CN117751197A - 使用不对称可环化探针的样品分析 - Google Patents

使用不对称可环化探针的样品分析 Download PDF

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奥尔加·苏洛娃
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Ao ErjiaSuluowa
10X Genomics Inc
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Abstract

本公开在一些方面涉及直接RNA(dRNA)检测方法，所述dRNA检测方法包括使用具有不对称臂的可环化探针(例如，挂锁探针)、连接的可环化探针的滚环扩增和原位检测(例如，使用基于杂交的原位测序)对生物样品中的核酸序列(例如，诸如SNP和点突变的短序列)进行多重空间分析。在一些方面，本文公开的方法和组合物提高了检测特异性，减少了假阳性信号检测，和/或保持或提高了检测效率。

Description

使用不对称可环化探针的样品分析
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年6月2日提交的名称为“SAMPLE ANALYSIS USING ASYMMETRICPADLOCK PROBES”的美国临时专利申请号63/196,120的优先权，该美国临时专利申请全文以引用方式并入本文以用于所有目的。
技术领域
本公开在一些方面涉及用于靶核酸的分析(诸如组织样品中的多核苷酸中感兴趣区域的原位检测)的方法和组合物。
背景技术
现在已经有可用于分析生物样品(诸如细胞或组织)中存在的核酸的方法。例如，单分子荧光原位杂交(smFISH)的进步实现了细胞和组织中的RNA的纳米级分辨率成像。然而，分析单个转录物上的短序列(例如，单核苷酸多态性(SNP)或点突变)仍然具有挑战性。需要用于分析生物样品中存在的核酸(诸如原位SNP基因分型)的改进方法。本文提供了解决这些和其他需求的方法和组合物。
发明内容
用于鉴定和/或区分靶核酸中感兴趣的序列的基于连接的测定可能由于多种原因而缺乏特异性，这些原因包括连接酶和/或靶核酸的特性。这种保真度的缺乏可能使得即使当感兴趣的序列不匹配探针的探询区域时，也能形成并检测到连接产物，从而产生高水平的背景或假阳性结果。例如，连接酶(也称为PBCV-1DNA连接酶或小球藻病毒DNA连接酶)有效地催化DNA末端的RNA模板化连接。然而，连接酶在连接时可能不区分序列，并且可以具有较高的模板非依赖性连接效率。具有探询碱基G的常规挂锁探针可以被设计成检测RNA转录物中的互补C。然而，当连接酶保真度较低时，挂锁探针可以在杂交时连接到具有A、T/U或G而不是C的靶，从而产生假阳性结果。使用具有除G以外的探询碱基的附加挂锁探针可能不会增加测定特异性；事实上，附加“对照”挂锁探针本身可能发生模板非依赖性连接，从而导致假阳性结果。因此，需要特异性更高的连接方法来检测短序列(例如，一个或多个核苷酸)，以进行原位基因分型。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于分析生物样品的方法，该方法包括使生物样品与可环化探针或探针组接触。在一些实施方案中，可环化探针或探针组包含一个或多个线性寡核苷酸，其在与一个或多个核酸分子(例如，靶核酸和/或夹板)杂交后，形成可环化探针(例如，可以被环化的挂锁探针)。可环化探针可以使用靶核酸或夹板作为模板，通过连接(或先进行引物延伸以填充缺口，然后再连接)来环化。
在本文的任何实施方案中，可环化探针或探针组可以包含分别与生物样品中的靶核酸中相邻的第一靶区域和第二靶区域杂交的5’杂交区域和3’杂交区域。在本文的任何实施方案中，5’杂交区域和3’杂交区域可以是不对称的。5’杂交区域可以比3’杂交区域长，或反之亦然。在本文的任何实施方案中，靶核酸中相邻的第一靶区域和第二靶区域可以是不对称的。第一靶区域可以比第二靶区域长，或反之亦然。
在本文的任何实施方案中，5’杂交区域或3’杂交区域可以包含分别与第一靶区域或第二靶区域中感兴趣的序列互补的探询序列。在本文的任何实施方案中，探询序列可以在5’杂交区域或3’杂交区域的内部。在本文的任何实施方案中，探询序列可以是可环化探针或探针组中的内部序列。例如，探询序列不在可环化探针的5’或3’末端。在本文的任何实施方案中，探询序列可以不包含5’或3’末端核苷酸。在本文的任何实施方案中，探询序列可以不包含可连接末端。在本文的任何实施方案中，探询序列可以是可环化探针的5’杂交区域或3’杂交区域中的内部序列，这些杂交区域分别与靶核酸中的第一靶区域和第二靶区域杂交。在本文的任何实施方案中，探询序列可以不包含这样的核苷酸，该核苷酸在加工或不加工可环化探针或探针组的情况下参与随后的连接反应，例如，由具有RNA夹板化连接酶活性的连接酶催化的连接。
在本文的任何实施方案中，该方法还可以包括使与靶核酸杂交的可环化探针或探针组环化，以形成环化探针。在本文的任何实施方案中，该方法还可以包括检测生物样品中的环化探针或其产物。
在本文的任何实施方案中，靶核酸可以包含RNA。在本文的任何实施方案中，靶核酸可以是mRNA。在本文的任何实施方案中，可环化探针或探针组可以包含DNA。在本文的任何实施方案中，可环化探针或探针组可以包含一个或多个核糖核苷酸。在本文的任何实施方案中，一个或多个核糖核苷酸可以位于和/或靠近可环化探针或探针组的可连接3’末端。
在本文的任何实施方案中，可环化探针或探针组可以是挂锁探针。在本文的任何实施方案中，可环化探针或探针组的3’末端核苷酸可以是核糖核苷酸。在本文的任何实施方案中，可环化探针或探针组可以包含一个、两个、三个、四个至更多个核糖核苷酸。在本文的任何实施方案中，核糖核苷酸可以位于或靠近可环化探针或探针组的3’末端，例如，位于或靠近3’末端核苷酸，位于或靠近第二核苷酸，位于或靠近第三核苷酸，位于或靠近第四核苷酸，位于或靠近第五核苷酸，所有都从可环化探针或探针组的3’末端算起。
在本文的任何实施方案中，探询序列可以在5’杂交区域和3’杂交区域中较短的一者中。在本文的任何实施方案中，探询序列可以在5’杂交区域和3’杂交区域中较长的一者中。在本文的任何实施方案中，本文的可环化探针或探针组的5’杂交区域可以比3’杂交区域更短或更长。
在本文的任何实施方案中，5’杂交区域和3’杂交区域的长度可以独立地为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个核苷酸。在本文的任何实施方案中，5’杂交区域和3’杂交区域的长度可以相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在本文的任何实施方案中，5’杂交区域可以包含探询序列，并且可以比3’杂交区域短约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。在本文的任何实施方案中，5’杂交区域可以比3’杂交区域短约10个核苷酸。
在本文的任何实施方案中，样品可以与可环化探针或探针组接触，并且可环化探针或探针组中的探询序列的长度可以是一个、两个、三个、四个或五个核苷酸。在本文的任何实施方案中，探询序列可以是探询核苷酸，并且感兴趣的序列可以是选自由以下项组成的组的感兴趣的单核苷酸：单核苷酸多态性(SNP)、单核苷酸变异(SNV)、单核苷酸取代、点突变、单核苷酸缺失和单核苷酸插入。例如，本文公开的第一可环化探针或探针组中的探询核苷酸可以与靶核酸中SNP的第一变体互补，并且该方法可以包括使生物样品与基本上与第一可环化探针或探针组相同的第二可环化探针或探针组接触。第二可环化探针或探针组中的探询核苷酸可以与SNP的第二变体互补。第一可环化探针或探针组和第二可环化探针或探针组可以各自包含与可环化探针或探针组靶向的SNP变体相对应的条形码序列。
在本文的任何实施方案中，可环化探针或探针组的5’末端核苷酸可以是5’杂交区域的第一核苷酸，并且探询核苷酸可以是5’杂交区域的第二核苷酸、第三核苷酸、第四核苷酸、第五核苷酸、第六核苷酸、第七核苷酸、第八核苷酸、第九核苷酸或第十核苷酸。在一些实例中，探询核苷酸是从可环化探针或探针组的5’磷酸基团算起的第四核苷酸、第五核苷酸或第六核苷酸。在一些实例中，探询核苷酸是5’杂交区域的第五核苷酸。在本文的任何实施方案中，可环化探针或探针组的3’末端核苷酸可以是3’杂交区域的第一核苷酸，并且探询核苷酸可以是3’杂交区域的第二核苷酸、第三核苷酸、第四核苷酸、第五核苷酸、第六核苷酸、第七核苷酸、第八核苷酸、第九核苷酸或第十核苷酸。
在本文的任何实施方案中，可以使用靶核酸作为模板来连接可环化探针或探针组的3’末端和5’末端。在一些实施方案中，在连接之前不填充缺口的情况下连接3’末端和5’末端。在一些实施方案中，在3'末端和5'末端的连接之前，先填充缺口。该缺口可以是1、2、3、4、5个或更多个核苷酸。
在本文的任何实施方案中，环化步骤可以包括选自由酶促连接、化学连接、模板依赖性连接和/或模板非依赖性连接组成的组的连接。在本文的任何实施方案中，连接可以包括使用具有RNA模板化DNA连接酶活性和/或RNA模板化RNA连接酶活性的连接酶。在本文的任何实施方案中，连接可以包括使用选自由小球藻病毒DNA连接酶(PBCV DNA连接酶)、T4RNA连接酶、T4 DNA连接酶和单链DNA(ssDNA)连接酶组成的组的连接酶。在本文的任何实施方案中，连接可以包括使用PBCV-1DNA连接酶或其变体或衍生物和/或T4 RNA连接酶2(T4Rnl2)或其变体或衍生物。
在本文的任何实施方案中，该方法还可以包括在环化步骤之前，从生物样品中去除不与靶核酸结合的可环化探针或探针组的分子的步骤。在本文的任何实施方案中，该方法还可以包括在环化步骤之前，从生物样品中去除与靶核酸结合但在探询序列中包含一个或多个错配的可环化探针或探针组的分子的步骤。在本文的任何实施方案中，该方法还可以包括在环化步骤之前，允许与靶核酸结合但在探询序列中包含一个或多个错配的可环化探针分子从靶核酸解离，同时在探询序列中不包含错配的可环化探针分子保持与靶核酸结合的步骤。在本文的任何实施方案中，在相同的条件下，在探询序列中包含一个或多个错配的分子与靶核酸结合的稳定性不如不包含错配的分子。在本文的任何实施方案中，该方法可以包括一次或多次严格洗涤。例如，一次或多次严格洗涤可以用于去除未与靶核酸结合的可环化探针分子，和/或与靶核酸结合但在探询序列中包含一个或多个错配的可环化探针分子。
在本文的任何实施方案中，该方法还可以包括在生物样品中原位产生环化探针的产物。在本文的任何实施方案中，可以使用滚环扩增(RCA)产生产物。在本文的任何实施方案中，RCA可以包括线型RCA、分支RCA、树状RCA或它们的任何组合。在本文的任何实施方案中，可以使用选自由以下项组成的组的聚合酶产生产物：Phi29 DNA聚合酶、Phi29样DNA聚合酶、M2 DNA聚合酶、B103 DNA聚合酶、GA-1DNA聚合酶、phi-PRD1聚合酶、Vent DNA聚合酶、Deep Vent DNA聚合酶、Vent(exo-)DNA聚合酶、KlenTaq DNA聚合酶、DNA聚合酶I、DNA聚合酶I的Klenow片段、DNA聚合酶III、T3 DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、T5 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Bst聚合酶、rBST DNA聚合酶、N29 DNA聚合酶、TopoTaq DNA聚合酶、T7 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶及其变体或衍生物。
在本文的任何实施方案中，产物可以固定在生物样品中。在本文的任何实施方案中，产物可以与生物样品中的一个或多个其他分子交联。
在本文的任何实施方案中，该方法还可以包括对生物样品成像以检测环化探针或其产物。在本文的任何实施方案中，成像可以包括检测与荧光标记的探针相关的信号，该荧光标记的探针直接或间接与环化探针的滚环扩增产物结合。在本文的任何实施方案中，可以在生物样品中原位分析滚环扩增产物的序列。在本文的任何实施方案中，可以通过序贯杂交、边杂交边测序、边连接边测序、边合成边测序、边结合边测序或它们的组合来分析滚环扩增产物的序列。
在本文的任何实施方案中，滚环扩增产物的序列可以包含一个或多个条形码序列或其互补序列。在本文的任何实施方案中，一个或多个条形码序列可以包括与靶核酸相对应的条形码序列。在本文的任何实施方案中，一个或多个条形码序列可以包括与感兴趣的序列相对应的条形码序列，诸如感兴趣的单核苷酸的变体。
在本文的任何实施方案中，检测步骤可以包括使生物样品和直接或间接与滚环扩增产物杂交的一个或多个可检测地标记的探针接触，并且使一个或多个可检测地标记的探针与滚环扩增产物去杂交。在本文的任何实施方案中，可以用直接或间接与滚环扩增产物杂交的一个或多个可检测地标记的探针和/或一个或多个其他可检测地标记的探针重复接触和去杂交步骤。
在本文的任何实施方案中，检测步骤可以包括使生物样品和直接或间接与滚环扩增产物杂交的一个或多个中间探针接触，其中一个或多个中间探针可使用一个或多个可检测地标记的探针检测。在本文的任何实施方案中，检测步骤还可以包括使一个或多个中间探针和/或一个或多个可检测地标记的探针与滚环扩增产物去杂交。在本文的任何实施方案中，可以用一个或多个中间探针、一个或多个可检测地标记的探针、一个或多个其他中间探针和/或一个或多个其他可检测地标记的探针重复接触和去杂交步骤。
在一些实施方案中，本文公开了一种用于分析生物样品的方法，该方法包括使生物样品与可环化探针或探针组接触，其中可环化探针或探针组包含分别与生物样品中的靶RNA中相邻的第一靶区域和第二靶区域杂交的5’杂交区域和3’杂交区域，其中5’杂交区域和3’杂交区域的长度不同。在一些实施方案中，5’杂交区域和3’杂交区域中较短的一者包含分别与第一靶区域或第二靶区域中感兴趣的单核苷酸互补的探询核苷酸。例如，5’杂交区域可以是较短的区域，并且可以包含探询核苷酸。在其他实例中，3’杂交区域可以是较短的区域，并且可以包含探询核苷酸。在本文的任何实施方案中，探询核苷酸可以不是5’或3’末端核苷酸。
在本文的任何实施方案中，探询核苷酸可以是5’杂交区域或3’杂交区域中的内部核苷酸。在本文的任何实施方案中，探询核苷酸可以不包含可连接末端。在本文的任何实施方案中，探询核苷酸可以不是这样的核苷酸，该核苷酸在加工或不加工可环化探针或探针组的情况下参与随后的连接反应，例如，由具有RNA夹板化连接酶活性的连接酶催化的连接。在一些实施方案中，在加工与靶核酸杂交的可环化探针或探针组后，探询核苷酸可以被暴露并参与随后由具有RNA夹板化连接酶活性的连接酶催化的连接反应。在一些实施方案中，在加工可环化探针或探针组后，探询核苷酸的可连接5’磷酸基团或3’羟基可以被暴露。在本文的任何实施方案中，探询核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或其变体或衍生物。
在本文的任何实施方案中，该方法还可以包括连接与靶RNA杂交的可环化探针或探针组的末端，以形成环化的可环化探针或探针组。在本文的任何实施方案中，该方法还可以包括产生环化的可环化探针或探针组的滚环扩增产物。在本文的任何实施方案中，该方法还可以包括检测与生物样品中的滚环扩增产物相关的信号。
在一些实施方案中，本文公开了一种用于分析生物样品的方法，该方法包括使生物样品与可环化探针或探针组接触，其中：可环化探针或探针组包含分别与生物样品中的靶RNA中相邻的第一靶区域和第二靶区域杂交的5’杂交区域和3’杂交区域；5’杂交区域比3’杂交区域短，并且包含与靶RNA的第一分子的第一靶区域中感兴趣的单核苷酸互补的探询核苷酸，其中靶RNA的第二分子包含与探询核苷酸的错配；并且探询核苷酸是从可环化探针或探针组的5’末端算起的第二至第十核苷酸中的任何一个核苷酸。在一些实施方案中，该方法还包括允许可环化探针或探针组或其一部分(例如，5’杂交区域)从靶RNA的第二分子解离，其中在相同条件下，可环化探针或探针组(例如，包括5’杂交区域)保持与靶RNA的第一分子杂交。在一些实施方案中，该方法还包括连接与靶RNA的第一分子杂交的可环化探针或探针组的末端，以形成环化的可环化探针或探针组；产生环化的可环化探针或探针组的滚环扩增产物；以及检测与生物样品中的滚环扩增产物相关的信号。在任何前述实施方案中，与靶RNA的第二分子杂交的挂锁探针可以被去稳定化和/或从生物样品中去除，同时可环化探针或探针组保持与靶RNA的第一分子杂交，使得不形成与靶RNA的第二分子杂交的环化的可环化探针或探针组。在任何前述实施方案中，可能检测不到与靶RNA的第二分子相关的信号，使得与滚环扩增产物相关的信号指示生物样品中靶RNA的第一分子而非第二分子。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于分析生物样品的方法，该方法包括使生物样品与第一可环化探针或探针组和第二可环化探针或探针组接触。在一些实施方案中，第一可环化探针或探针组包含分别与靶核酸(诸如靶RNA)中相邻的第一靶区域和第二靶区域杂交的5’杂交区域和3’杂交区域，并且5’杂交区域和3’杂交区域的长度不同。在本文的任何实施方案中，5’杂交区域和3’杂交区域中较短的一者可以包含分别与第一靶区域或第二靶区域中感兴趣的单核苷酸的第一变体互补的第一探询核苷酸。在本文的任何实施方案中，第一探询核苷酸可以是从第一可环化探针或探针组的5’末端算起的第二至第十核苷酸中的任何一个核苷酸。在本文的任何实施方案中，第二可环化探针或探针组可以包含5’杂交区域和3’杂交区域，不同的是第二可环化探针或探针组可以包含与感兴趣的单核苷酸的第二变体互补的第二探询核苷酸。在本文的任何实施方案中，该方法还可以包括使与靶RNA杂交的第一可环化探针或探针组的末端和/或第二可环化探针或探针组的末端环化；产生环化的第一可环化探针或探针组的第一滚环扩增产物和/或环化的第二可环化探针或探针组的第二滚环扩增产物；以及检测与第一滚环扩增产物和/或第二滚环扩增产物相关的信号，从而检测生物样品中感兴趣的单核苷酸的第一变体和/或第二变体。在本文的任何实施方案中，第一可环化探针或探针组可以包含与第一变体相对应的第一条形码序列，并且第二可环化探针或探针组可以包含与第二变体相对应的第二条形码序列。在本文的任何实施方案中，在检测步骤中在生物样品中的给定位置处检测到的信号可以与第一条形码序列(或其互补序列)或第二条形码序列(或其互补序列)相关。因此，给定位置处的信号可以与感兴趣的单核苷酸的第一变体或第二变体相关。在本文的任何实施方案中，该方法还可以包括对生物样品成像，以在多个位置处原位检测感兴趣的单核苷酸的第一变体或第二变体，例如，通过检测第一条形码序列(或其互补序列)或第二条形码序列(或其互补序列)。
在本文的任何实施方案中，生物样品可以是固定的和/或透化的生物样品。在本文的任何实施方案中，生物样品可以是组织样品。在本文的任何实施方案中，生物样品可以是福尔马林固定石蜡包埋的(FFPE)组织样品、冷冻组织样品或新鲜组织样品。在本文的任何实施方案中，组织样品可以是厚度在约1μm和约50μm之间的组织切片，任选地其中组织切片的厚度在约5μm和约35μm之间。在本文的任何实施方案中，生物样品可以是交联的。在本文的任何实施方案中，生物样品可以包埋在水凝胶基质中。在本文的任何实施方案中，生物样品可以是澄清的。
在本文的任何实施方案中，生物样品可以不包埋在水凝胶基质中。
本文在一些方面还公开了一种用于分析生物样品的试剂盒，该试剂盒包含可环化探针或探针组，该可环化探针或探针组包含分别与靶核酸中相邻的第一靶区域和第二靶区域杂交的5’杂交区域和3’杂交区域，其中5’杂交区域和3’杂交区域的长度不同；5’杂交区域或3’杂交区域包含分别与第一靶区域或第二靶区域中感兴趣的序列互补的探询序列；并且探询序列不包含可连接末端(例如，探询序列是5’杂交区域中的内部序列，并且不包含5’末端核苷酸)。
在一些方面，本文公开了一种用于分析生物样品的试剂盒，该试剂盒包含可环化探针或探针组，该可环化探针或探针组包含分别与靶核酸中相邻的第一靶区域和第二靶区域杂交的5’杂交区域和3’杂交区域，其中5’杂交区域和3’杂交区域的长度不同；5’杂交区域和3’杂交区域中较短的一者包含分别与第一靶区域或第二靶区域中感兴趣的单核苷酸互补的探询核苷酸；并且探询核苷酸不是可环化探针或探针组的5’或3’末端核苷酸。在一些实施方案中，5’杂交区域比3’杂交区域短，并且探询核苷酸是从可环化探针或探针组的5’末端算起的第二至第十核苷酸中的任何一个核苷酸。
在一些方面，本文公开了一种用于分析生物样品的试剂盒，该试剂盒包含：i)第一可环化探针或探针组，该第一可环化探针或探针组包含分别与靶核酸中相邻的第一靶区域和第二靶区域杂交的5’杂交区域和3’杂交区域，其中：5’杂交区域和3’杂交区域的长度不同；5’杂交区域和3’杂交区域中较短的一者包含分别与第一靶区域或第二靶区域中感兴趣的单核苷酸的第一变体互补的第一探询核苷酸；并且第一探询核苷酸不是可环化探针或探针组的5’或3’末端核苷酸；以及ii)第二可环化探针或探针组，该第二可环化探针或探针组包含5’杂交区域和3’杂交区域，不同的是第二可环化探针或探针组包含与感兴趣的单核苷酸的第二变体互补的第二探询核苷酸。在一些实施方案中，第一可环化探针或探针组包含与第一变体相对应的第一条形码序列，并且第二可环化探针或探针组包含与第二变体相对应的第二条形码序列。在本文的任何实施方案中，试剂盒还可以包含直接或间接与第一条形码序列和/或第二条形码序列或其互补序列杂交的一个或多个中间探针；和/或直接或间接与一个或多个中间探针杂交的一个或多个可检测地标记的探针。在本文的任何实施方案中，第一探询核苷酸和第二探询核苷酸可以分别是从第一可环化探针或探针组或第二可环化探针或探针组的5’末端算起的第二至第十核苷酸中的任何一个核苷酸。
附图说明
以下附图展示了本公开的特征和优点的某些实施方案。这些实施方案无意于以任何方式限制所附权利要求书的范围。
图1A-1B示出了使用不对称可环化探针(例如，挂锁探针)来检测靶核酸中的感兴趣的区域(例如，SNP)的示例性方法。不对称可环化探针的一个臂包含内部探询核苷酸(例如，对SNP检测具有特异性的碱基)。可环化探针可以包含任选的3’RNA碱基。靶核酸中的SNP位置中互补碱基的存在有利于可环化探针的稳定杂交和随后的环化。相比之下，当探询核苷酸和靶核酸中的SNP位置之间存在错配时，含探询核苷酸的臂的杂交不太稳定。含探询核苷酸的臂(例如，如该图所示的较短的臂)可以从靶核酸解离，并防止可环化探针被保真度较差的连接酶环化(例如，在RNA模板上)，从而减少由于不加区分的连接酶活性而产生的假阳性信号。
图2描绘了样品中两种SNP(SNP1(序列变异G/C)和SNP2(序列变异G/A))的多重原位检测的实例。SNP1和SNP2是不同的SNP，并且可以在不同的基因座中，例如在不同的染色体上。可以检测样品中的DNA和/或RNA分子。加条形码的可环化探针或探针组可以同时或顺序与样品杂交。在相同SNP位置处的序列变异可以被有差异地加条形码和检测，例如，SNP1(G)和SNP1(C)各自与不同的条形码相关。不同SNP中的感兴趣的单核苷酸也可以被有差异地加条形码和检测，例如，SNP1(G)和SNP2(G)各自与不同的条形码相关。
图3A-3C是具有对称和不对称杂交区域的探针构型的示意图。图3A是对称探针构型的示意图，其在3’末端具有探询碱基(N)。图3B-3C是不对称探针构型的示意图，其具有较短的5’臂(图3B)或较短的3’臂(图3C)，并且在较短臂的内部位置处具有探询碱基(N)。
图4A-4B示出了示例性不对称可环化探针10-20m5和使用10-20m5进行KRAS突变体检测的结果。图4A是10-20m5不对称可环化探针的示意图，其包含5’臂上的10个核苷酸和3’臂上的20个核苷酸，在较短臂的第5碱基(从5’磷酸基团算起)上具有探询碱基(N)。图4B示出了在不将RNA转化为cDNA的直接RNA(dRNA)方法中，在KRAS上使用10-20m5不对称可环化探针的预期计数偏差。cDNA方法用作对照，其中RNA首先被逆转录成cDNA，并且在可环化探针连接接合点处具有探询碱基的对称可环化探针用于检测与培养的细胞中的KRAS野生型和突变体相关的信号。在ME180(KRAS野生型)和A549(KRAS G12S突变体)细胞系中检测来自dRNA方法(野生型和突变型探针)和cDNA方法(野生型和突变型探针)的信号。结果代表得自三个独立实验的平均值。图4C示出了与cDNA对照相比，使用10-20m5探针设计的预期计数的倍数变化。
图5A-5B描绘了在第一位置(10-20m1)或第三位置(10-20m3)处具有探询碱基的不对称探针设计。
图6A-6B示出了15-15对称探针设计的评价。图6A是15-15对称探针设计的示意图。15-15探针设计具有15个核苷酸长的3’和5’臂，在3’末端具有探询碱基(N)。图6B示出了检测ME180细胞中的KRAS RNA时15-15对称探针设计的预期偏差。预期偏差值以粗体和下划线表示。
图7A-7B示出了在3’末端具有探询核糖核酸酶碱基的对称可环化探针的验证。使用可环化探针池，每个探针在3’末端具有不同的探询核糖核苷酸，并且只有一个探针匹配靶中的突变(图7A)。图7B示出了四种不同的对称可环化探针设计的特异性的热图。效率由总信号比指示。总信号比被描绘为每个检测通道的RCA产物(RCP)除以总RCP的比值。
图8A-8C示出了使用10-20m5不对称可环化探针检测小鼠脑切片中的pcp4 mRNA。使用可环化探针池，每个探针在较短的臂中具有不同的内部探询碱基，并且只有一个探针匹配靶中的突变。图8A是实验设置的示意图。除了三个不匹配的探针外，每个探针组还包含匹配的探针。图8B示出了通过锚计数测量的pcp4 10-20探针的效率。图8C示出了pcp4 10-20探针的特异性的热图。
