CN109923216A - 将生物分子的检测组合到使用荧光原位测序的单个试验的方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供了将RNA荧光原位测序(FISSEQ)与其他分子检测方案组合形成整合的全组学(panomic)检测平台的方法。在各种实施方式中，本公开提供了制备生物样品的系统和方法，以保留生物样品内感兴趣的生物分子的空间关系用于FISSEQ检测。

Description

将生物分子的检测组合到使用荧光原位测序的单个试验的 方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年8月31日提交的美国临时申请号62/381,997的权益，该申请通过引用全文纳入本文。

有关联邦资助的研究的声明

本发明得到政府的支持，在国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的P50HG005550和RM1 HG008525和国家自然基金会(National Science Foundation)授予的DGE1144152的资助下完成。政府对本发明拥有一定的权利。

背景技术

转录组是细胞表型重要的介导物。细胞RNA反应了基因组的状态，并且还产生包含细胞主要物质表现的所有蛋白质。因此，据信检测RNA分子产生了对细胞表型的深刻理解。然而，检测RNA仅能够对基因组、蛋白质组、代谢组的状态和分子状态空间的维度做出推断。仍然存在对于将RNA荧光原位测序(FISSEQ)与其他分子检测方案组合以形成整合的全组学(panomic)检测平台的方法的需求。

发明概述

在一方面，本公开提供了用于检测和鉴定生物样品的一种或多种生物分子的系统。该系统可以包括：容器，所述容器包含(i)包含所述一种或多种生物分子的所述生物样品和(ii)膨胀剂和接合部分，其中所述膨胀剂在施加刺激后可以活化而增大体积，从而产生包含所述生物分子的三维基质，其中所述刺激是电磁刺激、电化学刺激或热刺激，其中所述一种或多种生物分子经由所述接合部分而与所述三维基质偶联，并且其中所述三维基质保留生物样品内所述生物分子的绝对或相对空间关系。

在另一方面，本公开还提供了用于检测和鉴定生物样品的一种或多种生物分子的系统。该系统可以包括：容器，所述容器包含(i)包含所述一种或多种生物分子的所述生物样品和(ii)膨胀剂和接合部分，其中所述膨胀剂在施加刺激后可活化，从而产生包含所述生物分子的三维基质，其中所述刺激不是液体，其中所述一种或多种生物分子经由所述接合部分而与所述三维基质偶联，并且其中所述三维基质保留生物样品内所述生物分子的绝对或相对空间关系。

在一些实施方式中，所述三维基质包含所述含有所述生物分子的生物样品。在一些实施方式中，该系统还包括与所述容器操作性地偶联的所述刺激的源，其中向所述膨胀剂施加所述刺激激活所述膨胀剂形成所述三维聚合物基质，其中三维聚合物基质保留所述生物分子在所述生物样品内的绝对或相对空间关系。在一些实施方式中，该系统还包含与所述刺激的所述源操作性地偶联的一个或多个计算机处理器，其中所述一个或多个计算机处理器经单独地或共同地编程以指导所述刺激的所述源向所述膨胀剂施加所述刺激，从而激活所述膨胀剂以形成所述三维聚合物基质。在一些实施方式中，所述生物样品是细胞或其衍生物。在一些实施方式中，所述生物分子是核糖核酸分子(RNA)，脱氧核糖核酸分子(DNA)或RNA和DNA。在一些实施方式中，所述电化学刺激是电化学反应。在一些实施方式中，所述膨胀剂被进一步设置成用作收缩剂(contracting agent)。在一些实施方式中，所述收缩剂是光激活的收缩剂，电化学激活的收缩剂或热激活的收缩剂。在一些实施方式中，所述膨胀剂包含螯合官能。在一些实施方式中，所述膨胀剂包含乙二胺四乙酸(EDTA)。在一些实施方式中，所述EDTA是邻硝基苄基笼状EDTA或醌-酯保护的EDTA。在一些实施方式中，三维基质被设置成在膨胀剂激活后膨胀1.1至10倍。在一些实施方式中，所述一个或多个生物分子的绝对或相对空间关系在三维基质膨胀后保留。在一些实施方式中，接合部分包括或者可操作地偶联反应性基团。在一些实施方式中，接合部分包括胺、硫醇、叠氮、炔烃或点击反应性基团。在一些实施方式中，接合部分包括可聚合(polymerizeable)基团。

在一些实施方式中，本公开包括使用本文所述的三维基质的方法，其包括：经由光、电化学或热使三维基质膨胀。在一些实施方式中，该方法还包括在所述膨胀后将用于荧光原位测序(FISSEQ)的试剂流入三维基质中。在一些实施方式中，该方法还包括经由光、电化学或热使三维基质收缩(contract)。

在另一方面，提供了用于原位检测或鉴定生物样品内的生物分子的方法。所述方法包括：提供容器，所述容器包含(i)包含所述生物分子的所述生物样品和(ii)膨胀剂和接合部分，其中所述膨胀剂在施加刺激后可被活化，从而产生包含所述生物分子的三维基质，其中所述刺激是电磁刺激、电化学刺激或热刺激；以及向所述膨胀剂施加所述刺激，从而激活所述膨胀剂以生成包含所述生物分子的三维基质，其中所述生物分子经由所述接合部分而与所述三维基质偶联，其中三维基质保留生物样品内所述生物分子的绝对或相对空间关系。

在另一方面，本公开还提供了用于原位检测或鉴定生物样品内的生物分子的方法。所述方法包括：提供容器，所述容器包含(i)包含所述生物分子的所述生物样品和(ii)膨胀剂和接合部分，其中所述膨胀剂在施加刺激后可被活化，从而产生包含所述生物分子的三维基质，其中所述刺激不是液体；以及向所述膨胀剂施加所述刺激，从而激活所述膨胀剂以生成包含所述生物分子的三维基质，其中所述生物分子经由所述接合部分而与所述三维基质偶联，其中三维基质保留生物样品内所述生物分子的绝对或相对空间关系。

在一些实施方式中，所述三维基质包含所述含有所述生物分子的生物样品。在一些实施方式中，所述生物样品是细胞或其衍生物。在一些实施方式中，该方法还包括检测所述三维基质中所述生物分子的至少一个子集。在一些实施方式中，该方法还包括施加所述刺激的源，其中所述源操作性地偶联所述容器，其中所述施加激活所述膨胀剂形成所述三维聚合物基质，其中三维聚合物基质保留所述生物分子在所述生物样品内的绝对或相对空间关系。在一些实施方式中，所述施加所述源包括在一个或多个计算机处理器的协助下将所述刺激的所述源导向所述膨胀剂，所述计算机处理器单独地或共同地经编程以指导所述源。

在一些实施方式中，所述膨胀剂被进一步设置成用作收缩剂。

在一些实施方式中，该方法还包括经由光、电化学或热使三维基质收缩。

在另一个方面，本公开提供了聚合的三维基质，用于鉴定一种或多种生物分子。该聚合的三维基质包括：包含骨架的三维聚合物；和与三维聚合物的骨架偶联的接合部分，其中接合部分被设置成保留三维聚合物内一种或多种生物分子的绝对或相对空间关系，其中聚合的三维基质不包含用于鉴定一种或多种生物分子的探针。

在一些实施方式中，接合部分被设置成捕获探针。在一些实施方式中，三维聚合物基质被设置成捕获探针。在一些实施方式中，聚合的三维基质还包含与三维聚合物整合的生物样品，并且其中接合部分被设置成保留生物样品内一种或多种生物分子的绝对或相对空间关系。在一些实施方式中，接合部分被设置成捕获与所述一种或多种生物分子偶联的探针。在一些实施方式中，骨架是聚(乙烯乙二醇)骨架。在一些实施方式中，接合部分以瓶刷(bottle brush)拓扑结构与骨架偶联。在一些实施方式中，接合部分包括反应性基团。在一些实施方式中，接合部分包括胺、硫醇、叠氮、炔烃或点击反应性基团。在一些实施方式中，接合部分包括可聚合基团。

在另一方面，本公开还提供了使用本文所述聚合的三维基质检测生物分子的方法，其包括：提供聚合的三维基质；使所述探针流入聚合的三维基质；和捕获聚合的三维基质中的探针。在一些实施方式中，该方法还包括检测探针。在一些实施方式中，该方法还包括经由探针对靶序列进行测序。在一些实施方式中，所述使探针流入包括将与待通过探针检测的生物分子偶联的探针流入。在一些实施方式中，所述捕获所述探针包括经由接合部分捕获所述探针。

在另一个方面，本公开提供了用于鉴定一种或多种生物分子的方法。该方法包括：提供容器，所述容器包括所述一种或多种生物分子以及聚合的三维基质，所述聚合的三维基质包含(i)含有骨架的三维聚合物和(ii)与三维聚合物的骨架偶联的接合部分，其中接合部分被设置成保留三维聚合物内一种或多种生物分子的绝对或相对空间关系，并且其中所述三维聚合物不包含用于鉴定所述一种或多种生物分子的探针；和引导所述探针通过所述聚合的三维基质。

在一些实施方式中，所述一种或多种生物分子包含于细胞或其衍生物。在一些实施方式中，所述一种或多种生物分子包含于源自所述细胞的细胞基质。在一些实施方式中，该方法还包括捕获所述聚合的三维基质内的所述探针。在一些实施方式中，捕获所述探针包括经由所述接合部分捕获所述探针。在一些实施方式中，所述探针与所述一种或多种生物分子偶联。在一些实施方式中，该方法还包括检测所述一种或多种生物分子。在一些实施方式中，该方法还包括对所述一种或多种生物分子进行测序。在一些实施方式中，骨架是聚(乙烯乙二醇)骨架。在一些实施方式中，接合部分以瓶刷拓扑结构与骨架偶联。在一些实施方式中，接合部分包括反应性基团。在一些实施方式中，接合部分包括胺、硫醇、叠氮、炔烃或点击反应性基团。在一些实施方式中，接合部分包括可聚合基团。

在另一方面，本公开提供了检测生物样品的多种生物分子的方法，其包括：提供所述生物样品，所述生物样品包含至少2种不同类型的多种生物分子；原位修饰所述多个生物分子以包含接合部分；将所述接合部分与三维聚合物基质原位连接，其中所述接合部分被设置成保留所述生物样品内所述多个生物分子的绝对或相对空间关系；和原位检测所述多个分子的至少一个子集。

在一些实施方式中，对所述生物分子进行光学检测。在一些实施方式中，对所述生物分子进行荧光检测。在一些实施方式中，所述生物样品是细胞或其衍生物。在一些实施方式中，所述生物样品是源自所述细胞的细胞基质。在一些实施方式中，生物分子包含脱氧核糖核酸(DNA)、蛋白质和小分子。在一些实施方式中，生物分子包含蛋白质，并且所述检测包括对所述蛋白质进行测序。在一些实施方式中，对所述蛋白质进行测序包括：酶促切割所述蛋白质的N-末端残基，并且将携带可检测标记物的亲和力结合物(binder)与所述蛋白质原位结合。在一些实施方式中，所述亲和力结合物是N-末端氨基酸结合蛋白。

在一些实施方式中，所述可检测标记物被设置成经由循环杂交链反应(HCR)或DNA纳米级测绘成像点积累(DNA points accumulation for imaging in nanoscaletopography)(PAINT)提供信号放大。在一些实施方式中，所述至少两种不同类型的生物分子包括核糖核酸分子(RNA)，脱氧核糖核酸分子(DNA)、蛋白质和小分子。在一些实施方式中，该方法还包括检测不同类别的生物分子之间的分子相互作用。在一些实施方式中，检测不同类别的生物分子于彼此附近的存在提供分子相互作用的信号。在一些实施方式中，该方法还包括测量两种或更多种不同类别的生物分子之间的空间距离。在一些实施方式中，所述检测包括经由第二类生物分子的表达检测第一类生物分子的存在。在一些实施方式中，第一类生物分子包括小分子。在一些实施方式中，所述第二类生物分子是核酸。在一些实施方式中，核酸是核糖核酸(RNA)，其中，所述RNA的转录本由小分子通过转录抑制或活化调节。在一些实施方式中，核酸的丰度或存在指示小分子的丰度或存在。

在一些实施方式中，所述检测所述一种或多种生物分子使用荧光原位测序(FISSEQ)完成。在一些实施方式中，接合部分包括反应性基团。在一些实施方式中，接合部分包括胺、硫醇、叠氮、炔烃或点击反应性基团。在一些实施方式中，接合部分包括可聚合基团。

在另一方面，本公开提供了检测生物样品的多个生物分子的方法。该方法包括：提供包含多种生物分子的所述生物样品，其中多种生物分子包含第一生物分子，所述第一生物分子指示所述生物样品的第二生物分子存在或不存在；原位修饰所述第一生物分子以包含接合部分；原位连接所述接合部分与三维聚合物基质，其中所述接合部分被设置成保留所述生物样品内所述第一生物分子的绝对或相对空间关系；检测所述第一生物分子；和在检测所述第一生物分子后鉴定所述第二生物分子的所述存在或不存在。

在一些实施方式中，该方法还包括原位修饰所述第二生物分子以包含另外的接合部分，并且原位连接所述另外的接合部分与所述三维聚合物基质，其中所述另外的接合部分被设置成保留所述生物样品内所述第二生物分子的绝对或相对空间关系。在一些实施方式中，第一类生物分子包括小分子。在一些实施方式中，所述小分子是代谢物。在一些实施方式中，核酸是核糖核酸(RNA)，其中，所述RNA的转录本由小分子通过转录抑制或活化调节。在一些实施方式中，核酸的丰度或存在指示小分子的丰度或存在。

在另一方面，本公开提供了原位检测单个反应容器中两种或更多种类别的生物分子的方法。该方法包括：提供多种生物分子，所述多种生物分子包含来自所述单个反应容器中生物样品的所述两种或更多种类别的生物分子的生物分子；原位形成含所述多种生物分子的聚合物基质，其中所述聚合物基质保留所述生物样品中所述多种生物分子的绝对或相对空间关系；和检测所述多种生物分子的至少一个子集。

在一些实施方式中，生物分子经修饰以包含针对各生物分子的接合部分。在一些实施方式中，接合部分能够连接聚合物基质。在一些实施方式中，该方法还包括提供包含接合部分的引物或探针，其中接合部分能够连接聚合物基质。在一些实施方式中，生物分子包括两种或更多种基因组DNA分子或其片段分子，并且其中接合部分被进一步用于保留DNA分子的绝对或相对空间关系。在一些实施方式中，用聚合物基质形成基因组DNA FISSEQ文库。在一些实施方式中，生物分子包括两种或更多种蛋白质物质分子或其片段分子，并且其中各蛋白质分子包含接合部分，所述接合部分被进一步用于保留DNA分子的绝对或相对空间关系。在一些实施方式中，该方法还包括将DNA条码与聚合物基质接合或将DNA条码纳入原位形成的聚合物基质。在一些实施方式中，生物分子包括小分子。在一些实施方式中，各小分子包含接合部分，其被进一步用于保留小分子和代谢物的绝对或相对空间关系。在一些实施方式中，将两个或更多个分子探针用于原位检测分子相互作用，其中两个或更多个分子探针各自包含DNA条码序列。在一些实施方式中，所述方法还包括细胞学和/或组织学染色。在一些实施方式中，可以使聚合物基质扩张，用于全组学FISSEQ的超分辨率检测。在一些实施方式中，所述检测还包括利用计算分析。

在一些实施方式中，本文所述两种或更多种类别的生物分子包括RNA，DNA、蛋白质、脂质和小分子。

通过参考纳入

本说明书中提到的所有发表物、专利和专利申请通过引用纳入本文，就好像将各篇单独的发表物、专利或专利申请专门和单独地通过引用纳入本文那样。

附图说明

所附权利要求书中具体说明了本发明的新特征。可参考以下详述更好地理解本发明的特征和优点，这些详述列出利用本发明原理的说明性实施方式和附图：

图1A-1C描述了根据实施方式的直接单个蛋白质测序的示意图。

图2描述了根据实施方式由原位单细胞“组学(omic)”数据共分析空间信息的目标。

图3显示了经过编程或以其他方式设置成执行本文所提供方法的计算机控制系统。

发明详述

概述

当前公开提供了涉及处理样品的系统和方法，从而使感兴趣的生物分子固定于三维基质中。本文所用三维基质可以指水凝胶或凝胶。可以使用各种刺激来聚合和/或扩张三维基质，如电磁刺激、电化学刺激或热刺激。在一些实施方式中，可以用外部刺激来扩张或缩小/收缩三维基质，如电磁刺激、电化学刺激或热刺激。在一些示例中，三维基质可以经聚合，然后可以将包含标记物的探针流入基质用于检测感兴趣的生物分子。样品可以用于和/或再次用于在单个试验中原位检测不同类别的生物分子。在一些示例中，样品(相同样品)可以经处理或测试多次，用于检测不同类型或类别的生物分子。例如，本公开的系统和方法中的一个优势是使用单一样品进行不同的生物分子检测。在一些实施方式中，通过试剂(例如，水凝胶形成单体)处理样品，从而可以原位形成水凝胶。在一些实施方式中，感兴趣的生物分子可以是核酸、蛋白质和/或小分子。在各种情况中，感兴趣的生物分子可以经由接合部分连接水凝胶。在各种实施方式中，提供了用于制备水凝胶的试剂。在各种实施方式中，提供了将感兴趣的不同生物分子与水凝胶接合的方法。在一些示例中，容器可以作为本文所述系统的部分提供。容器可以是设置成包含生物样品、生物分子、膨胀剂、接合部分、试剂等的任何容器在一些示例中，容器可以设置成接受来自刺激源的所述刺激。

RNA和DNA FISSEQ

荧光原位测序(FISSEQ)可以指一种在基质内原位检测或测序三维排列的靶标的方法，其中检测信号是荧光信号。FISSEQ可以采用的测序方法可以是合成测序、连接测序或杂交测序。FISSEQ中检测或测序的靶标可以是感兴趣的生物分子或与感兴趣的生物分子结合的探针。

