JP2005529219A - 少なくとも1のオリゴヌクレオチドに共有結合するフルオロフォアを含みかつ少なくとも1の官能基を含む蛍光物質、並びにその使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、1以上のオリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチド・アナログに共有結合するフルオロフォアであって、希土類金属クリプテートを除くものを含み、かつフルオロフォア上に、又はオリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチド・アナログのうちの1に導入されるか又は作られ、単体分子と結合することを許容する少なくとも1の官能基を含む蛍光物質に関する。本発明は、担体分子に共有結合する蛍光物質からなる蛍光抱合体に関し、並びに蛍光トレーサーの使用に関する。
Description
本発明は、1以上のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド・アナログに共有結合するフルオロフォアを含み、かつフルオロフォア上又はオリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチド・アナログの1上に導入されるか又は作成される少なくとも1の官能基を含む蛍光物質に関する。
有機分子の多くのファミリーが、多くの適用、特に生体分子を追跡する又は定量することを可能にする診断方法において、生体分子に対する蛍光標識として使用される。
特に、ローダミン、サイアニン、スクアライン(squaraines)、又はボディピー(Bodipy)色素が言及される。多くのこれらの分子は、高い分子吸光係数(100000M-1cm-1より大きいことも多い)及び通常20%より大きい蛍光量子収量を有する。
しかし、これらの蛍光物質がかなりの疎水性の性質を有するため、タンパク質毎に幾つかの蛍光標識を有することが所望されるとき、それらの有機分子は、生体分子、特にタンパク質の表面で凝集を形成する傾向を有する(U. Schobel et al., Bioconjugate chem., 1999,10, 1107-1114)。これらの凝集体は、実質的に非蛍光性であるので、タンパク質の表面に存在する蛍光分子の平均量子収量は、元の分子の量子収量より有意に低い。
この問題に打ち勝つために、文献において、特にスルホン酸基を加えることにより、蛍光分子の親水性の性質を増大するある試みが行われた(US5,268,486)。糖又は炭水化物残渣を、蛍光分子の構造に付加することも言及された(WO 98/49176)。しかしながら、これらのユニットの付加は、それを抑制することなく、凝集現象を制限する。
タンパク質の標識後、別の試みが、蛍光の量子収量の減少を避けるために使用された。WO 98/26287は、シクロデキストリンを使って、タンパク質の表面に蛍光分子を封入し、そしてその凝集を制限する方法を記載する。しかしながら、該技術は、全ての分子タイプでは、満足に機能しなかった。
一つの蛍光分子のみをタンパク質の表面に有するタンパク質を得ることができ、かつ凝集現象を避けることにより高量子収量を維持することができる技術が最近記載された(Winckler et al., Specific labeling of proteins using reactive affinity tag-dye systems, SBS Conference, Vancouver, 2000)。該システムは、制限的である。なぜなら、該システムはタンパク質毎に複数の蛍光分子を持たせることが出来ないからである。
それゆえ、解決される問題は、生体分子に結合できる標識を提供することであり、これらの複数の標識が同時に生体分子、特にタンパク質に結合したとき、その光物理学的性質は、特に凝集現象によって改変されない。
本発明に従って、該問題は、フルオロフォアを1以上のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド・アナログに結合することにより解決されうる。こうして形成された化合物は、1以上の反応性基を含み、担体分子への結合を許容する。
第一の態様に従って、本発明はそれゆえ、1以上のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド・アナログに共有結合するフルオロフォア(但し、希土類金属クリプテートを除く)を含む蛍光物質に関し、該蛍光物質がフルオロフォア又はオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドのうちの1上に導入されるか又は作成される少なくとも1の官能基を含むという点で特徴付けられる。
本発明に従った蛍光物質のフルオロフォアは、1以上の芳香環を好ましくは含み、そして、20000以上、好ましくは50000以上の高い分子吸光係数を有する。
上記フルオロフォアは、好ましくは、ローダミン、サイアニン、スクアライン、ボディピー、フルオレセイン、及びその誘導体から好ましくは選ばれる。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、オリゴデオキシリボヌクレオチド(DNA断片)またはオリゴリボヌクレオチド(RNA断片)を等しく意味する。
「オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド・アナログ」という用語は、本記載において、以下:
- ホスホジエステル型の結合を介して互いに結合されたリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド・ユニットの列;
- 又は、リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチドユニットの列、又は糖若しくは塩基を改変されるヌクレオチドアナログのユニットの列であって、該ユニットがホスホジエステル型の天然のヌクレオチド間の結合により互いに結合され、ここでヌクレオチド間結合のいくつかは、場合によりホスホネート、ホスホールアミド、又はホスホロチオエート結合で場合により置換される列。これらの様々なオリゴヌクレオチド・ファミリーは、Goodchild,Bioconjugate Chemistry, 1 (3), May/June 1990,77-99において記載される。
- 又は、ホスホジエステル型の結合によって互いに結合されるリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド・ユニット、並びにアミド結合、通常「PNAs」(ペプチド核酸)と呼ばれるアミド結合(M. Egholm et al., J. Am. Chem. Soc.,1992,114, 1895-1897によって記載される)によって、互いに結合されるヌクレオシドアナログ・ユニットの両者を含む列、ここでそうした化合物は、例えば、R. Vinayak et al., Nucleoside & Nucleotide, 1997,16 (7-9), 1653-1656において記載される。
- 又はリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドユニットの列、ここで、ヌクレオシドの幾つか又はヌクレオチド間結合の幾つかは、天然のオリゴリボヌクレオチド又はオリゴデオキシリボヌクレオチドに比較して改変されており、通常のヌクレオシド(アデノシン、デオキシアデノシン、シチジン、デオキシシチジン、グアノシン、デオキシグアノシン、ウリジン又はチミジン)から、ホスフェート架橋、例えばホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド(OPT)により形成され、ここでホスフェート架橋の全て又は一部は、チオホスフェート架橋で置換された(P. J. Romaniuk, F. Eckstein (1982) J. Biol. Chem. 257,7684)。
を意味すると企図される。
- ホスホジエステル型の結合を介して互いに結合されたリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド・ユニットの列;
- 又は、リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチドユニットの列、又は糖若しくは塩基を改変されるヌクレオチドアナログのユニットの列であって、該ユニットがホスホジエステル型の天然のヌクレオチド間の結合により互いに結合され、ここでヌクレオチド間結合のいくつかは、場合によりホスホネート、ホスホールアミド、又はホスホロチオエート結合で場合により置換される列。これらの様々なオリゴヌクレオチド・ファミリーは、Goodchild,Bioconjugate Chemistry, 1 (3), May/June 1990,77-99において記載される。