具体实施方式
本申请中提及的所有出版物(包括专利文献、科学文章和数据库)均出于所有目的全文以引用方式并入本文中，并入程度如同每一单独的出版物均以引用方式单独地并入一样。如果本文阐述的定义与以引用方式并入本文中的专利、专利申请、已公布的专利申请和其他出版物中阐述的定义相反或者说相矛盾，则本文阐述的定义优先于以引用方式并入本文中的定义。
本文所使用的章节标题仅用于组织目的，而不应被解释为限制所描述的主题。
I.概述
某些能够进行DNA寡核苷酸的RNA模板化连接的连接酶，对连接接合位点附近的错配核苷酸具有有限的区分特性。这限制了基于寡核苷酸连接的方法对RNA靶的特异性，因为对于这些方法来说，连接酶在能够鉴定突变方面起着重要作用。挂锁探针是一种衍生的寡核苷酸连接测定，可用于此目的，并已被描述用于检测DNA模板上的突变。Larsson等人,Nature Methods 1(3):227-232,2004，其全文以引用方式并入本文。大多数DNA连接酶不耐受RNA模板，而那些耐受RNA模板的DNA连接酶，例如小球藻病毒DNA连接酶(PBCV-1DNA连接酶)，具有较差的末端连接保真度，并且即使存在错配，也能够连接探针的接合位点。Krzywkowski和Nilsson,Nucleic Acids Res 45:e161,2017。因此，用于检测RNA上的突变的挂锁探针的应用受到限制。Krzywkowski等人,RNA 25:82-89,2019。
在一些方面，本文提供了组合物和方法，其克服了连接酶原位区分靶核酸中的短核苷酸序列(诸如单核苷酸错配)的有限能力。
在一些实施方案中，本文公开了寡核苷酸探针，其允许特异性检测靶RNA序列上感兴趣的短核苷酸序列，诸如单核苷酸多态性和点突变，而不将RNA序列转化(例如，通过逆转录)为DNA序列。在一些实施方案中，为了解决由于连接酶特异性较差而造成的限制，使用可环化探针或探针组，诸如包含不对称靶互补序列(称为“臂”)的挂锁探针，为用于检测RNA模板上感兴趣的短核苷酸序列的基于挂锁探针的测定提供一定程度的区分。在一些实施方案中，臂的不对称几何形状引入了差异杂交步骤，其中较短臂的完全杂交是反应的限制步骤。在一些实施方案中，如果较短臂的杂交由于例如与靶RNA序列的序列互补性错配导致的不完全杂交而不稳定，则探针臂不会被连接酶连接(例如，由于不稳定杂交的可环化探针或探针组从靶RNA上去除或解离)，从而产生阴性信号。
在一些实施方案中，除了可环化探针臂(例如，挂锁探针臂)的不对称几何形状之外，本文公开的可环化探针还包含内部探询序列(例如，内部探询核苷酸)。在一些实施方案中，可环化探针的较短臂包含内部探询序列。例如，内部探询序列不包含较短臂的游离5’或3’末端核苷酸。在一些实施方案中，可环化探针的较长臂包含内部探询序列。例如，内部探询序列不包含较长臂的游离5’或3’末端核苷酸。在一些实施方案中，当内部探询序列与靶核酸中感兴趣的序列互补时，使用靶核酸作为模板来连接可环化探针末端。然而，内部探询序列不包含为可环化探针连接提供5’磷酸或3’羟基的核苷酸。换句话说，在一些实施方案中，内部探询序列不包含位于连接接合点的核苷酸。在一些实施方案中，可环化探针中的探询碱基的位置可以变化，例如，在较短或较长臂上远离连接接合位点1、2、3、4、5、6个或更多个核苷酸。
一般认为，为了使用可环化探针连接来区分感兴趣的单核苷酸，可环化探针的连接接合点应准确地放在靶(例如，转录物)内感兴趣的单核苷酸上。Liu等人,Nucleic AcidsResearch,gkab120,2021。令人惊讶的是，本发明人已经证明了包含不在连接接合点的内部探询核苷酸的可环化探针可以用于成功检测感兴趣的单核苷酸。此外，使用这些可环化探针的检测特异性(例如，区分点突变和野生型核苷酸的能力)可与在连接接合点具有探询碱基的探针相媲美(实施例1，图4B)。在一些实施方案中，本文公开的不对称可环化探针可以直接靶向RNA分子，并且与使用挂锁探针的基于cDNA的原位检测相比，表现出增加的检测效率(实施例1，图4C)。
II.样品、分析物和靶序列
A.样品
本文公开的样品可以是或源自任何生物样品。本文公开的方法和组合物可以用于分析生物样品，所述生物样品可以使用多种技术(包括但不限于活检、手术和激光捕获显微术(LCM))中的任何一种从受试者获得，并且通常包括来自受试者的细胞和/或其他生物材料。除了上文所述的受试者之外，生物样品可以从原核生物(诸如细菌、古细菌、病毒或类病毒)获得。生物样品也可以从非哺乳动物生物体(例如，植物、昆虫、节肢动物、线虫、真菌或两栖动物)获得。生物样品也可以从真核生物获得，诸如组织样品、患者来源的类器官(PDO)或患者来源的异种移植物(PDX)。来自生物体的生物样品可以包含一种或多种其他生物体或其组分。例如，除了哺乳动物细胞和非细胞组织组分之外，哺乳动物组织切片可以包含朊病毒、类病毒、病毒、细菌、真菌或来自其他生物体的组分。可以从其获得生物样品的受试者可以是健康或无症状的个体、患有或怀疑患有疾病(例如，患有疾病诸如癌症的患者)或易患上疾病的个体、和/或需要疗法或怀疑需要疗法的个体。
生物样品可以包含任意数量的大分子，例如，细胞大分子和细胞器(例如，线粒体和细胞核)。生物样品可以作为组织样品(诸如组织切片、活检样品、芯针活检样品、针抽吸物或细针抽吸物)获得。样品可以是流体样品，诸如血液样品、尿液样品或唾液样品。样品可以是皮肤样品、结肠样品、颊拭子、组织学样品、组织病理学样品、血浆或血清样品、肿瘤样品、活细胞、培养细胞、临床样品(例如，全血或血液衍生制品、血细胞或培养的组织或细胞，包括细胞悬浮液)。在一些实施方案中，生物样品可以包含沉积在表面上的细胞。
生物样品可以源自本文提及的受试者或生物体的均质培养物或群体，或者可替代地源自几种不同生物体的集合，例如，在群落或生态系统中。
生物样品可以包括一个或多个患病细胞。患病细胞可能具有改变的代谢特性、基因表达、蛋白质表达和/或形态学特征。疾病的实例包括炎症性障碍、代谢性障碍、神经系统障碍和癌症。癌细胞可以源自实体瘤、血液恶性肿瘤、细胞系，或者作为循环肿瘤细胞获得。生物样品还可以包括胎儿细胞和免疫细胞。
生物样品可以包括包埋在3D基质中的分析物(例如，蛋白质、RNA和/或DNA)。在一些实施方案中，源自分析物(例如，蛋白质、RNA和/或DNA)或与之相关的扩增子(例如，滚环扩增产物)可以包埋在3D基质中。在一些实施方案中，3D基质可以包含通过化学和/或以酶促方式连接(例如，通过交联)的天然分子和/或合成分子网络。在一些实施方案中，3D基质可以包含合成的聚合物。在一些实施方案中，3D基质包含水凝胶。
在一些实施方案中，本文的基底可以是不溶于水性液体的任何支持物，并且允许在所述支持物上定位生物样品、分析物、特征和/或试剂(例如，探针)。在一些实施方案中，生物样品可以附着到基底上。生物样品的附着可以是不可逆的或可逆的，这取决于样品的性质和分析方法中的后续步骤。在某些实施方案中，通过将合适的聚合物涂层应用到基底上并且使样品与所述聚合物涂层接触，可以使样品可逆地附着到基底上。然后，例如使用至少部分溶解聚合物涂层的有机溶剂，可以将样品从基底上分离。水凝胶是适合用于此目的的聚合物的实例。
在一些实施方案中，基底可以用一种或多种物质涂覆或功能化，以促进样品附着到基底上。可以用于涂覆或功能化基底的合适物质包括但不限于凝集素、聚赖氨酸、抗体和多糖。
可以执行各种步骤来为测定和/或在测定期间制备或处理生物样品。除非另有说明，否则下文所述的制备或处理步骤通常可以以任何方式和以任何顺序组合，以适当地制备或处理特定样品用于和/或进行分析。
(i)组织切片
生物样品可以从受试者获得(例如，通过手术活检、整个受试者切片)或在生长基质或培养皿上体外生长为细胞群，并且作为组织薄片或组织切片制备用于分析。生长的样品可以足够薄，而无需进一步的处理步骤即可进行分析。可替代地，生长的样品和经由活检或切片获得的样品可以使用机械切割装置诸如振动切片机(vibrating blade microtome)制备成薄的组织切片。作为另一种替代方案，在一些实施方案中，薄的组织切片可以通过将生物样品的触摸印记施加到合适的基底材料上来制备。
组织切片的厚度可以是细胞最大横截面尺寸的分数(例如，小于0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1)。然而，也可以使用厚度大于最大横截面细胞尺寸的组织切片。例如，可以使用冷冻切片(cryostat section)，其可以是例如10-20μm厚。
更一般地，组织切片的厚度通常取决于用于制备切片的方法和组织的物理特性，因此可以制备和使用具有各种不同厚度的切片。例如，组织切片的厚度可以是至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.7、1.0、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、20、30、40或50μm。如果需要或方便，也可以使用更厚的切片，例如至少70、80、90或100μm或更厚。通常，组织切片的厚度在1-100μm、1-50μm、1-30μm、1-25μm、1-20μm、1-15μm、1-10μm、2-8μm、3-7μm或4-6μm之间，但是如上文所提及，也可以分析厚度大于或小于这些范围的切片。
也可以从单个生物样品中获得多个切片。例如，通过使用切片刀片对活检样品进行系列切片，可以从手术活检样品获得多个组织切片。系列切片之间的空间信息可以以这种方式保存，并且可以连续分析所述切片以获得关于生物样品的三维信息。
(ii)冷冻
在一些实施方案中，可以通过在适合于维持或保存组织结构的完整性(例如，物理特性)的温度下深度冷冻来制备生物样品(例如，如上文所述的组织切片)。可以使用任何数量的合适方法将冷冻组织样品切片(例如切薄片)到基底表面上。例如，可以使用设置在适合于保持组织样品的结构完整性和样品中核酸的化学特性的温度的冷冻切片机(例如，低温恒温器)制备组织样品。这样的温度可以是例如低于-15℃、低于-20℃或低于-25℃。
(iii)固定和后固定
在一些实施方案中，可以使用福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)来制备生物样品，这是已建立的方法。在一些实施方案中，可以使用福尔马林固定和石蜡包埋来制备细胞悬浮液和其他非组织样品。在固定样品并包埋在石蜡或树脂块中后，可以如上文所述对样品进行切片。在分析之前，可以通过在适当的溶剂(例如，二甲苯)中温育组织切片，然后冲洗(例如，99.5％乙醇持续2分钟，96％乙醇持续2分钟，和70％乙醇持续2分钟)，从组织切片中去除石蜡包埋材料(例如，脱蜡)。
作为上文所述的福尔马林固定的替代方案，可以将生物样品固定在多种其他固定剂中的任何一种中，以在分析之前保存样品的生物结构。例如，可以通过浸泡在乙醇、甲醇、丙酮、多聚甲醛(PFA)-Triton以及它们的组合中来固定样品。
在一些实施方案中，对新鲜冷冻样品使用丙酮固定，所述新鲜冷冻样品可以包括但不限于皮质组织、小鼠嗅球、人脑肿瘤、人死后脑和乳腺癌样品。当进行丙酮固定时，可以不进行预透化步骤(下文描述)。或者，丙酮固定可以与透化步骤结合进行。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括一个或多个后固定(post-fixing)(也称为后固定(postfixation))步骤。在一些实施方案中，在使样品与本文公开的多核苷酸(例如一个或多个探针，诸如可环化探针或探针组或环状探针)接触之后进行一个或多个后固定步骤。在一些实施方案中，在包含探针和靶的杂交复合物在样品中形成之后进行一个或多个后固定步骤。在一些实施方案中，在本文所公开的连接反应(诸如使可环化探针或探针组(例如，挂锁探针)环化的连接)之前进行一个或多个后固定步骤。
在一些实施方案中，在使样品与非核酸分析物诸如蛋白质分析物的结合剂或标记剂(例如，抗体或其抗原结合片段)接触之后进行一个或多个后固定步骤。标记剂可以包含核酸分子(例如，报告寡核苷酸)，其包含与标记剂对应并且因此与分析物对应(例如，唯一地鉴定)的序列。在一些实施方案中，标记剂可以包含含有一个或多个条形码序列的报告寡核苷酸。
可以使用本文公开的任何合适的固定试剂(例如，在DEPC-PBS中的3％(w/v)多聚甲醛)进行后固定步骤。
(iv)包埋
作为上文所述的石蜡包埋的替代方案，可以将生物样品包埋在多种其他包埋材料中的任何一种中，以在切片和其他处理步骤之前为样品提供结构基底。在一些情况下，可以例如在分析从样品获得的组织切片之前去除包埋材料。合适的包埋材料包括但不限于蜡、树脂(例如，甲基丙烯酸树脂)、环氧树脂和琼脂。
在一些实施方案中，可以将生物样品包埋在基质(例如，水凝胶基质)中。以这种方式包埋样品通常涉及将生物样品与水凝胶接触，使得生物样品变得被水凝胶包围。例如，可以通过使样品与合适的聚合物材料接触并且活化聚合物材料以形成水凝胶来包埋样品。在一些实施方案中，形成水凝胶使得水凝胶在生物样品中内化。
水凝胶-基质的组成和对生物样品的应用通常取决于生物样品的性质和制备(例如，切片的、非切片的、固定类型)。作为一个实例，在生物样品是组织切片时，水凝胶-基质可以包括单体溶液和过硫酸铵(APS)引发剂/四甲基乙二胺(TEMED)加速剂溶液。作为另一个实例，在生物样品由细胞(例如，培养的细胞或从组织样品解离的细胞)组成时，细胞可以与单体溶液和APS/TEMED溶液一起温育。对于细胞，水凝胶-基质凝胶在隔室中形成，所述隔室包括但不限于用于培养、维持或运输细胞的设备。例如，可以用添加到隔室中的单体溶液加APS/TEMED形成水凝胶-基质至约0.1μm至约2mm的深度范围。
生物样品的水凝胶包埋的另外的方法和方面描述于例如Chen等人,Science 347(6221):543–548,2015，其全部内容以引用方式并入本文。
(v)染色
为了便于显现，可以使用各种染色剂和染色技术对生物样品进行染色。在一些实施方案中，例如，可以使用任何数目的染色剂对样品染色，包括但不限于吖啶橙、俾斯麦棕、胭脂红、考马斯蓝、甲酚紫、DAPI、曙红、溴化乙锭、酸性品红、苏木精、Hoechst染色剂、碘、甲基绿、亚甲蓝、中性红、尼罗蓝、尼罗红、四氧化锇、碘化丙啶、罗丹明或番红。
可以使用苏木精和曙红(H&E)染色技术、使用帕帕尼科拉乌染色(Papanicolaoustaining)技术、马松三色染色(Masson’s trichrome staining)技术、银染色技术、苏丹染色技术和/或使用高碘酸希夫(PAS)染色技术对样品进行染色。PAS染色通常在福尔马林或丙酮固定之后进行。在一些实施方案中，可以使用罗曼诺夫斯基染色剂(包括瑞氏染色剂(Wright’s stain)、詹纳尔氏染色剂(Jenner’s stain)、坎-格二氏染色剂(Can-Grunwaldstain)、利什曼染色剂(Leishman stain)和吉姆萨染色剂(Giemsa stain))对样品进行染色。
在一些实施方案中，可以将生物样品脱去染色。使生物样品脱去染色或脱色的方法通常取决于应用到样品上的染色剂的性质。例如，在一些实施方案中，通过抗体偶联将一种或多种免疫荧光染色剂应用于样品。可以使用诸如通过用还原剂和去污剂洗涤处理来切割二硫键、离液盐处理、用抗原修复溶液处理和用酸性甘氨酸缓冲液处理等技术来去除此类染色剂。用于多重染色和脱去染色的方法描述于例如Bolognesi等人,J.Histochem.Cytochem.2017；65(8):431-444；Lin等人,Nat Commun.2015；6:8390；Pirici等人,J.Histochem.Cytochem.2009；57:567–75；以及Glass等人,J.Histochem.Cytochem.2009；57:899–905中，每篇文献的全部内容以引用方式并入本文。
(vi)等容膨胀(Isometric Expansion)
在一些实施方案中，包埋在基质(例如，水凝胶)中的生物样品可以被等容膨胀。可使用的等容膨胀方法包括水合，这是膨胀显微术中的制备步骤，如Chen等人,Science 347(6221):543–548,2015中所述，其内容全文以引用方式并入本文。
可以通过将生物样品的一种或多种组分锚定到凝胶上，然后形成凝胶、蛋白水解和溶胀来进行等容膨胀。在一些实施方案中，可以将样品中的分析物、分析物的产物和/或与样品中的分析物缔合的探针锚定到基质(例如，水凝胶)上。生物样品的等容膨胀可以发生在将生物样品固定在基底上之前或者发生在将生物样品固定在基底上之后。在一些实施方案中，可以在使基底与本文公开的探针接触之前，从基底上去除等容膨胀的生物样品。
通常，用于进行生物样品的等容膨胀的步骤可以取决于样品的特性(例如，组织切片的厚度、固定、交联)和/或感兴趣的分析物(例如，将RNA、DNA和蛋白质锚定到凝胶上的不同条件)。
在一些实施方案中，生物样品中的蛋白质被锚定到可溶胀的凝胶(诸如聚电解质凝胶)上。可抗体以在锚定到可溶胀凝胶上之前、之后或结合锚定到可溶胀凝胶上被引导至蛋白质。生物样品中的DNA和/或RNA也可以通过合适的接头锚定到可溶胀凝胶上。此类接头的实例包括但不限于6-((丙烯酰基)氨基)己酸(丙烯酰基-X SE)(可获自ThermoFisher,Waltham,MA)、Label-IT胺(可获自MirusBio,Madison,WI)和Label X(例如描述于Chen等人,Nat.Methods 13:679-684,2016，其全部内容以引用方式并入本文)。
样品的等容膨胀可以增加样品的后续分析的空间分辨率。空间分布中分辨率的增加可以通过比较等容膨胀的样品和尚未等容膨胀的样品来确定。
在一些实施方案中，生物样品被等容膨胀至如下尺寸：其未膨胀尺寸的至少2x、2.1x、2.2x、2.3x、2.4x、2.5x、2.6x、2.7x、2.8x、2.9x、3x、3.1x、3.2x、3.3x、3.4x、3.5x、3.6x、3.7x、3.8x、3.9x、4x、4.1x、4.2x、4.3x、4.4x、4.5x、4.6x、4.7x、4.8x或4.9x。在一些实施方案中，样品被等容膨胀至其未膨胀尺寸的至少2x且小于20x。
(vii)交联和去交联
在一些实施方案中，使生物样品在原位测定回合之前或期间可逆地交联。在一些方面，分析物、多核苷酸和/或与其结合的分析物或探针的扩增产物(例如，扩增子)可以锚定到聚合物基质。例如，聚合物基质可以是水凝胶。在一些实施方案中，可以将一种或多种多核苷酸探针和/或其扩增产物(例如，扩增子)修饰以含有官能团，所述官能团可以用作将多核苷酸探针和/或扩增产物附着到聚合物基质上的锚定位点。在一些实施方案中，包含寡dT的经修饰的探针可以用于结合感兴趣的mRNA分子，随后是mRNA分子的可逆交联。
在一些实施方案中，生物样品通过形成水凝胶的聚合物材料的交联而被固定在水凝胶中。交联可以通过化学和/或以光化学方式进行，或者可替代地通过任何其他水凝胶形成方法进行。水凝胶可以包括含有网状系统的大分子聚合物凝胶。在网状系统中，一些聚合物链可以任选地被交联，但是交联并不总是发生。
在一些实施方案中，水凝胶可以包括水凝胶亚单位，诸如但不限于丙烯酰胺、双丙烯酰胺、聚丙烯酰胺及其衍生物、聚(乙二醇)及其衍生物(例如，PEG-丙烯酸酯(PEG-DA)、PEG-RGD)、甲基丙烯酰化明胶(GelMA)、甲基丙烯酸酯化透明质酸(MeHA)、聚脂肪族聚氨酯、聚醚聚氨酯、聚酯聚氨酯、聚乙烯共聚物、聚酰胺、聚乙烯醇、聚丙二醇、聚四亚甲基氧化物、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚(丙烯酸羟乙酯)和聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、胶原、透明质酸、壳聚糖、葡聚糖、琼脂糖、明胶、海藻酸盐、蛋白质聚合物、甲基纤维素等、以及它们的组合。
在一些实施方案中，水凝胶包括杂化材料，例如，水凝胶材料包括合成聚合物和天然聚合物的要素。合适的水凝胶的实例描述于例如美国专利号6,391,937、9,512,422和9,889,422以及美国专利申请公开号2017/0253918、2018/0052081和2010/0055733中，每篇文献的全部内容以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，水凝胶可以形成基底。在一些实施方案中，基底包括水凝胶和一种或多种第二材料。在一些实施方案中，将水凝胶放置在一种或多种第二材料的顶部。例如，水凝胶可以预先形成，然后放置在一种或多种第二材料的顶部、底部或与一种或多种第二材料的任何其他构型中。在一些实施方案中，水凝胶形成发生在基底形成期间接触一种或多种第二材料之后。水凝胶形成也可以发生在位于基底上的结构(例如，孔、脊、突起和/或纹理)内。
在一些实施方案中，在向样品提供探针之前、同时或之后，发生基底上的水凝胶形成。例如，水凝胶形成可以在已经含有探针的基底上进行。
在一些实施方案中，水凝胶形成发生在生物样品内。在一些实施方案中，生物样品(例如，组织切片)被包埋在水凝胶中。在一些实施方案中，水凝胶亚单位被注入到生物样品中，并且水凝胶的聚合由外部或内部刺激引发。
在生物样品内形成水凝胶的实施方案中，可以使用官能化化学。在一些实施方案中，官能化化学包括水凝胶-组织化学(HTC)。适合于HTC的任何水凝胶-组织骨架(例如，合成的或天然的)都可以用于锚定生物大分子和调节官能化。使用HTC骨架变体的方法的非限制性实例包括CLARITY、PACT、ExM、SWITCH和ePACT。在一些实施方案中，生物样品内的水凝胶形成是永久性的。例如，生物大分子可以永久粘附到水凝胶上，允许多个回合的询问。在一些实施方案中，生物样品内的水凝胶形成是可逆的。
在一些实施方案中，在聚合之前、同时和/或之后，将另外的试剂添加到水凝胶亚单位中。例如，另外的试剂可以包括但不限于寡核苷酸(例如，探针)、使DNA片段化的核酸内切酶、DNA片段化缓冲液、DNA聚合酶、用于扩增核酸并将条形码附接到扩增片段的dNTP。可以使用其他酶，包括但不限于RNA聚合酶、转座酶、连接酶、蛋白质酶K和DNAse。另外的试剂还可以包括逆转录酶，包括具有末端转移酶活性的酶、引物和开关寡核苷酸。在一些实施方案中，在聚合之前、同时和/或之后，将光学标记添加到水凝胶亚单位中。
在一些实施方案中，在聚合之前、同时和/或之后，将HTC试剂添加到水凝胶中。在一些实施方案中，在聚合之前、同时和/或之后，将细胞标记剂添加到水凝胶中。在一些实施方案中，在聚合之前、同时和/或之后，将细胞渗透剂添加到水凝胶中。
可以使用任何合适的方法清除包埋在生物样品中的水凝胶。例如，电泳组织清除方法可以用于从水凝胶包埋的样品中去除生物大分子。在一些实施方案中，水凝胶包埋的样品在清除水凝胶之前或之后储存在介质(例如，固定介质、甲基纤维素或其他半固体介质)中。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括使可逆交联的生物样品解交联。解交联不需要是完全的。在一些实施方案中，可逆交联的生物样品中只有一部分交联分子被解交联并允许迁移。
(viii)组织透化和处理
在一些实施方案中，生物样品可以被透化以促进物类(诸如探针)转移到样品中。如果样品没有被充分透化，则样品中物类(诸如探针)的量可能太低而不能够进行充分的分析。相反，如果组织样品渗透性太强，则组织样品内分析物的相对空间关系可能会丧失。因此，在充分透化组织样品以获得良好的信号强度的同时仍然保持样品中分析物分布的空间分辨率之间的平衡是理想的。
通常，生物样品可以通过将样品暴露于一种或多种透化剂来进行透化。用于此目的的合适试剂包括但不限于有机溶剂(例如，丙酮、乙醇和甲醇)、交联剂(例如，多聚甲醛)、去污剂(例如，皂苷、Triton X-100TM或Tween-20TM)和酶(例如，胰蛋白酶、蛋白酶)。在一些实施方案中，可以将生物样品与细胞透化剂一起温育，以促进样品的透化。用于样品透化的另外的方法描述于例如Jamur等人,Method Mol.Biol.588:63-66,2010，其全部内容以引用方式并入本文。任何合适的样品透化方法通常都可以与本文所述的样品结合使用。
在一些实施方案中，可以通过向样品中添加一种或多种裂解剂来透化生物样品。合适的裂解剂的实例包括但不限于生物活性试剂，诸如用于裂解不同细胞类型(例如革兰氏阳性或阴性细菌、植物、酵母、哺乳动物)的裂解酶，诸如溶菌酶、无色肽酶、溶葡萄球菌素、labiase、立枯丝核菌裂解酶(kitalase)、溶壁酶和各种其他可商购获得的裂解酶。
可以另外地或可替代地将其他裂解剂添加到生物样品中以促进透化。例如，基于表面活性剂的裂解溶液可以用于裂解样品细胞。裂解溶液可以包含离子型表面活性剂，诸如十二烷基肌氨酸钠和十二烷基硫酸钠(SDS)。更一般地，化学裂解剂可以包括但不限于有机溶剂、螯合剂、去污剂、表面活性剂和离液剂。
在一些实施方案中，可以通过非化学透化方法透化生物样品。可以使用的非化学透化方法包括但不限于物理裂解技术(诸如电穿孔)、机械透化方法(例如，使用匀浆器和研磨球进行珠磨以机械破坏样品组织结构)、声学透化(例如，超声处理)和热裂解技术(诸如加热以诱导样品的热透化)。
在分析样品之前，可以向生物样品中添加附加试剂以执行各种功能。在一些实施方案中，可以向样品中添加DNase和RNase灭活剂或抑制剂如蛋白质酶K和/或螯合剂如EDTA。例如，本文公开的方法可包括用于增加核酸的结合可及性的步骤，例如开放细胞中的DNA以供探针杂交的变性步骤。例如，可以使用蛋白质酶K处理来释放与其结合了蛋白质的DNA。
(ix)RNA物类的选择性富集
在一些实施方案中，当RNA是分析物时，可以选择性地富集一种或多种感兴趣的RNA分析物物类。例如，可以通过向样品中添加一种或多种寡核苷酸来选择一种或多种感兴趣的RNA物类。在一些实施方案中，另外的寡核苷酸是用于通过酶(例如，聚合酶)引发反应的序列。例如，与一个或多个感兴趣的RNA具有序列互补性的一个或多个引物序列可以用于扩增一个或多个感兴趣的RNA，从而选择性地富集这些RNA。
