンカー、結合基および反応基に組込まれ、種々の標的物質に結合し得るこ
とが、当業者ならば容易に認識される。そのため、その更なる実施態様は、本発
明および特許請求の範囲内となる。
【００６１】 本発明は、本明細書中で適当に解説的に記載されており、本明細書中では特に
開示していない任意の要素または要素群、制限または制限群なしに実施され得る
。そのため、例えば、本明細書の各場合において、“含む”、“本質的に…から
なる”および“からなる”の任意の語は、他の２つの何れかの語と置換し得る。
用いる語および表現は、記述の語および制限のない語として使用し、示され記載
された特徴の任意の同等物またはその一部を除く語および表現の使用を目的とす
るものではないが、種々の修飾が請求の発明の範囲内で可能であると認識される
。そのため、本発明は、好ましい実施態様および所望の特徴により特に開示され
るが、本明細書に開示の観念の修飾および変形は当業者により行われると理解さ
れ、その修飾および変形は添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲
以内であると思われる。
【００６２】 加えて、本発明の特徴または態様はマーカッシュグループでまたは他の代わり
のグループで記載されており、当業者ならば、本発明はまた、マーカッシュグル
ープまたは他のグループの任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループ
で記載されることを認識するであろう。
【００６３】 そのため、更なる実施態様は、本発明の範囲内であり、特許請求の範囲内であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 800 Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ Ａｖｅｎｕ ｅ， Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ 1327，Ｐｉｓｃａ ｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ 08855−1327，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ ｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ

Claims (52)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 式 【化１】 [式中、Ｒ1は、エネルギー転移配置においてアクセプターまたはドナーとして適
    当な第一色素であり、 Ｒ5は、第一色素を用いるエネルギー転移配置においてドナーまたはアクセプタ ーとして適当である第二色素であり、 Ａは、各原子が炭素、窒素および酸素からなる群より独立して選択される、５な
    いし２０の連結原子の鎖を含み、 Ｒ3は、水素か、またはエネルギー転移色素を、標的物質に結合させるのに適当 な反応もしくは官能基を含み、 Ｄは、当該Ｒ5を当該Ａに結合させる原子または基であって、当該Ａと当該Ｒ5の
    間の共有結合には硫黄原子が含まれない。] のエネルギー転移色素。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載のエネルギー転移色素 [式中、当該Ａ-Ｄは、(ＣＨＲ2)m-ＣＨ(Ｒ3)-ＮＨ-ＣＯ-(ＣＨＲ4)n-ＮＨ-ＣＯ である {式中、Ｒ2は、水素を含むか、アルキルまたはフェニルを含む１,２,３または４
    炭素を含み、 Ｒ3は、チオールではなく、 Ｒ4は、水素であるか、アルキルまたはフェニルを含む１,２,３または４炭素を 含み、 ｍは、１,２または３であり、 ｎは、１,２,３,４,５,６,７,８または９である。}。]。
  3. 【請求項３】 当該ＡがＣ6-Ｃ17炭化水素鎖を含む、請求項１に記載のエネ
    ルギー転移色素。
  4. 【請求項４】 当該Ｒ1がフルオレセイン色素およびシアニン色素からなる 群より選択され、当該Ｒ5がローダミン色素およびシアニン色素からなる群より 選択される、請求項１に記載のエネルギー転移色素。