本公开可以提供用于RNA和/或DNA荧光原位测序(FISSEQ)的方法或系统。FISSEQ所利用的任何组件可以是本文所述系统的一部分。例如，本公开可以提供包含接合部分的引物。接合部分可以用于FISSEQ。在一些示例中，接合部分可以用于将感兴趣的生物分子与水凝胶连接。任选地，接合部分可以包括可聚合基团。在一些实施方式中，接合部分包括自由基可聚合基团。在一些实施方式中，接合部分包括胺、硫醇、叠氮、炔烃或点击反应性基团。在各种实施方式，接合部分随后可以连接水凝胶。任选地，一个或多个接合部分可以原位连接水凝胶。在各种实施方式中，原位形成水凝胶，并纳入接合部分。在各种实施方式中，接合部分进一步被用于保留样品内基因组DNA的两个或更多个分子或片段之间的绝对或相对空间关系。根据本公开的方法可以包括原位形成水凝胶，纳入包含接合部分的引物。根据本公开的方法可以还包括将引物与靶核酸退火的步骤。在一些情况中，根据公开的方法还包括由引物的逆转录步骤。在一些其他情况中，根据公开的方法还包括由引物的聚合酶链式反应步骤。根据公开的方法包括使用引物的3'或5'末端或使用两者的连接步骤。

基因组FISSEQ

下一代测序技术可以用于对生物体间变异的各种来源进行再测序，例如，用于个性化医疗，以及用于其他基因组测序应用，如推断系统发生，因为它们不需要关于DNA序列空间组织的信息。然而，基因组FISSEQ可以用于获得生物样品内许多非常有价值的信息。

例如，可能不是生物体内每个体细胞具有相同的基因组序列这样的情况。可以在体细胞组织中观测到广泛的拷贝数变异(CNV)。参见例如，O’Huallachain,Maeve,等.“体细胞人组织中广泛的遗传变异(Extensive genetic variation in somatic humantissues).”Proceedings of the National Academy of Sciences 109.44(2012):18018-18023。超过30种孟德尔疾病(Mendelian disease)可以与体细胞镶嵌性相关联。参见例如，Fabio Candotti."原发性免疫缺陷中的体细胞镶嵌性(Somatic mosaicism in primaryimmune deficiencies)."Current opinion in allergy and clinical immunology 8.6(2008):510-514。体细胞突变可以是自身免疫疾病的主要引发剂。参见例如，Ross,KennethAndrew."自身免疫疾病中的连贯性体细胞突变(Coherent somatic mutation inautoimmune disease)."PloS one 9.7(2014):e101093。在一些示例中，体细胞进化(somatic evolution)可以使癌细胞的基因组多样化，并且还在生物体内或肿瘤内产生空间或时间异质性。参见例如，Schmitt,Michael W.,Marc J.Prindle和Lawrence A.Loeb."癌症中遗传异质性的启示(Implications of genetic heterogeneity in cancer)."Annals of the New York Academy of Sciences 1267.1(2012):110-116。癌细胞之间的体细胞变异(Somatic variation)可以使极少的细胞携带药物抗性基因型，从而引起治疗后的复发。参见例如，Schmitt,Michael W.,Lawrence A.Loeb和Jesse J.Salk."亚克隆抗性突变对靶向的癌症治疗的影响(The influence of subclonal resistance mutationson targeted cancer therapy)."Nature reviews Clinical oncology 13.6(2016):335-347。

甚至在正常的免疫细胞中，V(D)J重组可以在免疫球蛋白(Ig)和T细胞受体(TCR)中产生能够实现适应性免疫系统的多样性。参见例如，Market,Eleonora和F.NinaPapavasiliou."适用性免疫系统的V(D)J重组和进化(V(D)J recombination and theevolution of the adaptive immune system)."PLoS Biol 1.1(2003):e16。在微生物群诸如生物膜内，可以在空间上组织多种物种的不同基因组序列。参见例如，Cutler,NickA.,等."石生生物膜的空间组织和微生物群落结构(The spatial organization andmicrobial community structure of an epilithic biofilm)."FEMS microbiologyecology 91.3(2015):fiu027。此外，每个足够大的生物体可以由许多生态系统——微生物组(如肠道和皮肤)组成，其可以是由来自生物各界的各种生物体的基因组构成的群体，无论是共生地还是病原性地。虽然DNA下一代测序(NGS)的某些实施方式具有单细胞分辨率(参见例如，Zong,Chenghang,等"单个人细胞的单核苷酸和拷贝数变异的基因组范围检测(Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of asingle human cell)."Science 338.6114(2012):1622-1626；Burton,Joshua N.,等"以基于Hi-C的接触概率图的宏基因组组装的物种水平的去卷积(Species-LevelDeconvolution of Metagenome Assemblies with Hi-C–Based Contact ProbabilityMaps)."G3:Genes|Genomes|Genetics 4.7(2014):1339-1346)，但是定位序列数据的能力仍然有限。

在个体细胞中，基因组被空间组织成核小体(参见例如，Lee,William,等"酵母中核小体占据的高分辨率图谱(A high-resolution atlas of nucleosome occupancy inyeast.)"Nature genetics 39.10(2007):1235-1244)，通过反式作用序列如增强子环(Heidari,Nastaran,等"人基因组中调节性相互作用的基因组范围图(Genome-wide mapof regulatory interactions in the human genome.)"Genome research 24.12(2014):1905-1917；Rao,Suhas SP,等"千碱基分辨率的人基因组的3D图揭示染色质环化的原理(A3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles ofchromatin looping.)"Cell 159.7(2014):1665-1680)，成为异染色质、常染色质或越来越多数量的其他染色质状态(参见例如，Baker,Monya."理解染色质状态(Making sense ofchromatin states.)"Nature methods 8.9(2011):717-722)，成为拓扑相关的结构域(topologically-associated domain)(TAD)(Dixon,Jesse R.,等"通过染色质相互作用分析鉴定哺乳动物基因组中的拓扑结构域(Topological domains in mammalian genomesidentified by analysis of chromatin interactions.)"Nature 485.7398(2012):376-380；Nora,Elphège P.,等"空间分割X-失活中心的调节性相图(Spatial partitioning ofthe regulatory landscape of the X-inactivation centre.)"Nature 485.7398(2012):381-385；Sexton,Tom,等"果蝇基因组的三维折叠和功能性组织结构原则(Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophilagenome)."Cell 148.3(2012):458-472)，并且相对于多种其他生物分子，如蛋白质(Jothi,Raja,等"来自ChIP-Seq数据的体内蛋白质DNA接合位点的基因组范围鉴定(Genome-wideidentification of in vivo protein–DNA binding sites from ChIP-Seq data)."Nucleic acids research 36.16(2008):5221-5231)和RNA(Chu,Ci,等"长非编码RNA占据的基因组图揭示RNA－染色质相互作用的原理(Genomic maps of long noncoding RNAoccupancy reveal principles of RNA-chromatin interactions)."Molecular cell44.4(2011):667-678)。使用NGS检测染色质构象的方法测量顺式和反式基因座的0.2～1kb分辨率的相对接触频率，这反映了邻近关系。参见例如，Dekker,Job,等"捕获染色体构象(Capturing chromosome conformation.)"science 295.5558(2002):1306-1311；Lieberman-Aiden,Erez,等"远程相互作用的综合制图揭示了人基因组的折叠原理(Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principlesof the human genome.)"science 326.5950(2009):289-293.(对于染色体构象捕获技术的综述(参见Sati,Satish和Giacomo Cavalli."染色体构象捕获技术和其在影响基因组功能中的影响(Chromosome conformation capture technologies and their impact inunderstanding genome function)."Chromosoma(2016):1-12)。然而，这些方法仅可以测量基因座序列的相对组织结构，而非绝对组织结构，并且其还涉及活性状态(参见例如，Schneider,Robert和Rudolf Grosschedl."核结构、基因组组织结构和基因表达的动力学和相互影响(Dynamics and interplay of nuclear architecture,genomeorganization,and gene expression.)"Genes&development 21.23(2007):3027-3043)，而非基因座的形状和大小(参见例如，Beliveau,Brian J.,等"染色体的单分子超分辨率成像以及使用寡涂针FISH探针的原位单体型可视化(Single-molecule super-resolutionimaging of chromosomes and in situ haplotype visualization using OligopaintFISH probes)."Nature communications 6(2015))。染色质构象捕获方法通常具有交叉的敏感性，需要数百万的输入细胞以捕获数百万的基因座-基因座共定位事件，即仅检测各细胞较少的事件，从而产生群平均构象。输入量可以缩减至单细胞，虽然以显著降低灵敏度为代价。参见例如，Nagano,Takashi,等."在单细胞中同时发生的染色质相互作用的基因组范围检测的单细胞Hi-C(Single-cell Hi-C for genome-wide detection of chromatininteractions that occur simultaneously in a single cell)."Nature protocols10.12(2015):1986-2003。

原位荧光杂交(FISH)的高分辨率成像可以用于检测序列水平的变异(参见例如，Kallioniemi,Anne,等"通过荧光原位杂交和比较基因组杂交的基因拷贝数量分析(GeneCopy Number Analysis by Fluorescence in Situ Hybridization and ComparativeGenomic Hybridization.)"Methods 9.1(1996):113-121)以及基因组基因座的绝对或相对空间组织结构(参见例如，Beliveau,Brian J.,等"染色体的单分子超分辨率成像以及使用寡涂针FISH探针的原位单体型可视化(Single-molecule super-resolution imagingof chromosomes and in situ haplotype visualization using Oligopaint FISHprobes.)"Nature communications 6(2015))。.FISSEQ可以能够直接测量单细胞内基因组序列的空间组织。因此，基因组的直接原位测序可以以精细分辨率(甚至小到数百或数十个碱基)揭示序列间的空间关系，并且对与试验中细胞数量成比例的稀有定位事件敏感。此外，当与来自原位RNA测序或蛋白质检测的信息组合时，可以揭露表观遗传状态中的单细胞异质性，并且有可能理解基因表达调控的潜在机制。

表观遗传

抗体或其他标志物可以应用于表观遗传修饰以及基因组检测，如通过使用DNA偶联的抗体以及寡涂针(OligoPaint)，寡FISSEQ(OligoFISSEQ)，通过环化方法的捕获，或直接原位基因组测序。可获得抗体并且在基因调节、转录、复制和/或DNA损害和修复中起突出作用的因子包括全局作用因子，如粘连蛋白，集缩蛋白，RNAPII，CTCF，组蛋白变体(例如，H2A.Z，H2A.X，H3K4me3，H3K27ac，H3K27me3，H3K9me2/3)，PRC1，PRC2，SIN3，NuRD和共-REST染色质复合物的组分，以及涉及多能性建立的因子，如Oct4，Sox2和Nanog。基因组FISSEQ能够显示同源染色体的区别，我们可以研究X-失活、印记(imprinting)和单等位基因表达。重要地是，虽然其他同源敏感方法限于基因组或RNA分子的重复部分，并且因此不适合单拷贝或沉默的区域，本文所提供的方法可以靶向单核苷酸多态性(SNP)，从而实现基因组范围的发现。

基因组FISSEQ可以作为用于同时测量单细胞中基因组的3D组织、基因型和表观遗传状态的强大策略。就RNA FISSEQ而言，基因组FISSEQ可以固有地受限于可以在核内测量的物理分散(非重叠)和可分辨荧光信号的数量的空间约束。这可以限制可以在任何一个时间检测的基因座的数量，以及空间共定位的序列(例如，增强子环)的检测。然而，许多应用可以在该空间约束内运行，诸如使用大量细胞的整体基因组再测序(ensemble genomicresequencing)或靶向的基因组FISSEQ。例如，对应于大约150个碱基对序列的各核小体是大约10×10×20纳米的大小，其可以通过使用仅为8～10X的线性膨胀因子的ExM或超分辨率显微技术领域普通技术人员已知的其他技术分辨。

总之，就RNA FISSEQ而言，核酸对文库构建生物化学的可及性可能实际上将其他信息编码到文库中。以此方式，FISSEQ不仅可以提供关于基因组序列变异和空间组织结构的信息，还可以提供对于表观遗传状态的理解。表观遗传特征如染色质状态可以揭示基因组调节的基质并且可以用于区分细胞表型状态(“细胞类型”)。基因组FISSEQ可以与蛋白质和其他生物分子的RNA FISSEQ和FISSEQ检测组合，这可能使相关分析能够从根本上揭示基因组调控的机制。

为了进行基因组FISSEQ，基因组DNA可以与水凝胶基质连接并且经原位处理用于FISSEQ检测。可以使用水凝胶处理的生物样品确定各种基因组信息。在各种实施方式横纵，基因组DNA可以通过接合部分(例如，本文所述内容)连接水凝胶基质。接合部分可以在水凝胶上通过偶联化学与反应性基团反应。在一些实施方式中，接合部分可以通过偶联化学与感兴趣的靶标连接。在一些实施方式中，接合部分可以直接连接天然核酸分子上的官能团(或反应性基团)。在一些实施方式中，接合部分可以通过中间体化合物或基团与靶标间接连接。本文所述偶联策略并不限于核酸靶标，并且还可以用于蛋白质或小分子靶标。

本文所用术语“反应性基团”表示水凝胶单体或聚合物上能够与不同化合物(即，感兴趣的底物或靶标)上的官能团(或其他反应性基团或接合部分)发生化学反应以形成共价连接或离子连接的任何部分。本文所用反应性基团和官能团可以互换使用。本文所用接合部分可以包含反应基团。合适的反应性基团的示例包括亲电体或亲核体，其可以通过分别与感兴趣的底物上相应的亲核体或亲电体反应而形成共价连接。例如，合适的亲电性反应性基团的非限制性示例可以包括酯(包括活化的酯，例如，琥珀酰亚胺酯)，酰胺，丙烯酰胺，酰基叠氮化物，酰卤，酰基腈，醛，酮，烷基卤化物，烷基磺酸盐，酐，芳基卤化物，氮杂环丙烷，硼烷盐(boranate)，碳二亚胺，重氮烷，环氧化物，卤代乙酰胺，卤代铂酸盐，卤代三嗪，亚氨基酯，异氰酸酯，异硫氰酸酯，马来酰亚胺，亚磷酰胺，甲硅烷基卤化物，磺酸酯，磺酰卤等。例如，合适的亲核性反应性基团的非限制性示例可以包括胺，苯胺，硫醇，醇，酚，肼，羟胺，羧酸，乙二醇，杂环等。

本公开提供了原位修饰基因组DNA以包含接合部分的方法。在一些实施方式中，接合部分包括可聚合基团。在一些实施方式中，接合部分包括自由基可聚合基团。在一些实施方式中，接合部分包括胺、硫醇、叠氮、炔烃或点击反应性基团。在一些实施方式，接合部分随后原位连接水凝胶。在各种实施方式中，原位形成水凝胶，并纳入接合部分。在一些实施方式中，接合部分进一步被用于保留样品内2个或更多个基因组DNA的片段或分子之间的绝对或相对空间关系。

本公开还包括进一步原位修饰基因组DNA的方法，其包括下述步骤：将DNA片段化，使双链体DNA变形以形成单链DNA链，修饰DNA的3'和/或5'末端，添加衔接子序列，将基因组DNA环化并扩增基因组DNA。在一些实施方式中，扩增可以通过聚合酶链式反应(PCR)或滚环扩增(RCA)。

本公开提供了使用核酸测序进一步原位检测所有或部分基因组DNA序列的方法。示例性的测序方法可以包括杂交测序和通过使用聚合酶或连接酶合成互补链来测序(合成测序、连接测序)。在一些实施方式中，在测序期间生成荧光信号。

本文公开提供了原位基因组测序在检测突变，包括SNV，缺失，插入，重排，倒置，复制，染色体融合和/或其他基因组变异中的用途，用于在人疾病中诊断、预后或治疗性指导。示例性的疾病包括但不限于，癌症、免疫和自身免疫疾病，和孟德尔疾病。本文所提供的方法还可以用于检测与获得性或先天免疫相关的序列，包括V(D)J重组的产物，免疫球蛋白，和变异细胞受体，例如，T细胞受体(TCR)。在一些实施方式中，本文所提供的方法可以用于检测人患者内的非人遗传序列，包括：微生物组内的物质，如皮肤，肠道，口腔和阴道微生物组，以及病原体，包括细菌，真菌和病毒。在一些实施方式中，本文所提供的方法可以用于确定生物膜的种类。在一些实施方式中，本文所提供的方法可以用于确定DNA元件，包括转录的遗传基因座，蛋白质编码区域，非蛋白质编码区域，增强子，启动子，调节区域，拓扑相关结构域(TAD)，着丝粒，染色体终端和复制起点。在一些实施方式中，本文所提供的方法可以用于检测2个或更多个DNA元件之间的空间关系并且检测DNA元件的性质，包括大小，形状和体积。

本公开提供了用于形成基因座DNA FISSEQ文库的试剂盒或系统，其包含，包含DNA结合部分和接合部分的试剂，其中接合部分可以与水凝胶连接；用于原位形成水凝胶的试剂；和/或DNA寡核苷酸，该DNA寡核苷酸包含用作进一步扩增的引发位点的衔接子序列。

本公开提供了用于DNA荧光原位测序的试剂盒或系统，其包含，超过一种与荧光部分偶联的寡核苷酸物质；DNA连接酶；适合用于FISSEQ试验的成像缓冲液；和/或适合用于测序的纳入(incorporation)缓冲液。

本公开提供了用于DNA荧光原位测序的试剂盒或系统，其包含，超过一种与荧光部分偶联的寡核苷酸物质；DNA聚合酶；适合用于FISSEQ试验的成像缓冲液；和/或适合用于测序的纳入缓冲液。

本公开提供了用于DNA荧光原位测序的试剂盒或系统，其包含，超过一种与荧光部分偶联的亚稳态自组装DNA发夹物质，例如，杂交链反应单体；超过一种DNA寡核苷酸物质，其包含与基因组序列互补的序列；适合用于FISSEQ试验的成像缓冲液；适合用于核酸杂交的杂交缓冲液；和/或HCR扩增缓冲液。