可替代地，可以使用多种方法中的任何一种方法降选(例如，去除)一种或多种RNA物类。例如，可以向样品施用探针，其选择性地与核糖体RNA(rRNA)杂交，从而减少样品中rRNA的池和浓度。另外和可替代地，双链特异性核酸酶(DSN)处理可以去除rRNA(参见例如，Archer等人,Selective and flexibledepletion of problematic sequences from RNA-seq libraries at the cDNA stage,BMC Genomics,15 401,(2014)，其全部内容以引用方式并入本文)。此外，羟基磷灰石层析可以去除丰富的物类(例如，rRNA)(参见例如，Vandernoot,V.A.,cDNA normalization by hydroxyapatite chromatography to enrichtranscriptome diversity in RNA-seq applications,Biotechniques,53(6)373-80,(2012)，其全部内容以引用方式并入本文)。
生物样品可以包含一种或多种感兴趣的分析物。提供了用于进行多重测定以分析单个生物样品中的两种或更多种不同分析物的方法。
B.分析物
本文公开的方法和组合物可以用于检测和分析多种不同的分析物，诸如生物样品中的一个或多个靶核酸。在一些实施方案中，本文公开的方法和组合物可以与其他方法组合，以检测和分析多种附加分析物，诸如附加靶核酸和/或非核酸靶分析物。在一些方面，分析物可以包括待分析的任何生物物质、结构、部分或组分。在一些方面，本文公开的靶可以类似地包括任何感兴趣的分析物。在一些实例中，可以直接或间接检测靶或分析物。
分析物可以源自特定类型的细胞和/或特定的亚细胞区域。例如，分析物可以源自胞质溶胶、源自细胞核、源自线粒体、源自微粒体，并且更一般地，源自细胞的任何其他隔室、细胞器或部分。特异性地靶向某些细胞隔室和细胞器的透化剂可以用于从细胞中选择性地释放出分析物以进行分析，和/或允许一种或多种试剂(例如，用于分析物检测的探针)接近细胞或细胞隔室或细胞器中的分析物。
分析物可以包括任何生物分子或化学化合物，包括大分子(诸如蛋白质或肽、脂质或核酸分子)或者小分子(包括有机或无机分子)。分析物可以是细胞或微生物，包括病毒或其片段或产物。分析物可以是任何物质或实体，可以为其开发特异性结合配偶体(例如亲和结合配偶体)。这样的特异性结合配偶体可以是核酸探针(用于核酸分析物)并且可以直接导致RCA模板(例如挂锁或其他可环化探针)的产生。可替代地，可以将特异性结合配偶体偶联到核酸上，所述核酸可以使用RCA策略进行检测，例如在使用或产生可以作为RCA模板的环状核酸分子的测定中。
特别感兴趣的分析物可以包括核酸分子，诸如DNA(例如，基因组DNA、线粒体DNA、质体DNA、病毒DNA等)和RNA(例如，mRNA、微小RNA、rRNA、snRNA、病毒RNA等)；以及合成的和/或经修饰的核酸分子(例如，包括包含合成的或经修饰的核苷酸诸如LNA、PNA、吗啉代等或由这些物质组成的核酸结构域)；蛋白质分子，诸如肽、多肽、蛋白质或朊病毒、或者包括蛋白质或多肽组分等的任何分子、或其片段；或脂质或碳水化合物分子或包含脂质或碳水化合物组分的任何分子。分析物可以是单个分子或含有两个或更多个分子亚单位的复合物，所述分子亚单位例如包括但不限于蛋白质-DNA复合物，所述分子亚单位可以或可以不彼此共价结合并且它们可以是相同的或不同的。因此，除了细胞或微生物之外，这样的复合分析物也可以是蛋白质复合物或蛋白质相互作用物。因此，这样的复合物或相互作用可以是同源多聚体或异源多聚体。分子(例如蛋白质)的聚集体也可以是靶分析物，例如相同蛋白质或不同蛋白质的聚集体。分析物也可以是蛋白质或肽与核酸分子(诸如DNA或RNA)之间的复合物，例如蛋白质与核酸(例如，调控因子(诸如转录因子)与DNA或RNA)之间的相互作用物。
(i)内源性分析物
在一些实施方案中，本文的分析物对于生物样品而言是内源的，并且可以包括核酸分析物和非核酸分析物。可以将本文公开的方法和组合物以任何合适的组合用于分析核酸分析物(例如，使用直接或间接与核酸分析物杂交的核酸探针或探针组)和/或非核酸分析物(例如，使用包含报告寡核苷酸并且直接或间接与非核酸分析物结合的标记剂)。
非核酸分析物的实例包括但不限于脂质、碳水化合物、肽、蛋白质、糖蛋白(N-连接的或O-连接的)、脂蛋白、磷蛋白、蛋白质的特定磷酸化或乙酰化变体、蛋白质的酰胺化变体、蛋白质的羟基化变体、蛋白质的甲基化变体、蛋白质的泛素化变体、蛋白质的硫酸化变体、病毒衣壳蛋白、细胞外蛋白质和细胞内蛋白质、抗体和抗原结合片段。在一些实施方案中，分析物在细胞内部或在细胞表面上，诸如跨膜分析物或附着于细胞膜的分析物。在一些实施方案中，分析物可以是细胞器(例如，细胞核或线粒体)。在一些实施方案中，分析物是细胞外分析物，诸如分泌的分析物。示例性分析物包括但不限于受体、抗原、表面蛋白、跨膜蛋白、分化蛋白簇、蛋白通道、蛋白泵、载体蛋白、磷脂、糖蛋白、糖脂、细胞-细胞相互作用蛋白质复合物、抗原呈递复合物、主要组织相容性复合物、工程化T细胞受体、T细胞受体、B细胞受体、嵌合抗原受体、细胞外基质蛋白、细胞表面蛋白的翻译后修饰(例如磷酸化、糖基化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化或脂化)状态、缺口连接或粘附连接。
核酸分析物的实例包括DNA分析物，诸如单链DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)、基因组DNA、甲基化DNA、特定甲基化DNA序列、片段化DNA、线粒体DNA、原位合成的PCR产物和RNA/DNA杂合体。DNA分析物可以是组织样品中存在的另一种核酸分子(例如，DNA或RNA(诸如mRNA))的转录物。
核酸分析物的实例还包括RNA分析物，诸如各种类型的编码和非编码RNA。不同类型的RNA分析物的实例包括信使RNA(mRNA)，包括新生RNA、前mRNA、初级转录RNA以及加工的RNA(诸如加帽的mRNA(例如，具有5'7-甲基鸟苷帽)、聚腺苷酸化mRNA(在3'末端的聚A尾)和一个或多个内含子已去除的剪接mRNA)。本文公开的分析物中还包括未加帽的mRNA、未聚腺苷酸化的mRNA和未剪接的mRNA。RNA分析物可以是组织样品中存在的另一种核酸分子(例如，DNA或RNA(诸如病毒RNA))的转录物。不翻译成蛋白质的非编码RNA(ncRNA)的实例包括转移RNA(tRNA)和核糖体RNA(rRNA)，以及小的非编码RNA，诸如微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、小核RNA(snRNA)、细胞外RNA(exRNA)、小卡哈尔体(Cajal body)特异性RNA(scaRNAs)和长ncRNA(诸如Xist和HOTAIR)。RNA可以是小的(例如，长度小于200个核酸碱基)或大的(例如，长度大于200个核酸碱基的RNA)。小RNA的实例包括5.8S核糖体RNA(rRNA)、5S rRNA、tRNA、miRNA、siRNA、snoRNA、piRNA、tRNA衍生的小RNA(tsRNA)和小rDNA衍生的RNA(srRNA)。RNA可以是双链RNA或单链RNA。RNA可以是环状RNA。RNA可以是细菌rRNA(例如，16s rRNA或23s rRNA)。
在本文所述的一些实施方案中，分析物可以是变性核酸，其中所得的变性核酸是单链的。核酸可以是变性的，例如，任选地使用甲酰胺、热或者甲酰胺和热两者变性的。在一些实施方案中，核酸没有被变性而用于本文公开的方法中。
在某些实施方案中，可以从活细胞中提取分析物。可以调整处理条件，以确保生物样品在分析期间保持活的，并且从样品的活细胞中提取(或释放)分析物。活细胞来源的分析物只能从样品中获得一次，或者可以从持续保持活的状态的样品中以一定间隔获得。
本文公开的方法和组合物可以用于分析任何数量的分析物。例如，被分析的分析物的数量可以是存在于样品的一个区域中或基底的单个特征内的至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9、至少约10、至少约11、至少约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30，至少约40、至少约50、至少约100、至少约1,000、至少约10,000、至少约100,000种或更多种不同的分析物。
在本文所述的任何实施方案中，分析物(例如，靶分析物，诸如靶核酸)可以包含靶序列。在一些实施方案中，靶序列可以是样品的内源序列、在样品中产生的序列、添加到样品中的序列或与样品中的分析物相关的序列。在一些实施方案中，靶序列是单链靶序列(例如，滚环扩增产物中的序列)。在一些实施方案中，分析物包含一个或多个单链靶序列。在一个方面，第一单链靶序列与第二单链靶序列不同。在另一个方面，第一单链靶序列与一个或多个第二单链靶序列相同。在一些实施方案中，一个或多个第二单链靶序列包含在与第一单链靶序列相同的分析物(例如，核酸)中。可替代地，一个或多个第二单链靶序列包含在与第一单链靶序列不同的分析物(例如，核酸)中。
(ii)标记剂
在一些实施方案中，本文提供了使用一种或多种标记剂分析样品中的内源分析物(例如，RNA、ssDNA和细胞表面或细胞内蛋白质和/或代谢物)的方法和组合物。在一些实施方案中，本文公开的包含探针的方法和组合物可以与使用一种或多种标记剂的分析相结合。在一些实施方案中，分析物标记剂可以包括与分析物(例如，样品中的内源分析物)相互作用的试剂。在一些实施方案中，标记剂可以包含指示与标记剂相互作用的分析物或其部分的报告寡核苷酸。例如，报告寡核苷酸可以包含允许鉴别标记剂的条形码序列。在一些情况下，被标记剂接触的样品可以进一步与探针(例如，单链探针序列)接触，所述探针与标记剂的报告寡核苷酸杂交，以便鉴定与标记剂缔合的分析物。在一些实施方案中，分析物标记剂包含分析物结合部分和标记剂条形码结构域，所述标记剂条形码结构域包含一个或多个条形码序列，例如与分析物结合部分和/或分析物对应的条形码序列。分析物结合部分条形码包括与分析物结合部分缔合或以其他方式鉴定分析物结合部分的条形码。在一些实施方案中，通过鉴定其相关的分析物结合部分条形码来鉴定分析物结合部分，也可以鉴定分析物结合部分所结合的分析物。分析物结合部分条形码可以是给定长度的核酸序列和/或与分析物结合部分缔合的序列。分析物结合部分条形码通常可以包括本文所述的条形码的方面中的任何一个。
在一些实施方案中，所述方法包括在使样品与一种或多种标记剂接触之后的一个或多个后固定步骤。
在本文所述的方法和系统中，能够结合于或以其他方式偶联至一个或多个特征的一种或多种标记剂可以用于表征分析物、细胞和/或细胞特征。在一些情况下，细胞特征包括细胞表面特征。分析物可以包括但不限于蛋白质、受体、抗原、表面蛋白、跨膜蛋白、分化蛋白簇、蛋白通道、蛋白泵、载体蛋白、磷脂、糖蛋白、糖脂、细胞-细胞相互作用蛋白质复合物、抗原呈递复合物、主要组织相容性复合物、工程化T细胞受体、T细胞受体、B细胞受体、嵌合抗原受体、缺口连接、粘附连接或它们的任何组合。在一些情况下，细胞特征可以包括细胞内分析物，诸如蛋白质、蛋白质修饰(例如，磷酸化状态或其他翻译后修饰)、核蛋白、核膜蛋白或它们的任何组合。
在一些实施方案中，分析物结合部分可以包括能够结合分析物(例如，生物分析物，例如，大分子成分)的任何分子或部分。标记剂可以包括但不限于蛋白质、肽、抗体(或其表位结合片段)、亲脂部分(诸如胆固醇)、细胞表面受体结合分子、受体配体、小分子、双特异性抗体、双特异性T细胞衔接体、T细胞受体衔接体、B细胞受体衔接体、抗体前药、适体、单抗体、affimer、darpin和蛋白质支架或它们的任何组合。标记剂可以包括(例如，连接至)报告寡核苷酸，该报告寡核苷酸指示结合基团所结合的细胞表面特征。例如，报告寡核苷酸可以包含允许鉴别标记剂的条形码序列。例如，对一种类型的细胞特征(例如，第一细胞表面特征)具有特异性的标记剂可以具有与之偶联的第一报告寡核苷酸，而对不同细胞特征(例如，第二细胞表面特征)具有特异性的标记剂可以具有与之偶联的不同报告寡核苷酸。关于示例性标记剂、报告寡核苷酸和使用方法的描述，参见例如美国专利10,550,429；美国专利公开2019/0177800；以及美国专利公开2019/0367969，这些专利均全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，分析物结合部分包括一种或多种抗体或其抗原结合片段。包括分析物结合部分的抗体或抗原结合片段可以特异性地结合靶分析物。在一些实施方案中，分析物是蛋白质(例如，生物样品(例如，细胞)表面上的蛋白质或细胞内蛋白质)。在一些实施方案中，包含多个分析物结合部分的多个分析物标记剂结合生物样品中存在的多种分析物。在一些实施方案中，所述多种分析物包括分析物的单种物类(例如，多肽的单种物类)。在其中所述多种分析物包括分析物的单种物类的一些实施方案中，所述多种分析物标记剂的分析物结合部分是相同的。在其中所述多种分析物包括分析物的单种物类的一些实施方案中，所述多种分析物标记剂的分析物结合部分是不同的(例如，所述多种分析物标记剂的成员可以具有分析物结合部分的两种或更多种物类，其中分析物结合部分的两种或更多种物类中的每种物类结合分析物的单种物类，例如在不同的结合位点)。在一些实施方案中，所述多种分析物包括分析物的多种不同物类(例如，多肽的多种不同物类)。
在其他情况下，例如为了促进样品复用，对特定细胞特征具有特异性的标记剂可以具有偶联至第一报告寡核苷酸的第一多种标记剂(例如，抗体或亲脂部分)和偶联至第二报告寡核苷酸的第二多种标记剂。
在一些方面，这些报告寡核苷酸可以包含一定核酸条形码序列，所述核酸条形码序列允许鉴定报告寡核苷酸与之偶联的标记剂。将寡核苷酸选择为报告子可以提供以下优点：能够在序列方面产生显著多样性，同时还易于连接至大多数生物分子(例如，抗体等)，而且是可检测的。
报告寡核苷酸连接(偶联)至标记剂可以通过多种直接或间接、共价或非共价缔合或连接中的任何一种来实现。例如，寡核苷酸可以使用化学缀合技术(例如，可从InnovaBiosciences获得的Lightning-抗体标记试剂盒)共价连接至标记剂(诸如蛋白质，例如抗体或抗体片段)的一部分，以及使用其他非共价连接机制进行连接，例如使用生物素酰化抗体和带有亲和素或链霉亲和素接头的寡核苷酸(或包括偶联至寡核苷酸的一个或多个生物素酰化接头的珠粒)。抗体和寡核苷酸生物素酰化技术是可用的。参见例如Fang等人,“Fluoride-Cleavable Biotinylation Phosphoramidite for 5′-end-Labelling andAffinity Purification of Synthetic Oligonucleotides,”Nucleic Acids Res.2003年1月15日；31(2):708-715，其出于所有目的全文以引用方式并入本文。同样，蛋白质和肽生物素酰化技术已经被开发并且是现成的。参见例如美国专利号6,265,552，其出于所有目的以引用方式并入本文。此外，点击反应化学可以用于将报告寡核苷酸偶联到标记剂上。可商购获得的试剂盒(诸如来自Thunderlink和Abcam的那些)以及本领域中常见的技术可以在适当时用于将报告寡核苷酸偶联至标记剂。在另一个实例中，标记剂间接(例如，经由杂交)偶联至报告寡核苷酸，该报告寡核苷酸包含鉴别该标记剂的条形码序列。例如，标记剂可以直接偶联(例如，共价结合)至杂交寡核苷酸，该杂交寡核苷酸包含与报告寡核苷酸的序列杂交的序列。杂交寡核苷酸与报告寡核苷酸的杂交将标记剂偶联至报告寡核苷酸。在一些实施方案中，诸如在施加刺激时，报告寡核苷酸可从标记剂释放。例如，报告寡核苷酸可以通过不稳定键(例如，化学不稳定、光不稳定、热不稳定等)连接至标记剂，如本文其他地方针对从支持物释放分子大体描述的。
在一些情况下，标记剂可以包含报告寡核苷酸和标签。标签可以是荧光团、放射性同位素、能够发生比色反应的分子、磁性颗粒或者能够检测的任何其他合适的分子或化合物。标签可以直接或间接缀合至标记剂(或报告寡核苷酸)(或，标签可以缀合至可结合于标记剂或报告寡核苷酸的分子)。在一些情况下，标签缀合至与报告寡核苷酸的序列互补(例如，杂交)的第一寡核苷酸。
在一些实施方案中，来自生物样品的分析物(例如，多肽)的多种不同物类可以随后与生物样品的一种或多种物理特性相关联。例如，分析物的多种不同物类可以与生物样品中分析物的位置相关联。这样的信息(例如，当分析物结合部分识别多肽时的蛋白质组信息)可以与其他空间信息(例如，来自生物样品的遗传信息，诸如DNA序列信息、转录组信息(例如，转录物序列)或两者)结合使用。例如，细胞的细胞表面蛋白可以与细胞的一种或多种物理特性(例如，细胞的形状、尺寸、活性或类型)相关联。所述一种或多种物理特性可以通过对细胞成像来表征。细胞可以被分析物标记剂结合，所述标记剂包含结合细胞表面蛋白的分析物结合部分和鉴定该分析物结合部分的分析物结合部分条形码。样品(例如，组织样品或细胞)中的蛋白质分析结果可以与样品中的DNA和/或RNA分析相关联。在一些实施方案中，本文公开的标记剂可以用于检测多种核酸和/或非核酸分析物的多重测定，与使用不对称探针的检测相结合，其中不对称探针可以用于检测一种或多种内源分析物(例如，基因组DNA和/或RNA如mRNA转录物中的SNP)。
(iii)内源分析物和/或标记剂的产物
在一些实施方案中，本文提供了用于分析生物样品中内源分析物和/或标记剂的一种或多种产物的方法和组合物。在一些实施方案中，分析内源分析物(例如，病毒或细胞DNA或RNA)或其产物(例如，杂交产物、连接产物、延伸产物(例如，通过DNA或RNA聚合酶)、复制产物、转录/逆转录产物和/或扩增产物，诸如滚环扩增(RCA)产物)。在一些实例中，可以使用如第III节中所述的多核苷酸，并通过进行如第IV节中所述的杂交、连接、扩增或其他步骤来产生产物。在一些实施方案中，分析直接或间接与生物样品中的分析物结合的标记剂。在一些实施方案中，分析直接或间接与生物样品中的分析物结合的标记剂的产物(例如，杂交产物、连接产物、延伸产物(例如，通过DNA或RNA聚合酶)、复制产物、转录/逆转录产物和/或扩增产物，诸如滚环扩增(RCA)产物)。在一些实施方案中，可以使用本文所述的方法的组合来分析一种或多种类型的分析物。
(a)杂交
在一些实施方案中，内源分析物和/或标记剂的产物是杂交产物，其包含在两个不同分子内成对的基本上互补或互补的核酸序列，其中一个分子是内源分析物或标记剂(例如，与其连接的报告寡核苷酸)。另一个分子可以是另一种内源分子或另一种标记剂，诸如探针。配对可以通过任何方法实现，其中核酸序列通过碱基配对与基本上或完全互补的序列结合以形成杂交复合物。出于杂交的目的，如果两个核酸序列各自单独的碱基的至少60％(例如，至少70％、至少80％或至少90％)彼此互补，则这两个核酸序列是“基本上互补的”。
各种探针和探针组可以与内源分析物和/或标记剂杂交，并且每个探针可以包含一个或多个条形码序列。例如，探针和探针组可以包含如第III节中所述的多核苷酸。示例性加条形码的探针或探针组可以基于挂锁探针、缺口挂锁探针、SNAIL(Splint NucleotideAssisted Intramolecular Ligation，夹板核苷酸辅助分子内连接)探针组、PLAYR(Proximity Ligation Assay for RNA，RNA邻近连接测定)探针组、PLISH(ProximityLigation in situ Hybridization，邻近连接原位杂交)探针组和RNA模板化连接探针。特定的探针或探针组设计可以变化。
(b)连接
在一些实施方案中，内源分析物和/或标记剂的产物是连接产物。在一些实施方案中，在两种或更多种内源分析物之间形成连接产物。在一些实施方案中，在内源分析物与标记剂之间形成连接产物。在一些实施方案中，在两种或更多种标记剂之间形成连接产物。在一些实施方案中，连接产物是内源分析物的分子内连接。在一些实施方案中，连接产物是标记剂的分子内连接，例如，在与靶序列杂交时可环化探针或探针组的环化。靶序列可以包含在内源分析物(例如，核酸，诸如基因组DNA或mRNA)或其产物(例如，来自细胞mRNA转录物的cDNA)中，或者包含在标记剂(例如，报告寡核苷酸)或其产物中。
在一些实施方案中，本文提供了能够进行DNA模板化连接(诸如从cDNA分子)的探针或探针组。参见例如美国专利8,551,710，其据此全文以引用方式并入。在一些实施方案中，本文提供了能够进行RNA模板化连接的探针或探针组。参见例如美国专利公开2020/0224244，其据此全文以引用方式并入。在一些实施方案中，探针组是SNAIL探针组。参见例如美国专利公开2019/0055594，其据此全文以引用方式并入。在一些实施方案中，本文提供了多重邻近连接测定。参见例如美国专利公开2014/0194311，其据此全文以引用方式并入。在一些实施方案中，本文提供了能够进行邻近连接的探针或探针组，例如RNA邻近连接测定(例如，PLAYR)探针组。参见例如美国专利公开2016/0108458，其据此全文以引用方式并入。在一些实施方案中，环状探针可以间接与靶核酸杂交。在一些实施方案中，环状构建体由能够进行邻近连接的探针组(例如邻近连接原位杂交(PLISH)探针组)形成。参见例如美国专利公开2020/0224243，其据此全文以引用方式并入。
在一些实施方案中，连接涉及化学连接。在一些实施方案中，连接涉及模板依赖性连接。在一些实施方案中，连接涉及非模板依赖性连接。在一些实施方案中，连接涉及酶促连接。
在一些实施方案中，酶促连接涉及连接酶的使用。在一些方面，本文所用的连接酶包括通常用于将多核苷酸连接在一起或连接单个多核苷酸末端的酶。RNA连接酶、DNA连接酶或另一种连接酶可以用于将两个核苷酸序列连接在一起。连接酶包括ATP依赖性双链多核苷酸连接酶、NAD-i依赖性双链DNA或RNA连接酶和单链多核苷酸连接酶，例如在EC6.5.1.1(ATP依赖性连接酶)、EC 6.5.1.2(NAD+依赖性连接酶)、EC 6.5.1.3(RNA连接酶)中所述的任何一种连接酶。连接酶的具体实例包括细菌连接酶(诸如大肠杆菌DNA连接酶)、Tth DNA连接酶、热球菌属(Thermococcus)物种(菌株9°N)DNA连接酶(9°NTMDNA连接酶，NewEngland Biolabs)、Taq DNA连接酶、AmpligaseTM(Epicentre Biotechnologies)和噬菌体连接酶(诸如T3 DNA连接酶、T4 DNA连接酶和T7 DNA连接酶)以及它们的突变体。在一些实施方案中，连接酶是T4 RNA连接酶。在一些实施方案中，连接酶是splintR连接酶。在一些实施方案中，连接酶是单链DNA连接酶。在一些实施方案中，连接酶是T4 DNA连接酶。在一些实施方案中，连接酶具有DNA夹板化DNA连接酶活性。在一些实施方案中，连接酶具有RNA夹板化DNA连接酶活性。在一些实施方案中，连接酶具有RNA夹板化RNA连接酶活性。
在一些实施方案中，本文的连接是直接连接。在一些实施方案中，本文的连接是间接连接。“直接连接”意指多核苷酸的末端彼此紧邻杂交以形成连接酶的底物，从而导致它们彼此连接(分子内连接)。可替代地，“间接”意指多核苷酸的末端彼此不相邻地杂交，例如被一个或多个插入核苷酸或“缺口”隔开。在一些实施方案中，所述末端彼此不直接连接，而是通过一个或多个插入物(所谓的“缺口”或“缺口填充”(寡)核苷酸)的中介或通过探针3’末端的延伸来“填充”与所述插入核苷酸相对应的“缺口”(分子间连接)而发生。在一些情况下，多核苷酸的杂交末端之间的一个或多个核苷酸的缺口可以被一个或多个“缺口”(寡)核苷酸“填充”，该一个或多个“缺口”(寡)核苷酸与夹板、可环化探针或靶核酸互补。缺口可以是1至60个核苷酸的缺口或1至40个核苷酸的缺口或3至40个核苷酸的缺口。在具体实施方案中，缺口可以是约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多个核苷酸的缺口、在所示值之间的任何整数(或整数范围)个的核苷酸的缺口。在一些实施方案中，所述末端区域之间的缺口可以通过缺口寡核苷酸或通过延伸多核苷酸的3'末端来填充。在一些情况下，连接涉及将探针的末端连接到至少一个缺口(寡)核苷酸上，使得缺口(寡)核苷酸掺入到所得的多核苷酸中。在一些实施方案中，在本文的连接之前进行缺口填充。在其他实施方案中，本文的连接不需要缺口填充。
在一些实施方案中，多核苷酸连接产生的多核苷酸的解链温度高于未连接的多核苷酸的解链温度。因此，在一些方面，在后续步骤(包括扩增和检测)之前，连接稳定了含有连接的多核苷酸的杂交复合物。
在一些方面，使用高保真连接酶，诸如热稳定的DNA连接酶(例如，Taq DNA连接酶)。热稳定的DNA连接酶在升高的温度下有活性，通过在接近DNA链的解链温度(Tm)的温度下温育连接允许进一步的区分。与退火的完全碱基配对的底物相比，这选择性地降低了退火的错配底物的浓度(预期在错配周围具有稍低的Tm)。因此，高保真连接可以通过连接酶活性位点的固有选择性和平衡条件的组合来实现，以降低退火错配dsDNA的发生率。
在一些实施方案中，本文的连接是连接彼此邻近的两个(或更多个)核酸序列的邻近连接，例如，通过酶促手段(例如，连接酶)。在一些实施方式中，邻近连接可以包括“缺口填充”步骤，其涉及跨越两个感兴趣的核酸分子之间的距离，基于模板核酸分子的核酸序列，通过聚合酶掺入一个或多个核酸(参见例如美国专利号7,264,929，其全部内容以引用方式并入本文)。各种不同的方法可以用于邻近连接核酸分子，包括(但不限于)“粘性末端”和“平末端”连接。此外，单链连接可以用于在单链核酸分子上进行邻近连接。粘性末端邻近连接涉及在连接事件本身之前，待连接的两个核酸分子之间互补单链序列的杂交。平末端邻近连接通常不包括来自每个核酸分子的互补区域的杂交，因为两个核酸分子在连接位点处都缺乏单链突出端。