  5. 【請求項５】 当該Ｒ1が、５-カルボキシフルオレセイン、６-カルボキシ フルオレセイン、６-カルボキシ-４',５'-ジクロロ-２',７'-ジメトキシフルオ レセイン、ＣｙＡ(３-(-カルボキシペンチル)-３'-エチル-５,５'-ジメチルオキ
    サカルボシアニン)およびＣｙ３(３-(-カルボキシペンチル)-１'-エチル-３,３,
    ３',３'-テトラメチル-５,５'-ジスルホネート-カルボシアニン)からなる群より
    選択される、請求項４に記載のエネルギー転移色素。
  6. 【請求項６】 当該Ｒ5が、６-カルボキシローダミン(ローダミン１１０)、
    ５-カルボキシローダミン-６Ｇ(Ｒ６Ｇ-５またはＲＥＧ-５)、６-カルボキシロ ーダミン-６Ｇ(Ｒ６Ｇ-６またはＲＥＧ-６)、Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチル-６- カルボキシローダミン(ＴＡＭＲＡまたはＴＭＲ)、６-カルボキシ-Ｘ-ローダミ ン(ＲＯＸ)、Ｃｙ３．５(３-(-カルボキシフェニル)-１'-エチル-３,３,３'３'-
    テトラメチル-４,５,４',５'-(１,３-ジスルホネート)ジベンゾカルボシアニン)
    、Ｃｙ５(１-(-カルボキシペンチル)-１'-エチル-３,３,３',３'-テトラメチル-
    ５,５'-ジスルホネート-ジカルボシアニン、Ｃｙ５.５(１-(-カルボキシペンチ ル)-１'-エチル-３,３,３',３'-テトラメチル-４,５,４',５'-(１,３-ジスルホ ネート)-ジベンゾ-ジカルボシアニンおよびＣｙ７(１-(-カルボキシペンチル)- １'-エチル-３,３,３',３'-テトラメチル-５,５'-ジスルホネート-トリカルボシ
    アニンからなる群より選択される、請求項４に記載のエネルギー転移色素。
  7. 【請求項７】 当該標的物質には生体物質が含まれる、請求項１に記載のエ
    ネルギー転移色素。
  8. 【請求項８】 当該Ｒ3が、カルボキシル、コハク酸イミジルエステル、硫 黄-コハク酸イミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミドおよびホスホ ラミダイト、ならびにカルボキシル、コハク酸イミジルエステル、硫黄-コハク 酸イミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミドおよびホスホラミダイト
    と共有結合する基からなる群より選択される、請求項１に記載のエネルギー転移
    色素。
  9. 【請求項９】 当該Ｒ3が、カルボキシル、コハク酸イミジルエステル、硫 黄-コハク酸イミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミドおよびホスホ ラミダイト、ならびにカルボキシル、コハク酸イミジルエステル、硫黄-コハク 酸イミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミドおよびホスホラミダイト
    と共有結合する基からなる群より選択される、請求項４に記載のエネルギー転移
    色素。
  10. 【請求項１０】 リンカー基を介して当該Ｒ5に結合[当該結合により、当該
    Ｒ5を伴う当該第三色素のエネルギー転移配置が生ずる。]する第三色素を更に含
    む、請求項１に記載のエネルギー転移色素。
  11. 【請求項１１】 リンカー基を介して当該Ｒ5に結合[当該結合により、当該
    Ｒ5を伴う当該第三色素のエネルギー転移配置が生ずる。]する第三色素を更に含
    む、請求項４に記載のエネルギー転移色素。
  12. 【請求項１２】 当該第三色素がシアニン色素である、請求項１０に記載の
    エネルギー転移色素。
  13. 【請求項１３】 当該第三色素がシアニン色素である、請求項１１に記載の
    エネルギー転移色素。
  14. 【請求項１４】 式 【化２】 [式中、Ｒ1は、エネルギー転移配置においてアクセプターまたはドナーとして適
    当な第一色素であり、 Ｒ5は、第一色素を用いるエネルギー転移配置においてドナーまたはアクセプタ ーとして適当である第二色素であり、 Ａは、各原子が炭素、窒素および酸素からなる群より独立して選択される、５な