蛋白质FISSEQ

传统蛋白质检测试验的限制

与核酸靶标类似，蛋白质可以原位检测。各种方法可以用于靶向蛋白质。例如，原位蛋白质检测可以使用适配体和免疫蛋白的亲和力结合性质。

免疫荧光技术利用了抗体(Ab)、免疫球蛋白(Ig)亚型或其片段的特异性结合靶抗原的能力。用于原位标记的抗体通常是IgG或IgY同种型，其由4个多肽链组成。抗体的片段(参见例如，Holliger,Philipp和Peter J.Hudson."工程改造的抗体片段和单结构的出现(Engineered antibody fragments and the rise of single domains.)"Naturebiotechnology 23.9(2005):1126-1136)，诸如“抗原结合片段”(Fab)，或甚至单链，被称为纳米抗体(参见例如，Gibbs,W.Wayt."纳米抗体(Nanobodies.)"Scientific American293.2(2005):78-83)，也可以用于结合蛋白质靶标。

通常通过用荧光染料直接标记抗体或通过使用由荧光二抗二级标记经结合的抗体来检测蛋白质，所述荧光二抗识别一抗的恒定区。二级标记的使用还可以是信号放大的形式，因为许多二抗可以结合一抗的不同结构域，并且二抗可以赋予许多荧光部分。然而，二抗的使用可能限制对多个正交一抗-二抗对的多重性(multiplexity)，例如，使用来自不同物种的Ig蛋白质，或不同的Ig同种型或亚型。参见例如，Tidman,N.,等“利用以单克隆抗体的双重染技术描绘人胸腺细胞分化途径(Delineation of human thymocytedifferentiation pathways utilizing double-staining techniques with monoclonalantibodies)."Clinical and experimental immunology 45.3(1981):457。抗体染色还可以连续地进行，虽然这仅随循环数量使多重性线性缩放。参见例如，Lan,Hui Y.,等"一种新颖、简单、可靠、灵敏的多重免疫酶染色方法：使用微波炉加热阻断抗体交叉反应并检索抗原(A novel,simple,reliable,and sensitive method for multiple immunoenzymestaining:use of microwave oven heating to block antibody crossreactivity andretrieve antigens.)"Journal of Histochemistry&Cytochemistry 43.1(1995):97-102；Gerdes,Michael J.,等"高度多重单细胞分析福尔马林固定的石蜡包埋的癌组织(Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed,paraffin-embeddedcancer tissue.)"Proceedings of the National Academy of Sciences 110.29(2013):11982-11987。抗体可以通过连续切片以多重化，其中免疫荧光检测可以在单个切片上进行，然后将其计算组合。参见例如，Potts,Steven,等"用于连续组织切片上特征分析的方法(Methods for feature analysis on consecutive tissue sections.)"，美国专利号8,787,651，2014年7月22日。

使用一抗或二抗标记，原位蛋白质检测可以是多重的程度到有限的程度。使用亮场显微镜，发光沉积可以提供许多视觉上不同的发光体/酶对(van der Loos,Chris M."用于视觉评估和光谱成像多重免疫组织化学染色中的发光体：丰富多彩的未来(Chromogensin multiple immunohistochemical staining used for visual assessment andspectral imaging:the colorful future.)"Journal of Histotechnology 33.1(2010):31-40)。也可以使用“比色”条码化。参见例如，Stack,Edward C.,等"多重免疫组织化学、成像和定量：藉由评估酪酰胺信号放大、多光谱成像和多重分析的综述(Multiplexedimmunohistochemistry,imaging,and quantitation:a review,with an assessment ofTyramide signal amplification,multispectral imaging and multiplex analysis.)"Methods 70.1(2014):46-58。这些技术都受限于靶蛋白的共定位，其将用于鉴定所需的不同颜色进行合并。使用量子点的多光谱成像可以用于同时对7种荧光信成像(参见例如，Fountaine,Thomas J.,等"使用半导体量子点对扁桃体和淋巴组织中临床相关细胞靶标的多光谱成像(Multispectral imaging of clinically relevant cellular targets intonsil and lymphoid tissue using semiconductor quantum dots.)"ModernPathology 19.9(2006):1181-1191)。

即使使用可以避免二抗特异性问题的一抗标记，将许多抗体组合在单一试验中可能是充满挑战的。抗体通常需要特殊的样品处理，被称之为抗原修复(AR)。AR的通常形式可以包括高或低pH、高温或酶促处理(参见例如，Taylor,Clive R."定量原位蛋白质组学；用于光显微水平上免疫组织化学定量的途径(Quantitative in situ proteomics；aproposed pathway for quantification of immunohistochemistry at the light-microscopic level.)"Cell and tissue research 360.1(2015):109-120)。不幸地是，这些处理难以组合或相互排斥，显著地限制可以同时使用的抗体组的组成。许多AR处理对于感兴趣的其他生物分子可能是有害的，如RNA和DNA。例如，可以藉由热量和置于酸性条件下来增加DNA的脱嘌呤速率。使用分层的膜可以通过大小将来自单个组织切片的蛋白质分开，从而能够在不同条件下免疫荧光检测不同大小的蛋白质并再次使用荧光颜色或二抗。参见例如，Park,Soon Sik,等"多重分层的免疫组织化学预测HER2阳性乳腺癌患者对曲妥单抗疗法的响应(Multiplex layered immunohistochemistry to predict response ofHER2-positive breast cancer patients to trastuzumab therapy.)"ASCO AnnualMeeting Proceedings.第30卷.第27号_增刊2012。虽然该方法可以扩大免疫荧光检测的多重性，但是由于重新分配三维以通过大小分离蛋白质，其仅可以捕获样品内蛋白质的2D分布。

除了免疫蛋白，原位蛋白质检测可以通过适配体进行，所述适配体是可以结合特异性靶标的寡核苷酸或肽。参见例如，Ellington,Andrew D.和Jack W.Szostak."结合特异性配体的RNA分子的体外选择(In vitro selection of RNA molecules that bindspecific ligands.)"nature 346.6287(1990):818-822；Tuerk,Craig和Larry Gold."通过指数富集系统进化配体：RNA配体至噬菌体T4 DNA聚合酶(Systematic evolution ofligands by exponential enrichment:RNA ligands to bacteriophage T4 DNApolymerase.)"Science 249.4968(1990):505-510。虽然存在一些成功的使用，但是适配体并不可以广泛地用于原位蛋白质确定，这是因为抗体试剂较宽的可用性以及抗体结合更有益的性质。适配体与蛋白质的结合通常远低于抗体与蛋白质的结合，在许多情况中，抗体可以比适配体高大约10～100倍结合，并且在各种不同条件下一致地起作用。抗体比适配体更好地起作用可能是因为蛋白质具有能够用于改善亲和力的更大的化学空间，如半胱氨酸的硫原子，疏水相互作用和带正电荷的基团。然而，在一些情况中，适配体在靶向蛋白质中仍然是有价值的。使用化学修饰的核苷酸的最新进展和使用动力学挑战来选择缓慢解离速率可以产生具有匹配抗体的亲和力的适配体(nM～pM)。参见例如，Gold,Larry,等"用于生物标志物发现的基于适配体多重蛋白质组学技术(Aptamer-based multiplexed proteomictechnology for biomarker discovery.)"PloS one 5.12(2010):e15004。

使用免疫蛋白或适配体，用于蛋白质原位标记的方案通常可能需要广泛的验证和微调以实现准确的结果。这些方案的复杂性可能来自生物分子和大分子组分的较大的多样性和其在样品固定和处理过程中的修饰。此外，由于有限的信号扩大和高背景，免疫蛋白或适配体两者都不可以用于检测单分子。

最终，蛋白质亲和力结合试剂的最后一个类别包括非免疫性胎和蛋白质，它们对某些蛋白质具有天然的亲和力。一个实例是麦胚凝集素(一种38kDa凝集素)或碳水化合物结合蛋白质，其可以用于标记细胞膜和其他组织特征，如软骨。另一实例是鬼笔环肽，一种双环七胎毒素，其结合F-肌动蛋白并且被用于标记细胞骨架。本文所述实例并非限制性的。

用于FISSEQ的亲和力结合试剂的文库对文库(Library-on-library)选择

在一些实施方式中，本文提供了使用文库对文库选择待用于FISSEQ的亲和力结合剂的方法。在一些实施方式中，文库对文库选择策略可以用于单分子相互作用测序(SMI-seq)。该策略可以用于为多个蛋白质靶标选择可以在相同缓冲液条件下起作用的多个结合剂。在一些实施方式中，在本文所提供的方法中选择的结合剂可以相同的条件起作用并且彼此之间不相互反应。在一些实施方式中，结合剂彼此之间可以具有降低的反应性。本文所提供的方法使用选择的结合剂以使用FISSEQ检测三维固定的样品中的蛋白质。

尽管这些亲和力结合试剂有局限性，有方法用于“文库筛选”结合物以同时测量分子结合亲和力和特异性。例如，单分子相互作用测序(SMI-seq)使用丙烯酰胺中的FISSEQ以检测蛋白质-核糖体-信使-RNA-互补-DNA(PRMC)复合物的文库与一组DNA偶联的蛋白质之间的单分子相互作用。参见例如，Gu,Liangcai,等"条码化DNA蛋白质的多重单分子相互作用概况(Multiplex single-molecule interaction profiling of DNA-barcodedproteins.)"Nature 515.7528(2014):554-557。SMI-seq可以从scFv肽文库中筛选和进化亲和结合物。以相同的方式，可以使用被称为SELEX的适配体体外选择来筛选和进化适配体。参见例如，Blind,Michael和Michael Blank."适配体选择技术和最新进展(Aptamerselection technology and recent advances.)"Molecular Therapy—Nucleic Acids4.1(2015):e223。这两种方法都能够从具有多样化的亲和性结合物的大文库(例如，1010)中进行多轮选择(例如，通过易错PCR)，然后通过DNA测序以确定结合频率和特异性，以表征针对靶标分析物的结合物。

然而，为了能够发现针对大量靶分子的亲和性结合物，结合物文库需要针对靶标库进行筛选，这种技术称为“文库对文库(library-on-library)”。在一些情况下，SMI-seq可以使用DNA偶联以将靶蛋白条码化。在一些其他情况中，SMI-seq可以使用mRNA展示至在选择的两侧上的蛋白质–核糖体–信使-RNA–互补-DNA(PRMC)复合物，如用包含人ORFeome的靶标文库和scFv文库(ORFeome协作(Collaboration).“ORFeome协作：基因组级人PRF-克隆源(The ORFeome Collaboration:a genome-scale human ORF-clone resource).”Naturemethods 13.3(2016):191-192)。在使用mRNA展示的情况下，可以使用针对多样性(通过重链和轻链结构域的lox加扰)和稳健折叠(之前令人烦恼的失败模式)专门设计的噬菌体-scFv文库。在重组之前，该策略估计的多样性可以是约5e7(之后约2.5e14)。

同时选择具有已知结合强度和特异性的PRMC结合物文库可用于通过FISSEQ检测蛋白质。该方法可以避免交叉反应，并且保证整个库的相容的结合条件。因为靶肽被翻译，可以控制靶肽的状态以模拟或匹配FISSEQ样品中蛋白质的状态。例如，在FISSEQ期间，可以使用甲醛固定，然后在尿素或SDS中进行处理以使蛋白质变性。还可以使用相同的化学处理来制备条码化的ORFeome文库，以匹配生物样品的表位呈递。

在一些情况下，还可以将使用适配体靶向我们的蛋白质-核糖体-信使-RNA-互补-DNA(PRMC)的ORFeome靶标文库的SMI-seq用于适配体的高通量选择。可以使用我们的条码化的靶标文库开发新型SELEX技术。虽然这些方法可以解决与亲和力结合物文库的发现和相容性相关联的问题，但是它们可能无法解决与单分子检测相关的问题。基于两种策略可以进一步开发单分子检测。例如，一种策略可以是开发信号扩大方法，如RCA和循环HCR(CHCR)，用于检测单个粘合物，而另一种策略可以是开发超分辨率显微方法，如ExM，用于解决和定位的单个靶蛋白。

直接单蛋白测序

在一些实施方式中，本文提供的方法还包括鉴定蛋白质序列。在一些实施方式中，蛋白质序列可以通过Edman降解鉴定。

使用Edman降解反应的肽测序可以是通过特异性切割和鉴定N-末端残基的循环确定蛋白质有序氨基酸组成的方法。N-末端氨基可以在中碱性条件下与苯基异硫氰酸盐/酯(issothiocyanite)反应，形成环状苯基硫代氨基甲酰基衍生物。通过将条件转变为酸性，可以将该衍生物切割，萃取到有机溶剂中，稳定在苯基乙内酰脲(PTH)-氨基酸衍生物中，并使用色谱或电泳鉴定。该过程可以适用于原位单分子蛋白质测序。除了使用可能与DNA稳定性不相容的Edman降解反应，可以使用N-末端残基的酶促切割。参见例如，Borgo,Benjamin和James J.Havranek."计算机辅助设计用于利用底物协助的催化作用的Edman降解的催化剂(Computer-aided design of a catalyst for Edman degradation utilizingsubstrate-assisted catalysis.)"Protein Science 24.4(2015):571-579。不是使用色谱或电泳来检测切割的N-末端残基，而是可以使用亲和力结合物，如携带可检测标记物的N-末端氨基酸结合蛋白(NAAB)。对于单分子检测，理想的可检测标记物是提供信号放大的那些，如通过环状HCR(CHCR)或DNA PAINT。

DNA PAINT还可以使用超分辨率显微术，其可用于在拥挤的细胞环境中检测单个N末端。还可以使用其他策略避免来自多个蛋白质的衍射限制的测序信号的卷积。具有足够大扩张因子的ExM可以实现超出衍射限制的单个蛋白质的物理分离。与随机形式的超分辨率显微术和数字分区显微术类似，可以将测序反应限制为随机或靶向的蛋白质子集，如通过将蛋白质的一个子集共价连接到FISSEQ水凝胶中，或者通过蛋白质水解直到仅保留了原始蛋白质的一部分。

其他蛋白质指纹识别方法可以进行鉴定而无需确定蛋白质的有序氨基酸组成。例如，仅使用分别结合L/F/Y和R/K/H的Clps和/或UBR1，独特可鉴定的蛋白质的数量接近在确定仅25个残基后使用对所有20个氨基酸的鉴定所获得的数目(图1A-1C)。参见例如，Erbse,A.,等"ClpS是大肠杆菌中N端规则途径的重要组分(ClpS is an essential component ofthe N-end rule pathway in Escherichia coli.)"Nature 439.7077(2006):753-756；Varshavsky,Alexander."N端规则：功能、谜团、使用(The N-end rule:functions,mysteries,uses.)"Proceedings of the National Academy of Sciences 93.22(1996):12142-12149。可以研发对蛋白质鉴定更多的“比色”方法(即，使用信号的组合，而不是顺序排列)。示例性的比色方法可以选择性地水解氨基酸的某些对之间的肽键并对产生的末端数进行计数。

通过消除对核酸条码的需要，本公开内容提供了用于直接单蛋白质测序的文库对文库筛选方法。单蛋白的原位测序还能够直接在生物试样上选择亲和力结合物，完全避免了对合成靶标文库的需要。单独测量mRNA的丰度对蛋白质组的状态提供了有限的见解。完整生物试样内单一蛋白质的大量多重检测可以开启定量蛋白质组学的新时代。本文所提供的蛋白质FISSEQ还可以与RNA和DNA FISSEQ组合。

本公开提供了原位修饰蛋白质以包含接合部分的方法。在一些实施方式中，接合部分包括自由基可聚合基团。在一些实施方式中，接合部分包括可聚合基团。在一些实施方式中，接合部分包括胺、硫醇、叠氮、炔烃、点击反应性基团。在一些实施方式，接合部分随后原位连接水凝胶。在一些实施方式中，原位形成水凝胶，并纳入接合部分。在一些实施方式中，接合部分进一步被用于保留样品内2个或更多个蛋白质的片段或分子之间的绝对或相对空间关系。接合部分可以通过偶联化学与蛋白质靶标连接。在一些实施方式中，接合的部分与天然蛋白质连接，没有任何中间体化学物质或基团。在一些实施方式中，接头部分与天然蛋白质通过中间体化学物质或基团连接。

本公开提供了检测水凝胶内两种或更多种蛋白质物质的方法，包括将两种或更多种亲和力结合试剂结合，所述亲和力结合试剂各自包含赋予亲和力结合性的部分以及独特的DNA条码。在一些所述方法中，该方法还包括使用核酸测序检测DNA条码。示例性的测序方法包括杂交测序和通过使用聚合酶或连接酶合成互补链而进行的测序(例如，合成测序、连接测序)。在一些实施方式中，该方法包括对DNA条码进行测序，其中生成了荧光信号。

本公开提供了检测水凝胶内两种或更多种蛋白质物质的方法，包括将两种或更多种亲和力结合试剂结合，所述两种或更多种亲和力结合试剂各自包含独特的DNA条码以及含有可聚合基团或反应性基团的接合部分。在一些实施方式中，该方法还包括将DNA条码与水凝胶接合或或将DNA条码纳入原位形成的水凝胶中。在一些实施方式中，该方法还包括使用核酸测序原位检测DNA条码，如通过杂交或通过使用聚合酶或连接酶合成互补链(例如，合成测序，连接测序)。在一些实施方式中，该方法包括测序步骤，其中生成了荧光信号。

该公开提供了文库对文库选择亲和力结合试剂以产生用于FISSEQ的亲和力结合试剂的方法，其中亲和力结合物的文库包含两种或更多种结合物。在一些实施方式中，结合物是适配体。在一些实施方式中，结合物由核酸、核酸类似物、肽、多肽或蛋白质组成。在一些实施方式中，靶标文库包含两种或更多种靶分子，其包括核酸、多肽、脂质或小分子。在一些实施方式中，各文库内的各亲和力结合物和靶标包含其他核酸条码。

本公开提供了原位蛋白质测序的方法，其包括在水凝胶内固定蛋白质。在一些实施方式中，该方法还包括将蛋白质与N-末端或C-末端结合物接触。在一些实施方式中，该方法还包括检测与结合物相关联的荧光标记物。在一些实施方式中，该方法还包括将蛋白质与试剂接触以切割一个或多个N-末端或C-末端残基。