(c)引物延伸和扩增
在一些实施方案中，产物是分析物、标记剂、与分析物结合的探针或探针组(例如，与基因组DNA、mRNA或cDNA结合的挂锁探针)、或与标记剂结合的探针或探针组(例如，与来自相同或不同标记剂的一种或多种报告寡核苷酸结合的挂锁探针)的引物延伸产物。
引物通常是可以在核酸延伸反应中用作核酸聚合酶底物的具有3'末端的单链核酸序列。RNA引物由RNA核苷酸形成并且用于RNA合成，而DNA引物由DNA核苷酸形成并且用于DNA合成。引物也可以包含RNA核苷酸和DNA核苷酸(例如，以随机或设计的模式)两者。引物还可以包含本文所述的可以具有另外的功能的其他天然或合成核苷酸。在一些实例中，DNA引物可以用于引发RNA合成，反之亦然(例如，RNA引物可以用于引发DNA合成)。引物的长度可以变化。例如，引物可以是约6个碱基至约120个碱基。例如，引物可以包含多达约25个碱基。在一些情况下，引物可以指引物结合序列。在一些实施方案中，引物延伸反应包括两个核酸序列通过它们的相应末端互补核酸序列(例如，3’末端)的重叠而连接(例如，杂交)的任何方法。这种连接之后，可以使用另一核酸序列作为延伸模板进行一个或两个末端的核酸延伸(例如，酶促延伸)。酶促延伸可以通过包括但不限于聚合酶和/或逆转录酶的酶来进行。
在一些实施方案中，内源分析物和/或标记剂的产物是一种或多种多核苷酸(例如，环状探针或可环化探针或探针组)的扩增产物。在一些实施方案中，通过执行滚环扩增(RCA)来实现扩增。在其他实施方案中，添加与环状探针或环化探针杂交的引物，并且原样用于扩增。在一些实施方案中，RCA包括线型RCA、分支RCA、树状RCA或它们的任何组合。
在一些实施方案中，扩增在或在约20℃与约60℃之间的温度下进行。在一些实施方案中，扩增在或在约30℃与约40℃之间的温度下进行。在一些方面，扩增步骤(诸如滚环扩增(RCA))在为或约25℃与为或约50℃之间的温度(诸如为或约25℃、27℃、29℃、31℃、33℃、35℃、37℃、39℃、41℃、43℃、45℃、47℃或49℃)下进行。
在一些实施方案中，在存在适当的dNTP前体和其他辅因子的情况下添加DNA聚合酶后，引物被延伸以产生环状模板的多个拷贝。该扩增步骤可以利用等温扩增或非等温扩增。在一些实施方案中，在杂交复合物形成和扩增探针结合后，杂交复合物发生滚环扩增以产生包含多拷贝cDNA的cDNA纳米球(例如，扩增子)。本文可以使用的滚环扩增(RCA)技术包括线型RCA、分支RCA、树状RCA或它们的任何组合。参见例如Baner等人,Nucleic AcidsResearch,26:5073-5078,1998；Lizardi等人,Nature Genetics 19:226,1998；Mohsen等人,Acc Chem Res.2016年11月15日；49(11):2540–2550；Schweitzer等人,Proc.NatlAcad.Sci.USA 97:101 13-1 19,2000；Faruqi等人,BMC Genomics 2:4,2000；Nallur等人,Nucl.Acids Res.29:e118,2001；Dean等人,Genome Res.11:1095-1099,2001；Schweitzer等人,Nature Biotech.20:359-365,2002；美国专利号6,054,274、6,291,187、6,323,009、6,344,329和6,368,801。用于RCA的示例性聚合酶包括DNA聚合酶，诸如phi29()聚合酶、Klenow片段、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)DNA聚合酶(BST)、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶或DNA聚合酶I。在一些方面，可以采用已经被工程化或突变以具有期待的特征的DNA聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶是phi29 DNA聚合酶。
在一些方面，在扩增步骤期间，可以将经修饰的核苷酸添加到反应中，以将经修饰的核苷酸掺入扩增产物(例如，纳米球)中。经修饰的核苷酸的实例包括胺修饰的核苷酸。在所述方法的一些方面，例如，用于将所产生的扩增产物(例如，纳米球)锚定或交联到支架、细胞结构和/或其他扩增产物(例如，其他纳米球)上。在一些方面，扩增产物包含经修饰的核苷酸，诸如胺修饰的核苷酸。在一些实施方案中，胺修饰的核苷酸包含丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺部分修饰。其他胺修饰的核苷酸的实例包括但不限于5-氨基烯丙基-dUTP部分修饰、5-炔丙基氨基-dCTP部分修饰、N6-6-氨基己基-dATP部分修饰或7-脱氮杂-7-炔丙基氨基-dATP部分修饰。
在一些方面，可以将多核苷酸和/或扩增产物(例如，扩增子)锚定到聚合物基质上。例如，聚合物基质可以是水凝胶。在一些实施方案中，可以对一个或多个多核苷酸探针进行修饰以含有官能团，所述官能团可以用作将多核苷酸探针和/或扩增产物附着到聚合物基质上的锚定位点。可以根据所提供的实施方案采用的示例性修饰和聚合物基质包括例如US2016/0024555、US 2018/0251833、US2017/0219465、US10,138,509、US10,494,662、US11,078,520、US11,299,767、US10,266,888、US11,118,220、US2021/0363579、US2021/0324450和US2021/0215581中所述的那些，所有这些专利均全文以引用方式并入本文。在一些实例中，支架还包含能够与探针组或扩增产物的修饰或官能团反应或掺入探针组或扩增产物的修饰或官能团的修饰或官能团。在一些实例中，支架可以包含寡核苷酸、聚合物或化学基团，以提供基质和/或支持结构。
扩增产物可以固定在基质内，通常在核酸被扩增的位置，从而产生扩增子的局部集落。扩增产物可以通过空间因素固定在基质内。扩增产物也可以通过共价键或非共价键固定在基质内。以这种方式，可以认为扩增产物连接到基质上。通过固定到基质上，诸如通过共价键或交联，保持了原始扩增子的尺寸和空间关系。通过固定到基质上，诸如通过共价键或交联，扩增产物对机械应力下移动或散开有抗性。
在一些方面，扩增产物共聚合和/或共价连接到周围的基质上，从而保留了它们的空间关系和任何其固有的信息。例如，如果扩增产物是由在基质中包埋的细胞内的DNA或RNA产生的那些，则扩增产物也可以被官能化以形成与基质的共价连接，保留它们在细胞内的空间信息，从而提供亚细胞定位分布模式。在一些实施方案中，所提供的方法涉及在水凝胶亚单位的存在下包埋一种或多种多核苷酸探针组和/或扩增产物，以形成一种或多种水凝胶包埋的扩增产物。在一些实施方案中，所描述的水凝胶-组织化学包括将核酸共价连接到用于组织清除、酶扩散和多循环测序的原位合成水凝胶上，而现有的水凝胶-组织化学方法则不能。在一些实施方案中，为了使扩增产物能够包埋在组织-水凝胶设置中，将胺修饰的核苷酸包含在扩增步骤(例如，RCA)中，使用丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯官能化为丙烯酰胺部分，并且与丙烯酰胺单体共聚合以形成水凝胶。
在一些实施方案中，RCA模板可以包含靶分析物或其一部分，其中靶分析物是核酸，或者它可以作为分析物的替代物或标记来提供或产生。基于RCA的检测系统可以用于检测不同的分析物，例如，其中通过从测定中提供或产生的环状RCA模板产生RCP来提供信号，并且检测RCP以检测分析物。因此，RCP可被视为报告分子，通过检测它来检测靶分析物。然而，RCA模板也可以被视为靶分析物的报告分子；RCP是基于RCA模板产生的，并且包含RCA模板的互补拷贝。RCA模板决定了被检测到的信号，并且因此指示靶分析物。如下文将更详细描述的，RCA模板可以是探针或探针的一部分或组分，或者可以由探针产生，或者可以是检测测定的组分(例如，检测测定中的试剂)，其用作测定的报告分子、或报告分子的一部分、或信号产生系统。因此，用于产生RCP的RCA模板可以是环状(例如，环化的)报告核酸分子，即来自任何基于RCA的检测测定，所述检测测定使用或产生环状核酸分子作为测定的报告分子。因为RCA模板产生RCP报告分子，所以其可以被视为测定的报告系统的一部分。
在一些实施方案中，本文的产物包括以任何合适的组合在一系列反应中产生的分子或复合物，这些反应例如为杂交、连接、延伸、复制、转录/逆转录和/或扩增(例如，滚环扩增)。例如，包含本文公开的探针的靶序列的产物可以是由样品中的细胞核酸和外源添加的核酸探针形成的杂交复合物。外源添加的核酸探针可以包含不与细胞核酸杂交但与另一探针杂交的突出端。外源添加的核酸探针可以任选地连接到细胞核酸分子或另一外源核酸分子上。在其他实例中，包含本文公开的探针的靶序列的产物可以是可环化探针或探针组的RCP，其与细胞核酸分子(例如，基因组DNA或mRNA)或其产物(例如，转录物诸如cDNA、两个探针的DNA模板化连接产物或两个探针的RNA模板化连接产物)杂交。在其他实例中，包含本文公开的探针的靶序列的产物可以是与RCP杂交的探针。探针可以包含不与RCP杂交但与另一探针杂交的突出端。探针可以任选地连接到细胞核酸分子或另一探针，例如与RCP杂交的锚定探针。
III.多核苷酸和杂交复合物
本文在一些方面公开了被引入到细胞中或用于以其他方式接触生物样品(诸如组织样品)的核酸探针和/或探针组(例如，可环化探针或探针组，诸如包含不对称靶互补序列的挂锁探针)。探针可以包含可以通常通过沃森-克里克碱基配对与核酸杂交的多种实体中的任何一种，诸如DNA、RNA、LNA、PNA等，具体取决于应用。核酸探针通常包含能够与靶核酸的至少一部分结合(在一些实施方案中，特异性地结合)的靶向序列。核酸探针可能能够结合特异性靶核酸(例如，mRNA或本文所讨论的其他核酸)。在一些实施方案中，可以使用可检测标记和/或通过使用能够结合核酸探针的二级核酸探针来确定核酸探针。在一些实施方案中，核酸探针与一种或多种生物和/或化学反应相容。例如，本文公开的核酸探针可以用作聚合酶的模板或引物、连接酶的模板或底物、点击化学反应的底物和/或核酸酶(例如，用于切割的核酸内切酶)的底物。
本文提供了这样的方法，其涉及使用一个或多个探针(例如，挂锁探针)来分析一个或多个靶核酸，诸如细胞或生物样品(诸如组织样品)中存在的靶核酸(例如，信使RNA)。还提供了根据所提供的方法使用的探针、探针组、组合物、试剂盒、系统和装置。在一些方面，所提供的方法和系统可以应用于检测、成像、定量或确定一个或多个靶核酸或其部分的存在或不存在(例如，序列变体(诸如点突变和SNP)的存在或不存在)。在一些方面，所提供的方法可以应用于检测、成像、定量或确定一个或多个靶核酸的序列，包括序列变体，诸如点突变和SNP。
在一些方面，所提供的实施方案可以用于细胞中的、例如生物样品或衍生自生物样品的样品(诸如固体支持物上的组织切片，如透明载玻片上的组织切片)的细胞中的靶核酸的原位检测和/或测序。
在一些方面，本文提供了使用显微术作为读出的原位测定，例如核酸测序、杂交或其他涉及光学读出的检测或确定方法。在一些方面，对靶核酸的一个、两个、三个、四个、五个或更多个核苷酸的序列的检测或确定是在完整组织的细胞中原位进行的。在一些方面，进行序列的检测或确定，从而检测原始样品中靶核酸(或与靶核酸相关的产物或其衍生物)的定位。在一些实施方案中，该测定包括检测扩增产物或其一部分(例如，RCA产物)的存在或不存在。在一些实施方案中，提供了一种用于对生物样品中的分析物(诸如转录组或其子集)进行空间谱分析的方法。提供了用于这些原位测定(包括空间基因组学和转录组学测定)的方法、组合物、试剂盒、装置和系统。在一些实施方案中，所提供的方法是定量的，并且保留了组织样品内的空间信息，而无需物理地分离细胞或使用匀浆。在一些实施方案中，本公开提供了用于原位高通量谱分析大量靶(诸如转录物和/或DNA基因座)中的一个或多个感兴趣的单核苷酸、用于检测和/或定量细胞、组织、器官或生物体中的核酸的方法。
在一些方面，本文公开的方法包括使用与靶核酸(诸如RNA分子)杂交的一个或多个探针或探针组，其中至少一个探针是包含与核酸分子杂交的不对称臂的可环化探针。示例性探针可以基于挂锁探针、缺口挂锁探针、SNAIL(Splint Nucleotide AssistedIntramolecular Ligation，夹板核苷酸辅助分子内连接)探针组、PLAYR(ProximityLigation Assay for RNA，RNA邻近连接测定)探针组、PLISH(Proximity Ligation insitu Hybridization，邻近连接原位杂交)探针组和RNA模板化连接探针。特定的探针或探针组设计可以变化。在一些实施方案中，一级探针(例如，直接结合RNA靶的DNA探针)通过滚环扩增进行扩增。在一些实施方案中，一级探针(诸如可环化探针或包含可环化探针的探针组)包含一个或多个条形码。在一些实施方案中，一个或多个条形码指示靶核酸中的序列，诸如感兴趣的单核苷酸(例如，SNP或点突变)、二核苷酸序列或长度为约5个核苷酸的短序列。
合适的可环化探针或探针组可以是具有可连接末端的线性分子形式的可环化RCA模板，其可以通过将末端直接或间接连接在一起而环化，例如彼此连接，或连接到插入(“缺口”)寡核苷酸的相应末端，或连接到可环化RCA模板的延伸3’末端。可环化模板也可以以两个或更多个部分提供，即可以连接在一起形成环的两个或更多个分子(例如，寡核苷酸)。在一些实施方案中，RCA模板在RCA之前通过连接环化。连接可以使用连接模板来模板化，并且在挂锁和分子倒置探针等的情况下，靶分析物可以提供连接模板，或者可以单独提供。在一些实施方案中，可环化RCA模板(或模板部分或组成部分)在其相应3’和5’末端包含与连接模板中的对应同源互补区(或结合位点)互补的区域，这些同源互补区可以与插入“缺口”序列相邻(其中末端彼此直接连接)或不相邻(其中发生间接连接)。
在挂锁探针的情况下，在一个实施方案中，挂锁探针的末端可以通过与靶核酸分子(诸如靶分析物)上的相邻序列杂交而彼此邻近，靶核酸分子充当连接模板，因此允许末端连接在一起形成环状核酸分子，从而允许环化的挂锁探针充当RCA反应的模板。在这样的实例中，与靶核酸分子杂交的挂锁探针的末端序列可以对所讨论的靶分析物具有特异性，并且可以在RCA产物中重复复制。因此，它们可以充当指示该靶分析物或其序列(诸如靶核酸中的SNP位点)的标记序列。因此，可以看出RCA产物中的标记序列可能等同于靶分析物本身中存在的序列。可替代地，可以在挂锁探针的非靶互补部分中提供标记序列(例如，标签或条形码序列)。在更进一步的实施方案中，标记序列可以存在于缺口寡核苷酸中，该缺口寡核苷酸在挂锁探针的相应杂交末端之间杂交，其中它们与靶分子中的非相邻序列杂交。
在一些实施方案中，本公开的检测方法可以用于检测靶核酸序列中的单核苷酸多态性或实际上任何变异碱基。用于这种方法的可环化探针可以在探针的5’末端包含5’附加序列。切割探针以去除5’附加序列提供了5’可连接末端，其可以连接到探针的3’可连接末端。如本文其他地方详细公开的，包含5’可连接末端的切割的探针的“臂”和包含3’可连接末端的“臂”可以是不对称的，例如，5’“臂”可以比3’“臂”短，诸如图4A所示。
在一些实施方案中，本文公开的核酸探针(例如，可环化探针)可以由多种组分预先组装，例如，在核酸探针与靶核酸或样品接触之前组装。在一些实施方案中，本文公开的核酸探针可以在靶核酸或样品与多种组分接触期间和/或之后组装。在一些实施方案中，本文公开的核酸探针在样品中原位组装。在一些实施方案中，所述多种组分可以按任何合适的次序和以任何合适的组合与靶核酸或样品接触。例如，第一组分和第二组分可以与靶核酸接触，以允许组分之间的结合和/或第一和/或第二组分与靶核酸之间的结合。任选地，可以在组分之间和/或组分中的任一者或两者与靶核酸之间进行涉及组分中的任一者或两者和/或靶核酸的反应，如杂交、连接、引物延伸和/或扩增、化学或酶促切割、点击化学或它们的任何组合。在一些实施方案中，可以在反应之前、期间或之后添加第三组分。在一些实施方案中，可以在使样品与第一和/或第二组分接触之前、期间或之后添加第三组分。在一些实施方案中，第一、第二和第三组分可以以任何合适的组合顺序或同时与样品接触。在一些实施方案中，核酸探针可以以逐步方式原位组装，每个步骤添加一种或多种组分，或在所有组分被组装在一起的动态过程中组装。一个或多个去除步骤(例如，通过诸如在严格条件下洗涤样品)可以在组装过程中的任何时间点进行，以在该时间点去除或去稳定不需要的中间体和/或组分，并增加精确的探针组装和组装的探针的特异性靶结合的机会。
在一些方面，所提供的方法涉及分析(例如，检测或确定)多核苷酸中和/或扩增产物中(诸如在包含一个或多个条形码序列的环化的可环化探针的扩增产物中)存在的一个或多个序列。在一些实施方案中，分析包括确定扩增产物的全部或一部分的序列。在一些实施方案中，分析包括检测扩增产物中存在的序列。在一些实施方案中，扩增产物的全部或一部分的序列指示靶核酸中感兴趣的区域(例如，单核苷酸)的身份。在一些实施方案中，分析可以用于将扩增产物中检测到的序列与可环化探针关联(例如，通过条形码)。在一些实施方案中，检测扩增产物中的序列可以提供关于样品中相关靶核酸(例如，被可环化探针杂交)的位置和/或身份的信息。在一些实施方案中，由于一个或多个多核苷酸(例如，挂锁探针)的扩增，即使多核苷酸在扩增前以低水平存在，也可以检测到扩增产物或其互补序列中存在的特定序列。例如，条形码序列和/或其互补序列的拷贝数由于包含条形码序列和/或其互补序列的探针的扩增而增加，从而能够特异性和灵敏地检测指示靶核酸中感兴趣的短区域(例如，单核苷酸)的身份的信号。在特定实施方案中，扩增产物是环化的可环化探针的原位滚环扩增(RCA)产物。
在一些实施方案中，本文提供了用于评估生物样品(诸如细胞或组织样品(诸如组织切片))中的一个或多个靶核酸(诸如多个不同的mRNA)的方法。在一些实施方案中，靶核酸包含DNA。在一些实施方案中，靶核酸包含RNA。在一些实施方案中，可环化探针或探针组包含DNA。在一些实施方案中，靶核酸是RNA，并且可环化探针或探针组包含DNA。
在一些方面，所提供的方法用于靶核酸的原位分析，例如用于在完整组织或保留了细胞或组织结构的样品中的原位测序或多重分析。在一些方面，所提供的方法可以用于原位检测或确定靶核酸中感兴趣的单核苷酸的身份或量，例如感兴趣的基因的单核苷酸多态性。
在一些方面，所提供的方法涉及使一个或多个多核苷酸(诸如本文所述的任何可环化探针)与含有具有感兴趣区域(例如，单核苷酸)的靶核酸的细胞或样品接触或杂交以形成杂交复合物的步骤。在一些方面，所提供的方法包括连接多核苷酸(例如连接可环化探针的末端以形成环化探针)的一个或多个步骤。在一些方面，所提供的方法涉及扩增多核苷酸之一(例如，挂锁探针或由其产生的环化探针)以产生扩增产物的步骤。在一些方面，所提供的方法涉及检测和/或确定扩增产物的全部或一部分(例如，扩增产物中包含的一个或多个条形码)和/或一个或多个扩增或未扩增的多核苷酸(例如其中包含的任何条形码)的序列的步骤。在一些方面，所提供的方法涉及同时和/或顺序执行本文所述的一个或多个步骤。
在一些实施方案中，本文公开的可环化探针包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多、20或更多、32或更多、40或更多、或50或更多个条形码序列。条形码序列可以位于核酸探针内的任何位置。如果存在多于一个条形码序列，则条形码序列可以彼此相邻定位，和/或与其他序列穿插。在一些实施方案中，条形码序列中的两个或更多个也可以至少部分地重叠。在一些实施方案中，同一探针中的两个或更多个条形码序列不重叠。在一些实施方案中，同一探针中的所有条形码序列由至少一个磷酸二酯键彼此分开(例如，它们可以彼此紧邻但不重叠)，如分开1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个核苷酸。
如果存在，条形码序列可以具有任何长度。如果使用多于一个条形码序列，则条形码序列可以独立地具有相同或不同的长度，如长度为至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少50个核苷酸。在一些实施方案中，条形码序列的长度可以不超过120、不超过112、不超过104、不超过96、不超过88、不超过80、不超过72、不超过64、不超过56、不超过48、不超过40、不超过32、不超过24、不超过16或不超过8个核苷酸。任何这些的组合也是可能的，例如，条形码序列可以在5至10个核苷酸之间、8至15个核苷酸之间等。
条形码序列可以是任意的或随机的。在某些情况下，条形码序列选择为减少或最小化与样品中其他组分的同源性，例如，使得条形码序列本身不与怀疑在细胞或其他样品内的其他核酸结合或杂交。在一些实施方案中，在特定的条形码序列与另一序列(例如，样品中的细胞核酸序列或添加到样品中的探针中的其他条形码序列)之间，同源性可以小于10％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％。在一些实施方案中，同源性可以小于20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个碱基，并且在一些实施方案中，所述碱基为连续碱基。
在一些实施方案中，核酸探针群体中的不同条形码序列的数量小于核酸探针的不同靶(例如，核酸分析物和/或蛋白质分析物)的数量，但不同的靶仍然可以例如通过用条形码序列的不同组合编码探针而从彼此唯一地鉴定。然而，并不需要使用一组给定条形码序列的所有可能组合。例如，每个探针可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15等或更多个条形码序列。在一些实施方案中，核酸探针群体可以各自包含相同数量的条形码序列，但在其他情况下，在不同的探针上可能存在不同数量的条形码序列。在一些实施方案中，核酸探针群体中的条形码序列或其任何子集可以被独立地和/或组合地检测和/或解码。
作为说明性实例，第一可环化探针可以包含第一靶结合序列、第一条形码序列和第二条形码序列，而第二不同的可环化探针可以包含第二靶结合序列(其不同于第一探针中的第一靶结合序列)、与第一探针中相同的第一条形码序列，但是包含第三条形码序列而不是第二条形码序列。因此，可以通过确定样品中给定位置处存在的或与给定探针相关的各种条形码序列组合来区分此类可环化探针。
在一些实施方案中，本文公开了一种用于分析生物样品的方法，该方法包括使生物样品与可环化探针或探针组接触，其中可环化探针包含分别用于与靶核酸中相邻的第一区域和第二区域杂交的5’杂交区域和3’杂交区域，并且5’杂交区域和3’杂交区域的长度不同。在一些实施方案中，5’杂交区域和/或3’杂交区域包含用于分别探询第一区域或第二区域中感兴趣的序列的探询序列。在一些实施方案中，5’杂交区域和3’杂交区域中较短的一者包含探询序列，诸如靶核酸中感兴趣的单核苷酸的探询核苷酸。在一些实施方案中，靶核酸的第一分子中感兴趣的序列与探询序列互补，而靶核酸的第二分子中感兴趣的序列包含与探询序列的错配。在一些实施方案中，错配不在可环化探针的5’或3’末端核苷酸。在一些实施方案中，该方法还包括连接与靶核酸的第一分子杂交的可环化探针的5’和3’杂交区域，以形成环化的可环化探针，而在相同或相似的条件下，与靶核酸的第二分子杂交的可环化探针的5’和3’杂交区域不连接。在一些实施方案中，该方法还包括检测生物样品中的环化的可环化探针或探针组。在一些实施方案中，在靶核酸的第一分子的位置处原位检测与环化的可环化探针或探针组相关的信号。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于分析生物样品的方法，该方法包括使生物样品与可环化探针或探针组接触。在一些实施方案中，可环化探针或探针组包含线性寡核苷酸序列，其在与感兴趣的RNA分子杂交时，形成可以被环化的探针。在一些实施方案中，一个或多个寡核苷酸可以包含在包含可环化探针的探针组中，并用作引物来引发可环化探针环化形成的环状模板的RCA。可环化探针或探针组可以使用靶RNA和/或DNA夹板作为模板，通过连接(或先引物延伸，然后再连接)来环化，例如，如第II.B.(iii)节中所述。可环化探针或探针组可以包含分别与靶RNA中相邻的第一靶区域和第二靶区域杂交的不对称的5’和3’杂交区域。在一些实施方案中，可环化探针或探针组包含多核苷酸(例如，如图图1A所示)，其具有用于与靶RNA中的第一靶区域和第二靶区域杂交的两个区域，一个区域在可环化探针的5’末端(例如，5’臂)(例如，5’杂交区域)，并且另一个区域在可环化探针的3’末端(例如，3’臂)(例如，3’杂交区域)。在一些实施方案中，可环化探针包含长度不对称并与靶RNA中的靶区域杂交的5’和3’杂交区域。5’杂交区域可以比3’杂交区域长，或反之亦然。第一靶区域可以比第二靶区域长，或反之亦然。内部探询序列可以在5’或3’臂上，并且不参与随后的挂锁连接步骤。