- 又は、ホスホジエステル型の結合によって互いに結合されるリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド・ユニット、並びにアミド結合、通常「PNAs」(ペプチド核酸)と呼ばれるアミド結合(M. Egholm et al., J. Am. Chem. Soc.,1992,114, 1895-1897によって記載される)によって、互いに結合されるヌクレオシドアナログ・ユニットの両者を含む列、ここでそうした化合物は、例えば、R. Vinayak et al., Nucleoside & Nucleotide, 1997,16 (7-9), 1653-1656において記載される。
- 又はリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドユニットの列、ここで、ヌクレオシドの幾つか又はヌクレオチド間結合の幾つかは、天然のオリゴリボヌクレオチド又はオリゴデオキシリボヌクレオチドに比較して改変されており、通常のヌクレオシド(アデノシン、デオキシアデノシン、シチジン、デオキシシチジン、グアノシン、デオキシグアノシン、ウリジン又はチミジン)から、ホスフェート架橋、例えばホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド(OPT)により形成され、ここでホスフェート架橋の全て又は一部は、チオホスフェート架橋で置換された(P. J. Romaniuk, F. Eckstein (1982) J. Biol. Chem. 257,7684)。
を意味すると企図される。
オリゴヌクレオチドのこれらの型の各々1の使用は、本発明の有利な態様を構成する。
ヌクレオチド又はヌクレオシド「アナログ」という用語は、糖又は核酸塩基に関する少なくとも1の改変、或いはそれらの改変の組み合わせを含むヌクレオチド/ヌクレオシドを意味すると意図される。例として、以下の改変について言及される。
I. 糖に関する改変(ヌクレオチド又はヌクレオシド・アナログ):
1゜) (遊離又はホスフェート架橋に含まれる)水酸基の立体配置が、天然立体配置(DNA列ではβ-D-エリスロであり、RNA列ではβ-D-リボである)とは異なるという点で、糖要素は改変されうる。アナログにおいては、例えばβ-D-アラビノ-ペントフラノシド又はβ-D-キシロ-ペントフラノシドを有する。
2゜) ヌクレオチド内結合が、2'→5'型であるという点で、構造は改変されうる。例えば、β-D-リボ-ペントフラノシド-2'-ホスフェート又は3’-デオキシ-β-D-エリスロ-ペントフラノシド-2'-ホスフェート誘導体である。
構造が、前述の二つの改変を含むようにヌクレオチドは存在する。例えばβ-D-キシロ-ペントフラノシド-2'-ホスフェートである。
3゜) 4'炭素が反対の立体配置を有するという点で、構造は天然モデルと異なりうる。つまり、α-L-スレオ-ペントフラノシド-3'-ホスフェートの場合である。違いは、1'位(アノマー位)における炭素の立体配置に関しており、つまりα-D-エリスロ-ペントフラノシド-3'-ホスフェートの場合である。ヌクレオチド/ヌクレオシドが、構造が前述の2つの改変を含んで存在する。例えばβ-L-スレオ-ペントフラノシド-3'-ホスフェートである。
4゜) 4'位の酸素が、炭素で置換される(炭素環アナログ)か又は硫黄で置換されるという点で、構造は天然モデルと異なりうる。例えば4'-チオ-β-D-エリスロ-ペンタフラノシド-3'-ホスフェートである。
5゜) 糖の水酸基の一つがアルキル化されるという点で、構造は天然モデルと異なりうる。例えば、骨格において、2'-O-アルキル-β-D-リボ-ペンタフラノシド-3'-ホスフェートであり、該アルキル基は、例えばメチル又はアリル基でありうる。
6゜) 糖要素のみが保存される(例えば、1,2-ジデオキシ-D-エリスロ-ペンタフラノース-3-ホスフェート)という点で、或いは糖がプロパンジオールなどのポリオールで置換されるという点で構造は天然モデルと異なりうる。
I. 糖に関する改変(ヌクレオチド又はヌクレオシド・アナログ):
1゜) (遊離又はホスフェート架橋に含まれる)水酸基の立体配置が、天然立体配置(DNA列ではβ-D-エリスロであり、RNA列ではβ-D-リボである)とは異なるという点で、糖要素は改変されうる。アナログにおいては、例えばβ-D-アラビノ-ペントフラノシド又はβ-D-キシロ-ペントフラノシドを有する。
2゜) ヌクレオチド内結合が、2'→5'型であるという点で、構造は改変されうる。例えば、β-D-リボ-ペントフラノシド-2'-ホスフェート又は3’-デオキシ-β-D-エリスロ-ペントフラノシド-2'-ホスフェート誘導体である。
構造が、前述の二つの改変を含むようにヌクレオチドは存在する。例えばβ-D-キシロ-ペントフラノシド-2'-ホスフェートである。
3゜) 4'炭素が反対の立体配置を有するという点で、構造は天然モデルと異なりうる。つまり、α-L-スレオ-ペントフラノシド-3'-ホスフェートの場合である。違いは、1'位(アノマー位)における炭素の立体配置に関しており、つまりα-D-エリスロ-ペントフラノシド-3'-ホスフェートの場合である。ヌクレオチド/ヌクレオシドが、構造が前述の2つの改変を含んで存在する。例えばβ-L-スレオ-ペントフラノシド-3'-ホスフェートである。
4゜) 4'位の酸素が、炭素で置換される(炭素環アナログ)か又は硫黄で置換されるという点で、構造は天然モデルと異なりうる。例えば4'-チオ-β-D-エリスロ-ペンタフラノシド-3'-ホスフェートである。
5゜) 糖の水酸基の一つがアルキル化されるという点で、構造は天然モデルと異なりうる。例えば、骨格において、2'-O-アルキル-β-D-リボ-ペンタフラノシド-3'-ホスフェートであり、該アルキル基は、例えばメチル又はアリル基でありうる。
6゜) 糖要素のみが保存される(例えば、1,2-ジデオキシ-D-エリスロ-ペンタフラノース-3-ホスフェート)という点で、或いは糖がプロパンジオールなどのポリオールで置換されるという点で構造は天然モデルと異なりうる。
II. 核酸塩基(ヌクレオチドアナログ)に関する改変:
1゜) 核酸塩基の置換基が改変されるという点で核酸塩基は改変されうる。例えば2,6-ジアミノプリン、ヒポキサンチン、4-チオチミン、4-チオウラシル、又は5-エチニルウラシル。
2゜) 置換基の位置が、天然の塩基と比較して変えられうる。例えば、イソグアノシン又はイソシトシン。
3゜)核酸塩基の窒素原子が、炭素で置換されうる。例えば、7-デアザグアノシン又は7-デアザアデニン。
1゜) 核酸塩基の置換基が改変されるという点で核酸塩基は改変されうる。例えば2,6-ジアミノプリン、ヒポキサンチン、4-チオチミン、4-チオウラシル、又は5-エチニルウラシル。
2゜) 置換基の位置が、天然の塩基と比較して変えられうる。例えば、イソグアノシン又はイソシトシン。
3゜)核酸塩基の窒素原子が、炭素で置換されうる。例えば、7-デアザグアノシン又は7-デアザアデニン。
III. ヌクレオチド間結合に関する修飾
さらに前記のように、糖ユニット間又はそのアナログ間の結合は、例えば、天然ホスホジエステル結合の1以上の酸素を、炭素(ホスホネート系)、窒素(ホスホラミド系)、又は硫黄(ホスホロチオエート)で置き換えることにより、改変されうる。
さらに前記のように、糖ユニット間又はそのアナログ間の結合は、例えば、天然ホスホジエステル結合の1以上の酸素を、炭素(ホスホネート系)、窒素(ホスホラミド系)、又は硫黄(ホスホロチオエート)で置き換えることにより、改変されうる。
ヌクレオチド間結合は、アミド結合で置換されうる。例えば「PNA」型のオリゴヌクレオチド・アナログである。
好ましい態様に従って、オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル型の結合により互いに結合されるリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドユニット、並びにアミド結合により互いに結合されるヌクレオシドアナログユニットを含む列からなる。
特に、この場合、前記オリゴヌクレオチドは、フルオロフォアに結合することを企図される末端で、ホスホジエステル型の少なくとも5個のヌクレオチド間結合を含みうる。
好ましくは、前記オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド・アナログは、5〜60個、特に5〜20個、好ましくは5〜15個のヌクレオチドユニットを含む。
本発明に従った蛍光物質は、担体分子と結合することを許容する少なくとも1の官能基を含むべきである。
有利なことに、官能基は、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド・アナログのヌクレオチドユニットのアミン官能基であるか、又は同種二機能性又は異種二機能性試薬を使用して、オリゴヌクレオチドの又はオリゴヌクレオチド・アナログのヌクレオチドユニットの遊離アミン官能基を反応させることから得られる。該試薬は、以下の基:カルボン酸の活性化エステル、カルボン酸、イソチオシアネート、アルデヒド、カルボニル、スルホニル・ハライド、アルキルハライド、アジド、ヒドラジド、ジクロロトリアジン、無水物、ハロアセトミド、マレイミド、及びスルフヒドリルから選ばれる官能基を導入することを可能とする。同種二機能性及び異種二機能性試薬並びにその使用は、「Bioconjugation」(chapters 5.3 to 5.6, M. Aslam & A. Dent, Macmillan, London, 1998)において記載される。