本公开提供了原位蛋白质FISSEQ在检测蛋白质和蛋白质修饰中的用途，用于人疾病中的诊断、预后或治疗指导。示例性疾病包括但不限于，癌症，免疫和自身免疫疾病，神经和脑疾病，炎性疾病，心脏病(包括心脏和循环系统的疾病)，器官疾病(包括肺，肝，肾，肠，骨骼，结缔组织和皮肤)和孟德尔疾病。本公开提供了原位蛋白质FISSEQ在检测人患者内非人蛋白质中的用途，所述蛋白质包括：微生物组内的微生物蛋白质，所述微生物组如皮肤，肠道，口腔和阴道微生物组，以及致病蛋白，包括细菌，真菌和病毒。本公开提供了出于鉴定细胞学特征的目的，使用原位蛋白质FISSEQ检测一种或多种蛋白质的用途，所述细胞学特征包括细胞膜，脂质体(lyposome)，核内体，线粒体，高尔基体，细胞核，细胞器，细胞骨架，颗粒包括应激颗粒。本文所提供的实例并非限制性的。

本公开提供了出于鉴定组织学特征的目的，原位蛋白质FISSEQ在检测一种或多种蛋白质中的用途，组织学特征包括：细胞膜，核，基质，上皮细胞，脂肪，胞外基质，神经纤维，血细胞，免疫细胞和基底膜。本文所提供的实例并非限制性的。

本公开提供了原位蛋白质FISSEQ在检测两种或更多种蛋白质物质之间的空间关系中的用途。本公开提供了原位蛋白质FISSEQ在检测两种或更多种细胞学或组织学特征之间的空间关系中的用途。本公开提供了原位蛋白质FISSEQ在检测细胞学或组织学要素的性质中的用途，所述要素包括大小、性质和体积。

本公开提供了试剂盒或系统，用于形成包含试剂的蛋白质FISSEQ文库，所述试剂用于原位形成水凝胶。在一些实施方式中，试剂盒包含亲和力结合物的文库，其中各独特的结合物包含赋予亲和力结合性的部分以及独特的DNA条码。在一些实施方式中，试剂盒包含缓冲液，用于结合亲和力结合物。本公开提供了试剂盒或系统，用于蛋白质FISSEQ文库的荧光原位测序，所述蛋白质FISSEQ文库包含超过一种与荧光部分偶联的寡核苷酸物质。在一些实施方式中，试剂盒包含DNA连接酶。在一些实施方式中，试剂盒包含成像缓冲液。在一些实施方式中，试剂盒包含纳入缓冲液。

本公开提供了试剂盒或系统，用于蛋白质FISSEQ文库的荧光原位测序，所述蛋白质FISSEQ文库包含超过一种与荧光部分偶联的dNTP类似物物质。在一些实施方式中，试剂盒还包括DNA聚合酶。在一些实施方式中，试剂盒还包括成像缓冲液。在一些实施方式中，试剂盒包含纳入缓冲液。

本公开提供了试剂盒或系统，用于蛋白质FISSEQ文库的荧光原位测序，所述蛋白质FISSEQ文库包含超过一种与荧光部分偶联的自组装DNA发夹物质，例如，杂交链反应单体。在一些实施方式中，试剂盒包含超过一种DNA寡核苷酸物质，其包含与亲和力结合物条码序列互补的序列。在一些实施方式中，试剂盒包含成像缓冲液。在一些实施方式中，试剂盒包含杂交缓冲液。在一些实施方式中，试剂盒包含HCR扩增缓冲液。

代谢物和小分子检测

为了创造真正的全组学(pan-omic)原位分子检测技术，除了核酸和蛋白质之外的其他类别的生物分子可以在本文提供的方法中被靶向。一些传统的小分子检测方法可以与本文提供的FISSEQ组合。代谢物基本上是与细胞生化过程相互作用的任何小分子，包括维生素，氨基酸，核苷酸，有机酸，醇和多元醇，脂质和脂肪酸等(Wishart,David S.,等"HMDB：人代谢组数据库(HMDB:the human metabolome database.)"Nucleic acids research35.增刊1(2007):D521-D526)。除了它们作为代谢中的中间体、产物和辅因子的作用，代谢物和其他小分子可以在生物系统中作为能源、信号转导分子、渗透调节剂和酶抑制剂或激活剂发挥作用。代谢物还在组织、整个生物体、群体和生态学层面中起重要作用，如毒素，色素，气味剂，信息素等(Vining,Leo C."次生代谢物的作用(Functions of secondarymetabolites.)"Annual Reviews in Microbiology 44.1(1990):395-427)。代谢产物的一个特别重要的类别是脂类。脂质物质的数量与蛋白质物质的数量大致相同，并且脂质作为结构和信号转导分子发挥不同的作用(Muro,Eleonora,G.Ekin Atilla-Gokcumen和UlrikeS.Eggert."细胞生物学中的脂质：我们如何才能更加的了解它们？(Lipids in cellbiology:how can we understand them better？.)"Molecular biology of the cell25.12(2014):1819-1823)。所有这些小分子在细胞中可以具有复杂的组织空间模式.

代谢物通过蛋白质保留和运输(Mercer,Andrew C.和Michael D.Burkart."无处不在的载体蛋白-代谢物生物合成的窗口(The ubiquitous carrier protein—a windowto metabolite biosynthesis.)"Natural product reports 24.4(2007):750-773)。代谢自身可以是高度空间定位的。例如，许多代谢过程可以定位于某些细胞类型；事实上，代谢的特化作用可能是多细胞进化的主要健康驱动因素(Ispolatov,Iaroslav,MartinAckermann和Michael Doebeli."多细胞的分工和进化(Division of labour and theevolution of multicellularity.)"Proceedings of the Royal Society of London B:Biological Sciences(2011):rspb20111999)。

细胞内，按照代谢物自身的大小的顺序，代谢可以组织成大隔室(macrocompartments)，如细胞群，和微隔室(Saks,Valdur,Nathalie Beraud和TheoWallimann."代谢隔室化-肌肉细胞的系统水平性质(Metabolic compartmentation–asystem level property of muscle cells.)"International journal of molecularsciences 9.5(2008):751-767)，从而改善酶的效率(Bonacci,Walter,等"碳固定蛋白细胞器的模块化(Modularity of a carbon-fixing protein organelle.)"Proceedings ofthe National Academy of Sciences 109.2(2012):478-483)，防止交联(Houslay,MilesD."环化AMP磷酸二酯酶的隔室化，信号转导“交联”，脱敏和G i-2的磷酸化增加细胞特异性个性化以控制第二信使环AMP的水平(Compartmentalization of cyclic AMPphosphodiesterases,signalling‘crosstalk’,desensitization and thephosphorylation of G i-2 add cell specific personalization to the control ofthe levels of the second messenger cyclic AMP.)"Advances in enzyme regulation35(1995):303-338)和调节通量(Klitgord,Niels和Daniel Segrè."代谢通量模型中隔室化的重要性：酵母作为细胞器的生态系统(The importance of compartmentalization inmetabolic flux models:yeast as an ecosystem of organelles)."Genome Inform.第22卷.2010)。细胞膜被高度组织成“筏(raft)”以隔室化信号转导、生物合成和细胞内和细胞外途径(参见例如，Simons,Kai和Julio L.Sampaio."细胞膜组织和脂质筏(Membraneorganization and lipid rafts.)"Cold Spring Harbor perspectives in biology3.10(2011):a004697)。然而，原位检测这些分子可限于荧光标记、示踪剂和质谱成像的使用(例如，纳米结构-引发剂质谱(NIMS)(Northen,Trent,Gary Siuzdak和AndersNordstrom."纳米结构-引发剂质谱(Nanostructure-initiator mass spectrometry.)"美国专利申请号11/852,863)。

即使低多重性读数，如使用荧光标记的类似物或通过染色(例如，用于甘油三酯定量的油-红-O(Oil-Red-O)染色(O'Rourke,Eyleen J.,等"秀丽隐杆线虫主要的脂肪储存于同于溶酶体相关细胞器的囊泡中(C.elegans major fats are stored in vesiclesdistinct from lysosome-related organelles.)"Cell metabolism 10.5(2009):430-435))可以能够用于理解某些代谢途径，推断整个代谢通量，并了解代谢疾病的遗传基础。可与FISSEQ组合的另一低多重性读数可以是钙成像，允许我们获得细胞活性的动态测量，如神经元放电，其随后可以与基因表达、基因型或甚至神经元连接性的测量组合。参见例如，Grienberger,Christine和Arthur Konnerth."在神经元中将钙成像(Imaging calciumin neurons.)"Neuron 73.5(2012):862-885。无机离子可能是渗透调节、信号传导和细胞电活性的核心，但是考虑到它们的大小、溶解度和动力学，它们可能需要在体内进行定量。

所有这些代谢物可能对原位试验具有挑战性，因为它们的小尺寸和溶解性使得它们在初始固定期间容易被从样品中洗掉。此外，FISSEQ要求透化以进入胞内分子，其中许多形式实际上特异性地去除小分子和脂质。然而，可以使用针对代谢物和生物分子的较高多重性读数机制。与通过FISSEQ的蛋白质检测一样，可以产生对代谢物具有特异性的DNA条码化的亲和结合试剂的文库(参见上文对SMI-seq的讨论)另一种解决方案可以是开发动态小分子生物传感器，其可以在靶配体存在的情况下经历构象变化。参见例如，Feng,Justin,等"在真核生物中构建小分子生物传感器的一般策略(A general strategy to constructsmall molecule biosensors in eukaryotes.)"Elife 4(2015):e10606。如本文所用的生物传感器可以指遗传编码的生物传感器，其响应于小分子诱导物的存在而调节基因表达。生物传感器可以是包含遗传编码的生物传感器的小分子诱导系统的一部分。这类生物传感器系统可以通过转录抑制或激活将小分子的活性或丰度转移到某些RNA物质的转录水平中。例如，生物传感器可以是蛋白质，其中蛋白质起转录阻遏物或激活剂的作用。在某些情况中，转录阻遏物或激活因子可以被小分子调节，而小分子继而调节RNA转录。在这样的情况中，某些RNA转录本/物质的丰度和/或存在可用于确定调节性小分子的水平和/或存在。

为了原位保留代谢物用于检测，需要开发使小分子与扩张水凝胶基质交联的化学物质，这能够在膨胀期间通过生物分子的稀释来使样品透化。此外，与钙成像一样，可以设计模糊原位和体内之间界限的FISSEQ实验。例如，荧光生物传感器可用于测量代谢物丰度和体内定位的动态，其可与基因表达或基因型的原位单一时间点测量组合。生物传感器还可以记录小分子进入RNA中的丰度和定位，如通过在结合时激活转录，或通过将该信息直接编码到基因组中，如通过使用CRISPR/Cas9基因组编辑技术。参见例如，Feng,Justin,等"真核生物中构建小分子生物传感器的一般策略(A general strategy to construct smallmolecule biosensors in eukaryotes.)"Elife 4(2015):e10606；Shipman,Seth L.,等"通过定向CRISPR间隔子获取分子记录(Molecular recordings by directed CRISPRspacer acquisition.)"Science(2016):aaf1175。在前一种情况中，可以使用FISSEQ原位检测含有关于体内代谢物浓度信息的RNA分子。在后一种情况中，可以使用FISSEQ原位检测修饰的基因组序列。

为了总结代谢物和小分子组合检测，本公开提供了原位修饰分子以包含接合部分的方法。在一些实施方式中，接合部分包括自由基可聚合基团。在一些实施方式中，接合部分包括可聚合基团。在一些实施方式中，接合部分包括胺、硫醇、叠氮、炔烃或点击反应性基团。在一些实施方式，接合部分随后原位连接水凝胶。在一些实施方式中，原位形成水凝胶，并纳入接合部分。在一些实施方式中，接合部分进一步被用于保留样品内2个或更多个代谢物或小分子的绝对或相对空间关系。

本公开提供了检测水凝胶内两种或更多种生物分子物质的方法，包括将两种或更多种亲和力结合试剂结合，所述亲和力结合试剂各自包含赋予亲和力结合性的部分以及独特的DNA条码。在一些实施方式中，该方法还包括使用核酸测序原位检测DNA条码，如通过杂交或通过使用聚合酶或连接酶合成互补链(合成测序，连接测序)。在一些实施方式中，该方法包括测序步骤，其中生成了荧光信号。

本公开提供了检测水凝胶内一种或多种生物分子物质的方法，包括体内表达一个或多个生物传感器，各自包含赋予亲和力结合性的部分以及读数部分。在一些实施方式中，读数部分是转录阻遏物。在一些实施方式中，读数部分是转录激活剂。在一些实施方式中，读数部分包含基因组编辑活性。在一些实施方式中，该方法还包括使用核酸测序原位检测读数部分的产物，所述核算测序如通过一种或多种RNA物质或一种或多种DNA基因座的FISSEQ，如通过杂交测序或通过使用聚合酶或连接酶合成互补链(例如，合成测序，连接测序)。在一些实施方式中，该方法包括检测生成的荧光信号。

本文所提供的FISSEQ方法可以与标准染色方法组合，用于靶标检测。根据本公开的方法包括步骤：将样品与一种或多种染色剂接触，将一种或多种染色剂成像，在样品内原位构建FISSEQ文库，用于检测RNA、DNA和/或蛋白质，对FISSEQ文库进行测序，并将染色数据与FISSEQ数据计算组合。

本公开提供还包含一种或多种试剂的FISSEQ试剂盒，所述试剂具有对生物分子的亲和力，并且还包含可检测的标记物。

经由FISSEQ的分子相互作用检测

在一些情况中，可以检测生物分子间的相互作用。存在许多检测和测量分子相互作用强度的策略，但通常可分为四个主题：定量与阵列化分析物的结合，交联纯化，互补分析和单分子成像。

定量与阵列化分析物的结合涉及合成有序的分子阵列，如RNA，DNA或蛋白质，添加靶分子，然后测量结合概况，例如，通过使用荧光标记的靶分子并在阵列上的每个点测量荧光水平。参见例如，Mukherjee,Sonali,等"以DNA微阵列快速分析转录因子的DNA结合特异性(Rapid analysis of the DNA-binding specificities of transcription factorswith DNA microarrays.)"Nature genetics 36.12(2004):1331-1339；Buenrostro,JasonD.,等"大规模平行阵列上的RNA-蛋白质相互作用的定量分析揭示了生物物理和进化特征(Quantitative analysis of RNA-protein interactions on a massively parallelarray reveals biophysical and evolutionary landscapes.)"Nature biotechnology32.6(2014):562-568；Espina,Virginia,等"蛋白质微阵列检测策略：关于直接检测技术(Protein microarray detection strategies:focus on direct detectiontechnologies.)"Journal of immunological methods 290.1(2004):121-133。这些方法受限于一次测定一个分子，虽然可能设计测定对阵列化分析物的结合的文库对文库方法。例如，人们可以想象使用FISSEQ来检测结合在分析物阵列上的DNA条码化的蛋白质或核酸分子，或质谱成像以直接检测蛋白质。参见例如，van Hove,Erika R.Amstalden,DonaldF.Smith和Ron MA Heeren."质谱成像的简明综述(A concise review of massspectrometry imaging.)"Journal of chromatography A 1217.25(2010):3946-3954。可以想象使用阵列化分析物进行文库对文库筛选的其他方法，如经由分子条码化(即，靶分子的条码(如蛋白质-核糖体-信使-RNA-互补-DNA(PRMC))与指示阵列中的结合位置或结合伴侣种类的条码连接)。SMI-seq是定量结合的一种相关形式，但是其中分析物没有阵列化，而是稀释并在适当的地方使用FISSEQ检测。参见例如，Gu,Liangcai,等"条码化DNA蛋白质的多重单分子相互作用概况(Multiplex single-molecule interaction profiling ofDNA-barcoded proteins.)"Nature 515.7528(2014):554-557(参见上述对于SMI-seq的讨论)。

交联纯化试验可以是免疫沉淀(IP)，其中使用免疫蛋白及其结合伴侣将蛋白质抗原沉淀，然后检测蛋白质抗原。该主题上有许多变形，如用于检测蛋白质-基因组相互作用的染色质IP(ChIP)(Jothi,Raja,等"由ChIP-Seq数据基因组范围鉴定体内蛋白质-DNA结合位点(Genome-wide identification of in vivo protein–DNA binding sites fromChIP-Seq data.)"Nucleic acids research 36.16(2008):5221-5231)，和用于检测蛋白质-RNA相互作用的交联和IP(CLIP)(Ule,Jernej,等"CLIP：用于在活细胞中鉴定蛋白质-RNA相互作用位点的方法(CLIP:a method for identifying protein–RNA interactionsites in living cells.)"Methods 37.4(2005):376-386)，两者可以使用NGS进行无偏高通量检测与靶蛋白相互作用的核酸。共免疫沉淀和质谱可用于检测与靶蛋白结合的蛋白质。参见例如，Free,R.Benjamin,Lisa A.Hazelwood和David R.Sibley."使用共沉淀和质谱鉴定新型蛋白质-蛋白质相互作用(Identifying Novel Protein-ProteinInteractions Using Co-Immunoprecipitation and Mass Spectroscopy.)"CurrentProtocols in Neuroscience(2009):5-28。另一种策略可以是靶向核酸用于纯化，使用杂交来“下拉”染色质的某些区域或某些RNA种类，然后使用质谱检测结合的蛋白质。Déjardin,和Robert E.Kingston."与特异性基因组基因座相关联的蛋白质纯化(Purification of proteins associated with specific genomic Loci.)"Cell 136.1(2009):175-186；Butter,Falk,等"通过定量蛋白质组学无偏见RNA-蛋白质相互作用筛选(Unbiased RNA–protein interaction screen by quantitative proteomics.)"Proceedings of the National Academy of Sciences 106.26(2009):10626-10631。所有染色质构象捕获测序方法(参见例如，Dekker,Job,等"捕获染色体构象(Capturingchromosome conformation)."science 295.5558(2002):1306-1311)可以是交联纯化的一种形式，其中非常接近的DNA分子经交联和纯化。在这些方法中，化学交联可以被经由连接(ligation)的共价连接(linkage)替代，使得阻碍扩增和测序的化学交联反转并产生可以被NGS检测的序列接连。相似地，RNA相互作用和结构的补骨脂素分析(PARIS)使用补骨脂素衍生物4'-氨基甲基三恶唑(aminomethyltrioxsalen)(AMT)进行可逆交联，然后连接，以通过NGS检测RNA-RNA相互作用(Lu,Zhipeng,et al."活细胞中的RNA双重图显示高级转录组结构(RNA Duplex Map in Living Cells Reveals Higher-Order TranscriptomeStructure.)"Cell 165.5(2016):1267-1279)。可逆的补骨脂素交联技术可以扩展到DNA-DNA和RNA-DNA相互作用的分析.