内部探询序列可以在5’杂交区域和3’杂交区域中较短的一者中。在一些实施方案中，内部探询序列可以在5’杂交区域和3’杂交区域中较长的一者中。在本文的任何实施方案中，本文的可环化探针的5’杂交区域可以比3’杂交区域更短或更长。在本文的任何实施方案中，5’杂交区域和3’杂交区域的长度可以独立地为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，5’杂交区域的长度在约5与约20个核苷酸之间，而3’杂交区域的长度在约10与约40个核苷酸之间。在一些实施方案中，5’杂交区域的长度在约10与约15个核苷酸之间，而3’杂交区域的长度在约15与约30个核苷酸之间。在一些实施方案中，5’杂交区域的长度在约8与约12个核苷酸之间，而3’杂交区域的长度在约16与约24个核苷酸之间。在一些实施方案中，5’杂交区域的长度为约10个核苷酸，而3’杂交区域的长度为约20个核苷酸。
在本文的任何实施方案中，5’杂交区域和3’杂交区域的长度可以相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在本文的任何实施方案中，5’杂交区域可以包含探询序列，并且可以比3’杂交区域短约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。在本文的任何实施方案中，5’杂交区域可以比3’杂交区域短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。
在本文的任何实施方案中，可环化探针的5’末端核苷酸可以是5’杂交区域的第一核苷酸，并且探询核苷酸可以是5’杂交区域的第二核苷酸、第三核苷酸、第四核苷酸、第五核苷酸、第六核苷酸、第七核苷酸、第八核苷酸、第九核苷酸或第十核苷酸。在一些实例中，探询核苷酸是从可环化探针的5’磷酸基团算起的第四核苷酸、第五核苷酸或第六核苷酸。在一些实例中，探询核苷酸是5’杂交区域的第五核苷酸。在本文的任何实施方案中，可环化探针的3’末端核苷酸可以是3’杂交区域的第一核苷酸，并且探询核苷酸可以是3’杂交区域的第二核苷酸、第三核苷酸、第四核苷酸、第五核苷酸、第六核苷酸、第七核苷酸、第八核苷酸、第九核苷酸或第十核苷酸。
在本文的任何实施方案中，5’杂交区域可以比3’杂交区域短约5至约10个核苷酸，并且探询核苷酸可以是5’杂交区域的第二核苷酸、第三核苷酸、第四核苷酸、第五核苷酸、第六核苷酸、第七核苷酸、第八核苷酸、第九核苷酸或第十核苷酸。
在本文的任何实施方案中，可环化探针或探针组可以包含一个、两个、三个、四个或更多个核糖核苷酸。在一些实施方案中，本文公开的可环化探针或探针组可以在DNA骨架中包含一个、两个、三个、四个或更多个核糖核苷酸。在本文的任何实施方案中，一个或多个核糖核苷酸可以位于和/或靠近可环化探针或探针组的可连接3’末端。图1B示出了使用不对称可环化探针来检测靶核酸中的感兴趣的区域(例如，SNP)的示例性方法。不对称可环化探针的一个臂包含内部探询核苷酸(例如，对SNP检测具有特异性的碱基)。可环化探针可以包含3’RNA碱基，这是任选的。靶核酸中的SNP位置中互补碱基的存在有利于可环化探针的稳定杂交和随后的挂锁环化。相比之下，当探询核苷酸和靶核酸中的SNP位置之间存在错配时，含探询核苷酸的臂的杂交不太稳定。含探询核苷酸的臂(例如，如该图所示的较短的臂)可以从靶核酸解离，并防止可环化探针被保真度较差的连接酶环化(例如，在RNA模板上)，从而减少由于不加区分的连接酶活性而产生的假阳性信号。
IV.连接、扩增和检测
在一些实施方案中，本公开的方法包括在存在感兴趣的靶核酸的情况下进行滚环扩增的步骤。
在一些实施方案中，该方法包括使用与感兴趣的多核苷酸杂交的环状或可环化的构建体(例如，在第III节中描述)来产生靶核酸(例如，包含感兴趣的多核苷酸的序列或与感兴趣的多核苷酸相关的一个或多个条形码序列)。在一些实施方案中，RCA包括线型RCA。在一些实施方案中，RCA包括分支RCA。在一些实施方案中，RCA包括树状RCA。在一些实施方案中，RCA包括前述的任何组合。可以使用用于探针杂交、连接、扩增和检测的任何合适的方法和条件，例如，如第II-IV节中所述。
在一些实施方案中，使用连接来形成环状构建体。在一些实施方案中，使用模板引物延伸、然后连接来形成环状构建体。在一些实施方案中，通过在待连接的末端之间提供插入物来形成环状构建体。在一些实施方案中，使用任何前述的组合来形成环状构建体。在一些实施方案中，连接为DNA-DNA模板化连接。在一些实施方案中，连接为RNA-RNA模板化连接。在一些实施方案中，连接为RNA-DNA模板化连接。在一些实施方案中，提供夹板作为连接的模板。
在一些实施方案中，环状构建体直接与靶核酸杂交。在一些实施方案中，环状构建体由可环化探针(例如，挂锁探针)形成。在一些实施方案中，环状构建体由能够进行DNA模板化连接的探针或探针组形成。参见例如美国专利8,551,710，其据此全文以引用方式并入。在一些实施方案中，环状构建体由能够进行RNA模板化连接的探针或探针组形成。示例性RNA模板化连接探针和方法描述于US2020/0224244中，该专利全文以引用方式并入本文。在一些实施方案中，环状构建体是通过分子内连接(例如，SNAIL)探针组对核酸进行特异性扩增而形成的。参见例如US2019/0055594或US2021/0164039，该专利据此全文以引用方式并入。在一些实施方案中，环状构建体由能够进行邻近连接的探针(例如RNA邻近连接测定(例如PLAYR)探针组)形成。参见例如US2016/0108458，该专利据此全文以引用方式并入。在一些实施方案中，环状构建体可以间接与靶核酸杂交。在一些实施方案中，环状构建体由能够进行邻近连接的探针组(例如邻近连接原位杂交(PLISH)探针组)形成。参见例如US2020/0224243，该专利据此全文以引用方式并入。可以使用本文所述的探针设计的任何合适的组合。
连接反应的性质取决于用于形成挂锁或环状探针的多核苷酸的结构组分。在一个实施方案中，多核苷酸包含互补停靠区，该互补停靠区将两个或更多个多核苷酸自组装成挂锁探针，该挂锁探针要么准备好进行连接(因为停靠区之间不存在缺口)，要么准备好进行填补过程，进而将允许多核苷酸的连接以形成可环化探针。在另一个实施方案中，停靠区与夹板引物互补。在一个实施方案中，夹板引物与两个多核苷酸的一对停靠区互补。在另一个实施方案中，夹板引物与两对停靠区互补。在该实施方案的一个方面，夹板引物具有与形成可环化探针的多核苷酸的停靠区互补的两个区域。通常，该实施方案的夹板探针将包含第一停靠区互补序列、间隔区和第二停靠区互补序列。
在一些实施方案中，可以使用靶核酸(例如，RNA)作为模板来连接可环化探针或探针组的3’末端和5’末端。在一些实施方案中，在连接之前不填充缺口的情况下连接3’末端和5’末端。在一些实施方案中，在3'末端和5'末端的连接之前，先填充缺口。该缺口可以是1、2、3、4、5个或更多个核苷酸。
在一些实施方案中，环化步骤可以包括选自由酶促连接、化学连接、模板依赖性连接和/或模板非依赖性连接组成的组的连接。在本文的任何实施方案中，连接可以包括使用具有RNA模板化DNA连接酶活性和/或RNA模板化RNA连接酶活性的连接酶。在本文的任何实施方案中，连接可以包括使用选自由小球藻病毒DNA连接酶(PBCV DNA连接酶)、T4 RNA连接酶、T4 DNA连接酶和单链DNA(ssDNA)连接酶组成的组的连接酶。在本文的任何实施方案中，连接可以包括使用PBCV-1DNA连接酶或其变体或衍生物和/或T4 RNA连接酶2(T4 Rnl2)或其变体或衍生物。
在一些实施方案中，该方法还可以包括在环化步骤之前，从生物样品中去除不与靶核酸结合的可环化探针或探针组的分子的步骤。在本文的任何实施方案中，该方法还可以包括在环化步骤之前，从生物样品中去除与靶核酸结合但在探询序列中包含一个或多个错配的可环化探针或探针组的分子的步骤。在本文的任何实施方案中，该方法还可以包括在环化步骤之前，允许与靶核酸结合但在探询序列中包含一个或多个错配的可环化探针分子从靶核酸解离，同时在探询序列中不包含错配的可环化探针分子保持与靶核酸结合的步骤。在一些实施方案中，该方法还可以包括在环化步骤之前，允许与靶核酸结合但在包含探询区域的杂交区域中包含一个或多个错配的可环化探针分子从靶核酸解离，同时在探询序列中不包含错配的可环化探针分子保持与靶核酸结合的步骤。在本文的任何实施方案中，在相同的条件下，在探询序列中包含一个或多个错配的分子与靶核酸结合的稳定性不如不包含错配的分子。在本文的任何实施方案中，该方法可以包括一次或多次严格洗涤。例如，一次或多次严格洗涤可以用于去除未与靶核酸结合的可环化探针分子，和/或与靶核酸结合但在探询序列中包含一个或多个错配的可环化探针分子。
在形成例如环化的挂锁探针或以其他方式提供环状探针之后，在一些情况下，添加扩增引物。在其他情况下，扩增引物与可环化探针一起添加。在一些情况下，扩增引物也可以与靶核酸和可环化探针(例如，SNAIL探针)互补。在一些实施方案中，进行洗涤步骤以去除任何未结合的探针、引物等。在一些实施方案中，洗涤为严格洗涤。可以在该过程中的任何时间点进行洗涤步骤以去除非特异性结合的探针、已经连接的探针等。
在存在合适的dNTP前体和其他辅因子的情况下添加DNA聚合酶后，通过复制模板的多个拷贝来延伸扩增引物(例如，产生模板的多联体)。可以使用例如本文所述的二级和更高级探针及检测寡核苷酸来检测该扩增产物。在本文的任何实施方案中，可以例如通过使用可检测地标记的探针和成像来确定或以其他方式分析扩增产物中的序列。扩增产物的测序或分析可以包括边杂交边测序、边连接边测序和/或荧光原位测序，和/或其中原位杂交包括序贯荧光原位杂交。在一些情况下，使用例如本文所述的二级和更高级探针及检测寡核苷酸来进行测序。
在本文的任何实施方案中，该方法还可以包括在生物样品中原位产生环化探针的产物。在本文的任何实施方案中，可以使用滚环扩增(RCA)产生产物。在本文的任何实施方案中，RCA可以包括线型RCA、分支RCA、树状RCA或它们的任何组合。在本文的任何实施方案中，可以使用选自由以下项组成的组的聚合酶产生产物：Phi29 DNA聚合酶、Phi29样DNA聚合酶、M2 DNA聚合酶、B103 DNA聚合酶、GA-1DNA聚合酶、phi-PRD1聚合酶、Vent DNA聚合酶、Deep Vent DNA聚合酶、Vent(exo-)DNA聚合酶、KlenTaq DNA聚合酶、DNA聚合酶I、DNA聚合酶I的Klenow片段、DNA聚合酶III、T3 DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、T5 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Bst聚合酶、rBST DNA聚合酶、N29 DNA聚合酶、TopoTaq DNA聚合酶、T7 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶及其变体或衍生物。
在本文的任何实施方案中，产物可以固定在生物样品中。在本文的任何实施方案中，产物可以与生物样品中的一个或多个其他分子交联。可以使用任何合适的栓系和固定方法，例如第II节中描述的任何方法。
在本文的任何实施方案中，该方法还可以包括对生物样品成像以检测环化探针或其产物。在本文的任何实施方案中，成像可以包括检测与荧光标记的探针相关的信号，该荧光标记的探针直接或间接与环化探针的滚环扩增产物结合。在本文的任何实施方案中，可以在生物样品中原位分析滚环扩增产物的序列。在本文的任何实施方案中，可以通过序贯杂交、边杂交边测序、边连接边测序、边合成边测序、边结合边测序或它们的组合来分析滚环扩增产物的序列。
在本文的任何实施方案中，滚环扩增产物的序列可以包含一个或多个条形码序列或其互补序列。在本文的任何实施方案中，一个或多个条形码序列可以包括与靶核酸相对应的条形码序列。在本文的任何实施方案中，一个或多个条形码序列可以包括与感兴趣的序列相对应的条形码序列，诸如感兴趣的单核苷酸的变体。
在本文的任何实施方案中，检测步骤可以包括使生物样品和直接或间接与滚环扩增产物杂交的一个或多个可检测地标记的探针接触，并且使一个或多个可检测地标记的探针与滚环扩增产物去杂交。在本文的任何实施方案中，可以用直接或间接与滚环扩增产物杂交的一个或多个可检测地标记的探针和/或一个或多个其他可检测地标记的探针重复接触和去杂交步骤。
在本文的任何实施方案中，检测步骤可以包括使生物样品和直接或间接与滚环扩增产物杂交的一个或多个中间探针接触，其中一个或多个中间探针可使用一个或多个可检测地标记的探针检测。在本文的任何实施方案中，检测步骤还可以包括使一个或多个中间探针和/或一个或多个可检测地标记的探针与滚环扩增产物去杂交。在本文的任何实施方案中，可以用一个或多个中间探针、一个或多个可检测地标记的探针、一个或多个其他中间探针和/或一个或多个其他可检测地标记的探针重复接触和去杂交步骤。
在一些实施方案中，检测可以是空间的，例如在二维或三维中。在一些实施方案中，检测可以是定量的，例如，可以确定一级核酸探针(和靶核酸)的量或浓度。在一些实施方案中，一级探针、二级探针、高级探针和/或可检测地标记的探针可以包含能够与核酸杂交的多种实体中的任何一种，例如DNA、RNA、LNA和/或PNA等，具体取决于应用。
在一些实施方案中，本文公开了一种多重测定，其中用多个一级探针(例如，挂锁一级探针)探测多个靶(例如，核酸，诸如基因或RNA转录物，或蛋白质靶)，并且任选地，与一级条形码(或其互补序列)杂交的多个二级探针一次全部杂交，随后是序贯的二级条形码检测和信号解码。在一些实施方案中，条形码或条形码子序列的检测可以以循环方式发生。
在一些实施方案中，用于分析靶核酸中感兴趣的区域的方法是多重测定，其中多个探针(例如，挂锁探针)用于同时检测多个感兴趣区域(例如，靶核酸的相同位置处的变异和/或不同位置中的SNP)。在一些实施方案中，对一个或多个感兴趣的区域的一个或多个检测可以同时发生。在一些实施方案中，对一个或多个感兴趣的区域的一个或多个检测可以顺序发生。在一些实施方案中，相同可环化探针设计的多个可环化探针用于使用与每个感兴趣的区域相关的不同条形码来检测一个或多个感兴趣的区域。在一些实施方案中，不同可环化探针设计的多个可环化探针用于使用不同条形码(例如，与靶核酸或其序列相关的每个条形码)来检测一个或多个感兴趣的区域。在一些实施方案中，一个或多个感兴趣的区域位于相同的分子(例如，RNA或DNA)上。在替代实施方案中，一个或多个感兴趣的单核苷酸位于不同的分子上。
在一些实施方案中，本文公开了一种用于分析生物样品的方法，该方法包括使生物样品与可环化探针或探针组接触，其中可环化探针包含分别与生物样品中的靶RNA中相邻的第一靶区域和第二靶区域杂交的5’杂交区域和3’杂交区域，其中5’杂交区域和3’杂交区域的长度不同。在一些实施方案中，5’杂交区域和3’杂交区域中较短的一者包含分别与第一靶区域或第二靶区域中感兴趣的单核苷酸互补的探询核苷酸。例如，5’杂交区域可以是较短的区域，并且可以包含探询核苷酸。在其他实例中，3’杂交区域可以是较短的区域，并且可以包含探询核苷酸。在本文的任何实施方案中，探询核苷酸可以不是5’或3’末端核苷酸。
在本文的任何实施方案中，探询核苷酸可以是5’杂交区域或3’杂交区域中的内部核苷酸。在本文的任何实施方案中，探询核苷酸可以不包含可连接末端。在本文的任何实施方案中，探询核苷酸可以不是这样的核苷酸，该核苷酸在加工或不加工可环化探针或探针组的情况下参与随后的连接反应，例如，由具有RNA夹板化连接酶活性的连接酶催化的连接。在一些实施方案中，在加工与靶核酸杂交的可环化探针或探针组后，探询核苷酸可以被暴露并参与随后由具有RNA夹板化连接酶活性的连接酶催化的连接反应。在一些实施方案中，在加工可环化探针或探针组后，探询核苷酸的可连接5’磷酸基团或3’羟基可以被暴露。在本文的任何实施方案中，探询核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或其变体或衍生物。
在一些实施方案中，本文公开的探针(例如，可环化探针)可以包含侧翼。在一些实施方案中，本文公开的可环化探针(例如，挂锁探针)可以包含5’侧翼，其可以被结构特异性切割酶识别，例如能够识别单链5’突出端和DNA双链体之间的接合点并切割单链突出端的酶。应当理解，作为结构特异性切割酶的底物的分支三链结构可以由一个探针部分的5’末端和另一个探针部分的3’末端形成(当两者都与靶核酸分子杂交时)，也可以由单组分探针的5’和3’末端形成。适合于此类切割的酶包括侧翼核酸内切酶(FENS)，其是一类具有核酸内切活性并且能够催化单链与双链DNA的衔接点处磷酸二酯键的水解切割的酶。因此，在一些实施方案中，通过结构特异性切割酶(例如，侧翼核酸内切酶)进行在第一靶特异性结合位点的5’处的附加序列的切割。合适的侧翼核酸内切酶见述于Ma等人,2000.JBC 275,24693-24700中和US2020/0224244中，并且可以包括P.furiosus(Pfu)、A.fulgidus(Afu)、M.jannaschii(Mja)或M.thermoautotrophicum(Mth)。在其他实施方案中，能够识别和降解具有游离5’末端的单链寡核苷酸的酶可以用于从如上所述的结构切割附加序列(5’侧翼)。因此，具有5’核酸酶活性的酶可以用于切割5’附加序列。这样的5’核酸酶活性可以是5’核酸外切酶活性和/或5’核酸内切酶活性。5’核酸酶能够识别单链寡核苷酸的游离5’末端并降解所述单链寡核苷酸。5’核酸外切酶通过将寡核苷酸从其5’末端降解成组成单核苷酸来降解具有游离5’末端的单链寡核苷酸。5’核酸内切酶活性可以在一个或多个核苷酸处内部切割5’侧翼序列。一旦该酶识别出游离5’末端，该酶就会穿过单链寡核苷酸到达双链体区域，并将单链区域切割成较大的组成核苷酸(例如，二核苷酸或三核苷酸)，或切割整个5’单链区域，从而发生5’核酸酶活性，例如如Lyamichev等人,1999.PNAS 96,6143-6148中针对Taq DNA聚合酶和其5'核酸酶所描述的，该文献的内容全文以引用方式并入本文。具有5’核酸酶活性的优选酶包括核酸外切酶VIII，或来自水生栖热菌(Thermus aquaticus)(Taq)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)或黄栖热菌(Thermus flavus)的天然或重组DNA聚合酶，或来自其的核酸酶结构域。
在本文的任何实施方案中，该方法还可以包括连接与靶RNA杂交的可环化探针的末端，以形成环化的可环化探针。在本文的任何实施方案中，该方法还可以包括产生环化的可环化探针的滚环扩增产物。在本文的任何实施方案中，该方法还可以包括检测与生物样品中的滚环扩增产物相关的信号。
在一些实施方案中，本文公开了一种用于分析生物样品的方法，该方法包括使生物样品与可环化探针或探针组接触，其中：可环化探针或探针组包含分别与生物样品中的靶RNA中相邻的第一靶区域和第二靶区域杂交的5’杂交区域和3’杂交区域；5’杂交区域比3’杂交区域短，并且包含与靶RNA的第一分子的第一靶区域中感兴趣的单核苷酸互补的探询核苷酸，其中靶RNA的第二分子包含与探询核苷酸的错配；并且探询核苷酸是从可环化探针的5’末端算起的第二至第十核苷酸中的任何一个核苷酸。在一些实施方案中，该方法还包括允许可环化探针或其一部分(例如，5’杂交区域)从靶RNA的第二分子解离，其中在相同条件下，可环化探针(例如，包括5’杂交区域)保持与靶RNA的第一分子杂交。在一些实施方案中，该方法还包括连接与靶RNA的第一分子杂交的可环化探针的末端，以形成环化的可环化探针；产生环化的可环化探针的滚环扩增产物；以及检测与生物样品中的滚环扩增产物相关的信号。在任何前述实施方案中，与靶RNA的第二分子杂交的可环化探针可以被去稳定化和/或从生物样品中去除，同时可环化探针保持与靶RNA的第一分子杂交，使得不形成与靶RNA的第二分子杂交的环化的可环化探针。在任何前述实施方案中，可能检测不到与靶RNA的第二分子相关的信号，使得与滚环扩增产物相关的信号指示生物样品中靶RNA的第一分子而非第二分子。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于分析生物样品的方法，该方法包括使生物样品与第一可环化探针或探针组和第二可环化探针或探针组接触。在一些实施方案中，第一可环化探针或探针组包含分别与靶核酸(诸如靶RNA)中相邻的第一靶区域和第二靶区域杂交的5’杂交区域和3’杂交区域，并且5’杂交区域和3’杂交区域的长度不同。在本文的任何实施方案中，5’杂交区域和3’杂交区域中较短的一者可以包含分别与第一靶区域或第二靶区域中感兴趣的单核苷酸的第一变体互补的第一探询核苷酸。在本文的任何实施方案中，第一探询核苷酸可以是从第一可环化探针或探针组的5’末端算起的第二至第十核苷酸中的任何一个核苷酸。在本文的任何实施方案中，第二可环化探针或探针组可以包含5’杂交区域和3’杂交区域，不同的是第二可环化探针或探针组可以包含与感兴趣的单核苷酸的第二变体互补的第二探询核苷酸。在本文的任何实施方案中，该方法还可以包括使与靶RNA杂交的第一可环化探针的末端和/或第二可环化探针的末端环化；产生环化的第一可环化探针或探针组的第一滚环扩增产物和/或环化的第二可环化探针或探针组的第二滚环扩增产物；以及检测与第一滚环扩增产物和/或第二滚环扩增产物相关的信号，从而检测生物样品中感兴趣的单核苷酸的第一变体和/或第二变体。在本文的任何实施方案中，第一可环化探针或探针组可以包含与第一变体相对应的第一条形码序列，并且第二可环化探针或探针组可以包含与第二变体相对应的第二条形码序列。在本文的任何实施方案中，在检测步骤中在生物样品中的给定位置处检测到的信号可以与第一条形码序列(或其互补序列)或第二条形码序列(或其互补序列)相关。因此，给定位置处的信号可以与感兴趣的单核苷酸的第一变体或第二变体相关。在本文的任何实施方案中，该方法还可以包括对生物样品成像，以在多个位置处原位检测感兴趣的单核苷酸的第一变体或第二变体，例如，通过检测第一条形码序列(或其互补序列)或第二条形码序列(或其互补序列)。
图2描绘了样品中两种SNP(SNP1(序列变异G/C)和SNP2(序列变异G/A))的多重原位检测的实例。SNP1和SNP2是不同的SNP，并且可以在不同的基因座中，例如在不同的染色体上。可以检测样品中的DNA和/或RNA分子。加条形码的可环化探针或探针组(例如，挂锁探针)可以同时或顺序与样品杂交。在相同SNP位置处的序列变异可以被有差异地加条形码和检测，例如，SNP1(G)和SNP1(C)各自与不同的条形码相关。不同SNP中的感兴趣的单核苷酸也可以被有差异地加条形码和检测，例如，SNP1(G)和SNP2(G)各自与不同的条形码相关。
在一些方面，所提供的方法涉及分析(例如，检测或确定)多核苷酸中和/或其产物或衍生物中(诸如在扩增的可环化探针或探针组中)存在的一个或多个序列。在一些实施方案中，可以通过提供检测探针(诸如用于进行形成扩增产物的链式反应(例如，HCR)的探针)来检测可环化探针或探针组或其产物。在一些实施方案中，扩增是非酶促的。在一些实施方案中，分析包括确定扩增产物的全部或一部分的序列。在一些实施方案中，分析包括检测扩增产物中存在的序列。在一些实施方案中，扩增产物的全部或一部分的序列指示靶核酸中感兴趣的区域的身份。在其他实施方案中，所提供的方法涉及分析(例如，检测或确定)多核苷酸探针中存在的一个或多个序列(例如，可环化探针或探针组或其产物中存在的条形码序列)。
在一些实施方案中，该方法包括对扩增产物的全部或一部分(诸如扩增产物中存在的一个或多个条形码序列)进行测序。在一些实施方案中，分析和/或序列确定包括对扩增产物或探针的全部或一部分进行测序和/或对扩增产物或探针进行原位杂交。在一些实施方案中，测序步骤涉及边杂交边测序、边连接边测序和/或荧光原位测序、基于杂交的原位测序和/或其中原位杂交包括序贯荧光原位杂交。在一些实施方案中，分析和/或序列确定包括检测通过杂交链反应(HCR)反应产生的聚合物，对于示例性的探针和HCR反应组分，参见例如US2017/0009278，其以引用方式并入本文。在一些实施方案中，检测或确定包括使用荧光团、同位素、质量标签或其组合标记的检测寡核苷酸与扩增产物杂交。在一些实施方案中，检测或确定包括对扩增产物成像。在一些实施方案中，靶核酸为组织样品中的mRNA，并且在靶核酸和/或扩增产物位于组织样品中原位时进行检测或确定。
在一些方面，所提供的方法包括对扩增产物(例如，扩增子)和/或多核苷酸的一个或多个部分成像，例如，通过检测探针的结合并检测可检测标记。在一些实施方案中，检测探针包含可被测量和定量的可检测标记。术语“标记”和“可检测标记”包括与待检测的分子缔合(例如，缀合)的直接或间接可检测的部分，例如可检测的探针，包括但不限于荧光团、放射性同位素、荧光剂、化学发光剂、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、发色团、染料、金属离子、金属溶胶、配体(例如，生物素或半抗原)等。
术语“荧光团”包括能够在可检测范围内表现出荧光的物质或其一部分。可以根据所提供的实施方案使用的标记的特定实例包括但不限于藻红蛋白、Alexa染料、荧光素、YPet、CyPet、Cascade blue、别藻蓝蛋白、Cy3、Cy5、Cy7、罗丹明、丹酰、伞形酮、Texas red、鲁米诺、吖啶酯、生物素、绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、红色荧光蛋白(RFP)、萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶、NADPH、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶、氯霉素乙酰转移酶和脲酶。