前記官能基は、例えば、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド・アナログのユニットの遊離アミン官能基を、N-ヒドロキシスクシンイミジル・エステルと反応することから得られる。
好ましい態様に従って、官能基は以下の基:マレイミド、カルボン酸、ハロアセトアミド、アルキル・ハライド、アジド、ヒドラジド、アルデヒド、ケトン、アミノ、スルフヒドリル、イソチオシアネート、イソシアネート、モノクロロトリアジン、ジクロロトリアジン、アジリジン、スルホニル・ハライド、酸無水物、ヒドロキシスクシンイミド・エステル、ヒドロキシスルホスクシンイミド・エステル、イミドエステル、ヒドラジド、 アジドニトロフェニル、アジドフェニル、アジド、3-(2-ピリジルジチオ)-プロプリオンアミド(proprionamide)、及びグリオキサール、より特異的に以下の式:
(式中、nは0〜8の範囲であり、かつpは、0又は1と等しく、そしてArは、1〜3のヘテロ原子を含む5-又は6員環の複素環であり、場合によりハロゲン原子で置換される)
で表される基から選ばれる。
で表される基から選ばれる。
有利な態様に従って、官能基は、フルオロフォア及び/又はオリゴヌクレオチドに、スペーサー腕により結合される。該スペーサー腕は、場合により、1以上の二重結合若しくは三重結合を含み、及び/又は場合により1以上のヘテロ原子、例えば、酸素、窒素、硫黄、リンを含み、或いは1以上のカルバモイル若しくはカルボキサミド基を含む直鎖又は分枝鎖C1〜C20アルキレン基;C5〜C8シクロアルキレン基;並びにC6〜C14アリーレン基から選ばれる二価有機ラジカルからなる。ここで、前記アルキレン、シクロアルキレン、アリーレン基は、場合によりアルキル、アリール、又はスルホネート基で置換される。
好ましい態様に従って、本発明は、以下の式(I):
[式中、
-Aは、以下の基:
{式中、
- 点線は、1〜3個の融合環を形成するために必要とされる炭素原子を表し、R3基は、該環に結合し;
- X及びYは、各々N、C=O、O、S、又はC(CH3)2を表し、
- mは、1、2、3、又は4の値を有し;
- qは、1、2、又は3の値を有し;
- (R3)qは、q個のR3基を表し、該R3はそれぞれが同一であるか又は異なりうる;
- R1、R2、及びR3基は、同一であるか異なり、そして水素;-(CH2)s-Z基(基中、-sは0〜4の範囲であり、かつZが、CH3、SO3H、OH、又はN+R1R2R3であり、ここでR1、R2、及びR3は、上で定義される通りである)、上で定義される官能基、及び場合により上で定義される官能基を含むオリゴヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチド・アナログから選ばれる}で表される基から選ばれ;
-R4は、H;OH;CH3;Cl;及び以下の式:
で表される基から選ばれ、アリル位における置換基R4は、ポリエチレン鎖と共に、4〜14個の原子を含む1〜3の融合環を形成し、該環は、飽和されるか又は不飽和であり、該環は1以上のO、N、及びS原子を含むことがあり、そして場合によりオキソ基で置換されうる]
で表される蛍光物質に関する。
-Aは、以下の基:
- 点線は、1〜3個の融合環を形成するために必要とされる炭素原子を表し、R3基は、該環に結合し;
- X及びYは、各々N、C=O、O、S、又はC(CH3)2を表し、
- mは、1、2、3、又は4の値を有し;
- qは、1、2、又は3の値を有し;
- (R3)qは、q個のR3基を表し、該R3はそれぞれが同一であるか又は異なりうる;
- R1、R2、及びR3基は、同一であるか異なり、そして水素;-(CH2)s-Z基(基中、-sは0〜4の範囲であり、かつZが、CH3、SO3H、OH、又はN+R1R2R3であり、ここでR1、R2、及びR3は、上で定義される通りである)、上で定義される官能基、及び場合により上で定義される官能基を含むオリゴヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチド・アナログから選ばれる}で表される基から選ばれ;
-R4は、H;OH;CH3;Cl;及び以下の式:
で表される蛍光物質に関する。
都合の良いことに、本発明は、以下の式(IV)、(V)、(VI)、又は(VII):
{式中、R1、R2、R3、及びR5は、同一であるか又は異なり、そして、水素;-(CH2)s-Z基(基中、-sは0〜4の範囲であり、かつZが、CH3、SO3H、OH、又はN+R1R2R3であり、ここでR1、R2、及びR3は、上で定義される通りである);上で定義される通りの官能基、又はオリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチド・アナログから選ばれる}において表される蛍光物質に関する。
別の好ましい態様に従って、本発明は以下の式(VIII):
[式中、
置換基R6〜R12は、以下:水素;ハロゲン;アルキル;シクロアルキル;アリール;アリールアルキル;アシル;スルホ;上で定義される官能基又はオリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチド・アナログから選ばれる。 ]で表される蛍光物質に関する。
置換基R6〜R12は、以下:水素;ハロゲン;アルキル;シクロアルキル;アリール;アリールアルキル;アシル;スルホ;上で定義される官能基又はオリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチド・アナログから選ばれる。 ]で表される蛍光物質に関する。
特に好ましい式(IX)の物質は、X及びYがC(CH3)2基を表す物質であり、かつ
-R1及びR2が、1〜4個の炭素原子を含むアルキル又は以下の式の基を表し、少なくとも1のR1及びR2基は、以下の式:
で表される基を表し、
- R4が、水素を表し、
- q=1、m=2であり、
- R3が、水素;-(CH2)s-Z基(基中、sは0〜4の範囲であり、かつZが、CH3、SO3H、OH、又はN+R1R2R3を表し、ここでR1、R2、及びR3は、上で定義される通りである);上で定義される官能基又はオリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチド・アナログを表し;
-R4が、H;OH;CH3;Cl;及び以下の式:
で表される基から選ばれ、アリル位における置換基R4が、ポリエチレン鎖と共に、4〜14個の原子を含む1〜3の融合環を形成し、該環は、飽和されるか又は不飽和であり、該環は1以上のO、N、及びS原子を含むことがあり、そして場合によりオキソ基で置換されうる。
-R1及びR2が、1〜4個の炭素原子を含むアルキル又は以下の式の基を表し、少なくとも1のR1及びR2基は、以下の式:
- R4が、水素を表し、
- q=1、m=2であり、
- R3が、水素;-(CH2)s-Z基(基中、sは0〜4の範囲であり、かつZが、CH3、SO3H、OH、又はN+R1R2R3を表し、ここでR1、R2、及びR3は、上で定義される通りである);上で定義される官能基又はオリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチド・アナログを表し;
-R4が、H;OH;CH3;Cl;及び以下の式:
都合の良いことに、本発明に従った蛍光物質は、オリゴヌクレオチドに直接又はスペーサー腕を介して共有結合するフルオロフォアを含む。
該スペーサー腕は、1以上の二重結合又は三重結合及び/又は場合により1以上のヘテロ原子、例えば酸素、窒素、硫黄、リン、又は1以上カルバモイル若しくはカルボキサミド基を場合により含む直鎖状又は分枝鎖状のC1〜C20アルキレン基;C5〜C8シクロアルキレン基;及びC6〜C14 アリーレン基から選ばれる二価有機ラジカルからなり、前記アルキレン、シクロアルキレン又はアリーレン基は、アルキル、アリール、又はスルホネート基で場合により置換されるか、又は以下の基:
[基中、n1及びn2は2〜6の間である。]
から選ばれる。
から選ばれる。
次の態様に従って、本発明は、担体分子に共有結合される、上で定義される物質からなる蛍光抱合体に関する。
都合の良い抱合体は、担体分子あたりの蛍光物質のモル数として定義される
終モル比は、0より大きく100未満、好ましくは20未満である。
終モル比は、0より大きく100未満、好ましくは20未満である。
担体分子は、例えば抗体、抗原、細胞内メッセンジャー、細胞間メッセンジャー、タンパク質、ペプチド、ハプテン、レクチン、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、トキシン、炭水化物、オリゴ糖、多糖、核酸、ホルモン、ビタミン、薬用製品、ポリマー、ポリマー製粒子、ガラス、ガラス粒子、又はガラス若しくはポリマーから作られる表面である。