互补试验使用由分子标记物邻近而产生的新型官能以检测分子相互作用，所述分子标记物是报告物系统的子集。杂合互补性筛选试验通常使用包含一个或多个转录因子片段和靶序列的转录报告物系统。这些组分与内源分子接合，例如，通过产生融合蛋白。当靶分子相互作用时，报告系统可以重构并激活可选择标记物(如抗生素抗性基因)的转录。

一些典型的实例是细菌单杂交DNA-蛋白质相互作用筛选(Meng,Xiangdong和ScotA.Wolfe."使用细菌单杂交系统鉴定转录因子识别的DNA序列(Identifying DNAsequences recognized by a transcription factor using a bacterial one-hybridsystem.)"NATURE PROTOCOLS-ELECTRONIC EDITION-1.1(2006):30)，酵母双杂交蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA筛选(Chien,Cheng-Ting,等"双杂交系统：鉴定和克隆与感兴趣蛋白质相互作用的蛋白质的基因的方法(The two-hybrid system:a method to identify andclone genes for proteins that interact with a protein of interest)."Proceedings of the National Academy of Sciences 88.21(1991):9578-9582；Vidal,Marc,等"逆转双杂交和单杂交系统以检测蛋白质-蛋白质和DNA-蛋白质相互作用的解离(Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions.)"Proceedings of the National Academy ofSciences 93.19(1996):10315-10320)，和酵母三杂交蛋白质-RNA相互作用筛选(Hook,Brad,等"酵母三杂交系统中的RNA-蛋白质相互作用：亲和力、敏感性并增强文库筛选(RNA–protein interactions in the yeast three-hybrid system:Affinity,sensitivity,and enhanced library screening.)"Rna 11.2(2005):227-233)。其他形式的互补试验利用荧光来检测体内分子相互作用。荧光共振能量转移(FRET)能够在供体和受体荧光团之间(如果它们距离在10nm内)转移能量(参见例如，Jares-Erijman,Elizabeth A.和ThomasM.Jovin."在活细胞中通过FRET显微术对分子相互作用进行成像(Imaging molecularinteractions in living cells by FRET microscopy.)"Current opinion in chemicalbiology 10.5(2006):409-416)，从而产生可检测的荧光信号。双分子荧光互补(BiFC)使用荧光蛋白的非荧光片段，当它们非常接近时，它们会暂时重新组装并发荧光。参见例如，Magliery,Thomas J.,等"以绿色荧光蛋白质片段重组陷阱检测蛋白质-蛋白质相互作用：范围和机制(Detecting protein-protein interactions with a green fluorescentprotein fragment reassembly trap:scope and mechanism.)"Journal of theAmerican Chemical Society 127.1(2005):146-157；Kerppola,Tom K."设计和实施生物分子荧光互补(BiFC)试验显示活细胞中的蛋白质相互作用(Design and implementationof bimolecular fluorescence complementation(BiFC)assays for the visualizationof protein interactions in living cells.)"Nature protocols 1.3(2006):1278-1286。这些荧光计数还可以用于使用超分辨率显微术观察单个相互作用。参见例如，Liu,Zhen,等"超分辨率成像和追踪亚衍射细胞空间中蛋白质-蛋白质相互作用(Super-resolution imaging and tracking of protein–protein interactions in sub-diffraction cellular space.)"Nature communications 5(2014)。

最后，超分辨率显微术的出现可以直接显示单独标记的组分，形成分子复合物。通过光活化的定位显微术(PALM)的超分辨率成像可以原位用于确定2个蛋白质的空间分布和共定位，精确度为20nm。参见例如，Sherman,Eilon,Valarie A.Barr和LawrenceE.Samelson."通过光活化定位显微术解析多分子蛋白质相互作用(Resolving multi-molecular protein interactions by photoactivated localization microscopy.)"Methods 59.3(2013):261-269。反射光片显微镜(RLSM)可以在体内测量转录因子与DNA的结合动力学(不直接检测DNA靶标)，以及2个DNA结合蛋白的共定位。参见例如，Gebhardt,J.Christof M.,等"活哺乳动物细胞中接合DNA的转录因子的单分子成像(Single-molecule imaging of transcription factor binding to DNA in live mammaliancells.)"Nature methods 10.5(2013):421-426。虽然这些方法在技术上具有挑战性，但ExM可用于使用更简单的衍射限制的成像模式促进分子相互作用的原位超分辨率检测。参见例如，Chen,Fei,Paul W.Tillberg和Edward S.Boyden."扩增显微术(Expansionmicroscopy.)"Science 347.6221(2015):543-548。

为了将关于分子相互作用的信息捕获到FISSEQ文库中，可以使用来自交联纯化和互补试验的邻近捕获概念。例如，不是免疫沉淀或下拉蛋白质或核酸靶标，而是可以使用分子探针原位结合靶标。分子探针可以是核酸或带有核酸条码。在一些情况中，邻近连接试验(Proximity Ligation Assay)(PLA)可用于产生具有邻近核酸的新杂交序列，然后可由FISSEQ检测。参见例如，Ola,等"通过邻近连接原位直接观察个体内源性蛋白质复合物。(Direct observation of individual endogenous protein complexes in situby proximity ligation)."Nature methods 3.12(2006):995-1000。邻近连接试验(PLA)也可用于检测内源核酸序列的邻近，染色质构象捕获测序，RNA双链体检测(PARIS)或使用转基因细胞条形码(BOINC)检测神经元突触。或者，与互补试验一样，分子探针可以带有FISSEQ文库构建反应的组分，例如RT引物或酶，将文库构建化学定位于靶分子附近的序列。

使用与FISSEQ组合的ExM，通过直接观测可以实现分子相互作用的大规模多重检测。共定位的检测可以用于推断相互作用，以及估计热力学量，如结合自由能。参见例如，Helmuth,Jo A.,Grégory Paul和Ivo F.Sbalzarini."超越共定位：从显微术图像推断亚细胞结构之间的空间相互作用(Beyond co-localization:inferring spatialinteractions between sub-cellular structures from microscopy images.)"BMCbioinformatics 11.1(2010):1；Herce,H.D.,C.S.CASAS-DELUCCHI,and M.C.Cardoso."用于荧光显微术定量(生物-)分子相互作用的新的图像共定位系数(New imagecolocalization coefficient for fluorescence microscopy to quantify(bio-)molecular interactions.)"Journal of microscopy 249.3(2013):184-194)。

相较于邻近连接，使用直接观测的一个益处可以是邻近连接限于检测将标签定位在短距离内的相互作用，通常约10nm，这通常将检测限制于成对或极近端相互作用。参见例如，Ola,等"通过邻近度连接原位直接观察个体内源性蛋白质复合物。(Directobservation of individual endogenous protein complexes in situ by proximityligation)."Nature methods 3.12(2006):995-1000。直接检测这些复合物可以使我们观测到大分子复合物或涉及许多组分的组织和空间关系。例如，RNA剪接机制包含数百种蛋白质以及RNA分子。列举组成分子和相互作用可以仅提供群体平均状态的抽象网络图表示，其可能难以解释或映射到物理结构。参见例如，Zhou,Zhaolan,等"人剪接体的全面蛋白质组学分析(Comprehensive proteomic analysis of the human spliceosome.)"Nature419.6903(2002):182-185；Dominguez,Daniel和Christopher B.Burge."相互作用组分析将拼接引入焦点(Interactome analysis brings splicing into focus.)"Genomebiology 16.1(2015)；Pires,Mathias M.,等"剪接体中蛋白质相互作用的网络组织由食物网模型的简单规则复制(The network organization of protein interactions in thespliceosome is reproduced by the simple rules of food-web models.)"Scientificreports 5(2015)。确定该复合物的整体空间组织以及特定元素的位置的进展主要由cryo-EM推进。参见例如，Newman,Andrew J.和Kiyoshi Nagai."剪接体的结构研究：盲人和大象(Structural studies of the spliceosome:blind men and an elephant.)"Currentopinion in structural biology 20.1(2010):82-89。使用全组学FISSEQ检测直接观测具有纳米级分辨率的分子复合物利用了这两种方法的最佳方面。

为了总结分子相互作用检测，本公开提供了两种或更多种分子探针在原位检测分子相互作用的用途，其中各探针还包含DNA条码。在一些实施方式中，本公开提供了原位测序的方法，包括通过杂交测序或通过使用聚合酶或连接酶合成互补链(例如，合成测序，连接测序)。在一些实施方式中，该方法包括检测在测序中生成的荧光信号。在一些实施方式中，本公开提供了通过邻近连接而原位连接的两种或更多种核酸条码的用途。在一些实施方式中，连接汇合(junction)作为相互作用的标识符。

在一些实施方式中，本公开提供了制备原位测序文库的方法。在一些实施方式中，该方法包括当两种或更多种核酸条码非常接近时，连接两种或更多种核酸条码的步骤。

在一些实施方式中，该方法包括制备原位测序文库，其中该方法包括使用一种核酸物质来引起以不同核酸物质为模板的核酸聚合反应。在一些实施方式中，核酸物质中的一种或两种是代表蛋白质、RNA、DNA或其他生物分子的核酸条码，并且其中一种或两种核酸物质是内源核酸分子。本公开提供了通过两个FISSEQ鉴定的空间邻近关系来推断分子相互作用的方法。

本公开提供了试剂盒或系统，用于形成包含试剂的分子相互作用FISSEQ文库，所述试剂用于原位形成水凝胶。在一些实施方式中，试剂盒包含用于将DNA、RNA或其他核酸条码原位连接到水凝胶中的试剂。

本公开提供了试剂盒或系统，用于分子相互作用FISSEQ文库的荧光原位测序，所述蛋白质FISSEQ文库包含超过一种与荧光部分偶联的寡核苷酸物质。在一些实施方式中，试剂盒包含DNA连接酶。在一些实施方式中，试剂盒包含成像缓冲液和/或纳入缓冲液。

本公开提供了试剂盒或系统，用于分子相互作用FISSEQ文库的荧光原位测序，所述蛋白质FISSEQ文库包含超过一种与荧光部分偶联的dNTP类似物。在一些实施方式中，试剂盒包含DNA聚合酶。在一些实施方式中，试剂盒包含成像缓冲液和/或纳入缓冲液。

本公开提供了试剂盒或系统，用于分子相互作用FISSEQ文库的荧光原位测序，所述分子相互作用FISSEQ文库包含超过一种与荧光部分偶联的自组装DNA发夹物质，例如，杂交链反应单体。在一些实施方式中，试剂盒包含超过一种DNA寡核苷酸物质，其包含与亲和力结合条码序列互补的序列。在一些实施方式中，试剂盒包含成像缓冲液。在一些实施方式中，试剂盒包含杂交缓冲液和/或HCR扩大缓冲液。

细胞学和组织学染色

染色可以是用于增强生物样品各方面之间对比度的重要技术，通常通过样品的一些组分的差异结合进行。自从发现合成苯胺染料以来，科学家们已经利用化学物质与组织成分之间的化学反应和亲和力来增强组织的光学特性，用于组织结构以及化学和分子组成的观测或微观分析。最为熟知的染色剂之一可以是苏木精和曙红(H&E)的组合，其分别染色核酸和胞质/胞外组织成分。其他示例性染色包括甲苯胺蓝，马森三色(Masson’strichrome)染色，马洛里三色(Mallory’s trichrome)染色，魏格特弹性(Weigert’selastic)染色，海登海因AZAN三色(Heidenhain’s AZAN trichrome)染色，银染色(Silverstain)，赖特(Wright’s)染色，地衣红染色和过碘酸席夫染色(PAS)。DAPI和其他嵌入染料也可用于标记核酸和细胞核。

为了总结染色加FISSEQ，根据本公开的方法包括步骤：将样品与一种或多种染色剂接触；将一种或多种染色剂成像；在样品内原位构建FISSEQ文库，用于检测RNA、DNA和/或蛋白质；对FISSEQ文库进行测序；并将染色数据与FISSEQ数据计算型整合。

本公开内容提供了FISSEQ试剂盒，其还含有一种或多种细胞学和/或组织学染色试剂。

全组学的超分辨率显微术

在一些情况中，需要更高的成像分辨率。在生物系统中，大多数物体的大小为纳米量级。例如，DNA螺旋的“B”形式每10碱基对宽23.7埃并且长34埃。参见例如，Watson,JamesD.和Francis HC Crick."核酸的分子结构(Molecular structure of nucleic acids.)"Nature 171.4356(1953):737-738。最小的多肽的长也为数纳米量级。因此，对于生物学“完美的分辨率”可以是数纳米量级。可以使用任何数量的策略来实现荧光成像的这种分辨率。

DNA PAINT是一种随机超分辨率显微术，已经证明为亚10nm的分辨率。参见例如，Silverberg,Jesse L.,等"多重3D超分辨率显微术的DNA-Paint和Exchange-Paint(DNA-Paint and Exchange-Paint for Multiplexed 3D Super-Resolution Microscopy.)"Biophysical Journal 108.2(2015):477a。使用FISSEQ的这种和其他超分辨率模式可能需要开发单分子“测序”用于检测和定位单个荧光团。虽然这可以实现所有分子的同时测序，但是各测序循环的成像时间可能很长。获取具有亚10nm的分辨率的DNA PAINT图像需要使用高放大率每帧数小时成像，这也可能限制了每个图像的视野。

另一种方法可以是使用信号放大，如通过RCA或环状HCR(CHCR)，以及数字分区显微术。这可以实现足够的分辨率，但是以定位为代价，因为扩增子本身比靶分子大近两个数量级。该方法还可能需要对许多分区进行连续测序，这大大增加了试验时间。也可能存在空间限制；例如，可能无法在相同的物理体积内产生许多RCA扩增子。

ExM可以是实现完美的分辨率的另一种策略，因为其可以使用衍射限制显微术的低放大倍率和快速像素采集率以任意分辨率和出色的定位成像。(ExM的定位精度可能收到聚合期间分子捕获节点的密度和所得扩张水凝胶的各向同性以及用于捕获靶分子或可检测标记物的化学的物理尺寸的限制。)本文所讨论的所有策略可以用于实现对ExM的全组学FISSEQ。在将该信息捕获到凝胶中后，以数百的线性膨胀因子的膨胀可足以实现单纳米分辨率。此外，我们可以通过RCA或环状HCR(CHCR)高度放大信号，因为这些扩增子通常在尺寸上是衍射受限的，并且因此可以被解析和物理分离。

ExM和FISSEQ的组合将NGS和MS的多重性、灵敏度和准确性与分辨率相结合，所述分辨率可通过操纵水凝胶的组成或通过连续扩展以任意方式缩放。

在一些情况中，水凝胶(例如，三维基质)可以借助于膨胀剂制备，所述膨胀剂可以通过外部刺激激活。本文所述本发明的水凝胶系统可以包含能够外部诱导体积状态转变的功能性水凝胶基质和/或溶剂组合物。任选地，水凝胶可以不是离子聚合物基质，该基质在通过添加液态水而对盐透析时扩张。

任选地，水凝胶可包含一种或多种膨胀剂。如本文所述的膨胀剂可以指参与和/或诱导三维基质膨胀的任何机制。任选地，膨胀剂可以是构建在聚合物骨架中的官能。例如，膨胀剂可以是三维基质内这样的机制，当通过刺激(例如，外部刺激)激活时，其可以引起基质的网络拓扑结构的变化。在一些示例中，外部刺激(例如，电磁辐射)可以引起基质中聚合物链之间的交联断裂，从而使水凝胶溶胀。在这类示例中，膨胀剂可以指聚合物基质交联的子集。在一些示例中，外部刺激(例如，热刺激)可以诱导聚合物骨架之间非共价连接的改变(例如，这类连接的断裂)，从而使水凝胶溶胀。在这类示例中，膨胀剂可以指非共价连接。在一些示例中，膨胀剂可以是基质内可编程的螯合剂。在一些示例中，三维基质可以响应刺激和/或借助于膨胀剂而经历结构重排。

在一些示例中，外部刺激是电磁刺激，电化学刺激或热刺激。膨胀剂可以包含可通过外部刺激激活的化学基团，如电磁刺激，电化学刺激或热刺激。电磁刺激可包括具有不同波长的光。在一些实施方式中，本公开提供了用于对生物样品的一种或多种生物分子进行检测或鉴定的系统或方法，其包括膨胀剂，其中所述膨胀剂能在施加刺激后活化而体积增大，从而产生包含所述生物分子的三维基质，其中所述刺激是电磁刺激、电化学刺激或热刺激，其中所述三维基质保留所述生物分子在生物样品内的绝对或相对空间关系。在一些实施方式中，膨胀剂还包含接合部分，其中感兴趣的生物分子可以通过接合部分与膨胀剂连接。在一些实施方式中，向膨胀剂施加外部刺激将激活所述膨胀剂形成所述三维聚合物基质，其中三维聚合物基质保留生物样品内生物分子的绝对或相对空间关系。在一些实施方式中，膨胀剂是三维水凝胶基质。在一些实施方式中，膨胀剂可以是收缩剂，其中收缩剂可以帮助收缩和/或缩小三维基质。