    いし２０の連結原子の鎖を含み、 Ｒ3は、水素か、またはエネルギー転移色素を標的物質に結合させるのに適当な 反応もしくは官能基を含み、 Ｄは、当該Ｒ5を当該Ａに結合させる原子または基であって、当該Ａと当該Ｒ5の
    間の共有結合には硫黄原子が含まれない。] のエネルギー転移色素を製造する方法であって、 (ａ)色素Ｒ1とチオールを含むＡの部分とのカップリング [式中、当該Ａはまた当該Ｒ3を含む。]、 (ｂ)部分(ａ)の生成物と、結合基Ｄの形成に適当な反応基により置換されるＡの
    残存部分とのカップリング、および (ｃ)(ｂ)の生成物と当該Ｒ5とのカップリング [それによって、当該結合基Ｄを形成する。]、 を含む方法。
  15. 【請求項１５】 生体物質を蛍光的に標識する方法であって、 (ａ)当該生体物質を含む液体に、式 【化３】 [式中、Ｒ1は、エネルギー転移配置においてアクセプターまたはドナーとして適
    当な第一色素を含み、 Ｒ5は、第一色素を用いるエネルギー転移配置においてドナーまたはアクセプタ ーとして適当である第二色素を含み、 Ａは、各原子が炭素、窒素および酸素からなる群より独立して選択される、５な
    いし２０の連結原子の鎖を含み、 Ｒ3は、水素か、またはエネルギー転移色素を標的物質に結合させるのに適当な 反応もしくは官能基を含み、 Ｄは、当該Ｒ5を当該Ａに結合させる原子または基であって、当該Ａと当該Ｒ5の
    間の共有結合には硫黄原子が含まれる。] のエネルギー転移色素を加えること、 (ｂ)当該色素が共有結合的に当該生体物質と反応し当該生体物質を標識するよう
    に、当該色素を反応させること、 を含む方法。
  16. 【請求項１６】 当該生体物質が、抗体、抗原、ペプチド、タンパク質、炭
    水化物、脂質、ヌクレオチド、オキシまたはデオキシポリ核酸、およびそれらに
    １つまたはそれ以上のアミノ、ヒドロキシ、チオホスホリル、メルカプトまたは
    カルボキシ基が含まれるように、所望により誘導された細胞からなる群より選択
    される、請求項１５に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 当該エネルギー転移色素が、化合物 [式中、当該Ａ-Ｄは、(ＣＨＲ2)m-ＣＨ(Ｒ3)-ＮＨ-ＣＯ-(ＣＨＲ4)n-ＮＨ-ＣＯ であり、 Ｒ2は、水素を含むか、アルキルまたはフェニルを含む１,２,３または４炭素を 含み、 Ｒ3は、チオールではなく、 Ｒ4は、水素を含むか、アルキルまたはフェニルを含む１,２,３または４炭素を 含み、 ｍは、１,２または３であり、 ｎは、１,２,３,４,５,６,７,８または９である。] を含む、請求項１５に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 当該エネルギー転移色素が、化合物 [式中、当該ＡがＣ6-Ｃ17炭化水素鎖を含む。] を含む、請求項１５に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 当該エネルギー転移色素が、化合物 [式中、当該Ｒ1は、フルオレセイン色素およびシアニン色素からなる群より選択
    され、Ｒ5は、ローダミン色素およびシアニン色素からなる群より選択される。]
    を含む、請求項１５に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 当該エネルギー転移色素が、化合物 [式中、当該Ｒ1は、５-カルボキシフルオレセイン、６-カルボキシフルオレセイ
    ン、６-カルボキシ-４',５'-ジクロロ-２',７'-ジメトキシフルオレセイン、Ｃ ｙＡ(３-(-カルボキシペンチル)-３'-エチル-５,５'-ジメチルオキサカルボシア
    ニン)およびＣｙ３(３-(-カルボキシペンチル)-１'-エチル-３,３,３',３'-テト
    ラメチル-５,５'-ジスルホネート-カルボシアニン)からなる群より選択される。
    ] を含む、請求項１９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 当該エネルギー転移色素が、化合物 [式中、当該Ｒ5が、６-カルボキシローダミン(ローダミン１１０)、５-カルボキ
