CN117396613A - 用于分析物检测和探针解析的方法和组合物 - Google Patents

用于分析物检测和探针解析的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

在一些方面，本公开涉及用于准确检测和定量以高水平存在的分析物(如样品中的高表达基因)的方法和组合物。在一些实施方案中，本文公开的探针解析条形码序列不明确对应于任何特定的靶分析物，但可以用于解析由于与靶分析物的不同分子相关联的空间重叠信号引起的密集光学信号，从而使得能够解析密集“斑点”中的信号并准确计数与空间接近的分子相关联的斑点。还提供了试剂盒，所述试剂盒包含用于此类方法的探针。

Description

用于分析物检测和探针解析的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年6月1日提交的名称为“METHODS AND COMPOSITIONS FORANALYTE DETECTION AND PROBE RESOLUTION”的美国临时专利申请号63/195,613的优先权，该临时专利申请出于所有目的全文以引用方式并入本文。
技术领域
本公开总体上涉及用于检测样品中的一种或多种分析物的多种分子的方法和组合物。
背景技术
在同时检测多个信号的多重测定中，重要的是每个单独的信号可以彼此区分，以便可以从测定中收集尽可能多的信息。例如，在基于显微术的光学测定中，发射光学信号的单独“斑点”通常需要从样品中的相邻斑点中解析出来。然而，解析大量不同强度的信号仍然具有挑战性，并且需要改进的方法。本公开解决了这些和其他需求。
发明内容
在原位分析如涉及边杂交边测序(SBH)的那些的过程中，高表达的分析物会产生许多紧挨着的局部扩增探针，从而导致光学拥挤并限制定量的动态范围。大的信号斑点(例如，由于高的分析物丰度)可能彼此重叠和/或掩盖相邻的较小信号斑点，从而使得较小的斑点不可解析。另外，当亮斑点和相对暗的斑点在同一显微镜视场中时，暗斑点可能无法通过后续图像分析的斑点检测阈值。因此，高丰度分析物不仅可能使分析物本身的检测具有挑战性，而且还可能导致无法检测附近的信号斑点和/或同一视场中的较弱信号斑点。因此，需要改进的方法来精确检测和准确定量生物样品中高表达基因的表达水平。在一些方面，本公开涉及用于更准确地检测和定量以高水平存在于样品中的分析物的方法和组合物。
在一些实施方案中，本文公开了一种用于分析生物样品的方法，其包括：(a)使所述生物样品与各自包含靶特异性条形码序列的多种探针接触，其中所述多种探针中的第一探针包含第一探针解析条形码序列，并且所述多种探针中的第二探针包含第二探针解析条形码序列，其中所述第一探针靶向生物样品中靶分析物的第一分子，并且所述第二探针靶向生物样品中靶分析物的第二分子，并且靶特异性条形码序列对应于靶分析物；(b)检测与所述多种探针的所述靶特异性条形码序列相关联的多个信号；(c1)检测与第一探针解析条形码序列相关联的信号；以及(c2)检测与第二探针解析条形码序列相关联的信号，其中(c1)和(c2)的信号与与第一和第二探针解析条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针相关联，并分开检测(例如，不同时检测)第一和第二探针解析条形码序列。在一些实施方案中，所述方法还包括(d)使用在步骤(c1)和(c2)中检测到并分别归属于第一和第二探针的信号来解析在步骤(b)中检测到的指示靶分析物的多个信号。
在一些实施方案中，本文公开了一种用于分析生物样品的方法，其包括使生物样品与各自包含靶特异性条形码序列的多种探针接触，其中所述多种探针中的第一探针包含第一探针解析条形码序列，并且所述多种探针中的第二探针包含第二探针解析条形码序列。在一些实施方案中，所述多种探针靶向生物样品中的靶核酸，并且靶特异性条形码序列对应于靶核酸或其序列。在一些实施方案中，第一探针靶向生物样品中靶核酸的第一分子，第二探针靶向靶核酸的第二分子，并且靶核酸的第一和第二分子可以在生物样品中的相同位置处或不同位置处。在一些实施方案中，第一和第二探针解析条形码序列是不同的。在一些实施方案中，第一和第二探针解析条形码序列不对应于生物样品中的任何特定靶核酸，而是将第一探针与第二探针区分开，其中两种探针对应于相同的靶核酸。