本発明に従った蛍光物質の使用は、フルオロフォアの凝集体を実質的に示さない抱合体を生産することを可能にする。結果として、フルオロフォアの量子収量は、終モル収量(担体分子あたりの蛍光物質のモル数)が増加するときでさえも、担体分子へ結合した後においてもほぼ完全に保存されうる。
このことにより、これらの抱合体は、非照射性エネルギー転移(HTRF型)を使用する蛍光システムにおける使用にとても有利になる。担体分子あたりのフルオロフォアの数、フルオロフォアの量子収量及び分子吸光係数が、これらのシステムの感受性の主要な判定基準である場合、該抱合体は、蛍光による慣用の検出技術よりかなり有利である。
本発明はそれゆえ、特に医薬生成物のスクリーニング方法において、蛍光により、分析物を含む媒体中の該分析物を検出及び/又は測定すること、又は生体分子間の相互作用を検出すること;又は生理活性、例えば:酵素活性、膜結合受容体の活性化、遺伝子の転写、膜輸送、若しくは膜分極の変動などを測定することを目的として、上で定義される蛍光物質又は蛍光抱合体を、蛍光トレーサーとして使用することに関する。
本発明に従った蛍光抱合体は、特に蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光偏向、又は蛍光相関において蛍光化合物のドナーの存在下で蛍光化合物の受容体として使用されうるか、蛍光化合物の受容体の存在下で蛍光化合物のドナーとして使用されうる。
該抱合体は、in vivoにおける光学イメージングのコントラスト剤として、都合よく使用されうる。
本発明の対象は、フルオロフォアに結合する担体分子の表面で、凝集現象を低減するための方法であり、上で定義される蛍光物質が、上記フルオロフォアの変わりに使用されるという点で特徴付けられる。
最終的に、本発明の対象は、担体分子に結合するフルオロフォアの量子収量を増加する方法であり、上で定義される蛍光物質が、フルオロフォアとして使用されるという点で特徴付けられる。
本発明に従った蛍光物質は、以下に記載されるように、「官能性を持たせた」オリゴヌクレオチドを、フルオロフォアとカップリングすることにより調製されうる。
本記載において、「官能性を持たせたオリゴヌクレオチド」という用語は、少なくとも1の化学的に反応性のある官能基、又は化学基(たとえば蛍光基)を含むオリゴヌクレオチドを意味することを企図され、該オリゴヌクレオチドは、天然オリゴヌクレオチドにおいては存在せず、かつ化学的に反応性の官能基又は化学基を有する改変されたヌクレオチド又は非ヌクレオチド・ユニット取り込むことからもたらされる。該化学的に反応性の官能基は、とりわけ、オリゴヌクレオチド又は改変されたオリゴヌクレオチドの抱合体の合成を行うことを可能にする。「化学的に反応性がある官能基」、「改変されたヌクレオチド」、「非ヌクレオチド・ユニット」、及び「オリゴヌクレオチド抱合体」という用語は、例えばJ. Goodchild による総説[Conjugates of oligonucleotides and modified oligonucleotides: A review of their synthesis and properties. Bioconjugate chemistry, (1990) 1 (3), 77-99]で記載される意味において理解される。「天然オリゴヌクレオチド」という用語は、核酸において存在するヌクレオチドユニットの列によって形成されるポリヌクレオチドを指す[Abbreviations and symbols for the description of conformations of polynucleotide chains. Eur. J. Biochem. (1983) 131,9-15]。
以下の例は、本発明を非制限的な様式で例示する。
以下の略語が使用される:
DTT:ジチオスレイトール
DSS:N-(ジスクシンイミジル)スベレート
GST:グルタチオン・S-トランスフェラーゼ
MOPS:3-[N-モルフォリノ]プロパンスルホン酸
SPDP:N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート
SSMCC:4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-l-カルボン酸の3-スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミド・エステル
TEAB:トリエチルアンモニウム・ビカルボネート
TEA Ac:10%アセトニトリルを含むトリエチルアンモニウム・アセテート
DTT:ジチオスレイトール
DSS:N-(ジスクシンイミジル)スベレート
GST:グルタチオン・S-トランスフェラーゼ
MOPS:3-[N-モルフォリノ]プロパンスルホン酸
SPDP:N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート
SSMCC:4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-l-カルボン酸の3-スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミド・エステル
TEAB:トリエチルアンモニウム・ビカルボネート
TEA Ac:10%アセトニトリルを含むトリエチルアンモニウム・アセテート
I/抱合体の合成
実施例1:CY5-T15-ヘキシルアミン、CY5-T10へキシルアミン、及びCY5-T5へキシルアミンの合成
該実施例は、5’末端で、非スルホン化CY5などのサイアニン分子で官能性を与えられ、3'末端で、関心の生物分子を標識するために使用されうるアミン基を有する腕で官能性を与えられるT5、T10、又はT15配列のオリゴヌクレオチドの合成を記述する。実施例についてのCY15-T10へキシルアミン化合物の一般的な構造は、5'(CY5-TTT TTT TTT T-ヘキシルアミン)3’により表される。
実施例1:CY5-T15-ヘキシルアミン、CY5-T10へキシルアミン、及びCY5-T5へキシルアミンの合成
該実施例は、5’末端で、非スルホン化CY5などのサイアニン分子で官能性を与えられ、3'末端で、関心の生物分子を標識するために使用されうるアミン基を有する腕で官能性を与えられるT5、T10、又はT15配列のオリゴヌクレオチドの合成を記述する。実施例についてのCY15-T10へキシルアミン化合物の一般的な構造は、5'(CY5-TTT TTT TTT T-ヘキシルアミン)3’により表される。
「ヘキシルアミン」という用語は、6個の炭素原子から構成され、置換され、かつアミン官能基を有しうる腕を指す。
本実施例において、2-ヒドロキシメチル-6-アミノヘキサノール腕は、3'末端に位置するヌクレオチドの3’位における水酸基と、腕の2-ヒドロキシメチルとの間で形成されるリン酸架橋を介して結合される。
オリゴヌクレオチドの合成に慣用的に使用されるCPG(制御孔ガラス(Controlled pore glass)の固体支持体が使用される。そうした支持体は、「官能性をあたえられた」といわれる。なぜなら、オリゴヌクレオチドの最後の脱保護の後で、脂肪性の第一アミン官能基を放出することが出来る保護アミン官能基を有する化学構造が、CPG上に繋がれるからである。
市販のチミジンのホスホラミダイト誘導体を、T15の配列を合成するために使用する。
オリゴヌクレオチドの5’位に、サイアニン(CY5)などの蛍光マーカーを直接導入することができる、市販の非スルホン化サイアニンのホスホラミダイト誘導体を使用する。
該合成を、自動DNA合成機(Applied Biosystems type 392)を製品プロトコルに従って使用して行う。2-O-ジメトキシトリチル-6-フルオレニル・メトキシカルボニルアミノヘキサン-1-スクシノイル-長鎖アルキルアミノ-CPG誘導体を繋がれた固体支持体(CPG)(1μmol)を合成機に設置し、チミジンのホスホラミダイト誘導体を使用して、15サイクルの合成を行い、そして次に非スルホン化サイアニン(CY5)のホスホラミダイト誘導体を使用して1回のカップリングサイクルを行うことにより、T15の配列を合成した。
該合成の終わりにおいて、製品プロトコルに従って、カラムをアンモニア処理し(約2mlの28%アンモニア水)、オリゴヌクレオチドとCPG支持体との間の結合を分解することを可能にした。放出されたオリゴヌクレオチドを集めたフラスコを密閉し、50〜55℃で二時間維持し、そして次に室温に戻した。フラスコの内容物(2ml)を次に5mlポリプロピレン・チューブ移し、そして次に、スピード-vac(speed-vac)を使用して吸引下で蒸発させて乾燥させた。残渣を次に500μlの10mM・TEABで溶解した。得られた溶液は、「粗製」オリゴヌクレオチド及び主に所望の5’(CY5-(T)15-2-オキシメチル-6-アミノヘキサノール)3’を含む。