    シローダミン-６Ｇ(Ｒ６Ｇ-５またはＲＥＧ-５)、６-カルボキシローダミン-６ Ｇ(Ｒ６Ｇ-６またはＲＥＧ-６)、Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチル-６-カルボキシロ
    ーダミン(ＴＡＭＲＡまたはＴＭＲ)、６-カルボキシ-Ｘ-ローダミン(ＲＯＸ)、 Ｃｙ３．５(３-(-カルボキシフェニル)-１'-エチル-３,３,３'３'-テトラメチル
    -４,５,４',５'-(１,３-ジスルホネート)ジベンゾカルボシアニン)、Ｃｙ５(１-
    (-カルボキシペンチル)-１'-エチル-３,３,３',３'-テトラメチル-５,５'-ジス ルホネート-ジカルボシアニン、Ｃｙ５.５(１-(-カルボキシペンチル)-１'-エチ
    ル-３,３,３',３'-テトラメチル-４,５,４',５'-(１,３-ジスルホネート)-ジベ ンゾ-ジカルボシアニンおよびＣｙ７(１-(-カルボキシペンチル)-１'-エチル-３
    ,３,３',３'-テトラメチル-５,５'-ジスルホネート-トリカルボシアニンからな る群より選択される。] を含む、請求項１９に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 当該エネルギー転移色素が、化合物 [式中、当該Ｒ3が、カルボキシル、コハク酸イミジルエステル、硫黄-コハク酸 イミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミドおよびホスホラミダイト、
    ならびにカルボキシル、コハク酸イミジルエステル、硫黄-コハク酸イミジルエ ステル、イソチオシアネート、マレイミドおよびホスホラミダイトと共有結合す
    る基からなる群より選択される。] を含む、請求項１５に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 当該エネルギー転移色素が、化合物 [式中、当該Ｒ3が、カルボキシル、コハク酸イミジルエステル、硫黄-コハク酸 イミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミドおよびホスホラミダイト、
    ならびにカルボキシル、コハク酸イミジルエステル、硫黄-コハク酸イミジルエ ステル、イソチオシアネート、マレイミドおよびホスホラミダイトと共有結合す
    る基からなる群より選択される。] を含む、請求項１９に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 当該エネルギー転移色素が、リンカー基を介して当該Ｒ5 に結合[当該結合により、当該Ｒ5を伴う当該第三色素のエネルギー転移配置が生
    ずる。]する第三色素を更に含む化合物を含む、請求項１５に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 当該エネルギー転移色素が、リンカー基を介して当該Ｒ5 に結合[当該結合により、当該Ｒ5を伴う当該第三色素のエネルギー転移配置が生
    ずる。]する第三色素を更に含む化合物を含む、請求項１９に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 当該第三色素が、シアニン色素である、請求項２５に記載
    の方法。
  27. 【請求項２７】 当該第三色素が、シアニン色素である、請求項２４に記載
    の方法。
  28. 【請求項２８】 蛍光的に第一部分を標識し、次いで当該標識第一部分を用
    い、サンプル中の第二部分の存在を検出する方法であって、 ａ)当該第一部分を含む液体に、式 【化４】 [式中、Ｒ1は、エネルギー転移配置においてアクセプターまたはドナーとして適
    当な第一色素を含み、 Ｒ5は、第一色素を用いるエネルギー転移配置においてドナーまたはアクセプタ ーとして適当である第二色素を含み、 Ａは、各原子が炭素、窒素および酸素からなる群より独立して選択される、５な