在本文公开的任何实施方案中，方法可还包括检测与所述多种探针的靶特异性条形码序列相关联的多个信号。在本文公开的任何实施方案中，方法可还包括检测与第一探针解析条形码序列相关联的信号。在本文公开的任何实施方案中，方法可还包括检测与第二探针解析条形码序列相关联的信号。在一些实施方案中，与所述多种探针的靶特异性条形码序列相关联的多个信号中的每个信号可以与与第一探针解析条形码序列相关联的信号或与第二探针解析条形码序列相关联的信号相关联。例如，生物样品中给定位置处与靶特异性条形码序列相关联(因此与靶分析物如感兴趣的靶核酸相关联)的信号可以作为“斑点”检测到。可以配准“斑点”的位置，并且可以跟踪顺序探针杂交和检测循环中该位置处的信号，将其与来自先前循环的信号关联和/或比较，和/或编译以产生信号签名。因此，与第一或第二探针解析条形码序列相关联的信号可以与靶特异性条形码序列相关联(因此与靶分析物如感兴趣的靶核酸相关联)。然而，与第一或第二探针解析条形码序列相关联的信号仅与包含靶特异性条形码序列的探针的一个子集相关联，并且可以在与其他子集分开的检测通道中检测到。因此，在与单独的靶特异性条形码序列相关联的信号不能在空间上解析成单独的点的情况下，与第一或第二探针解析条形码序列相关联的信号可以在空间上解析。
在本文公开的任何实施方案中，与所述多种探针的靶特异性条形码序列相关联的多个信号可以包含不在空间上解析成单独的点的重叠信号。在本文公开的任何实施方案中，对于与靶特异性条形码序列相关联的重叠信号，每个重叠信号可以与与第一探针解析条形码序列相关联的信号或与第二探针解析条形码序列相关联的信号相关联，但不与两者都相关联，由此将与靶特异性条形码序列相关联的重叠信号解析成分别与第一和第二探针相关联的信号。
在本文公开的任何实施方案中，与靶特异性条形码序列相关联的多个信号可以在生物样品中的多个位置处检测到，与第一探针解析条形码序列相关联的信号可以在所述多个位置的第一子集处检测到，与第二探针解析条形码序列相关联的信号可以在所述多个位置的第二子集处检测到，并且所述多个位置的第一和第二子集不完全重叠。
在本文公开的任何实施方案中，与靶特异性条形码序列相关联的信号、与第一探针解析条形码序列相关联的信号和/或与第二探针解析条形码序列相关联的信号可以分别使用直接或间接与靶特异性条形码序列或其互补序列、第一探针解析条形码序列或其互补序列、和第二探针解析条形码序列或其互补序列结合的可检测探针检测，并且任选地检测可以包括滚环扩增(RCA)、杂交链反应(HCR)、线型寡核苷酸杂交链反应(LO-HCR)或引物交换反应(PER)或它们的任何组合。
在本文公开的任何实施方案中，靶特异性条形码序列的长度可以为约5、约10、约15、约20、约25、约30或约35个核苷酸。在本文公开的任何实施方案中，第一和第二探针解析条形码序列的长度可以独立地为约3、约5、约10、约15、约20、约25、约30或约35个核苷酸。在本文公开的任何实施方案中，靶特异性条形码序列的长度可以为约20个核苷酸，第一和第二探针解析条形码序列的长度可以为约5个核苷酸。
在本文公开的任何实施方案中，第一和/或第二探针还可以包含锚定序列。在本文公开的任何实施方案中，锚定序列可以与靶特异性条形码序列相邻，任选地其中锚定序列可以与靶特异性条形码序列的5’或3’核苷酸分开0、1、2、3、4、5个或更多个核苷酸。在本文公开的任何实施方案中，锚定序列可以在第一和第二探针之间是共同的。在本文公开的任何实施方案中，锚定序列可以在所述多种探针之间是共同的。在本文公开的任何实施方案中，锚定序列可以在靶向生物样品中的不同靶分析物的探针之间是共同的。在本文公开的任何实施方案中，锚定序列的长度可以为约5、约10、约15、约20、约25、约30或约35个核苷酸，任选地其中锚定序列的长度可以为约20个核苷酸。