组织样品中的荧光检测通常会因强背景荧光的存在而受到阻碍。“自发荧光”是用于区分背景荧光(其可以由多种来源产生，包括醛固定、细胞外基质组分、红细胞、脂褐素等)与来自荧光标记抗体或探针的所需免疫荧光的通用术语。组织自发荧光可能导致难以将归因于荧光抗体或探针的信号与一般背景区分开来。在一些实施方案中，本文公开的方法利用一种或多种试剂来减少组织自发荧光，例如自发荧光消除剂(AutofluorescenceEliminator)(Sigma/EMD Millipore)、TrueBlack脂褐素自发荧光淬灭剂(TrueBlackLipofuscin Autofluorescence Quencher)(Biotium)、MaxBlock自发荧光减少试剂盒(MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit)(MaxVision Biosciences)和/或非常强的黑色染料(例如，苏丹黑(Sudan Black)或类似的深色发色团)。
在一些实施方案中，含有可检测标记的可检测探针可以用于检测本文所述的一个或多个探针和/或扩增产物(例如，扩增子)。在一些实施方案中，该方法涉及将含有可检测标记的可检测探针与样品一起温育，洗涤未结合的可检测探针，并检测标记(例如，通过成像)。在一些实施方案中，可检测探针可以直接或间接与探针和/或扩增产物结合。
可检测标记的实例包括但不限于各种放射性部分、酶、辅基、荧光标记、发光标记、生物发光标记、金属颗粒、蛋白质-蛋白质结合对和蛋白质-抗体结合对。荧光蛋白的实例包括但不限于黄色荧光蛋白(YFP)、绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白(CFP)、伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三吖嗪胺荧光素、丹酰氯和藻红蛋白。
生物发光标记的实例包括但不限于荧光素酶(例如，细菌、萤火虫和叩甲)、荧光素、水母素等。具有视觉可检测信号的酶系统的实例包括但不限于半乳糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、磷酸酶、过氧化物酶和胆碱酯酶。可鉴定标记还包括放射性化合物如125I、35S、14C或3H。可鉴定标记可从多种来源商购获得。
荧光标记和与这样的荧光标记缀合的核苷酸和/或多核苷酸的实例包括例如以下中描述的那些：Hoagland,Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals,第九版(Molecular Probes,Inc.,Eugene,2002)；Keller和Manak,DNA Probes,第2版(Stockton Press,New York,1993)；Eckstein,editor,Oligonucleotides andAnalogues:A Practical Approach(IRL Press,Oxford,1991)；以及Wetmur,CriticalReviews in Biochemistry and Molecular Biology,26:227-259(1991)。在一些实施方案中，适用于所提供的实施方案的示例性技术和方法包括例如US 4,757,141、US 5,151,507和US 5,091,519中描述的那些。在一些实施方案中，使用一种或多种荧光染料作为标记的靶序列的标记，例如，如以下中所述：US 5,188,934(4,7-二氯荧光素染料)；US 5,366,860(可光谱解析的罗丹明染料)；US 5,847,162(4,7-二氯罗丹明染料)；US 4,318,846(醚取代的荧光素染料)；US 5,800,996(能量转移染料)；US 5,066,580(黄嘌呤染料)；和US 5,688,648(能量转移染料)，所有这些专利均全文以引用方式并入本文。也可以用量子点进行标记，如US 6,322,901、US 6,576,291、US 6,423,551、US 6,251,303、US 6,319,426、US 6,426,513、US 6,444,143、US 5,990,479、US 6,207,392、US2002/0045045和US2003/0017264中所描述，所有这些专利均全文以引用方式并入本文。在一些实施方案中，荧光标记包括信号传导部分，该信号传导部分通过一个或多个分子的荧光吸收和/或发射特性来传达信息。示例性荧光特性包括荧光强度、荧光寿命、发射光谱特性和能量转移。
容易掺入到核苷酸和/或多核苷酸序列中的可商购获得的荧光核苷酸类似物的实例包括但不限于Cy3-dCTP、Cy3-dUTP、Cy5-dCTP、Cy5-dUTP(Amersham Biosciences,Piscataway,N.J.)、荧光素-！2-dUTP、四甲基罗丹明-6-dUTP、TEXAS REDTM-5-dUTP、CASCADEBLUETM-7-dUTP、BODIPY TMFL-14-dUTP、BODIPY TMR-14-dUTP、BODIPY TMTR-14-dUTP、RHODAMINE GREENTM-5-dUTP、OREGON GREENRTM488-5-dUTP、TEXAS REDTM-l2-dUTP、BODIPYTM630/650-14-dUTP、BODIPYTM650/665-14-dUTP、ALEXA FLUORTM488-5-dUTP、ALEXA FLUORTM532-5-dUTP、ALEXA FLUORTM568-5-dUTP、ALEXA FLUORTM594-5-dUTP、ALEXA FLUORTM546-14-dUTP、荧光素-12-UTP、四甲基罗丹明-6-UTP、TEXAS REDTM-5-UTP、mCherry、CASCADE BLUETM-7-UTP、BODIPYTMFL-14-UTP、BODIPY TMR-14-UTP、BODIPYTMTR-14-UTP、RHOD AMINE GREENTM-5-UTP、ALEXA FLUORTM488-5-UTP和ALEXA FLUORTM546-14-UTP(Molecular Probes,Inc.Eugene,Oreg.)。用于定制合成具有其他荧光团的核苷酸的方法可以包括Henegariu等人,(2000)Nature Biotechnol.18:345中描述的那些，其以引用方式并入本文。
可得到的用于合成后附着的其他荧光团包括但不限于ALEXA FLUORTM350、ALEXAFLUORTM532、ALEXA FLUORTM546、ALEXA FLUORTM568、ALEXA FLUORTM594、ALEXA FLUORTM647、BODIPY 493/503、BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY 530/550、BODIPY TMR、BODIPY 558/568、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、Cascade Blue、Cascade Yellow、丹酰、丽丝胺罗丹明B、Marina Blue、Oregon Green 488、Oregon Green 514、太平洋蓝、罗丹明6G、罗丹明绿、罗丹明红、四甲基罗丹明、Texas Red(可得自Molecular Probes,Inc.,Eugene,Oreg.)、Cy2、Cy3.5、Cy5.5和Cy7(Amersham Biosciences,Piscataway,N.J.)。还可以使用FRET串联荧光团，包括但不限于PerCP-Cy5.5、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、APC-Cy7、PE-Alexa染料(610、647、680)和APC-Alexa染料。
在一些情况下，可以使用金属银或金颗粒来增强来自荧光标记的核苷酸和/或多核苷酸序列的信号(Lakowicz等人,(2003)Bio Techniques 34:62)。
生物素或其衍生物也可以用作核苷酸和/或多核苷酸序列上的标记，并随后由可检测地标记的抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白衍生物(例如，藻红蛋白缀合的链霉抗生物素蛋白)或可检测地标记的抗生物素抗体结合。地高辛可以作为标记掺入并随后由可检测地标记的抗地高辛抗体(例如，荧光素化抗地高辛)结合。氨基烯丙基-dUTP残基可以掺入到多核苷酸序列中并随后与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)衍生的荧光染料偶联。一般来说，只要可检测地标记的缀合配偶体可以被结合以允许检测，缀合物对的任何成员就可以掺入到检测多核苷酸中。在一些实施方案中，抗体包含任何类别的抗体分子或其任何亚片段，诸如Fab。
多核苷酸序列的其他合适的标记可以包括荧光素(FAM)、地高辛、二硝基苯酚(DNP)、丹酰、生物素、溴脱氧尿苷(BrdU)、六聚组氨酸(6xHis)和磷光体-氨基酸(例如，P-tyr、P-ser、P-thr)。在一些实施方案中，以下半抗原/抗体对用于检测，其中每种抗体用可检测标记来衍生化：生物素/α-生物素、地高辛/α-地高辛、二硝基苯酚(DNP)/α-DNP、5-羧基荧光素(FAM)/α-FAM。
在一些实施方案中，核苷酸和/或多核苷酸序列可以被间接标记，特别是用半抗原标记，然后该半抗原被捕获剂结合，例如如US 5,344,757、US 5,702,888、US 5,354,657、US5,198,537和US 4,849,336以及US 5,073,562中所公开，这些专利的内容全文以引用方式并入本文。许多不同的半抗原-捕获剂对可供使用。示例性的半抗原包括但不限于生物素、脱生物素(des-biotin)和其他衍生物、二硝基苯酚、丹酰、荧光素、Cy5和地高辛。对于生物素，捕获剂可以是抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或抗体。抗体可以用作其他半抗原的捕获剂(许多染料-抗体对是可商购获得的，例如Molecular Probes,Eugene,Oreg.)。
在一些方面，检测涉及使用检测方法，诸如流式细胞术；测序；探针结合和电化学检测；pH改变；由与DNA标签结合的酶诱导的催化；量子纠缠；拉曼光谱；太赫兹波技术；和/或扫描电子显微术。在一些方面，流式细胞术是质谱流式细胞术或荧光激活流式细胞术。在一些方面，检测包括进行显微术、扫描质谱法或本文描述的其他成像技术。在这样的方面，检测包括测定信号，例如荧光信号。
在一些方面，使用许多不同类型的显微术中的任何一种来进行检测(包括成像)，例如共聚焦显微术、双光子显微术、光场显微术、完整组织扩张显微术和/或CLARITYTM-优化的光片显微术(COLM)。
在一些实施方案中，使用荧光显微术来进行检测探针的检测和成像。在一些方面，荧光显微镜为光学显微镜，其使用荧光和磷光代替或补充反射和吸收来研究有机或无机物质的性质。在荧光显微术中，用在样品中激发荧光的波长的光照射样品。然后通过显微镜物镜对荧光成像，荧光波长通常比照射波长长。该技术中可以使用两个滤光片；照射(或激发)滤光片，其确保照射接近单色且在正确的波长下，和第二发射(或屏障)滤光片，其确保没有激发光源到达检测器。或者，这些功能都可以由单个二向色滤光片实现。“荧光显微镜”包括使用荧光来生成图像的任何显微镜，无论其是像落射荧光显微镜这样的更简单的装置，还是像共聚焦显微镜这样的更复杂的设计，其都使用光学切片来获得荧光图像的更好分辨率。
在一些实施方案中，使用共聚焦显微术来进行检测探针的检测和成像。共聚焦显微镜使用点照射和检测器前方光学共轭平面中的针孔来消除离焦信号。由于只能检测到非常靠近焦平面的荧光产生的光，故图像的光学分辨率，特别是在样品深度方向上，比宽视场显微镜要好得多。然而，由于来自样品荧光的许多光在针孔处被阻挡，故分辨率的这种提高是以信号强度的降低为代价的——因此通常需要长的曝光时间。由于一次仅照射样品中的一个点，故2D或3D成像需要在试样中以规则光栅(例如，平行扫描线的矩形图案)扫描。焦平面的可实现厚度主要由所用光的波长除以物镜的数值孔径限定，但也由试样的光学性质限定。薄光学切片使得这些类型的显微镜在样品的3D成像和表面轮廓分析方面特别好。CLARITYTM-优化的光片显微术(COLM)提供了用于大型澄清样品的快速3D成像的替代显微术。COLM询问大型免疫染色组织，允许提高采集速度并产生更高质量的生成数据。
可以采用的其他类型的显微术包括明场显微术、斜照显微术、暗场显微术、相差显微术、微分干涉差(DIC)显微术、干涉反射显微术(也称为反射干涉差或RIC)、单平面照明显微术(SPIM)、超高分辨率显微术、激光显微术、电子显微术(EM)、透射电子显微术(TEM)、扫描电子显微术(SEM)、反射电子显微术(REM)、扫描透射电子显微术(STEM)和低电压电子显微术(LVEM)、扫描探针显微术(SPM)、原子力显微术(ATM)、弹道电子发射显微术(BEEM)、化学力显微术(CFM)、导电原子力显微术(C-AFM)、电化学扫描隧道显微镜(ECSTM)、静电力显微术(EFM)、流体力显微镜(FluidFM)、力调制显微术(FMM)、特征导向扫描探针显微术(FOSPM)、开尔文探针力显微术(KPFM)、磁力显微术(MFM)、磁共振力显微术(MRFM)、近场扫描光学显微术(NSOM)(或SNOM、扫描近场光学显微术、SNOM、压电响应力显微术(PFM)、PSTM、光子扫描隧道显微术(PSTM)、PTMS、光热显微光谱/显微术(PTMS)、SCM、扫描电容显微术(SCM)、SECM、扫描电化学显微术(SECM)、SGM、扫描门显微术(SGM)、SHPM、扫描霍尔探针显微术(SHPM)、SICM、扫描离子电导显微术(SICM)、SPSM自旋偏振扫描隧道显微术(SPSM)、SSRM、扫描扩散电阻显微术(SSRM)、SThM、扫描热显微术(SThM)、STM、扫描隧道显微术(STM)、STP、扫描隧道电位法(STP)、SVM、扫描电压显微术(SVM)、同步加速器x-射线扫描隧道显微术(SXSTM)和完整组织扩张显微术(exM)。
在一些实施方案中，测序可以原位进行。原位测序通常涉及以顺序的、模板依赖性方式掺入标记的核苷酸(例如，荧光标记的单核苷酸或二核苷酸)或使标记的引物(例如，标记的无规六聚体)与核酸模板杂交使得可以确定掺入的核苷酸或标记的引物延伸产物的身份(例如，核苷酸序列)，并因此确定相应的模板核酸的核苷酸序列。原位测序的方面见述于例如Mitra等人,(2003)Anal.Biochem.320,55-65以及Lee等人,(2014)Science,343(6177),1360-1363。此外，用于进行原位测序的方法和系统的实例描述于US 2016/0024555、US 2019/0194709中以及US 10,138,509、US 10,494,662和US.10,179,932中。用于原位测序的示例性技术包括但不限于STARmap(描述于例如Wang等人,(2018)Science,361(6499)5691中)、MERFISH(描述于例如Moffitt,(2016)Methods in Enzymology,572,1-49中)、基于杂交的原位测序(HybISS)(描述于例如Gyllborg等人,Nucleic Acids Res(2020)48(19):e112中)以及FISSEQ(描述于例如US 2019/0032121中)。
在一些实施方案中，测序可以通过边合成边测序(SBS)来进行。在一些实施方案中，测序引物与一个或更多个条形码处或附近的序列互补。在这样的实施方案中，边合成边测序可以包括逆转录和/或扩增以生成引物序列可从其结合的模板序列。示例性SBS方法包括例如但不限于以下专利中描述的那些：US 2007/0166705、US 2006/0188901、US 7,057,026、US 2006/0240439、US 2006/0281109、US 2011/005986、US 2005/0100900、US 9,217,178、US 2009/0118128、US 2012/0270305、US 2013/0260372和US 2013/0079232。
在一些实施方案中，可以使用单分子边连接边测序来进行测序。这样的技术利用DNA连接酶来并入寡核苷酸并鉴别这样的寡核苷酸的并入。寡核苷酸通常具有与寡核苷酸与之杂交的序列中的特定核苷酸的身份相关的不同标记。边连接边测序中涉及的方面和特征见述于例如Shendure等人,Science(2005),309:1728-1732中，以及US 5,599,675；US 5,750,341；US 6,969,488；US 6,172,218；和US 6,306,597。
在一些实施方案中，可以使用核酸杂交来进行测序。这些方法利用与条形码序列的至少一部分互补的标记的核酸解码器探针。可以用具有可区分标签的许多不同探针的池来进行多重解码。核酸杂交测序的非限制性实例见述于例如US 8,460,865中和Gunderson等人,Genome Research 14:870-877(2004)中。
在一些实施方案中，可以在测序期间使用DNA聚合酶活性的实时监测。例如，可以通过荧光共振能量转移(FRET)来检测核苷酸并入，如例如Levene等人,Science(2003),299,682-686、Lundquist等人,Opt.Lett.(2008),33,1026-1028和Korlach等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2008),105,1176-1181中所述。
在一些方面，分析和/或序列确定可以在室温下进行，以在低背景噪声和减少错误的情况下最好地保存组织形态。在一些实施方案中，分析和/或序列确定包括随着测序的进行消除错误累积。
在一些实施方案中，分析和/或序列确定涉及洗涤以去除未结合的多核苷酸，此后显现荧光产物以便成像。
在一些实施方案中，探针(例如，本文公开的可环化探针或探针组)或其互补序列或产物的条形码被可检测地标记的检测寡核苷酸(诸如荧光标记的寡核苷酸)靶向。在一些实施方案中，使用一种或多种解码方案来解码信号(诸如荧光)以进行序列确定。在本文的任何实施方案中，可以使用结合RNA序贯靶探测(RNA SPOT)、序贯荧光原位杂交(seqFISH)、单分子荧光原位杂交(smFISH)、多重抗误差荧光原位杂交(MERFISH)、基于杂交的原位测序(HybISS)、原位测序、靶向原位测序、荧光原位测序(FISSEQ)(描述于例如US2019/0032121中)或空间分辨转录物扩增子读数作图(STARmap)描述的任何合适的方法或技术来分析(例如，检测或测序)条形码(例如，一级和/或二级条形码序列)。在一些实施方案中，本文提供的方法包括通过用多个标记探针(例如，检测寡核苷酸)进行序贯杂交和检测来分析条形码。可以使用如以下文献所述的示例性解码方案来分析(例如，检测或测序)条形码：Eng等人,“Transcriptome-scale Super-Resolved Imaging in Tissues by RNA SeqFISH+,”Nature 568(7751):235-239(2019)；Chen等人,“Spatially resolved,highlymultiplexed RNA profiling in single cells,”Science；348(6233):aaa6090(2015)；Gyllborg等人,Nucleic Acids Res(2020)48(19):e112；US10,457,980B2；US2016/0369329A1；WO 2018/026873A1；和US2017/0220733 A1中，所有这些文献均全文以引用方式并入。在一些实施方案中，这些测定使得能够同时实现信号放大、组合解码和纠错方案。
在一些实施方案中，核酸(例如，包含条形码序列的核酸，诸如RCA产物)的序列分析可以通过序贯杂交(例如，边杂交边测序和/或序贯原位荧光杂交)进行。序贯荧光杂交可以涉及包含寡核苷酸和可检测标记的检测探针的序贯杂交。在一些实施方案中，本文公开的方法包括本文公开的可检测探针的序贯杂交，包括可检测地标记的探针(例如，荧光团缀合寡核苷酸)和/或本身未被可检测地标记但能够结合可检测地标记的探针(例如，经由核酸杂交)并被可检测地标记的探针检测的探针。包括可检测探针的序贯荧光杂交的示例性方法描述于US2019/0161796、US 2020/0224244、US2022/0010358、US2021/0340618和WO2021/138676中，所有这些专利均以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，本文描述了对样品中相同或不同靶核酸中的多个靶核酸和/或多个感兴趣的序列(例如，SNP)进行定位检测的方法，其中每个靶核酸和/或感兴趣的序列被对所述靶核酸和/或感兴趣的序列具有特异性的环状或可环化的一级探针靶向，并且可环化的一级探针包含不对称杂交区域(例如，较长的3’杂交区域或较长的5’杂交区域)，并且可以在与靶核酸杂交时被环化。多个环状或环化探针中的每一者可以包含与特定靶核酸相对应的条形码序列和/或与特定感兴趣的序列(例如，SNP)相对应的条形码序列。多个环状或环化探针可以在样品中的多个位置处结合靶核酸的分子，并且可以通过滚环扩增(RCA)来原位扩增以产生滚环产物(RCP)。每个RCP可以包含与特定靶核酸相对应的条形码序列和/或与特定感兴趣的序列(例如，SNP)相对应的条形码序列的多个互补拷贝，其中每个条形码序列可以在多个序贯解码循环中解码，每个循环使用杂交探针(例如，中间探针，诸如L形探针)，其与RCP中的条形码序列的互补拷贝杂交并允许产生可检测的信号。序贯解码循环中与条形码序列相关的信号一起产生信号代码序列，该信号代码序列可以用于鉴定条形码序列及其对应的靶核酸序列和/或感兴趣的序列(例如，SNP)。
在一些实施方案中，本文提供了一种分析样品的方法，该方法包括：a)在样品中产生扩增产物，诸如RCA产物，该扩增产物包含条形码序列(例如，多个不同条形码序列之一)的多个拷贝，其中该条形码序列与靶核酸序列和/或感兴趣的序列(例如，SNP)相关，并被分配信号代码序列，并且其中该样品是细胞或组织样品；b)使样品与第一中间探针和第一可检测探针接触，以产生包含与扩增产物杂交的第一中间探针和与第一中间探针杂交的第一可检测探针的第一复合物，其中第一中间探针包含(i)与条形码序列互补的杂交区域和(ii)第一突出端序列，并且其中第一可检测探针包含(i)与第一突出端序列互补的序列和(ii)第一光学可检测部分；c)对样品成像以检测来自第一光学可检测部分的第一信号，其中第一信号对应于信号代码序列中的第一信号代码；d)使样品与第二中间探针和第二可检测探针接触，以产生包含与扩增产物杂交的第二中间探针和与第二中间探针杂交的第二可检测探针的第二复合物，其中第二中间探针包含(i)与条形码序列互补的杂交区域和(ii)第二突出端序列，并且其中第二可检测探针包含(i)与第二突出端序列互补的序列和(ii)第二光学可检测部分；以及e)对样品成像以检测来自第二光学可检测部分的第二信号，其中第二信号对应于信号代码序列中的第二信号代码，其中包含至少第一信号代码和第二信号代码的信号代码序列是在样品中的某个位置处确定的，从而解码条形码序列并鉴定样品中该位置处的靶核酸序列和/或感兴趣的序列(例如，SNP)。在一些实施方案中，与靶核酸序列和/或感兴趣的序列(例如，SNP)相关的条形码序列选自多个条形码序列，其中该方法包括使样品与第一中间探针池和通用可检测探针池接触，其中第一中间探针池包含第一中间探针，并且通用可检测探针池包含第一可检测探针和第二可检测探针，其中第一中间探针池中的每个中间探针包含(i)与多个条形码序列之一互补的杂交区域和(ii)与通用可检测探针池中的可检测探针互补的突出端序列；并且该方法包括使样品与第二中间探针池和通用可检测探针池接触，其中第二中间探针池包含第二中间探针，并且其中第二中间探针池中的每个中间探针包含(i)与多个条形码序列之一互补的杂交区域和(ii)与通用可检测探针池中的可检测探针互补的突出端序列。在一些实施方案中，该方法包括鉴定存在于样品中各位置处的多个不同靶核酸序列和/或感兴趣的序列(例如，SNP)，其中每个不同靶核酸序列和/或感兴趣的序列(例如，SNP)被分配不同信号代码序列，并被包含多个条形码序列中的不同条形码序列的互补序列的可环化探针或探针组靶向。在一些实施方案中，每个中间探针池中不同中间探针的数量大于通用可检测探针池中不同可检测探针的数量。在一些实施方案中，通用可检测探针池中不同可检测探针的数量为4。在一些实施方案中，每个中间探针池中不同中间探针的数量为约10、约20、约50、约100、约200、约500、约1,000、约2,000、约5,000或更多。
在一些实施方案中，可以使用如本文所述的中间探针(例如，L形探针)和可检测探针(例如，荧光标记的探针)的序贯杂交来检测本文公开的每个条形码序列。中间探针可以包含与荧光标记的探针杂交的突出端。中间探针的突出端可以介导和/或引发信号增强或放大，诸如杂交链式反应(HCR)、线性寡核苷酸杂交链式反应(LO-HCR)或引物交换反应(PER)或本文所述的任何其他信号增强或放大方法。例如，可以使用本文所述的探针的序贯杂交来检测图2中的每个条形码序列。
在一些实施方案中，本文公开的条形码序列可以使用这样的方法来检测，该方法包括产生滚环扩增(RCA)产物分子、包含用于杂交链式反应(HCR)的引发剂和放大剂的复合物、包含用于线性寡核苷酸杂交链式反应(LO-HCR)的引发剂和放大剂的复合物、引物交换反应(PER)产物分子、包含用于分支DNA(bDNA)的预放大剂和放大剂的复合物、或包含任何两种或更多种上述分子和复合物的复合物。例如，bDNA复合物或HCR复合物可以被组装在RCA产物上。参见例如US2021/0198727，该专利全文以引用方式并入本文。