任选地，三维基质可以响应于刺激和/或借助于收缩剂而经历结构重排，从而收缩或缩小。收缩剂或缩小剂量可以是三维基质内这样的机制，当通过刺激(例如，外部刺激)激活时，其可以引起基质的网络拓扑结构的变化。任选地，收缩剂可以是构建在聚合物骨架中的官能。在一些示例中，外部刺激(例如，电磁辐射)可以引起水凝胶中聚合链之间交联的形成，从而使水凝胶收缩。在这类示例中，收缩剂可以指聚合物基质交联的子集。在一些示例中，外部刺激(例如，热刺激)可以诱导聚合物骨架之间非共价连接的改变(例如，这类连接的形成)，从而使水凝胶收缩。在这类示例中，膨胀剂可以指非共价连接。在一些情况中，膨胀剂可以是基质内可编程的螯合剂。

例如，膨胀/收缩剂可以被具有特定波长的光激活以扩张，并且可以被具有不同波长的光激活以收缩。在一些示例中，藉由刺激，收缩剂先前，在一些实施方式中，外部刺激不是液体。本文所述生物样品可包括器官，组织，细胞，外来体，血液或其部分。细胞样品可以包括任何亚细胞组分或细胞衍生物。

作为一个实例，本文所述水凝胶可以包含具有N,N′-双(丙烯酰基)胱胺(BAC)交联接头的聚丙烯酰胺-双丙烯酰胺(PA-BIS)共聚物。水凝胶可以按一定尺寸聚合，并在通过还原二硫化物进行电化学诱导，破坏水凝胶基质内交联的一部分时，水凝胶可以在尺寸上扩张。在这类示例中，水凝胶基质内仅有交联的一部分可能被破坏，使得在扩张或膨胀之后，仍然存在与生物分子或生物分子标记物接合的3D水凝胶基质。

在另一个实例中，水凝胶可以是热诱导的水凝胶。热诱导的水凝胶可以响应热刺激而经历体积转变。热诱导的水凝胶的一个实例是NIPAM凝胶。在这类水凝胶中，体积转变可能是由水凝胶骨架之间非共价连接的变化引起的，类似于PA-BIS-BAC水凝胶网络中由电化学诱导的二硫键状态变化。)

在另一个实例中，水凝胶可以是离子聚合物水凝胶。这类水凝胶的实例可以是丙烯酰胺-丙烯酸酯-双丙烯酰胺共聚物水凝胶，具有可编程的螯合剂溶质组分，如光笼状的(photocaged)-EDTA。激活或改变光笼状的螯合剂元件的构象可以引发水凝胶内溶液的有效离子强度的变化，如通过吸收(螯合)或释放离子，其用于调节离子聚合物基质的润湿强度，引起膨胀和收缩。

为了总结用于全组学FISSEQ的超分辨率显微术，根据本发明的原位形成扩张水凝胶的方法包括各自对应生物分子物质的超过一种可检测标记物，其中水凝胶膨胀导致线性维度扩张2倍至4倍，3倍至4倍，4倍至5倍，5倍到6倍，6倍到7倍，7倍到8倍，8倍到9倍，9倍到10倍，或大于10倍，并且其中水凝胶稳定在扩张状态。在一些实施方式中，水凝胶膨胀导致线性维度扩张2倍至10倍。在一些示例中，水凝胶可以由于膨胀剂的存在而膨胀。在一些示例中，膨胀剂可以通过本文进一步描述的刺激激活，从而产生三维基质(例如，凝胶)。任选地，水凝胶可以设置成收缩。例如，水凝胶在收缩剂的帮助下可以收缩。任选地，本文所述膨胀剂可以进一步作为收缩剂。

本公开提供了原位形成扩张水凝胶的方法，其包括一种或多种内源性核酸物质。

本公开提供了原位形成扩张水凝胶的方法，其包括一种或多种核酸条码物质,作为可以通过FISSEQ检测的某些生物分子物质的标记物。

本公开提供了原位形成扩张水凝胶的方法，其包括一种或多种内源性核酸物质以及一种或多种核酸条码物质。在一些实施方式中，扩张水凝胶包含光激活的膨胀剂，其包含螯合反离子，如邻位硝基苄基笼状EDTA。在一些实施方式中，当通过一个波长激活时，膨胀剂可以扩张，并且当通过不同的波长激活时，膨胀剂可以缩小/收缩。在一些实施方式中，膨胀剂可以缩小/收缩至原始扩张大小的1/5～1/4、1/4～1/3、1/3～1/2。在一些实施方式中，扩张水凝胶包含电化学激活的膨胀剂，其包含螯合反离子，如醌-酯保护的EDTA。在一些实施方式中，扩张水凝胶包含热激活的膨胀剂，其包含螯合反离子。

出于不同的检测目的，可以扩张或收缩水凝胶。例如，在一些情况中，水凝胶经编程以扩张，使得感兴趣的靶标彼此分开，从而使得它们在成像步骤期间可以被解析。在一些情况中，水凝胶经编程以在接触其他试剂后收缩，使得感兴趣的靶标彼此靠近，用于相互作用检测。在一些示例中，可以使用刺激来扩张水凝胶。刺激可以是任何类型的刺激，例如，电磁刺激，电化学刺激或热刺激。在一些示例中，刺激可能不是液体。任选地，可以使用另一刺激使水凝胶收缩。用于扩张的刺激和用于收缩或缩小的另一刺激可以是相同类型(例如，光)。任选地，用于扩张的刺激和用于收缩的另一刺激可以是不同类型(例如，光和化学物质)。在一些情况中，水凝胶可在外部刺激(如第一波长的光)后扩张，并且在扩张后试剂混合物可以流过水凝胶，然后水凝胶可以在外部刺激(如第二波长的光)后收缩，其中第一和第二波长不相同。

全组学FISSEQ文库构建和水凝胶组合物

分子和探针捕获

为了构建全组学FISSEQ文库，需要将原始分子或代表原始分子的可检测标记物(即核酸条码)捕获到水凝胶基质中以通过测序进行荧光检测。FISSEQ水凝胶用于在文库构建和测序步骤期间保持分子的相对或绝对3D空间位置信息。捕获和研究的位置保真度可以通过水凝胶中捕获节的密度确定，其中捕获节是基质和原始分子或代表性标记物之间直接或间接的连接，以及水凝胶基质本身的拓扑和/或空间不变性。例如，拓扑不变性要求保留分析物之间的空间关系(例如，在关系内/没有关系，顺序关系)。空间不变性可以指保留绝对或相对空间关系，例如，使得水凝胶基质内所有节相对于其他节或基准标记物保持恒定的绝对或相对关系。在ExM的情况中，水凝胶可能正在扩张；虽然水凝胶的各向同性扩张通过保留水凝胶内节之间的相对距离来保留存在的空间信息。或者，水凝胶可以表现出杂合特性，如短距离空间不变性或各向同性扩张，但是在较长距离上会失去空间关系(虽然这可以通过计算分析或使用基准标记来减轻)。

关于蛋白质种类和定位的信息可以通过将蛋白质本身连接到凝胶中捕获，或者可以通过连接来自抗体或探针的DNA条码来捕获，这可能是其自身接合或结合蛋白质，或者通过中间体(例如，初级，二级，三级或更高级别的信息传递)。参见例如，Tillberg,Paul W.,等"使用标准荧光蛋白和抗体标记的细胞和组织的蛋白质保留扩增显微术(Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standardfluorescent proteins and antibodies.)"Nature Biotechnology(2016)；Chen,Fei,Paul W.Tillberg和Edward S.Boyden."扩展显微术(Expansion microscopy)."Science347.6221(2015):543-548)。蛋白质本身可以这样被捕获到水凝胶中：凭借蛋白质靶标的内在特性，例如，蛋白质的半胱氨酸残基上存在的硫醇，以及N-末端胺，赖氨酸的ε-氨基，和组氨酸的咪唑环，以及其他基团，共价聚合到生长的聚丙烯酰胺链，或者凭借蛋白质的化学修饰以在基质形成期间或之后促进蛋白质纳入或共价连接到水凝胶基质中。探针(例如，初级，次级或更高级)可以凭借携带化学部分而连接到FISSEQ水凝胶中，所述化学部分在水凝胶基质形成(例如，聚合)期间或之后与水凝胶基质特异性或非特异性相互作用。在免疫蛋白和其他类型的合成表达的肽探针的情况中，这些探针在非天然氨基酸存在并纳入肽的情况下表达，如在体外或体内表达系统中的那样，用于直接纳入可以连接到水凝胶基质中的化学部分，或用以纳入可以经进一步体内或体外修饰的化学部分以形成能够共价连接水凝胶基质的化学部分。在免疫蛋白和其他类型的合成表达的肽探针的情况中，这些探针的表达可用于将探针与核酸序列化学连接，这作为核酸条码或标记物，例如，通过mRNA展示或核糖体展示以将RNA分子与蛋白质连接，或者通过将同源DNA或cDNA分子进一步定位于探针(例如，通过逆转录)。

关于核酸的序列和定位的信息可以通过连接核酸自身来捕获，如使用我们的新型LabelX试剂，或通过连接某种核酸探针，如OligoPaint、挂锁探针或MIP。LabelX试剂由氮芥反应性基团和Label-IT胺(MirusBio)的模块化反应性胺接头组成，并且除了将丙烯酰基自由基聚合成聚丙烯酰胺之外，还能够进一步开发其他接合化学物质。例如，NHS-酯-叠氮化合物可以与Label-IT胺偶联以产生能够将核酸栓系成PEG-点击水凝胶的新接头。另一方面，我们可以使用水凝胶接合部分，如LabelX的AcX 6-((丙烯酰基)氨基)己酸(生命技术公司(Life Technologies))组分，以产生针对不同靶分子的其他接合化学物质。氮芥与核酸反应是有效的，但反应性炔也与其他杂原子非特异性反应。可以产生任何数量的新接头，具有其他反应性质，或增强的特异性，用于将特定类别的靶分子共价捕获到FISSEQ水凝胶中。用于将核酸特异性地连接到水凝胶基质中的其他类型的化学物质包括能够嵌入双链核酸中并具有能够连接到水凝胶基质中的化学部分的试剂。这些试剂还可以具有其他功能性部分，如在经嵌入特异性地导向核酸后用于与核酸建立共价连接。用于将核酸特异性地连接到水凝胶基质中的另一化学过程包括核酸汞化反应，由此使汞原子与核酸反应以形成与巯基进一步反应的复合物。这种化学过程可以包括使核酸与汞盐溶液接触的步骤，任选地，(如用氰化氢)去除复合但未反应的汞，并最后与含有巯基和水凝胶连接基团的化合物反应，水凝胶连接基团如自由基可聚合基团，包括丙烯酰基，点击基团或其它反应性基团，用于与水凝胶基质偶联。

水凝胶组成，分子纳入和排除

为了形成FISSEQ水凝胶，可能需要某些性质，例如：与酶的相容性，快速的扩散，热，物理，光和化学稳定性，光学透明度，用于与核酸建立共价连接的简便化学，接合至固体支持物底物的方法，生物正交性和均匀的纳米级网络架构。

FISSEQ水凝胶的组成和形成化学可以部分地确定纳入FISSEQ水凝胶中的分子和化学部分的类型。例如，聚丙烯酰胺-双丙烯酰胺水凝胶的自由基聚合可以将能够参与自由基聚合的某些基团化学纳入到水凝胶中。由双或多功能单体形成的其它聚合物，或丙烯酰胺，双丙烯酰胺和其它双或聚功能单体(例如点击单体)的共聚物，可以凭借另外的官能在聚合后提供功能性水凝胶。例如，点击功能性炔丙基丙烯酰胺(PAm)单体包括经由所得聚合物中的可点击乙炔基团的另外的偶联官能。其他类型的水凝胶，如通过PEG点击化学形成的那些，其中经炔烃或叠氮化物末端官能化的n臂PEG聚合物可以经由“点击”化学组装成水凝胶基质。

PEG-点击凝胶是使用“点击化学”通过共价连接多臂PEG分子而形成的水凝胶。叠氮-炔烃环加成，特别是铜催化的叠氮-炔烃环加成(CuAAC)是示例性点击化学。CuAAC在大范围的pH和温度下在水性溶剂中起作用，并且在很大程度上是生物正交的，这意味着点击功能化的PEG单体可能不与蛋白质或核酸反应。因此，所得水凝胶在某些条件下可以表现出均一并且甚至理想的的纳米级网络结构。PEG可以与酶促反应相容——实际上PEG是增强反应动力学的常见添加剂。PEG-点击水凝胶可以是光学透明的。由CuAAC和PEG间隔物产生的三唑连接都是化学稳定的，并且可能承受测序的热，物理，化学和光毒性应激。核酸可以经修饰以纳入PEG-点击凝胶中，从而能够将RNA和DNA栓系到水凝胶中；还可以修饰蛋白质和其他类型的分子以纳入PEG-点击凝胶中。最后，PEG-点击水凝胶可以经其他连接基团进一步官能化，理想地是沿着骨架以“瓶刷(bottle-brush)”拓扑结构，为形成水凝胶后合成的交联分子提供化学手柄(chemical handle)(如RCA扩增子)。可以合成扩张的PEG-点击水凝胶，其中PEG骨架可以由带电基团或亲水性基团官能化。在一些实施方式中，可以由具有靶标或探针的反应性基团或接合部分连接水凝胶，其中接合基团或反应性基团起着捕获探针或感兴趣的靶标的功能。在一些实施方式中，水凝胶可以是PEG-点击水凝胶，其中PEG-点击水凝胶在有或没有生物样品的情况下原位形成。在一些实施方式中，液体混合物可以流过形成的水凝胶，如PEG-点击水凝胶，其中接合部分或反应性基团可以捕获流过的液体混合物中的其他分子。在一些情况中，使用聚合的三维基质检测生物分子的方法可以包括提供聚合的三维基质，使探针流过，所述探针可以将靶标结合到聚合的三维基质，并在聚合的三维基质中捕获探针。在一些情况中，使探针流过包括使与生物分子偶联的探针流过，所述生物分子待通过所述探针检测。在一些情况中，可以经由接合部分捕获探针。

合适的化学偶联基团可以被纳入聚合物水凝胶网络的骨架中以用于捕获靶标。示例性的偶联基团可以包括伯胺，巯基和“点击”化学基团(例如，叠氮化物，炔烃)。

可以适当的浓度纳入官能团，从而实现空间精度所需的3D空间中的功能性捕获节点密度。在一些实施方式中，平均捕获节点密度可以大于1节点/立方微米，1-1000/立方纳米，500至600/立方纳米，600至700/立方纳米，700至800/立方纳米，800至900/立方纳米，900至1000/立方纳米，1000至1200/立方纳米，1200至1500/立方纳米，1500至1800/立方纳米，或1800至2000/立方纳米。在一些实施方式中，捕获节点密度可以是至少1000/立方纳米，至少2000/立方纳米，至少3000/立方纳米，至少4000/立方纳米，或至少5000/立方纳米。

为了增加FISSEQ的效率和空间均匀性，可以仅将测序模板特异性地交联到水凝胶中，而可能在水凝胶基质中产生不均匀性的所有其他类型的生物分子可以被去除。例如，交联的生物分子可能降低基质的有效孔径，导致试剂进入凝胶的不均匀扩散速率，或甚至产生较大大分子不能接近的局部区域。交联的生物分子还可以与FISSEQ期间导入的寡核苷酸，酶和其他试剂非特异性地相互作用。例如，捕获寡核苷酸与蛋白质的非特异性结合可以增加背景信号或产生假阳性。

存在许多用于从生物样品中水解或洗涤生物分子的方法。可以使用不扰乱FISSEQ水凝胶的方法。预期那些方法与核酸正交(具体地，纳入原位测序文库中的感兴趣的核酸和包含测序模板的核酸)。主要包含有机溶剂如甲醇和丙酮，以及洗涤剂如皂苷，曲通X-100和吐温-20的常用的透化试剂可以去除脂质以及一些蛋白质。蛋白质可经酶促或化学水解。蛋白质的酶促水解可以使用多种蛋白酶来完成，包括胃蛋白酶，胰蛋白酶，肠肽酶和蛋白酶K。变性剂，如盐酸胍和SDS，以及还原剂，如DTT和β-巯基乙醇，可以通过分解抵抗酶消化所用的紧密蛋白质结构来予以协助。蛋白质的酸水解虽然有效，但可能导致RNA降解和DNA脱嘌呤，因此可能不适合FISSEQ。然而，肽键水解的其他化学方法，如在中性pH下通过Pd(II)复合物，可能是在原位可行的。

大多数小分子和离子可以很容易地从水凝胶中洗掉。然而，较大的碳水化合物如糖胺聚糖和蛋白多糖，特别是ECM中存在时，可能会带来挑战。这些紧凑的、晶体状结构可能难以分解，并且许多是带电荷的，如肝素，软骨素和角蛋白硫酸盐和牛磺酸。许多酶可以具有降解特异性ECM组分的能力，包括透明质酶(hyuralonases)，胶原酶，而其他酶，如MMP，表现出广谱ECM水解活性。

除了利用替代性FISSEQ水凝胶形成化学物质，各自具有其自身纳入生物分子以及特异性连接生物分子或鉴定标记物的特征，人们还可以调节生物分子对水凝胶形成化学物质的反应性，从而建立特异性或非特异性连接以及避免形成某些连接。前者在上文讨论。作为后者的一个实例，蛋白质上的硫醇基团可以纳入自由基聚合的聚丙烯酰胺水凝胶中；因此，在水凝胶形成之前，通过与马来酰亚胺或碘乙酰胺反应，钝化存在于生物分子上的硫醇可以特异性地防止这些基团与水凝胶相互作用。

为了总结全组学FISSEQ水凝胶方法，本公开提供了用接合部分化学修饰RNA、DNA、蛋白质或其他生物分子的方法，用于将它们捕获至原位形成的水凝胶中。

本公开内容提供了能够与某些生物分子或接合部分形成共价连接的水凝胶材料。在一些实施方式中，该方法包括使生物分子钝化而不纳入水凝胶中的处理，如游离氨基基团的酰化，羧酸基团的胺化或硫醇基团的烷基化。在其他实施方式中，该方法包括从水凝胶中去除某些类型的生物分子的处理，包括物理洗去不需要的生物分子，用SDS/洗涤剂处理，诱导蛋白水解，诱导脂解，使用酶促或化学降解生物结构，如胞外基质，和/或诱导溶解，随后用有机溶剂洗去。