リクロスファー(LiChrospher)RP-18e・250-10・(10μ)カラム(Merck)上で、水性TEAAc中のアセトニトリル勾配(緩衝液A:25mM・TEAAC中の5%アセトニトリル、緩衝液B:25mM・TEAAc中の50%アセトニトリル;流速5ml/分、20分間における10%Bから20%Bへの直線的勾配、及び10分間における20%から100%の直線的勾配)を使用して、HPLC精製をした後に、5’(CY5-(T)15-2-オキシメチル-6-アミノヘキサノール)3’化合物を得た。不完全であり、かつCY5を含まない配列は、20分あたりで溶出し、所望の配列5’(CY5-(T)15-2-オキシメチル-6-アミノヘキサノール)3’を含む分画は、28分あたりで収集された(これらの分画は、CY5基の存在のため青色であった。)
所望の配列を含む分画を貯め、そしてスピード-vacを使用して蒸発させて乾燥させた。残渣を純水で溶解した。該溶液の希釈液にあてられたUV/可視光スペクトル(210nm〜750nm)は、260nmでの吸光度によってオリゴヌクレオチドの濃度を決定することを可能とし、そしてその650nmでの吸光度によりサイアニン基(CY5)の存在を特徴付けることを可能とした。
CY5-T10-ヘキシルアミン及びCY5-T5-ヘキシルアミンの化合物は、自動合成機における合成サイクル数を変えることにより、同様に合成される。
実施例2:SMCCによるCY5-T15-ヘキシル-アミン、CY5-T10-ヘキシルアミン、及びCY5-T5-ヘキシルアミン化合物の3’位の活性化
実施例1から得られたCY5-T15-ヘキシルアミンを、200mM・PO4緩衝液で溶解し、pHを8に調節した。
実施例1から得られたCY5-T15-ヘキシルアミンを、200mM・PO4緩衝液で溶解し、pHを8に調節した。
SSMCCの250当量を、得られた溶液に添加した。反応混合液を攪拌しながら30分間室温でインキュベーションした。
以後でCY5-T15-マレイミドと呼ばれる(以後CY5-T15(mal)と名付けられる)SSMCCで活性化されたCY5-T15-ヘキシルアミン化合物は、2mM・EDTA、pH7を含む10mM・PO4緩衝液中のHR10/30G25(SF)カラムで精製された。精製を60ml/hで行った。
CY5-T15-マレイミド溶液を、スピード-vacで蒸発することにより濃縮した。
同じ手順を、CY5-T10-ヘキシルアミンについて行った。
CY5-T5-ヘキシルアミン化合物の活性化のために、SSMCCの150当量のみを使用した。HR10/30カラムでの更なる精製ステップが必要である。
実施例3:DSS(N-(ジスクシンイミジル・スベレート)による3位におけるCY5-T15-ヘキシルアミンの活性化
実施例1で得られたCY5-T15-ヘキシルアミン化合物を、10μlの100mM・MOPS緩衝液(pH7.6)及び5μlのアセトニトリルで溶解した。
実施例1で得られたCY5-T15-ヘキシルアミン化合物を、10μlの100mM・MOPS緩衝液(pH7.6)及び5μlのアセトニトリルで溶解した。
DSS(DMF中で35mg/ml)の150当量を、得られた溶液に加えた。
反応混合液を攪拌しながら4℃で一晩インキュベーションした。
以後CY5-T15-NHSと呼ばれる、DSSで活性化されたCY5-T15-ヘキシルアミン化合物を、5mM・MOPS緩衝液pH6.5においてNAP5G25(SF)カラム上で精製した。
CY5-T15-NHS化合物を、次にブタノールでの数回の精製並びに遠心により濃縮した。ペレットを水で溶解した。
CY5-T10-ヘキシルアミン及びCY5-T5-ヘキシルアミン化合物を活性化するために同様の手順を行った。
実施例4:SMCCで活性化されたCY5-(T) n -ヘキシルアミン − 抗GST抗体(GSS11)抱合体の調製
GSS11-T15-CY5バッチ(Batch)02B(mal):
0.1M炭酸塩緩衝液、pH9中のGSS11抗体(CIS bio international, France) を、8当量のSPDPを室温で30分間攪拌しながら加え、そして次に終濃度20mMのDTTを攪拌せずに室温で15分間で加えることにより活性化した。
GSS11-T15-CY5バッチ(Batch)02B(mal):
0.1M炭酸塩緩衝液、pH9中のGSS11抗体(CIS bio international, France) を、8当量のSPDPを室温で30分間攪拌しながら加え、そして次に終濃度20mMのDTTを攪拌せずに室温で15分間で加えることにより活性化した。
0.1M・PO4緩衝液、pH7中のHR10/10G25(SF)カラムで精製した。
そうして活性化された抗体を、CY5-T15-マレイミド/抗体GSS11の開始モル比7.6で、実施例2で得たオリゴヌクレオチドCY5-T15-マレイミドと混合した。該インキュベーションは、4℃で18〜20時間であった。
カップリングの間における抗体濃度は、0.5mg/mlである。
GSS11-T15-CY5バッチ03(mal):
GSS11抗体は、5mMの濃度でDTTを添加することによってのみ活性化される。上記バッチ02Bと同様の手順を、CY5-T15-マレイミド/抗体GSS11の開始モル比10.8で行った。
カップリングの間の抗体濃度は、この場合、0.68mg/mlであった。
GSS11抗体は、5mMの濃度でDTTを添加することによってのみ活性化される。上記バッチ02Bと同様の手順を、CY5-T15-マレイミド/抗体GSS11の開始モル比10.8で行った。
カップリングの間の抗体濃度は、この場合、0.68mg/mlであった。
GSS11-T5-CY5バッチ01(mal):
CY5-T5-マレイミド/抗体GSS11の開始モル比8で、上記バッチ02Bと同様の手順を行った。
カップリングの間の抗体濃度は、0.9mg/mlである。
CY5-T5-マレイミド/抗体GSS11の開始モル比8で、上記バッチ02Bと同様の手順を行った。
カップリングの間の抗体濃度は、0.9mg/mlである。
GSS11-T10-CY5バッチ01(mal):
GSS11-T5-CY5バッチ01(mal)と同様の手順を行った。
カップリング生成物を、60ml/hでHR10/30スペルデックス(superdex)200カラム上で生成した。
溶出緩衝液は、0.1Mリン酸緩衝液、pH7であった。
ダイオード・アレイ検出器を使用して精製を行った(様々な波長で行った)。
GSS11-T5-CY5バッチ01(mal)と同様の手順を行った。
カップリング生成物を、60ml/hでHR10/30スペルデックス(superdex)200カラム上で生成した。
溶出緩衝液は、0.1Mリン酸緩衝液、pH7であった。
ダイオード・アレイ検出器を使用して精製を行った(様々な波長で行った)。
実施例5:DSSで活性化されたCY5-(T)n-ヘキシルアミン − 抗GST抗体(GSS11)抱合体の調製
GSS11-T15-CY5バッチ01(NHS):
0.1M炭酸塩緩衝液、pH9中のGSS11抗体を、実施例3中で得られたCY5-T15-NHS溶液と混合する。CY5-T15-NHS/抗体の開始モル比は8であった。カップリングの間における抗体濃度は、3.3mg/mlである。インキュベーションは、室温で攪拌せずに30分間であった。
GSS11-T15-CY5バッチ01(NHS):
0.1M炭酸塩緩衝液、pH9中のGSS11抗体を、実施例3中で得られたCY5-T15-NHS溶液と混合する。CY5-T15-NHS/抗体の開始モル比は8であった。カップリングの間における抗体濃度は、3.3mg/mlである。インキュベーションは、室温で攪拌せずに30分間であった。
GSS11-T15-CY5バッチ02 (NHS):
プロトコルは、GSS11-T15-CY5バッチ01NHSと同じであり、CY5-T15-NHS/抗体の開始モル比は12であった。インキュベーションは、室温で攪拌しながら2時間30分間であった。
プロトコルは、GSS11-T15-CY5バッチ01NHSと同じであり、CY5-T15-NHS/抗体の開始モル比は12であった。インキュベーションは、室温で攪拌しながら2時間30分間であった。
カップリング生成物を、HR10/30スペルデックス200カラム上で、60ml/hで精製した。溶出緩衝液は、0.1Mリン酸緩衝液、pH7であった。
精製をダイオード・アレイ検出器を使用して行った(様々な波長で行った)。
実施例6:CY5スルホ-GSS11抱合体の合成
オリゴヌクレオチドを含まない抱合体は、本発明に従った抱合体の利点を示すために参照化合物として貢献する。
オリゴヌクレオチドを含まない抱合体は、本発明に従った抱合体の利点を示すために参照化合物として貢献する。
スルホン化サイアニンがここで使用される。前述の例において使用される非スルホン化サイアニンは使用されない。なぜなら、後者がオリゴヌクレオチドに結合されない場合、後者の量子収量は、実質的に0であるからである。
GSS11-CY5スルホ バッチM5:
スルホン化サイアニン(CY5スルホ)モノNHSを、0.1M炭酸塩緩衝液、pH9中のGSS11抗体に添加した。
スルホン化サイアニン(CY5スルホ)モノNHSを、0.1M炭酸塩緩衝液、pH9中のGSS11抗体に添加した。
CY5スルホ/抗体の開始モル比は4であった。
インキュベーションは、攪拌しながら室温で1時間であり、カップリングの間における抗体濃度は、5.2mg/mlであった。
精製は、0.1Mリン酸緩衝液pH7において、HR10/10G25(SF)カラム上で行われた。
GSS11-CY5スルホバッチM6:
プロトコルは、上記バッチM5と同じであるが、CY5スルホ/抗体の開始モル比が10であった。