与本文公开的可环化探针或探针组相关的信号(例如，与条形码序列相关的信号)可以使用这样的方法来检测，该方法包括可检测反应性分子在探针杂交位点周围的靶向沉积、分支结构的靶向组装(例如，bDNA或使用锁核酸(LNA)的分支测定)、通过酶促滚环扩增(RCA)使多联体的程序化原位生长(例如，如US2019/0055594中所述，该专利以引用方式并入本文)、杂交链式反应、使用连续几轮化学连接(clampFISH)对拓扑链接的DNA结构的组装、通过发夹介导的多联体化的信号放大(例如，如US2020/0362398中所述，该专利以引用方式并入本文)，例如引物交换反应，诸如交换反应信号放大(SABER)或SABER与DNA-Exchange联用(Exchange-SABER)。
可检测反应性分子可以包括酪胺，诸如用于酪胺信号放大(TSA)或多重催化报告沉积(CARD)-FISH。在一些实施方案中，可检测反应性分子可以从可检测标记如荧光团释放和/或切割。在一些实施方案中，本文公开的方法包括生物样品的多重分析，包括探针杂交、荧光成像和信号去除的连续循环，其中信号去除包括从荧光团标记的反应性分子(例如，酪胺)去除荧光团。示例性可检测反应性试剂和方法描述于US 6,828,109、US2019/0376956、US2019/0376956、US 2022/0026433、US2022/0128565和US2021/0222234中，所有这些专利均全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，可以使用杂交链式反应(HCR)检测与本文公开的探针相关的信号。HCR是一种无酶核酸扩增，其基于从HCR单体开始的核酸分子的杂交触发链，这些核酸分子彼此杂交形成带切口的核酸聚合物。该聚合物是HCR反应的产物，其最终被检测以指示靶分析物的存在。HCR详细描述于Dirks和Pierce,2004,PNAS,101(43),15275-15278中以及US 7,632,641和US 7,721,721中(也参见US2006/00234261；Chemeris等人,2008DokladyBiochemistry and Biophysics,419,53-55；Niu等人,2010,46,3089-3091；Choi等人,2010,Nat.Biotechnol.28(11),1208-1212；和Song等人,2012,Analyst,137,1396-1401)。HCR单体通常包含发夹或其他亚稳态核酸结构。在最简单的HCR形式中，当引入“引发剂”核酸分子时，两种不同类型的稳定发夹单体(这里称为第一和第二HCR单体)经历杂交链反应事件，形成带长切口的双链DNA分子。HCR单体具有发夹结构，该发夹结构包含双链茎区、连接茎区的两条链的环区和在双链茎区的一端处的单链区。当单体处于发夹结构中时暴露(并因此可用于与另一分子例如引发剂或其他HCR单体杂交)的单链区可以被称为“立足点区”(或“输入结构域”)。第一HCR单体各自还包含与第二HCR单体的暴露的立足点区中的序列互补的序列。第一HCR单体中的这种互补性序列可以被称为“相互作用区”(或“输出结构域”)。类似地，第二HCR单体各自包含相互作用区(输出结构域)，例如与第一HCR单体的暴露的立足点区(输入结构域)互补的序列。在不存在HCR引发剂的情况下，这些相互作用区受到二级结构的保护(例如，它们不暴露)，因此发夹单体是稳定的或动力学被困的(也称为“亚稳态”)，并保持为单体(例如，防止系统快速平衡)，因为第一和第二组HCR单体不能彼此杂交。然而，一旦引入引发剂，它就能够与第一HCR单体的暴露的立足点区杂交，并侵入它，导致其打开。这将暴露第一HCR单体的相互作用区(例如，与第二HCR单体的立足点区互补的序列)，从而允许其与立足点区处的第二HCR单体杂交并侵入第二HCR单体。这种杂交和侵入进而打开第二HCR单体，暴露其相互作用区(其与第一HCR单体的立足点区互补)，并允许其与另一第一HCR单体杂交并侵入另一第一HCR单体。反应以这种方式继续，直至所有HCR单体都被耗尽(例如，所有HCR单体都并入到聚合物链中)。最终，该链反应导致形成第一单体物类和第二单体物类的交替单元的带切口的链。因此需要HCR引发剂的存在以便通过与第一HCR单体杂交并侵入第一HCR单体来触发HCR反应。第一和第二HCR单体被设计成彼此杂交并因此可以定义为彼此同源。它们还与给定的HCR引发剂序列同源。彼此相互作用(杂交)的HCR单体可以被描述为一组HCR单体或HCR单体或发夹系统。
HCR反应可以用多于两种物类或类型的HCR单体进行。例如，可以使用涉及三种HCR单体的系统。在这样的系统中，每个第一HCR单体可以包含与第二HCR单体的立足点区结合的相互作用区；每个第二HCR可以包含与第三HCR单体的立足点区结合的相互作用区；并且每个第三HCR单体可以包含与第一HCR单体的立足点区结合的相互作用区。然后，HCR聚合反应将如上所述进行，不同的是所得产物将是连续具有第一、第二和第三单体的重复单元的聚合物。可以容易地设想具有更大数量的HCR单体组的相应系统。关于示例性复合物，参见例如US2020/0399689和US 2022/0064697，这些专利以引用方式完全并入本文。
在一些实施方案中，可以使用线性寡核苷酸杂交链式反应(LO-HCR)检测与本文公开的探针相关的信号。在一些实施方案中，本文提供了一种检测样品中的分析物的方法，该方法包括：(i)进行线性寡核苷酸杂交链式反应(LO-HCR)，其中引发剂与至少第一物类和第二物类的多个LO-HCR单体接触，以产生与靶核酸分子杂交的聚合LO-HCR产物，其中第一物类包含与引发剂互补的第一杂交区域和与第二物类互补的第二杂交区域，其中第一物类和第二物类是线性单链核酸分子；其中所述引发剂以一个或多个部分提供，并且直接或间接与靶核酸分子杂交或包含在靶核酸分子中；以及(ii)检测聚合物产物，从而检测分析物。在一些实施方案中，第一物类和/或第二物类可以不包含发夹结构。在一些实施方案中，所述多种LO-HCR单体可以不包含亚稳态二级结构。在一些实施方案中，LO-HCR聚合物可以不包含分支结构。在一些实施方案中，进行线性寡核苷酸杂交链式反应包括使靶核酸分子与引发剂接触，以提供与靶核酸分子杂交的引发剂。在本文的任何实施方案中，靶核酸分子和/或分析物可以是本文公开的内源分析物、连接的不对称探针或RCA产物的序列。用于LO-HCR的示例性方法和组合物描述于US2021/0198723中，该专利全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，可以用这样的方法检测条形码序列，该方法包括通过进行引物交换反应(PER)来放大信号。在各种实施方案中，在其3’末端上具有结构域的引物与催化发夹结合，并通过链置换聚合酶延伸出新结构域。例如，在其3’末端上具有结构域1的引物与催化发夹结合，并通过链置换聚合酶延伸出新结构域1，重复循环产生重复的结构域1序列的多联体。在各种实施方案中，链置换聚合酶为Bst。在各种实施方案中，催化发夹包括释放链置换聚合酶的终止子。在各种实施方案中，分支迁移置换延伸的引物，然后延伸的引物可以解离。在各种实施方案中，引物经历重复循环以形成多联体引物。在各种实施方案中，多个多联体引物与包含使用本文所述方法产生的RCA产物的样品接触。在各种实施方案中，RCA产物可以与多个多联体引物和多个标记探针接触。参见例如美国专利公开号US2019/0106733(其以引用方式并入本文)，了解示例性分子和PER反应组分。
在一些实施方案中，可以通过提供检测探针(诸如用于进行形成扩增产物的链式反应(例如，HCR)的探针)来检测RCA产物。在一些实施方案中，分析包括确定扩增产物的全部或一部分的序列。在一些实施方案中，分析包括检测扩增产物中存在的序列。在一些实施方案中，扩增产物的全部或一部分的序列指示靶核酸中感兴趣的区域的身份。在其他实施方案中，所提供的方法涉及分析(例如，检测或确定)多核苷酸探针中存在的一个或多个序列(例如，第一探针和/或第二探针的突出端区域中存在的条形码序列)。
在一些实施方案中，序贯解码方案涉及在多个循环中检测来自给定靶的多个信号，并且靶可以在不同循环中处于样品中的相同位置。在一些实施方案中，本文公开的方法包括靶核酸序列的定位检测。在一些实施方案中，靶核酸序列存在于样品中固定或限定的位置处，并在该位置处被检测。靶核酸序列可以通过在样品(例如，细胞或组织样品)中其天然位置处原位存在来定位，或者通过连接或以其他方式定位于在样品中其天然位置处原位存在的靶核酸序列和/或感兴趣的序列(例如，SNP)来定位。靶核酸序列可以固定在样品中，例如通过与样品中的其他分子或包埋样品的基质交联。
V.组合物、试剂盒和系统
在一些实施方案中，本文公开了一种包含复合物的组合物，该复合物包含靶核酸、不对称可环化探针或探针组，例如本文所述的任何不对称可环化探针或探针组。在一些实施方案中，复合物包含引物，例如用于环化的可环化探针或探针组的滚环扩增。
在一些实施方案中，本文公开了一种包含扩增产物的组合物，该扩增产物包含与不对称可环化探针或探针组的序列互补的序列的单体单元。在一些实施方案中，使用任何靶核酸、不对称可环化探针和本文所述的任何扩增技术形成扩增产物。
本文还提供了试剂盒，该试剂盒例如包含一个或多个多核苷酸，例如第III节中所述的任何多核苷酸，以及用于执行本文提供的方法的试剂，例如包括本文所述的杂交、连接、扩增、检测、测序和/或样品制备的一个或多个步骤所需的试剂。在一些实施方案中，试剂盒还包含靶核酸。在一些实施方案中，任何或所有多核苷酸是DNA分子。在一些实施方案中，靶核酸是信使RNA分子。在一些实施方案中，试剂盒还包含连接酶，例如用于从可环化探针或探针组形成连接的环状探针。在一些实施方案中，连接酶具有DNA夹板化DNA连接酶活性。在一些实施方案中，试剂盒还包含聚合酶，例如用于进行可环化探针或探针组的扩增。在一些实施方案中，聚合酶能够使用连接的环状探针作为扩增的模板。在一些实施方案中，试剂盒还包含用于扩增的引物。
本文在一些方面公开了一种用于分析生物样品的试剂盒，该试剂盒包含可环化探针或探针组，该可环化探针或探针组包含分别与靶核酸中相邻的第一靶区域和第二靶区域杂交的5’杂交区域和3’杂交区域，其中5’杂交区域和3’杂交区域的长度不同；5’杂交区域或3’杂交区域包含分别与第一靶区域或第二靶区域中感兴趣的序列互补的探询序列；并且探询序列是5’杂交区域中的内部序列，并且不包含5’末端核苷酸。
在一些方面，本文公开了一种用于分析生物样品的试剂盒，该试剂盒包含可环化探针，该可环化探针包含分别与靶核酸中相邻的第一靶区域和第二靶区域杂交的5’杂交区域和3’杂交区域，其中5’杂交区域和3’杂交区域的长度不同；5’杂交区域和3’杂交区域中较短的一者包含分别与第一靶区域或第二靶区域中感兴趣的单核苷酸互补的探询核苷酸；并且探询核苷酸不是可环化探针的5’或3’末端核苷酸。在一些实施方案中，5’杂交区域比3’杂交区域短，并且探询核苷酸是从可环化探针的5’末端算起的第二至第十核苷酸中的任何一个核苷酸。
在一些方面，本文公开了一种用于分析生物样品的试剂盒，该试剂盒包含可环化探针或探针组。在一些实施方案中，可环化探针或探针组包含i)第一可环化探针，该第一可环化探针包含分别与靶核酸中相邻的第一靶区域和第二靶区域杂交的5’杂交区域和3’杂交区域，其中5’杂交区域和3’杂交区域的长度不同；5’杂交区域和3’杂交区域中较短的一者包含分别与第一靶区域或第二靶区域中感兴趣的单核苷酸的第一变体互补的第一探询核苷酸；并且第一探询核苷酸不是可环化探针的5’或3’末端核苷酸。以及ii)第二可环化探针，该第二可环化探针包含5’杂交区域和3’杂交区域，不同的是第二可环化探针包含与感兴趣的单核苷酸的第二变体互补的第二探询核苷酸。在一些实施方案中，第一可环化探针或探针组包含与第一变体相对应的第一条形码序列，并且第二可环化探针或探针组包含与第二变体相对应的第二条形码序列。在本文的任何实施方案中，试剂盒还可以包含直接或间接与第一条形码序列和/或第二条形码序列或其互补序列杂交的一个或多个中间探针；和/或直接或间接与一个或多个中间探针杂交的一个或多个可检测地标记的探针。在本文的任何实施方案中，第一探询核苷酸和第二探询核苷酸可以分别是从第一可环化探针或探针组或第二可环化探针或探针组的5’末端算起的第二至第十核苷酸中的任何一个核苷酸。
试剂盒的各种组分可以存在于单独的容器中，或者某些相容的组分可以预先组合到单个容器中。在一些实施方案中，试剂盒还含有使用试剂盒组分实施所提供的方法的说明书。
在一些实施方案中，试剂盒可以含有用于进行所提供的方法的一个或多个步骤所需的试剂和/或消耗品。在一些实施方案中，试剂盒含有用于固定、包埋和/或透化生物样品的试剂。在一些实施方案中，试剂盒含有试剂，诸如用于连接和/或扩增的酶和缓冲液，诸如连接酶和/或聚合酶。在一些方面，试剂盒还可以包含本文所述的任何试剂，例如洗涤缓冲液和连接缓冲液。在一些实施方案中，试剂盒含有用于检测和/或测序的试剂，如条形码检测探针或可检测标记。在一些实施方案中，试剂盒任选包含其他组分，例如核酸引物、酶和试剂、缓冲液、核苷酸、修饰的核苷酸、用于附加测定的试剂。
VI.应用
在一些方面，所提供的实施方案可以应用于分析核酸序列的原位方法中，如原位转录组分析或原位测序，例如来自其中空间信息已被保留的完整组织或样品的核酸序列。在一些方面，实施方案可以应用于用于多重核酸分析的成像或检测方法中。在一些方面，所提供的实施方案可以用于鉴定或检测靶核酸中感兴趣的区域。
在一些实施方案中，感兴趣的区域是感兴趣的单核苷酸。在一些实施方案中，感兴趣的单核苷酸是单核苷酸多态性(SNP)。在一些实施方案中，感兴趣的单核苷酸是单核苷酸变异(SNV)。在一些实施方案中，感兴趣的单核苷酸是单核苷酸取代。在一些实施方案中，感兴趣的单核苷酸是点突变。在一些实施方案中，感兴趣的单核苷酸是单核苷酸插入。在一些实施方案中，感兴趣的区域包含多态性，包括但不限于多核苷酸改变、插入、缺失和易位。
在一些方面，实施方案可以应用于研究和/或诊断应用，例如，用于来自受试者的特定细胞或组织的表征或评估。所提供的方法的应用可以包括生物医学研究和临床诊断。例如，在生物医学研究中，应用包括但不限于用于生物研究或药物筛选的空间解析基因表达分析。在临床诊断中，应用包括但不限于检测患者样品的基因标志物如疾病、免疫反应、细菌或病毒DNA/RNA。
在一些方面，实施方案可以应用于以亚细胞分辨率观察整个组织中遗传编码标记的分布，例如染色体异常(倒位、重复、易位等)、遗传杂合性丧失、指示易患病体质或健康状况良好的基因等位基因的存在、对治疗有反应的可能性，或应用于个性化医疗或血统。
VII.术语
除非另有定义，否则本文所使用的所有专门术语、符号以及其他技术和科学术语旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为清楚起见和/或供及时参考，本文定义了具有通常理解的含义的术语，并且本文包括此类定义不应当被解释为代表与本领域通常理解的含义具有实质性区别。
术语“多核苷酸”和“核酸分子”在本文中可互换使用，是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体，或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。多核苷酸的骨架可以包含糖和磷酸基团(通常可以在RNA或DNA中发现)，或者修饰或取代的糖或磷酸基团。
如本文所用，“杂交”可以指两个单链多核苷酸非共价结合形成稳定的双链多核苷酸的过程。在一个方面，所得的双链多核苷酸可以是“杂交体”或“双链体”。“杂交条件”通常包括大约小于1M的盐浓度，通常小于约500mM，并且可以小于约200mM。“杂交缓冲液”包括缓冲盐溶液，诸如5％SSPE，或本领域已知的其他此类缓冲液。杂交温度可以低至5℃，但通常高于22℃，并且更通常高于约30℃，并且通常超过37℃。杂交通常在严格条件下进行，例如，序列将与其靶序列杂交但不会与其他非互补序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性的，并且在不同的情况下是不同的。例如，对于特异性杂交，较长的片段可能需要比短片段更高的杂交温度。由于其他因素可能影响杂交的严格性(包括互补链的碱基组成和长度、有机溶剂的存在和碱基错配的程度)，参数的组合比任何一个单独参数的绝对度量更重要。通常，严格条件被选择为在限定的离子强度和pH下比特定序列的Tm低约5℃。解链温度Tm可以是双链核酸分子群体半解离成单链的温度。可以使用用于计算核酸的Tm的几个方程，例如，当核酸在1M NaCl的水溶液中时，可以通过方程Tm＝81.5+0.41(％G+C)计算Tm值的简单估值(参见例如，Anderson和Young,Quantitative Filter Hybridization,载于Nucleic AcidHybridization(1985))。其他参考文献(例如，Allawi和SantaLucia,Jr.,Biochemistry,36:10581-94(1997))包括计算Tm时考虑结构和环境以及序列特征的替代计算方法。
一般来说，杂交体的稳定性是离子浓度和温度的函数。通常，杂交反应在较低严格性的条件下进行，随后进行不同但更高严格性的洗涤。示例性严格条件包括在约7.0至约8.3的pH和至少25℃的温度下至少0.01M至不超过1M钠离子浓度(或其他盐)的盐浓度。例如，5×SSPE(750mM NaCl，50mM磷酸钠，5mM EDTA，pH 7.4)和大约30℃温度的条件适用于等位基因特异性杂交，尽管合适的温度取决于被杂交的区域的长度和/或GC含量。在一个方面，决定错配百分比的“杂交严格性”可以是如下：1)高严格性：0.1×SSPE，0.1％SDS，65℃；2)中等严格性：0.2×SSPE，0.1％SDS，50℃(也称为适度严格性)；和3)低严格性：1.0×SSPE，0.1％SDS，50℃。应当理解，可以使用替代的缓冲液、盐和温度实现同等的严格性。例如，适度严格杂交可以指允许核酸分子(诸如探针)结合互补核酸分子的条件。杂交的核酸分子通常具有至少60％的同一性，包括例如至少任何70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性。适度严格条件可以是相当于在42℃下在50％甲酰胺、5×邓哈特氏溶液(Denhardt’s solution)、5x SSPE、0.2％SDS中杂交，然后在42℃下在0.2×SSPE、0.2％SDS中洗涤的条件。可以例如通过在42℃下在50％甲酰胺、5×邓哈特氏溶液、5×SSPE、0.2％SDS中杂交，然后在65℃下在0.1×SSPE和0.1％SDS中洗涤来提供高严格性条件。低严格性杂交可以指相当于在22℃下在10％甲酰胺、5×邓哈特氏溶液、6×SSPE、0.2％SDS中杂交，然后在37℃下在1×SSPE、0.2％SDS中洗涤的条件。邓哈特氏溶液含有1％Ficoll、1％聚乙烯吡咯烷酮和1％牛血清白蛋白(BSA)。20×SSPE(氯化钠、磷酸钠、乙二胺四乙酸(EDTA))含有3M氯化钠、0.2M磷酸钠和0.025M EDTA。其他合适的适度严格性和高严格性杂交缓冲液和条件描述于例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold SpringHarbor Press,Plainview,N.Y.(1989)；和Ausubel等人,Short Protocols in MolecularBiology,第4版,John Wiley&Sons(1999)中。
可替代地，当RNA或DNA链将在选择性杂交条件下与其互补序列杂交时，存在实质性的互补性。通常，当在至少14至25个核苷酸的片段(stretch)内存在至少约65％互补，优选至少约75％，更优选至少约90％互补时，将发生选择性杂交。参见M.Kanehisa,NucleicAcids Res.12:203(1984)。
本文所用的“引物”可以是天然的或合成的寡核苷酸，其能够在与多核苷酸模板形成双链体时充当核酸合成的起始点，并从其3’末端沿着模板延伸，从而形成延伸的双链体。延伸过程中添加的核苷酸序列由模板多核苷酸的序列决定。引物通常由DNA聚合酶延伸。
“连接”可以指在模板驱动的反应中，在两个或更多个核酸(例如，寡核苷酸和/或多核苷酸)的末端之间形成共价键或键合。键或键合的性质可以变化很大，并且连接可以通过酶促或化学法进行。如本文所用，连接通常通过酶促进行，以在一个寡核苷酸的5’碳末端核苷酸与另一个核苷酸的3’碳之间形成磷酸二酯键。
“测序”、“序列测定”等意指测定与核酸的核苷酸碱基序列相关的信息。这种信息可以包括对核酸的部分以及全部序列信息的鉴定或测定。序列信息可以用不同程度的统计可靠性或置信度来确定。在一个方面，该术语包括确定核酸中多个连续核苷酸的同一性和排序。“高通量数字测序”或“下一代测序”意指使用以本质上平行的方式测定许多(通常数千个至数十亿个)核酸序列的方法进行的序列测定，例如，其中DNA模板不是一次一个地制备用于测序，而是以批量方法制备，并且其中优选平行地读出许多序列，或替代性地使用本身可以并行化的超高通量串行方法。此类方法包括但不限于：焦磷酸测序(例如，由454LifeSciences,Inc.(Branford,Conn.)商业化)；连接法测序(例如，由Life Technologies,Inc.(Carlsbad,Calif.)以SOLiDTM技术商业化)；使用经修饰的核苷酸边合成边测序(诸如由Illumina,Inc.(San Diego,Calif.)以TruSeqTM和HiSeqTM技术商业化；由HelicosBiosciences Corporation(Cambridge,Ma.)以HeliScopeTM商业化；以及由PacificBiosciences of California,Inc.(Menlo Park,Calif.)以PacBio RS商业化)、通过离子检测技术(诸如Life Technologies(Carlsbad,Calif.)的Ion TorrentTM技术)来测序；DNA纳米球测序(Complete Genomics,Inc.(Mountain View,Calif.))；基于纳米孔的测序技术(例如，由Oxford Nanopore Technologies,LTD(Oxford,UK)开发)，以及类似的高度并行的测序方法。
“SNP”或“单核苷酸多态性”可以包括个体之间的遗传变异；例如，生物体DNA中可变的单个含氮碱基位置。在整个基因组中都发现了SNP；个体之间的大部分遗传变异是由于SNP基因座的变异，并且通常这种遗传变异导致个体之间的表型变异。本公开中使用的SNP及其相应等位基因可以源自任何数量的来源，诸如公共数据库(加州大学圣克鲁斯分校人类基因组浏览器网关(U.C.Santa Cruz Human Genome Browser Gateway)(genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)或NCBI dbSNP网站(www.ncbi.nlm.nih gov/SNP/)，或者可以如美国专利号6,969,589和名称为“Human Genomic Polymorphisms”的美国公开号2006/0188875中所述的那样通过实验确定，所有这些专利全文以引入方式并入本文。尽管在本文提出的一些实施方案中描述了SNP的使用，但是应当理解，也可以使用其他双等位基因或多等位基因遗传标记。双等位基因遗传标记是具有两种多态形式或等位基因的标记。如上所述，对于与性状相关的双等位基因遗传标记，与对照组相比在病例组的遗传组成中更丰富的等位基因被称为“相关等位基因”，而另一个等位基因可以被称为“无关等位基因”。因此，对于与给定性状(例如，疾病或药物反应)相关的每个双等位基因多态性，存在对应的相关等位基因。可以与本文提出的方法一起使用的其他双等位基因多态性包括但不限于多核苷酸改变、插入、缺失和易位。还应当理解，本文提及的DNA可包括基因组DNA、线粒体DNA、附加体DNA和/或DNA衍生物，诸如扩增子、RNA转录物、cDNA、DNA类似物等。在关联研究中筛选的多态基因座可以呈二倍体或单倍体状态，并且理想情况下，将来自整个基因组的位点。
本文中的“多重”或“多重测定法”可以指一种测定法或其他分析方法，其中可以通过使用超过一种捕获探针缀合物同时测定多个靶(例如，多个核酸靶序列)的存在和/或量，其中每种捕获探针缀合物具有至少一种不同的检测特性，例如荧光特性(例如激发波长、发射波长、发射强度、FWHM(半最大峰高全宽)或荧光寿命)或独特的核酸或蛋白质序列特性。
如本文所用，术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的通常误差范围。本文对“约”值或参数的引用包括(并描述)涉及该值或参数本身的实施方案。
如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个指代物，除非上下文另有明确规定。例如，“一个”或“一种”意指“至少一个(种)”或“一个(种)或多个(种)”。
在整个本公开中，要求保护的主题的各个方面以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对要求保护的主题的范围的不灵活限制。因此，范围的描述应被认为已经具体公开了在该范围内的所有可能的子范围以及单独的数值。例如，在提供值的范围的情况下，应当理解，在该范围的上限和下限之间的每个居间值以及该陈述的范围中的任何其他陈述的或居间的值均涵盖在要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围中，并且也涵盖在要求保护的主题内，但受制于陈述的范围中的任何具体排除的极限。在陈述的范围包括这些极限中的一个或两个极限的情况下，排除那些包括的极限中的任一个或两个极限的范围也包括在要求保护的主题中。不管范围的广度如何，这都适用。