在某些实施方式中，该方法包括减少共价连接到水凝胶中的分子的自发荧光的处理，从而经由原位测序增强检测，如用硼氢化钠还原羰基。

原位全组学测序

测序是获取一组有序信号的过程，这些信号起着具有有效唯一身份的丰富的数字标记物的作用。用于确定核酸分子内碱基序列或用于使用核酸产生有序的荧光信号组的化学过程包括但不限于通过杂交测序(SBH)，连接测序(SBL)和合成测序(SBS)。

用于检测分子种类的测序可涉及检测内源序列或天然核酸序列，例如，在分析时存在于生物样品内的RNA和DNA分子。那些核酸分子可以包括已经通过任何文库构建步骤修饰的核酸分子，例如，衔接子连接，环化，第二和其他链合成，扩增(例如，PCR和RCA)。或者，测序可以用于检测经由探针导入的核酸标记物，如与免疫蛋白，传感器，亲和结合试剂，核酸捕获探针(例如OligoPaint，MIP，挂锁探针)等连接的核酸标记物。最后，测序可以用于顺序地或并行地检测核酸序列和合成条码。

在全组学FISSEQ的情况中，可以对所有靶分子同时(即，平行地)或顺序地对分子的子集进行测序用于检测分子种类，核酸序列或核酸标记物(图2)。特别地，用于检测分子种类的测序可以在“组(ome)”之间或之内分子的子集上进行，例如，对于转录组，基因组，蛋白质组，病毒组，代谢组，脂质组(lipome)，谱系组(lineage-ome)等。在分子标记物和序列之中将测序反应分区可以通过多种技术实现，包括使用测序-反应-正交条件，选择性引发，和部分标记。正交测序-反应指在相互排斥的条件下进行的测序反应，从而在任何一个特定反应期间，仅可以检测潜在模板的子集。选择性引发可与SBS和SBL化学过程相关，其中使用短的双链核酸“引发”测序反应，由此开始合成新的互补核酸。引发事件是序列依赖性的，即在所有被检测的分子中，子集可以利用不同的引发序列，从而使得仅有一个测序反应的子集通过导入任何一种序列引物而被引发。部分标记指将荧光部分选择性导入和定位于正在被检测的分子或标记物的子集，这与SBH，SBL和CHCR化学过程特别相关。例如，在使用SBH研究与DNA偶联的抗体以检测蛋白质的期间，仅有与抗体标记物互补的荧光探针的子集可以在任何一个时间被导入。

为了总结全组学FISSEQ测序方法，本发明提供了含有对应超过一种以上类型的生物聚合物的可检测标记物的3D水凝胶，其中可检测标记物是核酸序列。

本公开提供了鉴定生物分子并测量3D水凝胶内两种或更多种生物分子之间的绝对或相对空间关系的方法。

本公开提供了原位生成一组有序的荧光信号用于检测的方法，如经由通过杂交测序或通过使用聚合酶或连接酶合成互补链(合成测序，连接测序)的测序进行。

本公开提供了在FISSEQ文库内连续检测可检测标记物或分子物质的子集的方法，包括RNA，DNA，蛋白质和/或其他类型的生物分子，其中在包括连续检测过程的各步骤中检测到两种或更多种分子。

本公开内容提供了同时检测FISSEQ文库内分子物质或可检测标记物的方法，包括RNA，DNA，蛋白质和/或其他类型的生物分子。

本公开提供了试剂盒或系统，用于FISSEQ文库的荧光原位测序，所述FISSEQ文库包含超过一种与荧光部分偶联的寡核苷酸物质。在一些实施方式中，试剂盒包含DNA连接酶。在一些实施方式中，试剂盒还包含成像缓冲液和/或纳入缓冲液。

本公开提供了试剂盒或系统，用于FISSEQ文库的荧光原位测序，所述FISSEQ文库包含超过一种与荧光部分偶联的dNTP类似物物质。在一些实施方式中，试剂盒包含DNA聚合酶。在一些实施方式中，试剂盒包含成像缓冲液和/或纳入缓冲液。

本公开提供了试剂盒或系统，用于FISSEQ文库的荧光原位测序，所述FISSEQ文库包含超过一种与荧光部分偶联的自组装DNA发夹物质，例如，杂交链反应单体。在一些实施方式中，试剂盒包含超过一种DNA寡核苷酸物质，其包含与亲和力结合条码序列互补的序列。在一些实施方式中，试剂盒包含成像缓冲液。在一些实施方式中，试剂盒包含杂交缓冲液。在一些实施方式中，试剂盒还包含HCR扩增缓冲液。

计算鉴定

全组学FISSEQ可以生成以一组图像为特征的一类数据，所述一组图像对应样品内相同的物理空间并构成样品。

对于这些图像数据中的一些，如由单一种类的(single-identity)SBH和染色产生的图像数据，单个图像可以包含鉴定和定位靶分子所需的所有信息，在这种情况中，关于“图像周期”的信息以及相应的化学研究在采集过程中与图像数据以数字方式连接，并且足以进行鉴定。该信息可以在图像元数据中连接，或者以其他方式与图像数据相关联，如通过时间戳，唯一图像标识符，图像文件路径，数据库注释等。

对于图像数据的其他方面，可以鉴定对象并与一组时间有序的荧光信号(例如，测序读数)连接。为了将这种类原始图像数据处理成分子鉴定和定位，可能需要将原始图像数据处理成“读取”，其是用于识别的高维向量，通常包括一组有序的标识符，例如核碱基种类，整数或其他符号(例如“ACTCTA”，“0102010120”等)。测序读数还可以具有伴随信息，包括对空间坐标和其他空间或基于图像的性质、质量数据等的参照。在某些情况中，测序读数的构建构成分子识别的总体，如用于测序基因组DNA。在其他情况中，有序的信号被映射到参考字典，其在生物信息学中通常称为“对齐”。

对于全组学测序，所有读取可以与称之为参照的统一查找字典同时对齐，如已知RNA或DNA序列的数据库，或合成条码的字典，或包含多个来源和类型标识符的混合参照。或者，部分测序读数被用于指导查找字典查找，例如，使用测序读数的部分作为地址来确定正在鉴定何种类型的分子，以便选择合适的参照数据库。或者，可以针对许多参考文献连续地分析读数。在读取匹配超过一个可能的标识符的情况中，将种类分配给读取可以是概率性的。

在条码测序的情况中，可以构建条码，用于增强检测的稳健性，例如，通过将检错码和/或纠错码的特征纳入条码序列中。例如，合成条码可以以某个汉明(Hamming)距离分开，从而允许多个测序错误累积但不会导致错误鉴定。

为了总结计算分析，本公开提供了一种注释图像数据的方法，如在图像元数据中，或以其他方式通过与图像数据相关的注释，如通过时间戳，唯一图像标识符，图像文件路径，数据库注释等，从而使图像数据与正在被检测的可检测标记物的性质相关联。

本公开提供了分析多组学或全组学FISSEQ数据的方法，包括将测序读数与分子标识符或分子条码序列的一个或多个数据库比对的步骤。

本公开提供了通过纳入错误检测或错误校正信息来计算性设计分子标识符或分子条码序列的方法。

本文所用的核酸化学、生物化学、遗传学和分子生物学的术语和符号遵循本领域的标准论述和文本中的术语和符合，例如，Kornberg和Baker，DNA Replication(《DNA复制》)，第二版(W.H.弗里曼出版社(W.H.Freeman)，纽约，1992)；Lehninger，Biochemistry(《生物化学》)，第二版(沃斯出版社(Worth Publishers)，纽约，1975)；Strachan和Read，Human Molecular Genetics(《人类分子遗传学》)，第二版(WL出版社(Wiley-Liss)，纽约，1999)；Eckstein编，Oligonucleotides andanalogs:A Practical Approach(《寡核苷酸和类似物：实践方法》)(牛津大学出版社(Oxford University Press)，纽约，1991)；Gait编，Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach(《寡核苷酸合成：实践方法》)(IRL出版社，牛津，1984)；等。

计算机控制系统

本公开提供了被编程为实现本公开的方法的计算机控制系统。图3显示了计算机系统301，其经编程或以其他方式配置成协助检测或鉴定生物分子，基本上如全文所述。计算机系统301可以调节生物分子检测中利用的本公开的组件和/或装置的各个方面，例如，光源，检测器(例如，光检测器)，用于释放试剂的装置或组件，用于提供反应条件(例如，杂交，测序，酶促反应)的装置或组件等。计算机系统301可以是用户的电子设备或相对于电子设备远程定位的计算机系统。电子设备可以是移动电子设备。

计算机系统301包括中央处理单元(CPU，本文也称至为“处理器”和“计算机处理器”)305，其可以是单核或多核处理器，或者是用于并行处理的多个处理器。计算机系统301还包括存储器或存储器位置310(例如，随机存取存储器，只读存储器，闪存)，电子存储单元315(例如，硬盘)，用于与一个或多个其他系统通信的通信接口320(例如，网络适配器)和外围设备325，如缓存，其他存储器，数据存储和/或电子显示适配器。存储器310、存储单元315、接口320和外围装置325通过诸如主版的通信总线(实线)与CPU 305通信。存储单元315可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据存储库)。计算机系统301可借助于通信接口320操作性地连接到计算机网络(“网络”)330。网络330可以是互联网，因特网和/或外联网，或与互联网沟通内联网和/或外联网。在某些情况中，网络330是电信和/或数据网络。网络330可以包括一个或多个计算机服务器，其可以实现分布式计算，如云计算。在一些情况中，借助于计算机系统301，网络330可以实现对等网络，这使得连接到计算机系统301的装置可以充当客户端或服务器。

CPU 305可以执行一系列机器可读指令，其可以体现在程序或软件中。指令可以存储在存储器位置，如存储器310。指令可以指向CPU 305，CPU 305随后可以编程或以其他方式配置CPU 305以实现本公开的方法。由CPU 305执行的操作的实例可以包括提取，解码，执行和回写。

CPU 305可以是电路的一部分，如集成电路。系统301的一个或多个其他组件可以包括在电路中。在某些情况中，该电路是专用集成电路(ASIC)。

存储单元315可以存储文件，如驱动程序，库和保存的程序。存储单元315可以存储用户数据，例如，用户偏好和用户程序。在一些情况中，计算机系统301可以包括在计算机系统301外部的一个或多个附加数据存储单元，如位于通过内联网或因特网与计算机系统301通信的远程服务器上。

计算机系统301可以通过网络330与一个或多个远程计算机系统通信。例如，计算机系统301可以与用户(例如，检测本公开生物分子的用户)的远程计算机系统通信。远程计算机系统的实例包括个人计算机(例如，便携式PC)，平板或平板电脑(例如，iPad，GalaxyTab)，电话，智能电话(例如，iPhone，支持Android的设备，))或个人数字助理。用户可以经由网络330访问计算机系统301。

这里描述的方法可以通过存储在计算机系统301的电子存储位置上的机器(例如，计算机处理器)可执行代码来实现，例如，在存储器310或电子存储单元315上。机器可执行或机器可读代码可以软件的形式提供。在使用过程中，代码可以由处理器305执行。在某些情况下，可从存储单元315获取代码并将其存储在存储器310供处理器305快速访问。在一些情况中，可以排除电子存储单元315，并将机器可执行指令存储在存储器310中。

代码可以被预编译并配置用于具有适于执行代码的处理器的机器，或者可以在运行期间编译。代码可以用编程语言提供，可以选择该编程语言使代码能够以预编译或编译的方式执行。

本文所提供的系统和方法的方面，如计算机系统301可以在编程中实现。该技术的各个方面可以被认为是“产品”或“制造品”，特别是以在一种计算机可读介质中进行或实施的机器(或处理器)可执行代码和/或相关数据的形式。机器可执行代码可以存储在电子存储单元上，如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪存)或硬盘。“存储”类型的介质可以包括计算机、处理器等或其相关模块的任何或所有有形存储器，如各种半导体存储器，磁带驱动器，磁盘驱动器等，其可以随时提供用于软件编程的非瞬时存储。软件的所有或部分可以有时通过互联网或各种其它远程通信网络通信。例如，这样的通信可以将软件从一台计算机或处理器加载到另一台计算机或处理器中，例如，从管理服务器或主计算机加载到应用服务器的计算机平台中。因此，可以包括软件元件的其它类型的媒介包括光波、电波和电磁波，诸如跨越本地装置之间的物理接口使用的，通过有线和光学陆地线网络以及跨越各种空中链路的。诸如有线或无线连接、光链路等承载这些波的物理元件也可以被认为是承载软件的介质。如本文所用，除非限于非暂时性，有形“存储”介质，诸如计算机或机器“可读介质”之类的术语指代参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。

因此，诸如计算机可执行代码之类的机器可读介质可以采用许多形式，包括但不限于有形存储介质，载波介质或物理传输介质。非易失性储存介质介质包括，例如，光盘或磁盘，如任何计算机或诸如可以用于实施图中所示的数据库等的那些中的任何储存装置。易失性存储介质包括动态存储器，如此类计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆、铜线和光纤，包括在计算机系统内包含总线的电线。载波传输介质可以采取电信号或电磁信号的形式，或者诸如在射频(RF)和红外(IR)数据通信期间产生的声波或光波的形式。因此，计算机可读介质的常见形式包括例如软盘(floppy disk)、软磁盘(flexibledisk)、硬盘、磁带、任何其它磁介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其它光学介质、打孔卡、纸带、具有孔图样的任何其它物理介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其它存储器芯片或盒、传送数据或指令的载波、电缆、或传输诸如载波的链接、或者计算机可从其中读取编程代码和/或数据的任何其它介质。这样形式的计算机可读介质中的许多可能包括将一个或多个指令的一个或多个序列运送到处理器以进行执行。

计算机系统301可包括电子显示器335或与电子显示器335通信，电子显示器335包括用户界面(UI)340，用于提供例如本公开的容器或三维矩阵的至少一部分，用于检测生物分子。UI的实例包括但不限于图形用户界面(GUI)和基于web的用户界面。

本公开的方法和系统可以通过一种或多种算法来实现。算法可以在由中央处理单元305执行时通过软件实现。例如，可以执行该算法从而利用本公开所公开的方法和系统检测多种生物分子。多种生物分子可以是本文所述的不同类型。任选地，可以执行算法，从而控制或实现本文所述系统的组件(例如，光源，检测器等)的操作以实现生物分子的检测。

本文所用的术语仅仅用来描述具体的实施方式，而不是用于限制本发明。如本文所用，单数形式的“一个”，“一种”和“该”也包括复数形式，除非上下文另有明确说明。还应当理解的是，本说明书所用属于“包括”和/或“包含”或“含有”和/或“含”特指所述特征，区域，整数，步骤，操作，元件和/或组件的存在，但不排除存在或添加一个或多个其他特征，区域，整数，步骤，操作，元件，组件和/或其组合。

此外，本文所用相对术语诸如“下”或“底”和“上”或“顶”来描述一个元件与其他元件的关系，如图中所示。应当理解，除了图中所示的方向之外，相对术语旨在包括元件的不同方向。例如，如果将其中一个图中的元件颠倒，那么所述位于其他元件“下”侧的元件将被定向在所述其他元件的“上”侧。因此，示例性术语“下”可以包括“下”和“上”的取向，这取决于图的特定取向。类似地，如果将其中一个图中的元件颠倒，那么所述在其他元件“下方”或“之下”的元件将被定向在所述其他元件“上方”。因此，示例性术语“下方”或“之下”可以包括上方和下方的方向。

虽然本文显示和描述了本发明的优选实施方式，但本领域技术人员显然了解这些实施方式仅以举例方式提供。本领域技术人员在不背离本发明的情况下可以作出多种改变、变化和替代。应理解，本文所述的本发明实施方式的各种替代形式可用于实施本发明。本文所述实施方式的许多不同组合是可能的，并且因此将这类组合认为是本公开的一部分。此外，结合本文任何一个实施方式讨论的所有特征可以容易地适用于本文的其他实施方式。所附权利要求书确定了本发明范围，这些权利要求范围内的方法和结构以及其等同物均为本发明所涵盖。

实施例

实施例1-示例性直接单蛋白测序

图1A-1C描述了根据实施方式的直接单个蛋白质测序的示意图。图1A显示了可以通过N-识别蛋白结合，单分子荧光检测，如使用环状杂交链反应(CHCR)，和N-末端残基的酶促切割的循环来确定氨基酸残基的有序序列。图1B显示使用分别与L/F/Y和R/K/H结合的Clps和UBR1的指纹识别将肽序列映射到低维的指纹。图1C显示了使用来自RefSeq的蛋白质的示例性实验数据，该指纹识别方法在仅确定约25个残基后实现了与完全测序方法相等的鉴定。由于RefSeq数据库中存在多个条目(如蛋白质同种型)，鉴定可能在约60％处渐近。