    いし２０の連結原子の鎖を含み、 Ｒ3は、水素か、またはエネルギー転移色素を標的物質に結合させるのに適当な 反応もしくは官能基を含み、 Ｄは、当該Ｒ5を当該Ａに結合させる原子または基であって、当該Ａと当該Ｒ5の
    間の共有結合には硫黄原子が含まれる。] のエネルギー転移色素を加えること、 ｂ)当該色素が共有結合的に当該第一部分と反応し当該第一部分を標識するよう に、当該色素を当該第一部分と反応させること、 ｃ)当該標識第一部分を当該サンプルに供し、当該標識第一部分を、存在するな らば当該第二部分に結合させること、 ｄ)光学的方法による蛍光標識の検出により、存在するならば当該第二部分を検 出すること、 を含む方法。
  29. 【請求項２９】 当該エネルギー転移色素が、化合物 [式中、当該Ａ-Ｄが、(ＣＨＲ2)m-ＣＨ(Ｒ3)-ＮＨ-ＣＯ-(ＣＨＲ4)n-ＮＨ-ＣＯ であり、 Ｒ2は、水素を含むか、アルキルまたはフェニルを含む１,２,３または４炭素を 含み、 Ｒ3は、チオールではなく、 Ｒ4は、水素を含むか、アルキルまたはフェニルを含む１,２,３または４炭素を 含み、 ｍは、１,２または３であり、 ｎは、１,２,３,４,５,６,７,８または９である。] を含む、請求項２８に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 当該エネルギー転移色素が、化合物 [式中、当該ＡがＣ6-Ｃ17炭化水素鎖を含む。] を含む、請求項２８に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 当該エネルギー転移色素が、化合物 [式中、当該Ｒ1は、フルオレセイン色素およびシアニン色素からなる群より選択
    され、Ｒ5は、ローダミン色素およびシアニン色素からなる群より選択される。]
    を含む、請求項２８に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 当該エネルギー転移色素が、化合物 [式中、当該Ｒ1は、５-カルボキシフルオレセイン、６-カルボキシフルオレセイ
    ン、６-カルボキシ-４',５'-ジクロロ-２',７'-ジメトキシフルオレセイン、Ｃ ｙＡ(３-(-カルボキシペンチル)-３'-エチル-５,５'-ジメチルオキサカルボシア
    ニン)およびＣｙ３(３-(-カルボキシペンチル)-１'-エチル-３,３,３',３'-テト
    ラメチル-５,５'-ジスルホネート-カルボシアニン)からなる群より選択される。
    ] を含む、請求項３１に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 当該エネルギー転移色素が、化合物 [式中、当該Ｒ5が、６-カルボキシローダミン(ローダミン１１０)、５-カルボキ
    シローダミン-６Ｇ(Ｒ６Ｇ-５またはＲＥＧ-５)、６-カルボキシローダミン-６ Ｇ(Ｒ６Ｇ-６またはＲＥＧ-６)、Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチル-６-カルボキシロ
    ーダミン(ＴＡＭＲＡまたはＴＭＲ)、６-カルボキシ-Ｘ-ローダミン(ＲＯＸ)、 Ｃｙ３．５(３-(-カルボキシフェニル)-１'-エチル-３,３,３'３'-テトラメチル
    -４,５,４',５'-(１,３-ジスルホネート)ジベンゾ-カルボシアニン)、Ｃｙ５(１
    -(-カルボキシペンチル)-１'-エチル-３,３,３',３'-テトラメチル-５,５'-ジス
    ルホネート-ジカルボシアニン、Ｃｙ５.５(１-(-カルボキシペンチル)-１'-エチ
    ル-３,３,３',３'-テトラメチル-４,５,４',５'-(１,３-ジスルホネート)-ジベ ンゾ-ジカルボシアニンおよびＣｙ７(１-(-カルボキシペンチル)-１'-エチル-３
    ,３,３',３'-テトラメチル-５,５'-ジスルホネート-トリカルボシアニンからな る群より選択される。] を含む、請求項３１に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 当該標的物質が、生体物質を含む、請求項２８に記載の方
    法。