在权利要求书中使用诸如“第一”、“第二”、“第三”等序数词来修饰权利要求要素本身并不意味着一个权利要求要素优于另一个权利要求要素的任何优先级、先后次序或顺序，也不意味着执行方法的多个动作的时间顺序，而是仅用作将具有某一名称的一个权利要求要素与具有用于区分权利要求要素的相同名称(但使用的序数词不同)的另一个要素区分开的标签。类似地，在权利要求中使用a)、b)等或i)、ii)等本身并不意味着任何优先级、先后次序或步骤顺序。类似地，在说明书中使用这些术语本身并不意味着任何要求的优先级、先后次序或顺序。
实施例
包括以下实施例仅用于说明目的，并不旨在限制本公开的范围。
实施例1：用不对称挂锁探针检测KRAS突变。
该实施例描述了通过使用不对称挂锁探针直接靶向KRAS mRNA分子来检测点突变和/或SNP。设计了靶向常见KRAS突变的各种挂锁探针以用于RNA模板化挂锁连接和随后的连接挂锁探针的RCA，并测试了它们在检测突变中的特异性。挂锁探针可以用于直接RNA(dRNA)原位谱分析，例如癌症中的突变谱分析和组织中的miRNA谱分析，例如在人类肿瘤切片和人类组织微阵列(TMA)中进行。
方法
将ME180和A549细胞接种在载玻片上并使其附着。然后将细胞固定在甲醛的PBS溶液中并透化。将载玻片在PBS中洗涤，并通过70％和100％的乙醇系列脱水。然后将载玻片水合，例如用PBS-T短暂洗涤。
为了进行探针杂交，将细胞在PBS-T中洗涤两次，然后将突变型和野生型探针的探针池添加到包含SSC和甲酰胺的杂交缓冲液中，并温育。然后，去除探针杂交混合物，并将细胞在包含SSC和甲酰胺的预热洗涤缓冲液中洗涤，随后用PBS-T洗涤。
为了进行连接，将细胞在PBS-T中洗涤一次，然后添加连接反应混合物。用于RNA上的不对称挂锁探针的连接反应混合物包含T4 RNA连接酶缓冲液、RNA酶抑制剂和T4 RNA连接酶。cDNA上的对称挂锁探针的连接反应混合物包含Tth连接酶(BLIRT)和RNaseH(BLIRT)。将细胞在PBS-T中洗涤两次，并且添加RCA反应混合物(含有Phi29反应缓冲液、dNTPs、Phi29聚合酶)并温育以进行滚环扩增(RCA)。
随后，将细胞在PBS-T中洗涤两次，并将检测探针与RCA产物原位杂交(Cy5标记探针与KRAS野生型探针杂交，Cy3标记探针与KRAS突变型探针杂交)，其中杂交缓冲液含有SSC和甲酰胺。将细胞在PBS-T中洗涤三次，用DAPI染色，再次洗涤三次，然后封固在Slowfade封固介质中。使用20倍物镜在荧光显微镜下对细胞进行成像，并使用Cell profiler软件对RCA产物进行定量。
结果
为了评价嵌合不对称挂锁探针的特异性，设计了靶向常见KRAS突变的多个挂锁探针(PLP)以用于RNA模板化RCA，并使用KRAS突变的细胞系进行了测试(表1)。探针是在3’末端具有一个核糖核苷酸的嵌合DNA/RNA探针，并且5’和3’臂的长度不对称。这些探针允许直接检测RNA靶，因为它们是RNA模板化连接的底物。将不对称挂锁探针与对称DNA探针进行了比较，后者需要在探针的DNA模板化连接之前通过逆转录将靶RNA转化为cDNA。
表1：选定的KRAS突变和细胞系
在评价的不对称探针设计中，选择10-20m5不对称探针进行进一步评价。10-20m5探针具有10个核苷酸的5’臂和20个核苷酸的3’臂，5’臂在第五个碱基处具有内部探询核苷酸(图4A)。图4B-4C示出了在KRAS突变型细胞系(A549)和KRAS野生型(ME180)细胞系中验证10-20m5探针的结果。图4B示出了在直接RNA(dRNA)检测中使用10-20m5探针的预期计数偏差与使用对称挂锁探针和建立在基于cDNA的杂交基础上的原位测序方法(cDNA对照)的结果相当，该方法描述于Gyllborg等人,“Hybridization-based in situ sequencing(HybISS)for spatially resolved transcriptomics in human and mouse braintissue,”Nucleic Acids Res.2020；48(19):e112中，该文献的内容全文以引用方式并入本文。然而，与cDNA对照相比，10-20m5探针在KRAS突变型细胞(A549)和KRAS野生型(ME180)细胞中显示出预期计数的更高倍数变化(图4C)。因此，当与基于cDNA的检测相比时，使用RNA上的不对称挂锁探针检测感兴趣的单核苷酸的效率增加，同时保持检测特异性。
为了评价10-20不对称探针设计中探询碱基的位置的影响，测试了在第一位置(10-20m1，如图5A所示)、第三位置(10-20m3，如图5B所示)或第五位置(10-20m5)具有突变的10-20探针。在ME180(KRAS野生型)和A549(KRAS突变型)细胞系中评价了每种探针设计的检测效率。
表2A：各种10-20探针的检测效率
细胞系/探针构型 总RCP，归一化
ME-180/10-20m1 1.64
ME-180/10-20m3 1.20
ME-180/10-20m5 1.00
A549/10-20m1 0.43
A549/10-20m3 0.99
A549/10-20m5 1.00
表2B：各种10-20探针设计的每个探针的RCP计数
发现10-20m1、10-20m3和10-20m5探针之间的检测效率相当(表2A)。表2B中的值代表检测到的野生型或突变型KRAS转录物与细胞核数量的比率。具有对称15-核苷酸臂和3’末端的探询碱基的探针显示出与不对称10-20m1、10-20m3和10-20m5探针相当的效率(检测到的转录物数量)。然而，与不对称10-20m1、10-20m3和10-20m5探针相比，具有对称15-核苷酸臂和3’末端的探询碱基的探针显示出较差的检测特异性(图6A-6B)。
鉴于这些结果，不对称挂锁探针可以有效且特异性地检测靶核酸中的单核苷酸变化。不对称挂锁探针可以应用于人类肿瘤切片和人类组织微阵列(TMA)中靶RNA的原位测序，并且还可以用于进一步的应用，诸如癌症中的突变谱分析和微小RNA谱分析。
实施例2：使用不对称挂锁探针在小鼠脑切片中进行突变检测。
在本实施例中，评估了使用不对称挂锁探针原位靶向mRNA的效率和特异性。
方法
对小鼠脑组织样品进行pcp4和neurod6检测。手术取出小鼠脑后，不经任何固定，立即将其包埋在OCT介质中，并直接在干冰上冷冻，然后在-80℃下保存直至使用。然后用cryostat切下10μm切片，并在Superfrost载玻片上收集切片。随后将切片在甲醛的PBS溶液中短暂固定，并在PBS Tween中洗涤一次，之后对其进行透化。透化后，将载玻片在PBS中洗涤两次，并通过乙醇系列脱水。将安全密封室安装在覆盖组织切片的载玻片上，并通过用PBS-T短暂洗涤使组织水合。
为了用嵌合不对称挂锁探针靶向mRNA，在短暂的再水合洗涤后，将切片浸入包含SSC和甲酰胺及不对称挂锁探针池的探针杂交混合物中并温育。除了三个不匹配的挂锁探针之外，每个池还包含一个匹配的挂锁探针。之后，在包含SSC和甲酰胺的预热缓冲液中洗涤该切片。最后，在PBS-T中洗涤该切片。在杂交后进行洗涤后，将包含T4连接酶缓冲液和T4连接酶的连接反应混合物添加到该切片。
为了进行RCA，将切片浸入含有Phi29聚合酶缓冲液、dNTPs、RCA引物和Phi29聚合酶的滚环扩增混合物中并温育。随后，将该切片在PBS-T中洗涤两次。
为了检测RCA产物，随后将中间探针(与RCA产物中的条形码序列杂交的L形探针，其突出端与荧光标记的探针杂交)和检测探针(荧光标记的探针)杂交。L-探针在包含SSC和甲酰胺的杂交缓冲液中与RCA产物原位杂交。然后将检测探针(在原位测序反应中用作锚定探针)在杂交缓冲液中与RCA产物原位杂交。随后将TrueBlack应用于所有切片。然后使用20倍物镜在荧光显微镜下对切片进行成像，在每个切片的3个视野上评价RCA产物。
结果
如通过总信号比(每个检测通道的RCA产物与总RCA产物的比率)(图7B)所测量的，在3’末端具有探询核糖核苷酸碱基的对称探针(图7A)检测靶RNA中的G和C突变的效率通常高于检测A和U突变的效率。为了测试使用不对称挂锁探针的原位突变检测的效率和特异性，在小鼠脑切片上评价10-20探针设计中的pcp4探针。确定了四个探针组(探针组A、探针组T、探针组G和探针组C)在小鼠脑切片中检测pcp4转录物中感兴趣的单核苷酸的效率和特异性(图8A)。每个探针组包括一个具有匹配碱基的探针和三个各有一个错配碱基的探针。例如，探针组G包括一个具有匹配碱基G的探针和三个具有错配碱基A、C和T的探针。每个探针组的检测效率在图8B中示出。每个探针组能够特异性地检测预期的碱基(图8C)。
本公开的范围并非旨在限于所公开的特定实施方案，这些实施方案是例如为了举例说明本公开的各方面而提供的。根据本文的描述和教导，对所描述的这些组合物和方法的各种修改将变得显而易见。可以在不脱离本公开的真实范围和实质的情况下实践此类变化，并且此类变化旨在落入本公开的范围内。

Claims (65)

1.一种用于分析生物样品的方法，包括：
a)使所述生物样品与可环化探针接触，其中：
所述可环化探针包含分别与所述生物样品中的靶核酸中相邻的第一靶区域和第二靶区域杂交的5’杂交区域和3’杂交区域，
所述5’杂交区域和所述3’杂交区域的长度不同，
所述5’杂交区域或所述3’杂交区域包含分别与所述第一靶区域或所述第二靶区域中感兴趣的序列互补的探询序列，并且
所述探询序列不包含可连接末端；
b)使与所述靶核酸杂交的所述可环化探针环化，以形成环化探针；以及
c)检测所述生物样品中的所述环化探针或其产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸包含RNA。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述靶核酸是mRNA。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述可环化探针包含DNA。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述可环化探针包含一个或多个核糖核苷酸残基。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述一个或多个核糖核苷酸位于和/或靠近所述可环化探针的可连接3’末端。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述可环化探针是挂锁探针。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述可环化探针包含3’末端核糖核苷酸。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述探询序列在所述5’杂交区域和所述3’杂交区域中较短的一者中。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述探询序列在所述5’杂交区域和所述3’杂交区域中较长的一者中。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述5’杂交区域比所述3’杂交区域短。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述5’杂交区域比所述3’杂交区域长。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述5’杂交区域和所述3’杂交区域的长度独立地为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个核苷酸。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述5’杂交区域的长度与所述3’杂交区域的长度相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述5’杂交区域包含所述探询序列，并且比所述3’杂交区域短约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述5’杂交区域比所述3’杂交区域短约10个核苷酸。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述可环化探针中的所述探询序列的长度是一个、两个、三个、四个或五个核苷酸。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述探询序列是探询核苷酸，并且所述感兴趣的序列是选自由以下项组成的组的感兴趣的单核苷酸：单核苷酸多态性(SNP)、单核苷酸变异(SNV)、单核苷酸取代、点突变、单核苷酸缺失和单核苷酸插入。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述探询核苷酸是所述5’杂交区域的第二核苷酸、第三核苷酸、第四核苷酸、第五核苷酸、第六核苷酸、第七核苷酸、第八核苷酸、第九核苷酸或第十核苷酸，所述可环化探针的5’末端核苷酸是所述5’杂交区域的第一核苷酸。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述探询核苷酸是所述5’杂交区域的第四核苷酸、第五核苷酸或第六核苷酸。
21.根据权利要求18所述的方法，其中所述探询核苷酸是所述3’杂交区域的第二核苷酸、第三核苷酸、第四核苷酸、第五核苷酸、第六核苷酸、第七核苷酸、第八核苷酸、第九核苷酸或第十核苷酸，所述可环化探针的3’末端核苷酸是所述3’杂交区域的第一核苷酸。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中使用所述靶核酸作为模板来连接所述可环化探针的3’末端和5’末端。
23.根据权利要求22所述的方法，其中在连接之前不填充缺口的情况下连接所述3’末端和所述5’末端。
24.根据权利要求22所述的方法，其中在所述3'末端和所述5'末端的所述连接之前，先填充缺口。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述环化步骤包括选自由酶促连接、化学连接、模板依赖性连接和/或模板非依赖性连接组成的组的连接。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述酶促连接包括使用具有RNA模板化DNA连接酶活性和/或RNA模板化RNA连接酶活性的连接酶。
27.根据权利要求25或26所述的方法，其中所述酶促连接包括使用选自由小球藻病毒DNA连接酶(PBCV DNA连接酶)、T4 RNA连接酶、T4 DNA连接酶和单链DNA(ssDNA)连接酶组成的组的连接酶。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中所述酶促连接包括使用PBCV-1DNA连接酶或其变体或衍生物和/或T4 RNA连接酶2(T4 Rnl2)或其变体或衍生物。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，还包括在所述环化步骤之前，从所述生物样品中去除不与所述靶核酸结合的所述可环化探针的分子的步骤。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，还包括在所述环化步骤之前，从所述生物样品中去除与所述靶核酸结合但在所述探询序列中包含一个或多个错配的所述可环化探针的分子，和/或允许包含一个或多个错配的所述分子(或其部分)从所述靶核酸解离，同时在所述探询序列中不包含错配的所述分子保持与所述靶核酸结合的步骤。
31.根据权利要求30所述的方法，其中在相同的条件下，在所述探询序列中包含一个或多个错配的所述分子与所述靶核酸结合的稳定性不如不包含错配的所述分子。
32.根据权利要求29至31中任一项所述的方法，包括一次或多次严格洗涤。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的方法，还包括在所述生物样品中原位产生所述环化探针的所述产物。.
34.根据权利要求33所述的方法，其中使用滚环扩增(RCA)产生所述产物。
35.根据权利要求33或34所述的方法，其中使用选自由以下项组成的组的聚合酶产生所述产物：Phi29 DNA聚合酶、Phi29样DNA聚合酶、M2 DNA聚合酶、B103 DNA聚合酶、GA-1DNA聚合酶、phi-PRD1聚合酶、Vent DNA聚合酶、Deep Vent DNA聚合酶、Vent(exo-)DNA聚合酶、KlenTaq DNA聚合酶、DNA聚合酶I、DNA聚合酶I的Klenow片段、DNA聚合酶III、T3 DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、T5 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Bst聚合酶、rBST DNA聚合酶、N29DNA聚合酶、TopoTaq DNA聚合酶、T7 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶及其变体或衍生物。
36.根据权利要求33至35中任一项所述的方法，其中所述产物固定在所述生物样品中和/或与所述生物样品中的一个或多个其他分子交联。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的方法，其中所述方法包括对所述生物样品成像以检测所述环化探针或其产物。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述成像包括检测与荧光标记的探针相关的信号，所述荧光标记的探针直接或间接与所述环化探针的滚环扩增产物结合。
39.根据权利要求38所述的方法，其中在所述生物样品中原位分析所述滚环扩增产物的序列。
40.根据权利要求39所述的方法，其中通过序贯杂交、边杂交边测序、边连接边测序、边合成边测序、边结合边测序或它们的组合来分析所述滚环扩增产物的所述序列。
41.根据权利要求39或40所述的方法，其中所述滚环扩增产物的所述序列包含一个或多个条形码序列或其互补序列。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述一个或多个条形码序列或其互补序列对应于所述靶核酸和/或所述感兴趣的序列。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述检测包括：
使所述生物样品和直接或间接与所述滚环扩增产物杂交的一个或多个可检测地标记的探针接触，并且
使所述一个或多个可检测地标记的探针与所述滚环扩增产物去杂交。
44.根据权利要求42所述的方法，其中所述检测包括：
使所述生物样品和直接或间接与所述滚环扩增产物杂交的一个或多个中间探针接触，其中所述一个或多个中间探针可使用一个或多个可检测地标记的探针检测，并且
使所述一个或多个中间探针和/或所述一个或多个可检测地标记的探针与所述滚环扩增产物去杂交。
45.一种用于分析生物样品的方法，包括：
a)使所述生物样品与可环化探针接触，其中：
所述可环化探针包含分别与所述生物样品中的靶RNA中相邻的第一靶区域和第二靶区域杂交的5’杂交区域和3’杂交区域，
所述5’杂交区域和所述3’杂交区域的长度不同，
所述5’杂交区域和所述3’杂交区域中较短的一者包含分别与所述第一靶区域或所述第二靶区域中感兴趣的单核苷酸互补的探询核苷酸，并且
所述探询核苷酸不是5’或3’末端核苷酸；
b)连接与所述靶RNA杂交的所述可环化探针的所述末端，以形成环化的可环化探针；
c)产生所述环化的可环化探针的滚环扩增产物；以及
d)检测与所述生物样品中的所述滚环扩增产物相关的信号。
46.一种用于分析生物样品的方法，包括：
a)使所述生物样品与可环化探针接触，其中：
所述可环化探针包含分别与所述生物样品中的靶RNA中相邻的第一靶区域和第二靶区域杂交的5’杂交区域和3’杂交区域，
所述5’杂交区域比所述3’杂交区域短，并且包含与所述靶RNA的第一分子的所述第一靶区域中感兴趣的单核苷酸互补的探询核苷酸，其中所述靶RNA的第二分子包含与所述探询核苷酸的错配，并且
所述探询核苷酸是从所述可环化探针的所述5’末端算起的第二至第十核苷酸中的任何一个核苷酸；
b)允许所述5’杂交区域从所述靶RNA的所述第二分子解离，其中在相同条件下，所述5’杂交区域保持与所述靶RNA的所述第一分子杂交；
c)连接与所述靶RNA的所述第一分子杂交的所述可环化探针的所述末端，以形成环化的可环化探针；
d)产生所述环化的可环化探针的滚环扩增产物；以及
e)检测与所述生物样品中的所述滚环扩增产物相关的信号，其中未检测到与所述靶RNA的所述第二分子相关的信号。
47.一种用于分析生物样品的方法，包括：
a)使所述生物样品与以下各项接触：
i)第一可环化探针，所述第一可环化探针包含分别与靶RNA中相邻的第一靶区域和第二靶区域杂交的5’杂交区域和3’杂交区域，
所述5’杂交区域和所述3’杂交区域的长度不同，
所述5’杂交区域和所述3’杂交区域中较短的一者包含分别与所述第一靶区域或所述第二靶区域中感兴趣的单核苷酸的第一变体互补的第一探询核苷酸，并且
所述第一探询核苷酸是从所述第一可环化探针的所述5’末端算起的第二至第十核苷酸中的任何一个核苷酸；以及
ii)第二可环化探针，所述第二可环化探针包含所述5’杂交区域和所述3’杂交区域，不同的是所述第二可环化探针包含与所述感兴趣的单核苷酸的第二变体互补的第二探询核苷酸；
b)连接与所述靶RNA杂交的所述第一可环化探针的所述末端和/或所述第二可环化探针的所述末端，以形成环化的第一可环化探针和/或环化的第二可环化探针；
c)产生所述环化的第一可环化探针的第一滚环扩增产物和/或所述环化的第二可环化探针的第二滚环扩增产物；以及
d)检测与所述第一滚环扩增产物和/或所述第二滚环扩增产物相关的信号，
从而检测所述生物样品中所述感兴趣的单核苷酸的所述第一变体和/或所述第二变体。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述第一可环化探针包含与所述第一变体相对应的第一条形码序列，并且所述第二可环化探针包含与所述第二变体相对应的第二条形码序列，并且在所述检测步骤中在所述生物样品中的给定位置处检测到的信号与所述第一条形码序列或所述第二条形码序列或其互补序列相关。
49.根据权利要求47或48所述的方法，还包括在所述生物样品中的多个位置处原位检测所述感兴趣的单核苷酸的所述第一变体或所述第二变体。
50.根据权利要求1至49中任一项所述的方法，其中所述生物样品是固定的和/或透化的生物样品。
51.根据权利要求1至50中任一项所述的方法，其中所述生物样品是组织样品。
52.根据权利要求1至51中任一项所述的方法，其中所述生物样品是福尔马林固定石蜡包埋的(FFPE)组织样品、冷冻组织样品或新鲜组织样品。
53.根据权利要求51或52所述的方法，其中所述组织样品是厚度在约1μm和约50μm之间的组织切片。
54.根据权利要求1至53中任一项所述的方法，其中所述生物样品是交联的。
55.根据权利要求1至54中任一项所述的方法，其中所述生物样品包埋在水凝胶基质中。
56.根据权利要求1至55中任一项所述的方法，其中所述生物样品是澄清的。
57.根据权利要求1至56中任一项所述的方法，其中所述生物样品不包埋在水凝胶基质中。
58.一种用于分析生物样品的试剂盒，包含可环化探针，所述可环化探针包含分别与靶核酸中相邻的第一靶区域和第二靶区域杂交的5’杂交区域和3’杂交区域，其中：
所述5’杂交区域和所述3’杂交区域的长度不同，
所述5’杂交区域或所述3’杂交区域包含分别与所述第一靶区域或所述第二靶区域中感兴趣的序列互补的探询序列，并且
所述探询序列不包含可连接末端。
59.一种用于分析生物样品的试剂盒，包含可环化探针，所述可环化探针包含分别与靶核酸中相邻的第一靶区域和第二靶区域杂交的5’杂交区域和3’杂交区域，其中：
所述5’杂交区域和所述3’杂交区域的长度不同，
所述5’杂交区域和所述3’杂交区域中较短的一者包含分别与所述第一靶区域或所述第二靶区域中感兴趣的单核苷酸互补的探询核苷酸，并且
所述探询核苷酸不是所述可环化探针的5’或3’末端核苷酸。
60.根据权利要求59所述的试剂盒，其中所述5’杂交区域比所述3’杂交区域短，并且所述探询核苷酸是从所述可环化探针的所述5’末端算起的第二至第十核苷酸中的任何一个核苷酸。
61.一种用于分析生物样品的试剂盒，包含：
i)第一可环化探针，所述第一可环化探针包含分别与靶核酸中相邻的第一靶区域和第二靶区域杂交的5’杂交区域和3’杂交区域，其中：
所述5’杂交区域和所述3’杂交区域的长度不同，
所述5’杂交区域和所述3’杂交区域中较短的一者包含分别与所述第一靶区域或所述第二靶区域中感兴趣的单核苷酸的第一变体互补的第一探询核苷酸，并且
所述第一探询核苷酸不是所述可环化探针的5’或3’末端核苷酸；以及
ii)第二可环化探针，所述第二可环化探针包含所述5’杂交区域和所述3’杂交区域，不同的是所述第二可环化探针包含与所述感兴趣的单核苷酸的第二变体互补的第二探询核苷酸。
62.根据权利要求61所述的试剂盒，其中所述第一可环化探针包含与所述第一变体相对应的第一条形码序列，并且所述第二可环化探针包含与所述第二变体相对应的第二条形码序列。
63.根据权利要求62所述的试剂盒，还包含：
直接或间接与所述第一条形码序列和/或所述第二条形码序列或其互补序列杂交的一个或多个中间探针。
64.根据权利要求63所述的试剂盒，还包含直接或间接与所述一个或多个中间探针杂交的一个或多个可检测地标记的探针。
65.根据权利要求61至64中任一项所述的试剂盒，其中所述第一探询核苷酸和所述第二探询核苷酸分别是从所述第一可环化探针或所述第二可环化探针的所述5’末端算起的第二至第十核苷酸中的任何一个核苷酸。
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