实施例2-共分析来自组织上原位单细胞“组学”的空间信号

图2描述了由原位单细胞“组学(omic)”数据共分析空间信息的目标。上图：目标(左)和CellNet官能(黑色虚线框，右)。CellNet通过系统分析表达数据为许多细胞类型(nCT)开发基因调控网络(GRN)概况。然后将来自工程化组织(eCT)的表达概况与这些谱相匹配以鉴定对应性和差异(黑色虚线框，左侧)。示出了使用所示方法由重编程至肝细胞样细胞的成纤维细胞的CellNet分析的实例(黑色虚线框，右)。虽然这些“iHep”系满足肝细胞的标记物和功能性测试(包括动物互补)，但CellNet显示它们继续强烈表达成纤维细胞对比肝脏的特征性。其他转录因子(总共4个)的表达改善了肝脏匹配，但不消除成纤维细胞种类(“4个事实”)。还示出了胎儿和成人肝脏的CellNet分析；胎儿肝脏表现出造血干细胞(HSPC)以及与其在胎儿造血中的作用一致的肝脏特征性。CellNet表明iHep系也在很小程度上表达肠道特征性(结肠)。CellNet分析在改善结肠特征性的因素中的应用导致细胞可以在功能上植入结肠，这表明iHeps实际上是双潜能内胚层祖细胞。第一步是调整CellNet处理以接受原位“组学”数据，从FISSEQ RNA表达数据开始(左上角，第1项，箭头)，然后整合空间和GRN分析(左上角，第2项，箭头)，描绘了其中预期的实例(底部，虚线框)。细胞形态可以在组织的单个细胞中分析并与CT/GRN概况相关联。示出了使用ACME方法为FISSEQ制备的细胞的图像分割的初步测试(左，分割；右，染色覆盖)。可以通过寻找与不同CT在空间邻近关系或其他空间结构上匹配的细胞来检测相互作用，该细胞的CT GRN产生彼此相互作用或调节的产物。藉由单细胞原位蛋白质概况可以更直接地观察到相互作用和形态。这些空间和GRN信息的共同分析没有深度整合，因为它们依赖于预先概况的nCT，其与使用当前的CellNet逻辑的样本“组学”数据比较(黑盒子，顶部)。该逻辑鉴定与特定nCT相关联的GRN网络，然后可以在空间上对其进行分析(架构，左侧，带圆圈的GRN表示特定CT)。通过样本中细胞的“组学”检测到的GRN概况对样本中的细胞进行无监督聚类并检测聚类的空间组织结构，深度整合的空间/GRN分析可以发现先前未概况的细胞类型或亚型GRN(架构，右侧，带圆圈的GRN对应样本中空间组织的细胞簇)。

Claims (103)

1.一种用于对生物样品的一种或多种生物分子进行检测或鉴定的系统，所述系统包括：容器，所述容器包含(i)包含所述一种或多种生物分子的所述生物样品和(ii)膨胀剂和接合部分，其中所述膨胀剂能在施加刺激后活化而体积增大，从而产生包含所述一种或多种生物分子的三维基质，其中所述刺激是电磁刺激、电化学刺激或热刺激，其中所述一种或多种生物分子经由所述接合部分与所述三维基质偶联，并且其中所述三维基质保留所述生物分子在所述生物样品内的绝对或相对空间关系。

2.一种用于对生物样品的一种或多种生物分子进行检测或鉴定的系统，所述系统包括：容器，所述容器包含(i)包含所述一种或多种生物分子的所述生物样品和(ii)膨胀剂和接合部分，其中所述膨胀剂能在施加刺激后活化，从而产生包含所述一种或多种生物分子的三维基质，其中所述刺激不是液体，其中所述一种或多种生物分子经由所述接合部分与所述三维基质偶联，并且其中所述三维基质保留所述生物分子在生物样品内的绝对或相对空间关系。

3.如权利要求1或2所述的系统，其中，所述三维基质包含所述生物样品，所述生物样品含有所述生物分子。

4.如权利要求3所述的系统，还包括：与所述容器操作性偶联的所述刺激的源，其中向所述膨胀剂施加所述刺激活化所述膨胀剂以形成所述三维聚合物基质，其中三维聚合物基质保留所述生物分子在所述生物样品内的绝对或相对空间关系。

5.如权利要求4所述的系统，还包括与所述刺激的所述源操作性偶联的一个或多个计算机处理器，其中所述一个或多个计算机处理器经单独地或共同地编程以指导所述刺激的所述源向所述膨胀剂施加所述刺激，从而活化所述膨胀剂以形成所述三维聚合物基质。

6.如权利要求1或2所述的系统，其中，所述生物样品为细胞或其衍生物。

7.如权利要求1或2所述的系统，其中，所述生物分子是核糖核酸分子(RNA)，脱氧核糖核酸分子(DNA)，或RNA和DNA。

8.如权利要求1或2所述的系统，其中，所述电化学刺激是电化学反应。

9.如权利要求1或2所述的系统，其中，所述膨胀剂被进一步设置为用作收缩剂。

10.如权利要求9所述的系统，其中，所述收缩剂是光活化的收缩剂，电化学活化的收缩剂或热活化的收缩剂。

11.如权利要求1或2所述的系统，其中，所述膨胀剂包含螯合官能。

12.如权利要求1或2所述的系统，其中，所述膨胀剂包括乙二胺四乙酸(EDTA)。

13.如权利要求12所述的系统，其中，所述EDTA是邻硝基苄基笼状EDTA或醌-酯保护的EDTA。

14.如权利要求1或2所述的系统，其中，所述三维基质被设置成在膨胀剂活化后膨胀1.1至10倍。

15.如权利要求14所述的系统，其中，所述一个或多个生物分子的绝对或相对空间关系在三维基质膨胀后保留。

16.如权利要求1或2所述的系统，其中，所述接合部分包括或者操作性偶联反应性基团。

17.如权利要求1或2所述的系统，其中，所述接合部分包括胺、硫醇、叠氮、炔烃或点击反应性基团。

18.如权利要求1或2所述的系统，其中，所述接合部分包括可聚合基团。

19.一种使用权利要求1或2的三维基质的方法，所述方法包括经由光、电化学或热使所述三维基质膨胀。

20.如权利要求19所述的方法，还包括在所述膨胀后将用于荧光原位测序(FISSEQ)的试剂流入三维基质中。

21.如权利要求19所述的方法，还包括经由光、电化学或热使所述三维基质收缩。

22.一种用于原位检测或鉴定生物样品内的生物分子的方法，所述方法包括：

(a)提供容器，所述容器包含(i)包含所述生物分子的所述生物样品和(ii)膨胀剂和接合部分，其中所述膨胀剂能在施加刺激后活化，从而产生包含所述生物分子的三维基质，其中所述刺激是电磁刺激、电化学刺激或热刺激；以及

(b)向所述膨胀剂施加所述刺激，从而活化所述膨胀剂以生成包含所述生物分子的三维基质，其中所述生物分子经由所述接合部分与所述三维基质偶联，所述三维基质保留所述生物分子在所述生物样品内的绝对或相对空间关系。

23.一种用于原位检测或鉴定生物样品内的生物分子的方法，所述方法包括：

(a)提供容器，所述容器包含(i)包含所述生物分子的所述生物样品和(ii)膨胀剂和接合部分，其中所述膨胀剂能在施加刺激后活化，从而产生包含所述生物分子的三维基质，其中所述刺激不是液体；以及

(b)向所述膨胀剂施加所述刺激，从而活化所述膨胀剂以生成包含所述生物分子的三维基质，其中所述生物分子经由所述接合部分与所述三维基质偶联，所述三维基质保留所述生物分子在所述生物样品内的绝对或相对空间关系。

24.如权利要求22或23所述的方法，其中，所述三维基质包含所述生物样品，所述生物样品含有所述生物分子。

25.如权利要求22或23所述的方法，其中，所述生物样品为细胞或其衍生物。

26.如权利要求22或23所述的方法，其中，所述方法还包括检测所述三维基质中所述生物分子的至少一个子集。

27.如权利要求22或23所述的方法，其中，所述方法还包括：施加所述刺激的源，其中所述源操作性偶联所述容器，其中所述施加活化所述膨胀剂形成所述三维聚合物基质，其中三维聚合物基质保留所述生物分子在所述生物样品内的绝对或相对空间关系。

28.如权利要求26所述的方法，其中，所述施加所述源包括在一个或多个计算机处理器的协助下将所述刺激的所述源导向所述膨胀剂，所述计算机处理器单独地或共同地经编程以引导所述源。

29.如权利要求22或23所述的方法，其中，所述膨胀剂被进一步设置成用作收缩剂。

30.如权利要求29所述的方法，还包括经由光、电化学或热使三维基质收缩。

31.一种聚合的三维基质，用于鉴定一种或多种生物分子，所述聚合的三维基质包含：

包含骨架的三维聚合物；和

与三维聚合物的骨架偶联的接合部分，其中所述接合部分被设置成保留所述一种或多种生物分子在三维聚合物内的绝对或相对空间关系，

其中聚合的三维基质不包含用于鉴定所述一种或多种生物分子的探针。

32.如权利要求31所述的聚合的三维基质，其中，所述接合部分被设置成捕获所述探针。

33.如权利要求31所述的聚合的三维基质，其中，所述三维聚合物基质被设置成捕获所述探针。

34.如权利要求31所述的聚合的三维基质，还包含与三维聚合物整合的生物样品，并且其中所述接合部分被设置成保留所述一种或多种生物分子在所述生物样品内的绝对或相对空间关系。

35.如权利要求31所述的聚合的三维基质，其中，所述接合部分被设置成捕获所述探针，所述探针与所述一种或多种生物分子偶联。

36.如权利要求31所述的聚合的三维基质，其中，所述骨架是聚(乙烯乙二醇)骨架。

37.如权利要求31所述的聚合的三维基质，其中，所述接合部分以瓶刷拓扑结构与所述骨架偶联。

38.如权利要求31所述的聚合的三维基质，其中，所述接合部分包括反应性基团。

39.如权利要求31所述的聚合的三维基质，其中，所述接合部分包括胺、硫醇、叠氮、炔烃或点击反应性基团。

40.如权利要求31所述的聚合的三维基质，其中，所述接合部分包括可聚合基团。

41.一种使用权利要求31所述聚合的三维基质检测生物分子的方法，所述方法包括：提供所述聚合的三维基质；使所述探针流入所述聚合的三维基质；和在所述聚合的三维基质中捕获所述探针。

42.如权利要求41所述的方法，还包括检测所述探针。

43.如权利要求42所述的方法，还包括经由所述探针对靶序列进行测序。

44.如权利要求41所述的方法，其中，所述使所述探针流入包括使与生物分子偶联的探针流入，所述生物分子待通过所述探针检测。

45.如权利要求44所述的方法，其中，所述捕获所述探针包括经由所述接合部分捕获所述探针。

46.一种用于鉴定一种或多种生物分子的方法，所述方法包括：

(a)提供容器，所述容器包含所述一种或多种生物分子以及聚合的三维基质，所述聚合的三维基质包含(i)含有骨架的三维聚合物和(ii)与所述三维聚合物的骨架偶联的接合部分，其中所述接合部分被设置成保留所述一种或多种生物分子在所述三维聚合物内的绝对或相对空间关系，并且其中所述三维聚合物不包含用于鉴定所述一种或多种生物分子的探针；和

(b)引导所述探针通过所述聚合的三维基质。

47.如权利要求46所述的方法，其中，所述一种或多种生物分子包含在细胞或其衍生物中。

48.如权利要求47所述的方法，其中，所述一种或多种生物分子包含在源自所述细胞的细胞基质中。

49.如权利要求46所述的方法，还包括捕获所述聚合的三维基质内的所述探针。

50.如权利要求49所述的方法，其中，所述捕获所述探针包括经由所述接合部分捕获所述探针。

51.如权利要求49所述的方法，其中，所述探针与所述一种或多种生物分子偶联。

52.如权利要求49所述的方法，还包括检测所述一种或多种生物分子。

53.如权利要求52所述的方法，还包括对所述一种或多种生物分子进行测序。

54.如权利要求46所述的方法，其中，所述骨架是聚(乙烯乙二醇)骨架。

55.如权利要求46所述的方法，其中，所述接合部分以瓶刷拓扑结构与所述骨架偶联。

56.如权利要求46所述的方法，其中，所述接合部分包括反应性基团。

57.如权利要求46所述的方法，其中，所述接合部分包括胺、硫醇、叠氮、炔烃或点击反应性基团。

58.如权利要求46所述的方法，其中，所述接合部分包括可聚合基团。

59.一种检测生物样品的多种生物分子的方法，所述方法包括：

(a)提供所述生物样品，所述生物样品包含至少两种不同类的多种生物分子；

(b)原位修饰所述多种生物分子以包含接合部分；

(c)原位连接所述接合部分和三维聚合物基质，其中所述接合部分被设置成保留所述多种生物分子在所述生物样品内的绝对或相对空间关系；和

(d)原位检测所述多种生物分子的至少一个子集。

60.如权利要求59所述的方法，其中，对所述生物分子进行光学检测。

61.如权利要求60所述的方法，其中，对所述生物分子进行荧光检测。

62.如权利要求59所述的方法，其中，所述生物样品为细胞或其衍生物。

63.如权利要求62所述的方法，其中，所述生物样品是源自所述细胞的细胞基质。

64.如权利要求59所述的方法，其中，所述生物分子包括脱氧核糖核酸(DNA)、蛋白质和小分子。

65.如权利要求64所述的方法，其中，所述生物分子包括蛋白质，并且所述检测包括对所述蛋白质进行测序。

66.如权利要求65所述的方法，其中，对所述蛋白质进行测序包括：酶促切割所述蛋白质的N-末端残基，和使具有可检测的标记物的亲和力结合物与所述蛋白质原位结合。

67.如权利要求66所述的方法，其中，所述亲和力结合物是N-末端氨基酸结合蛋白。

68.如权利要求66所述的方法，其中，所述可检测的标记物被设置成经由循环杂交链反应(HCR)或DNA纳米级测绘成像点积累(PAINT)提供信号放大。

69.如权利要求59所述的方法，其中，所述至少两种不同类的生物分子包括核糖核酸分子(RNA)，脱氧核糖核酸分子(DNA)、蛋白质和小分子。

70.如权利要求59所述的方法，还包括检测不同类别的生物分子之间的分子相互作用。

71.如权利要求70所述的方法，其中，检测不同类别的生物分子于彼此附近的存在提供所述分子相互作用的信号。

72.如权利要求59所述的方法，还包括测量两种或更多种不同类别的生物分子之间的空间距离。

73.如权利要求59所述的方法，其中，所述检测包括经由第二类生物分子的表达检测第一类生物分子的存在。

74.如权利要求73所述的方法，其中，所述第一类生物分子包括小分子。

75.如权利要求74所述的方法，其中，所述第二类生物分子是核酸。

76.如权利要求75所述的方法，其中，所述核酸是核糖核酸(RNA)，其中所述RNA的转录本由所述小分子通过转录抑制或活化来调节。

77.如权利要求75所述的方法，其中，所述核酸的丰度或存在指示所述小分子的丰度或存在。

78.如权利要求59所述的方法，其中，所述检测所述一种或多种生物分子使用荧光原位测序(FISSEQ)完成。

79.如权利要求59所述的方法，其中，所述接合部分包括反应性基团。

80.如权利要求59所述的方法，其中，所述接合部分包括胺、硫醇、叠氮、炔烃或点击反应性基团。

81.如权利要求59所述的方法，其中，所述接合部分包括可聚合基团。

82.一种检测生物样品的多种生物分子的方法，所述方法包括：

(a)提供所述生物样品，所述生物样品包含多种生物分子，其中多种生物分子包含第一生物分子，所述第一生物分子指示是否存在所述生物样品的第二生物分子；

(b)原位修饰所述第一生物分子以包含接合部分；

(c)原位连接所述接合部分和三维聚合物基质，其中所述接合部分被设置成保留所述第一生物分子在所述生物样品内的绝对或相对空间关系；

(d)检测所述第一生物分子；和

(e)在检测所述第一生物分子后鉴定是否存在所述第二生物分子。

83.如权利要求82所述的方法，其中(b)包括原位修饰所述第二生物分子以包含另外的接合部分，并且其中(c)包括原位连接所述另外的接合部分和所述三维聚合物基质，其中所述另外的接合部分被设置成保留所述第二生物分子在所述生物样品内的绝对或相对空间关系。

84.如权利要求82所述的方法，其中，所述第一类生物分子包括小分子。

85.如权利要求84所述的方法，其中所述小分子是代谢物。

86.如权利要求84所述的方法，其中，所述第二类生物分子是蛋白质。

87.如权利要求86所述的方法，其中所述蛋白质是转录阻遏物。

88.如权利要求86所述的方法，其中所述蛋白质是转录激活剂。

89.一种在单反应容器中原位检测两种或更多种类别生物分子的方法，所述方法包括：

(a)在所述单反应容器中提供多种生物分子，所述多种生物分子包含来自生物样品的所述两种或更多种类别生物分子的生物分子；

(b)原位形成含所述多种生物分子的聚合物基质，其中所述聚合物基质保留所述多种生物分子在所述生物样品中的绝对或相对空间关系；和

(c)检测所述多种生物分子的至少一个子集。

90.如权利要求89所述的方法，其中，所述生物分子经修饰以包含针对各生物分子的接合部分。

91.如权利要求90所述的方法，其中，所述接合部分能够连接所述聚合物基质。

92.如权利要求89所述的方法，还包括提供包含接合部分的引物或探针，其中所述接合部分能够连接所述聚合物基质。

93.如权利要求92所述的方法，其中，所述生物分子包括两种或更多种基因组DNA分子或其片段分子，并且其中所述接合部分被进一步用于保留DNA分子的绝对或相对空间关系。

94.如权利要求93所述的方法，其中，用所述聚合物基质形成基因组DNA FISSEQ文库。

95.如权利要求89所述的方法，其中，所述生物分子包括两种或更多种蛋白质物质分子或其片段分子，并且其中各蛋白质分子包含接合部分，所述接合部分被进一步用于保留蛋白质分子的绝对或相对空间关系。

96.如权利要求89所述的方法，还包括将DNA条码与所述聚合物基质接合或将DNA条码纳入原位形成的所述聚合物基质。

97.如权利要求89所述的方法，其中，所述生物分子包括小分子。

98.如权利要求97所述的方法，其中，各所述小分子包含接合部分，所述结合部分被进一步用于保留小分子和代谢物的绝对或相对空间关系。

99.权利要求89所述的方法，其中，将两个或更多个分子探针用于原位检测分子相互作用，其中所述两个或更多个分子探针各自包含DNA条码序列。

100.如权利要求89所述的方法，其中，所述检测还包括细胞学和/或组织学染色。

101.如权利要求89所述的方法，其中，所述聚合物基质能扩张，用于全组学FISSEQ的超分辨率检测。

102.如权利要求89所述的方法，其中，所述检测还包括利用计算分析。

103.如权利要求102所述的方法，其中，所述两种或更多种类别生物分子包括RNA、DNA、蛋白质、脂质和小分子。