  35. 【請求項３５】 当該エネルギー転移色素が、化合物 [式中、当該Ｒ3が、カルボキシル、コハク酸イミジルエステル、硫黄-コハク酸 イミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミドおよびホスホラミダイト、
    ならびにカルボキシル、コハク酸イミジルエステル、硫黄-コハク酸イミジルエ ステル、イソチオシアネート、マレイミドおよびホスホラミダイトと共有結合す
    る基からなる群より選択される。] を含む、請求項２８に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 当該エネルギー転移色素が、化合物 [式中、当該Ｒ3が、カルボキシル、コハク酸イミジルエステル、硫黄-コハク酸 イミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミドおよびホスホラミダイト、
    ならびにカルボキシル、コハク酸イミジルエステル、硫黄-コハク酸イミジルエ ステル、イソチオシアネート、マレイミドおよびホスホラミダイトと共有結合す
    る基からなる群より選択される。] を含む、請求項３１に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 当該エネルギー転移色素が、リンカー基を介して当該Ｒ5 に結合[当該結合により、当該Ｒ5を伴う当該第三色素のエネルギー転移配置が生
    ずる。]する第三色素を更に含む化合物を含む、請求項２８に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 当該エネルギー転移色素が、リンカー基を介して当該Ｒ5 に結合[当該結合により、当該Ｒ5を伴う当該第三色素のエネルギー転移配置が生
    ずる。]する第三色素を更に含む化合物を含む、請求項３１に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 当該第三色素がシアニン色素である、請求項３７に記載の
    方法。
  40. 【請求項４０】 当該第三色素がシアニン色素である、請求項３８に記載の
    方法。
  41. 【請求項４１】 ａ)式 【化５】 [式中、Ｒ1は、エネルギー転移配置においてアクセプターまたはドナーとして適
    当な第一色素を含み、 Ｒ5は、第一色素を用いるエネルギー転移配置においてドナーまたはアクセプタ ーとして適当である第二色素を含み、 Ａは、各原子が炭素、窒素および酸素からなる群より独立して選択される、５な
    いし２０の連結原子の鎖を含み、 Ｒ3は、水素か、またはエネルギー転移色素を標的物質に結合させるのに適当な 反応もしくは官能基を含み、 Ｄは、当該Ｒ5を当該Ａに結合させる原子または基であって、当該Ａと当該Ｒ5の
    間の共有結合には硫黄原子が含まれる。] のエネルギー転移色素、 ｂ)官能基と共有結合を形成し得る少なくとも１つの第一反応基、またはエネル ギー転移色素の反応基と共有結合を形成し得る官能基を含有するか、またはその
    含有を誘導し、それと共有結合する担体物質 を含む試薬。
  42. 【請求項４２】 当該担体物質が、ポリマー粒子、細胞、ガラスビーズ、抗
    体、タンパク質、ペプチド、酵素、炭水化物、脂質およびヌクレオチドからなる
    群より選択される、請求項４１に記載の試薬。
  43. 【請求項４３】 当該エネルギー転移色素が、化合物 [式中、当該Ａ-Ｄが、(ＣＨＲ2)m-ＣＨ(Ｒ3)-ＮＨ-ＣＯ-(ＣＨＲ4)n-ＮＨ-ＣＯ であり、 Ｒ2は、水素を含むか、アルキルまたはフェニルを含む１,２,３または４炭素を 含み、 Ｒ3は、チオールではなく、 Ｒ4は、水素を含むか、アルキルまたはフェニルを含む１,２,３または４炭素を 含み、 ｍは、１,２または３であり、 ｎは、１,２,３,４,５,６,７,８または９である。] を含む、請求項４２に記載の試薬。
  44. 【請求項４４】 当該エネルギー転移色素が、化合物 [式中、当該ＡがＣ6-Ｃ17炭化水素鎖を含む。] を含む、請求項４２に記載の方法。
  45. 【請求項４５】 当該エネルギー転移色素が、化合物 [式中、当該Ｒ1は、フルオレセイン色素およびシアニン色素からなる群より選択
    され、Ｒ5は、ローダミン色素およびシアニン色素からなる群より選択される。]