プロトコルは、上記バッチM5と同じであるが、CY5スルホ/抗体の開始モル比が10であった。
GSS11-CY5スルホバッチM7:
プロトコルは、上記バッチM5)同じであるが、CY5スルホ/抗体の開始モル比が20であった。
プロトコルは、上記バッチM5)同じであるが、CY5スルホ/抗体の開始モル比が20であった。
実施例7:CY5-A15-cAMP抱合体の調製
Cy5-A15-ヘキシルアミンは、アデノシンのホスホラミダイト誘導体を、チミジンのホスホラミダイト誘導体の代わりに使用することにより、実施例1においてCY5-T15-ヘキシルアミンに記載される手順と同様の手順に従って獲得される。
Cy5-A15-ヘキシルアミンは、アデノシンのホスホラミダイト誘導体を、チミジンのホスホラミダイト誘導体の代わりに使用することにより、実施例1においてCY5-T15-ヘキシルアミンに記載される手順と同様の手順に従って獲得される。
2'-モノスクシニルアデノシン 3',5'-サイクリック・モノホスフェート(cAMP-succ-NHS)のN-ヒドロキシスクシンイミド・エステルの合成を以下のとおりに行った:
2mg(3.9μmol)の2'-モノスクシニルアデノシン・3',5'-サイクリック・モノホスフェート(ナトリウム塩、Sigma #M9631)を、エッペンドルフチューブ内で15μlのN-ヒドロキシスクシンイミド(無水DMSO中で13.3mg/ml)の溶液中に懸濁した。
2mg(3.9μmol)の2'-モノスクシニルアデノシン・3',5'-サイクリック・モノホスフェート(ナトリウム塩、Sigma #M9631)を、エッペンドルフチューブ内で15μlのN-ヒドロキシスクシンイミド(無水DMSO中で13.3mg/ml)の溶液中に懸濁した。
35μlの(1-(3-ジミメチルアミノプロピル)-3エチルカルボジイミド・ヒドロクロリド(無水DMSO中に200mg/ml)溶液を、次に反応体積に加えて、そして室温で振盪機上に設置した。
90分間の反応後、反応混合液を、DMSOqs160μlで希釈し、その結果[cAMP-succ-NHS]=23nmol/μlを得、それを抱合体の合成に使用した。
H2O中に溶解したcAMP-succ-NHSを、10mMのTEAB緩衝液、pH8.5中のCY5-A15-ヘキシルアミンの溶液と混合した。カップリング反応の間、cAMP-NHS/CY5-A15-ヘキシルアミンのモル比は20であった。カップリング中のcAMPの濃度は、5μmol/mlであった。インキュベーションは、攪拌しながら室温で2時間30分間であった。
精製は、0.1M PO4緩衝液、pH7中のNap5(G25)上でデサリフィケーション(desalification)を使用して、行われた。
II-光物理学的性質
実施例8:量子収量及びODmax/OD604nm比の比較
量子収量は、蛍光物質が受けたエネルギーを放出する際の蛍光物質の効率を示す。量子収量が高ければ高いほど、蛍光物質の効率が高くなる。該量子収量が蛍光光度計を使用して計測される。励起は、600nmで起こり、蛍光は、615〜750nmで計測された。得られた蛍光スペクトルの領域は、計算され、そして量子収量を決定するために使用された。
実施例8:量子収量及びODmax/OD604nm比の比較
量子収量は、蛍光物質が受けたエネルギーを放出する際の蛍光物質の効率を示す。量子収量が高ければ高いほど、蛍光物質の効率が高くなる。該量子収量が蛍光光度計を使用して計測される。励起は、600nmで起こり、蛍光は、615〜750nmで計測された。得られた蛍光スペクトルの領域は、計算され、そして量子収量を決定するために使用された。
終モル比(FMR)は、タンパク質に共有結合するフルオロフォアの数を示す。
蛍光物質の吸収スペクトルは、ODmax/OD604nm比を計算することを可能にした。該比は、標識タンパク質、例えばGSS11抗体又はストレプトアビジンなどの表面上での、フルオロフォア、例えばCY5のおこりうる凝集現象を示す。
量子収量及びODmax/OD604nm比を前記実施例に従って合成された様々な化合物について決定した。
8.1/ 以下の表1において与えられる結果は、上記実施例において調製される(オリゴヌクレオチドを含まない)参照抱合体に関する。
これらの結果により、スルホン化サイアニン、つまりCY5スルホをGSS11抗体と結合させることは、ODmax/OD604nm比の減少によって示されるように、特に抗体表面でのCY5の凝集現象を付随する量子収量の低下を導くということを示された。
抗体分子あたりのCY5分子数(FMR)が増加すると、量子収量が低減する。
8.2/以下の表2に与えられる結果は、実施例4及び5において調製された抱合体に関する。参照として使用されるCY5-T10-ヘキシルアミン、及びCY5-T15-ヘキシルアミン化合物は、実施例1において記載されるように調製される。
本発明に従ってGSS11抗体を、蛍光物質と結合するとき、FMRsの増加に関し、参照抱合体と比較して量子収量及びODmax/OD604nm比のかなり小さい減少が観測される。このことは明らかに、本発明に従った蛍光物質が、標識タンパク質(ここではGSS11抗体)の表面での凝集を減じるという完全に予期しない性質を示すということを示す。
さらに、得られた結果は、CY5-T15-ヘキシルアミン化合物の活性化方法(DSS又はSSMCC)と無関係である。
8.3/ 以下の表3において与えられた結果は、実施例7において調製される生成物に関する。参照として使用されるCY5-A15-ヘキシルアミンは、実施例1においてCY5-T15-ヘキシルアミンについて記載される手順に従って調製される。
上の結果は、蛍光物質の蛍光量子収量が、サイクリックAMPに結合後わずかに増加するということを示す。こうして作られた抱合体は、凝集の徴候を示さず、そしてそれゆえ予期しない蛍光性質を有する。
実施例9:一定抗体濃度での蛍光スペクトル
様々な抱合体で得られた蛍光レベルを比較するために、蛍光放出スペクトル(放出波長の機能として、蛍光強度)を一定の抗体濃度(50nM)で作り出した。該スペクトルをLS50B分光蛍光光度計(PerkinElmer)上で、以下の設定で作り出した:励起波長600nm、放出波長615〜750nm、スキャン速度480nm/分。これらのスペクトルに基き、積分により得られるスペクトルの面積を計算することにより抱合体の蛍光強度を決定することができる。
様々な抱合体で得られた蛍光レベルを比較するために、蛍光放出スペクトル(放出波長の機能として、蛍光強度)を一定の抗体濃度(50nM)で作り出した。該スペクトルをLS50B分光蛍光光度計(PerkinElmer)上で、以下の設定で作り出した:励起波長600nm、放出波長615〜750nm、スキャン速度480nm/分。これらのスペクトルに基き、積分により得られるスペクトルの面積を計算することにより抱合体の蛍光強度を決定することができる。
図1におけるグラフは、抱合体GSS11-CY5スルホの場合、抗体表面におけるCY5の過度の凝集のため、抱合体のFMRの増加が、その全体の蛍光の減少を導くことを示す。他方、抱合体GSS11-T15-CY5の場合、CY5の凝集がないことにより、高い量子収量を維持することができ、結果として抗体毎のCY5の数と実質的に比例する全体の蛍光を得た。
III-FRET (「蛍光共鳴エネルギー転移」) 型アッセイにおける本発明に従った蛍光物質の使用。
実施例10:
本発明に従った蛍光物質は、当業者に周知のFRET型システムにおいて使用されうる。
実施例10:
本発明に従った蛍光物質は、当業者に周知のFRET型システムにおいて使用されうる。
本実施例において、ビオチン化グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST-ビオチン)は、ドナー化合物(ユーロピウム・クリプテート-ストレプトアビジン(K(EU)-Sa))と本発明に従った蛍光物質(抱合体GSS11-オリゴヌクレオチド-CY5)を含む受容体との間のエネルギー転移からもたらされる、受容体化合物により放出される蛍光を計測することによって、検出される。
プロトコル・アッセイ:
該アッセイは、蛍光光度計(Discovery,Packard)を用いて行われた。放出波長は、337nmであった。蛍光を665及び620nmで計測した。
アッセイ緩衝液: 50mM Hepes、pH7、0.1%BSA、400mM・KF
試薬: GST-ビオチン、20nM溶液
ドナー: Sa-K(EU)NHS(CIS bio international)
受容体: GSS11-XL665(CIS bio international)、参照化合物として使用される。
GSS11-T15-CY5 バッチ 02B mal (実施例4) FMR 4.3
GSS11-T15-CY5 バッチ 03mal (実施例4) FMR 1.4
GSS11-T15-CY5 バッチ 01NHS (実施例5) FMR 2
GSS11-T15-CY5 バッチ 02NHS (実施例5) FMR 5.1
GSS11-T10-CY5 バッチ 01mal (実施例4) FMR 4.6
GSS11-T15-CY5 バッチ 01mal (実施例4) FMR 8.7