    を含む、請求項４１に記載の試薬。
  46. 【請求項４６】 当該エネルギー転移色素が、化合物 [式中、当該Ｒ1は、５-カルボキシフルオレセイン、６-カルボキシフルオレセイ
    ン、６-カルボキシ-４',５'-ジクロロ-２',７'-ジメトキシフルオレセイン、Ｃ ｙＡ(３-(-カルボキシペンチル)-３'-エチル-５,５'-ジメチルオキサカルボシア
    ニン)およびＣｙ３(３-(-カルボキシペンチル)-１'-エチル-３,３,３',３'-テト
    ラメチル-５,５'-ジスルホネート-カルボシアニン)からなる群より選択される。
    ] を含む、請求項４５に記載の試薬。
  47. 【請求項４７】 当該エネルギー転移色素が、化合物 [式中、当該Ｒ5が、６-カルボキシローダミン(ローダミン１１０)、５-カルボキ
    シローダミン-６Ｇ(Ｒ６Ｇ-５またはＲＥＧ-５)、６-カルボキシローダミン-６ Ｇ(Ｒ６Ｇ-６またはＲＥＧ-６)、Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチル-６-カルボキシロ
    ーダミン(ＴＡＭＲＡまたはＴＭＲ)、６-カルボキシ-Ｘ-ローダミン(ＲＯＸ)、 Ｃｙ３．５(３-(-カルボキシフェニル)-１'-エチル-３,３,３'３'-テトラメチル
    -４,５,４',５'-(１,３-ジスルホネート)ジベンゾ-カルボシアニン)、Ｃｙ５(１
    -(-カルボキシペンチル)-１'-エチル-３,３,３',３'-テトラメチル-５,５'-ジス
    ルホネート-ジカルボシアニン、Ｃｙ５.５(１-(-カルボキシペンチル)-１'-エチ
    ル-３,３,３',３'-テトラメチル-４,５,４',５'-(１,３-ジスルホネート)-ジベ ンゾ-ジカルボシアニンおよびＣｙ７(１-(-カルボキシペンチル)-１'-エチル-３
    ,３,３',３'-テトラメチル-５,５'-ジスルホネート-トリカルボシアニンからな る群より選択される。] を含む、請求項４５に記載の試薬。
  48. 【請求項４８】 当該標的物質が、生体物質を含む、請求項４１に記載の試
    薬。
  49. 【請求項４９】 当該エネルギー転移色素が、化合物 [式中、当該Ｒ3が、カルボキシル、コハク酸イミジルエステル、硫黄-コハク酸 イミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミドおよびホスホラミダイト、
    ならびにカルボキシル、コハク酸イミジルエステル、硫黄-コハク酸イミジルエ ステル、イソチオシアネート、マレイミドおよびホスホラミダイトと共有結合す
    る基からなる群より選択される。] を含む、請求項４１に記載の試薬。
  50. 【請求項５０】 当該エネルギー転移色素が、リンカー基を介して当該Ｒ5 に結合[当該結合により、当該Ｒ5を伴う当該第三色素のエネルギー転移配置が生
    ずる。]する第三色素を更に含む化合物を含む、請求項４１に記載の試薬。
  51. 【請求項５１】 当該第三色素がシアニン色素である、請求項５０に記載の
    試薬。
  52. 【請求項５２】 ａ)式 【化６】 [式中、Ｒ1は、エネルギー転移配置においてアクセプターまたはドナーとして適
    当な第一色素を含み、 Ｒ5は、第一色素を用いるエネルギー転移配置においてドナーまたはアクセプタ ーとして適当である第二色素を含み、 Ａは、各原子が炭素、窒素および酸素からなる群より独立して選択される、５な
    いし２０の連結原子の鎖を含み、 Ｒ3は、水素か、またはエネルギー転移色素を標的物質に結合させるのに適当な 反応もしくは官能基を含み、 Ｄは、当該Ｒ5を当該Ａに結合させる原子または基であって、当該Ａと当該Ｒ5の
    間の共有結合には硫黄原子が含まれる。] のエネルギー転移色素、 ｂ)官能基と共有結合を形成し得る少なくとも１つの第一反応基、またはエネル ギー転移色素の反応基と共有結合を形成し得る官能基を含有するか、またはその
    含有を誘導し、それと共有結合する生体物質 を含み、結合エネルギー転移色素を有する生体物質。
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