該アッセイは、蛍光光度計(Discovery,Packard)を用いて行われた。放出波長は、337nmであった。蛍光を665及び620nmで計測した。
アッセイ緩衝液: 50mM Hepes、pH7、0.1%BSA、400mM・KF
試薬: GST-ビオチン、20nM溶液
ドナー: Sa-K(EU)NHS(CIS bio international)
受容体: GSS11-XL665(CIS bio international)、参照化合物として使用される。
GSS11-T15-CY5 バッチ 02B mal (実施例4) FMR 4.3
GSS11-T15-CY5 バッチ 03mal (実施例4) FMR 1.4
GSS11-T15-CY5 バッチ 01NHS (実施例5) FMR 2
GSS11-T15-CY5 バッチ 02NHS (実施例5) FMR 5.1
GSS11-T10-CY5 バッチ 01mal (実施例4) FMR 4.6
GSS11-T15-CY5 バッチ 01mal (実施例4) FMR 8.7
以下の混合液を、室温で20時間インキュベーションした。
- 終濃度0-0.31-0.62-1.25-2.5、又は5nMのGST-ビオチン50μl
- 終濃度2.5nMの受容体100μl
- 終濃度1nMのドナー50μl
- 終濃度0-0.31-0.62-1.25-2.5、又は5nMのGST-ビオチン50μl
- 終濃度2.5nMの受容体100μl
- 終濃度1nMのドナー50μl
図2におけるグラフは、FRET型のアッセイにおける、蛍光標識としての本発明にしたがった蛍光物質の利点を示す。特に、全ての場合において、本発明に従った蛍光物質を使用して観測されるシグナルは、参照受容体化合物(XL)で得られるシグナルより大きいか又は同等である。
実施例11:抱合体の寿命及び転移効率
FRET型のアッセイ、例えば前述の実施例のアッセイにおいて得られる寿命及び転移効率は、計算された。試験される抱合体を、実施例4及び5において記載されるように調製し、抱合体GSS11-XL665は、参照化合物として貢献した。
結果は以下の表4において与えられる。
FRET型のアッセイ、例えば前述の実施例のアッセイにおいて得られる寿命及び転移効率は、計算された。試験される抱合体を、実施例4及び5において記載されるように調製し、抱合体GSS11-XL665は、参照化合物として貢献した。
結果は以下の表4において与えられる。
該結果により、ドナー化合物と、受容体として使用される本発明に従った抱合体との間におけるエネルギー転移効率が、本発明に従った抱合体において、XL665(コントロール)の効率よりかなり高いということが示される。
実施例12:
蛍光物質は、当業者に周知のFRET競合系において使用されうる。
蛍光物質は、当業者に周知のFRET競合系において使用されうる。
本実施例において、試料中のサイクリックAMP(cAMP)の存在は、ドナー化合物(ユーロピウム・クリプテート-抗-cAMPモノクローナル抗体の抱合体)と蛍光物質を含む受容体化合物(CY5-A15-cAMP抱合体)との間におこる蛍光エネルギー転移の阻害を観測することにより検出される。
アッセイプロトコル:
該アッセイは、分光光度計(Rubystar, BMG)を使用して行われる。この励起波長は337nmである。該蛍光は、665nm及び620nmで計測される。
該アッセイは、分光光度計(Rubystar, BMG)を使用して行われる。この励起波長は337nmである。該蛍光は、665nm及び620nmで計測される。
アッセイ緩衝液:0.1Mホスフェート、pH7、0.1%BSA、400mM・KF
試薬:cAMP、280nMの溶液
ドナー:ユーロピウム・クリプテート-抗-cAMPモノクローナル抗体(抗-cAMP-K)(Cis bio international)
受容体:Cy5-A15-cAMP抱合体(Cis bio international)
cAMP-XL665抱合体、該抱合体は参照化合物として使用される
試薬:cAMP、280nMの溶液
ドナー:ユーロピウム・クリプテート-抗-cAMPモノクローナル抗体(抗-cAMP-K)(Cis bio international)
受容体:Cy5-A15-cAMP抱合体(Cis bio international)
cAMP-XL665抱合体、該抱合体は参照化合物として使用される
以下の混合液を室温で20時間インキュベーションした。
- 緩衝液25μl
- 0-0.07-0.27-1.09-4.37-17.5、又は70nMの終濃度でのcAMP25μl
- cAMP-XL665又はCy5-A15-cAMP 25μl
- 抗-cAMP-K 25μl
- 緩衝液25μl
- 0-0.07-0.27-1.09-4.37-17.5、又は70nMの終濃度でのcAMP25μl
- cAMP-XL665又はCy5-A15-cAMP 25μl
- 抗-cAMP-K 25μl
図3は、増加するcAMP量の存在において、2つのインキュベーション時間(1h及び20h)で獲得されるFRETシグナルの阻害(DF/DFmax)を示す。
図3におけるグラフは、FRET競合型のアッセイにおいて、蛍光標識としての本発明の蛍光物質の利点を示す。該試験の感受性は、実験のインキュベーション時間の限りでは、本発明に従った蛍光物質を使用することにより改良される。さらに、参照受容体(XL665)で観測される1時間と20時間の間における感受性の喪失は、本発明に従った蛍光物質が使用されるとき、なくなる。
Claims (41)
- 1以上のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド・アナログに共有結合するフルオロフォアを含む蛍光物質であって、該蛍光物質がフルオロフォア上又はオリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチド・アナログのうちの1上に導入されるか又は作成される少なくとも1の官能基を含むことを特徴とする前記物質。但し、上記フルオロフォアは、希土類金属クリプテートではない。
- 前記オリゴヌクレオチド又は前記オリゴヌクレオチド・アナログが、2〜60個のヌクレオチド・ユニットを含むことを特徴とする、請求項1に記載の物質。
- 前記官能基が、スペーサー腕を介して前記物質に結合しうることを特徴とする、請求項1又は2に記載の物質。
- 前記フルオロフォアが、1以上の芳香環を含み、そして20000より大きい、好ましくは50000より大きい、高い分子吸光係数を有することを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の物質。
- 前記フルオロフォアが、ローダミン、サイアニン、スクアライン、ボディピー、フルオロセイン、及びそれらの誘導体から選ばれることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の物質。
- 前記官能基が以下の群:マレイミド、カルボン酸、ハロアセトアミド、アルキル・ハライド、アジド、ヒドラジド、アルデヒド、ケトン、アミノ、スルフヒドリル、イソチオシアネート、イソシアネート、モノクロロトリアジン、 ジクロロトリアジン、 アジリジン、 スルホニル ・ハライド、酸ハライド、ヒドロキシスクシンイミド・エステル、ヒドロキシスルホスクシンイミド・エステル、イミド・エステル、ヒドラジド、アジドニトロフェニル、アジドフェニル、アジド、3-(2-ピリジルジチオ)プロプリオンアミド、及びグリオキサール、及びより特異的に以下の式:
で表される基から選ばれることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の物質。 - 以下の式(I):
- Aは、以下の基:
- 点線は、各々1〜3個の融合環を形成するために必要とされる炭素原子を表し、R3基は、該環に結合し;
- X及びYは、各々N、C=O、O、S、又はC(CH3)2を表し、
- mは、1、2、3、又は4の値を有し;
- qは、1、2、又は3の値を有し;
- (R3)qは、q個のR3基を表し、該R3は同一であるか又は異なりうる;
- R1、R2、及びR3基は、同一であるか又は異なり、そして水素;-(CH2)s-Z基(基中、sは0〜4の範囲であり、かつZは、CH3、SO3H、OH、又はN+R1R2R3を表し、ここでR1、R2、及びR3は、上で定義される通りである)、請求項6において定義される官能基;並びに場合により請求項6において定義される官能基を含むオリゴヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチド・アナログから選ばれる}から選ばれる基を表し;
- R4は、H;OH;CH3;Cl;及び以下の式:
で表される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の蛍光物質。 - 以下の式(II)又は式(III):
- 点線は、1〜3個の融合環を形成するために必要とされる炭素原子を表し、R3基は、該環に結合する;
- Xは、N、C=O、O、S、又はC(CH3)2を表し、
- mは、1、2、3、又は4の値を有し;
- qは、1、2、又は3の値を有し;
- (R3)2は、q個のR3基を表し、該R3は同一であるか又は異なりうる;
- R1及びR3基は、同一であるか又は異なり、そして水素;-(CH2)s-Z基(基中、sは0〜4の範囲であり、かつZは、CH3、SO3H、OH、又はN+R1R2R3を表し、ここでR1、R2、及びR3は、上で定義される通りである);請求項6において定義される官能基;並びに場合により請求項6において定義される官能基を含むオリゴヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチド・アナログから選ばれる}で表される基から選ばれ;
- R4は、H;OH;CH3;Cl;及び以下の式:
で表される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の蛍光物質。 - X及びYの各々が、C(CH3)2基を表す、請求項11に記載の物質。
- - R1及びR2が、1〜4個の炭素原子を含むアルキルを表すか、又は以下の式の基を表し、少なくとも1のR1及びR2基は、以下の式:
- R4が水素を表し、
- q=1、m=2であり、
- R3が水素;-(CH2)s-Z基(基中、sは0〜4の範囲であり、かつZは、CH3、SO3H、OH、又はN+R1R2R3基を表し、ここでR1、R2、及びR3は、上で定義される通りである);請求項6で定義される官能基;請求項6で定義される官能基を場合により含むオリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチド・アナログを表し;
- R4が、H;OH;CH3;Cl;及び以下の式:
- 前記フルオロフォアが、オリゴヌクレオチドに直接又はスペーサー腕を介して共有結合することを特徴とする、請求項1〜13のいずれか1項に記載の物質。
- 前記フルオロフォアが、場合により1以上の二重結合若しくは三重結合を含み、及び/又は場合により1以上のヘテロ原子、例えば、酸素、窒素、硫黄、リンを含み、或いは1以上のカルバモイル若しくはカルボキサミド基を含む直鎖又は分枝鎖C1〜C20アルキレン基;C5〜C8シクロアルキレン基;並びにC6〜C14アリーレン基から選ばれる二価有機ラジカルからなるスペーサー腕を介してオリゴヌクレオチドに結合し、ここで、上記アルキレン、シクロアルキレン、又はアリーレン基が、場合によりアルキル、アリール、又はスルホネート基で置換されることを特徴とする、請求項14に記載の物質。
- 前記オリゴヌクレオチドが、5〜60、特に5〜20、好ましくは5〜15個のヌクレオチド・ユニットを含むことを特徴とする、請求項1〜16のいずれか1項に記載の物質。
- 前記オリゴヌクレオチドが、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのユニットであって、ホスホジエステル型の結合を介して互いに結合するユニットの列からなることを特徴とするユニット、請求項17に記載の物質。
- 前記オリゴヌクレオチドが、リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチド・ユニット、又は糖若しくは塩基上で改変されるヌクレオチドアナログ・ユニットの列からなり、これらのユニットは、ホスホジエステル型の天然ヌクレオチド間結合によって、互いに結合され、ここで該ヌクレオチド間結合の幾つかは、場合によりホスホネート、ホスホラミド、又はホスホロチオエート結合で置換されることを特徴とする、請求項17に記載の物質。
- 前記オリゴヌクレオチドが、ホスホジエステル型の結合により互いに結合するリボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチドユニット、並びにアミド結合により互いに結合するヌクレオシドアナログユニットの両者を含む列からなることを特徴とする、請求項17に記載の物質。
- 前記オリゴヌクレオチドが、ホスホジエステル型の結合により互いに結合するリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド・ユニット、並びにアミド結合により互いに結合するヌクレオシド・アナログ・ユニットの列からなり、ここで、上記オリゴヌクレオチドが、フルオロフォアに結合することを企図される末端で、少なくとも5個のホスホジエステル型のヌクレオチド間結合を含む、請求項17に記載の物質。
- 前記官能基が、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド・アナログのヌクレオチドユニットのアミン官能基であるか、或いは、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド・アナログのヌクレオチド・ユニットの遊離アミン官能基を、エステル、カルボン酸、イソチオシアネート、アルデヒド、カルボニル、スルホニル・ハライド、アルキル・ハライド、アジド、ヒドラジド、ジクロロトリアジン、無水物、ハロアセトアミド、マレイミド、及びスルフヒドリル基から選ばれる基と反応させることから得られることを特徴とする、請求項1〜21のいずれか1項に記載の物質。
- 前記官能基が、オリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチド・アナログのヌクレオチドユニットの遊離アミン官能基を、N-ヒドロキシスクシンイミジル・エステルと反応させることから得られることを特徴とする、請求項1〜22のいずれか1項において記載される物質。
- 前記官能基が、場合により1以上の二重結合若しくは三重結合を含み、及び/又は場合により1以上のヘテロ原子、例えば、酸素、窒素、硫黄、リンを含み、或いは1以上のカルバモイル若しくはカルボキサミド基を含む直鎖又は分枝鎖C1〜C20アルキレン基;C5〜C8シクロアルキレン基;並びにC6〜C14アリーレン基から選ばれる二価有機ラジカルからなるスペーサー腕により、フルオロフォア及び/又はオリゴヌクレオチドに結合し、ここで、上記アルキレン、シクロアルキレン、又はアリーレン基が、場合によりアルキル、アリール、又はスルホネート基で置換されることを特徴とする、請求項1〜23に記載の物質。
- 担体分子に共有結合する請求項1〜25のいずれか1項に記載の物質からなる、蛍光抱合体。
- 前記蛍光物質のフルオロフォアが、サイアニン-5であり、前記物質のオリゴヌクレオチドが、A15配列を有し、そして前記担体分子がcAMPであることを特徴とする、請求項26に記載の抱合体。
- 終モル比が、0より大きく100未満、好ましくは0より大きく20未満であることを特徴とする、請求項26及び27のいずれかに記載の抱合体。
- 前記担体分子が、抗体、抗原、細胞内メッセンジャー、細胞間メッセンジャー、タンパク質、ペプチド、ハプテン、レクチン、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、トキシン、炭水化物、オリゴ糖、多糖、核酸、ホルモン、ビタミン、薬用製品、ポリマー、ポリマー製粒子、ガラス、ガラス粒子、又はガラス若しくはポリマーから作られた表面であるということを特徴とする、請求項26〜28のいずれか1項に記載の蛍光抱合体。
- 前記担体分子が、抗体又はストレプトアビジンであるということを特徴とする、請求項29に記載の蛍光抱合体。
- 蛍光トレーサーとしての、請求項1〜25のいずれか1項に記載の蛍光物質又は請求項26〜30のいずれか1項に記載の蛍光抱合体の使用。
- 分析物を含むと疑われる媒体中で当該分析物を、蛍光により検出及び/又は測定するための、請求項31に記載の使用。
- 生体分子間の相互作用を測定し;或いは生理活性、例えば酵素活性、膜結合受容体の活性化、遺伝子転写、膜輸送、又は膜分極の変化を測定するための、請求項32に記載の使用。
- 薬用製品をスクリーニングする方法における、請求項31〜33に記載の使用。
- 請求項26〜30のいずれか1項に記載される蛍光抱合体が、ドナー蛍光化合物の存在下において受容体蛍光化合物として使用される、請求項34に記載の使用。
- 請求項26〜30のいずれか1項に記載される蛍光抱合体が、受容体蛍光化合物の存在下においてドナー蛍光化合物として使用される、請求項35に記載の使用。
- 蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光偏向、又は蛍光相関における、請求項35に記載の使用。
- in vivoにおける光学イメージングのためのコントラスト剤として、請求項26〜30のいずれか1項に記載の抱合体の使用。
- 担体分子に結合するフルオロフォアの蛍光強度を高める方法であって、請求項1〜25のいずれか1項において記載される蛍光物質が、フルオロフォアとして使用されることを特徴とする、前記方法。
- フルオロフォアへ結合する担体分子の表面における凝集現象を低減する方法であって、請求項1〜25のいずれか1項に記載の蛍光物質が、上記フルオロフォアの代わりに使用されることを特徴とする、前記方法。
- 担体分子に結合するフルオロフォアの量子収量を増大させる方法であって、請求項1〜25のいずれか1項に記載の蛍光物質を、フルオロフォアとして使用することを特徴とする、前記方法。
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