在本文公开的任何实施方案中，第一和/或第二探针还可以包含一个或多个接头序列。在本文公开的任何实施方案中，第一和/或第二探针可以包含分别侧接第一或第二探针解析条形码序列的两个接头序列。在本文公开的任何实施方案中，所述一个或多个接头序列中的每一个的长度可以独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个核苷酸。在本文公开的任何实施方案中，所述一个或多个接头序列可以在第一和第二探针之间是共同的。在本文公开的任何实施方案中，所述一个或多个接头序列可以在所述多种探针之间是共同的。在本文公开的任何实施方案中，所述一个或多个接头序列可以在靶向生物样品中相同或不同的靶分析物的探针之间是共同的。
在本文公开的任何实施方案中，第一和/或第二探针解析条形码序列可以与靶特异性条形码序列相邻，任选地其中第一和/或第二探针解析条形码序列可以与靶特异性条形码序列的5’或3’核苷酸分开0、1、2、3、4、5个或更多个核苷酸。
在本文公开的任何实施方案中，所述多种探针还可以包括包含第三探针解析条形码序列的第三探针，并且所述方法还可以包括检测与第三探针解析条形码序列相关联的信号。在本文公开的任何实施方案中，所述多种探针还可以包括包含第四探针解析条形码序列的第四探针，并且所述方法还可以包括检测与第四探针解析条形码序列相关联的信号。在本文公开的任何实施方案中，与第一、第二、第三和/或第四探针解析条形码序列相关联的信号可以在分开的检测通道如不同的荧光通道中检测到。作为一个实例，可以使针对第一、第二、第三和第四探针解析条形码序列(或其互补序列)的可检测探针同时与生物样品接触，并且与每个探针解析条形码序列相关联的信号可以在红色、绿色、蓝色和黄色荧光通道中的一个中检测到。
在本文公开的任何实施方案中，第一、第二、第三和/或第四探针解析条形码序列可以在靶向相同的靶分析物(例如，靶核酸)的探针之间是不同的。
在本文公开的任何实施方案中，第一、第二、第三和/或第四探针解析条形码序列可以在各自靶向生物样品中的不同靶分析物的两种或更多种探针之间是共同的。在一些情况下，使用共同的探针解析条形码序列使额外的条形码序列的设计负担最小化。在一些情况下，共同的探针解析条形码序列是探针设计的“附加”特征，其提供额外的解析。例如，分别靶向基因X和基因Y的第一对探针可以共享共同的第一探针解析条形码序列，分别靶向基因X和基因Y的第二对探针可以共享共同的第二探针解析条形码序列，分别靶向基因X和基因Y的第三对探针可以共享共同的第三探针解析条形码序列，并且分别靶向基因X和基因Y的第四对探针可以共享共同的第四探针解析条形码序列。
在本文公开的任何实施方案中，第一、第二、第三和/或第四探针解析条形码序列可以与相同的生物体物种相关联。在本文公开的任何实施方案中，第一、第二、第三和/或第四探针解析条形码序列可以与不同的生物体物种相关联。在一些实施方案中，靶分析物的第一分子可以属于第一物种，靶分析物的第二分子可以属于不同于第一物种的第二物种，并且第一和第二探针解析条形码序列可以分别与第一和第二物种相关联。
在本文公开的任何实施方案中，靶分析物可以包含核酸序列，并且靶分析物可以任选地为靶DNA或RNA。在一些实施方案中，所述多种探针可以直接或间接与靶分析物的不同分子中的相同核酸序列结合。在一些实施方案中，所述多种探针中的两种或更多种各自可以直接或间接与靶分析物的不同分子中的不同核酸序列结合。
在本文公开的任何实施方案中，第一探针可以包含与靶分析物的第一核酸序列互补的第一靶结合序列，第二探针可以包含与靶分析物的第二核酸序列互补的第二靶结合序列。在一些实施方案中，第一和第二靶结合序列可以是相同的。在一些实施方案中，第一和第二靶结合序列可以是不同的。在一些实施方案中，第一和第二靶结合序列可以与靶分析物中的相同核酸序列杂交。在一些实施方案中，第一和第二靶结合序列可以与相同核酸分子中的不同、相邻和/或部分重叠的核酸序列杂交。例如，两种或更多种探针可以设计成具有不同的靶序列，这些靶序列平铺(tiled)在相同的核酸分子上。在一些情况下，由于结合效率低下，故靶向相同的核酸分子(例如，靶向平铺在核酸分子上的不同序列)的一种或一些但非全部探针与核酸分子结合。在一些实施方案中，靶分析物中的相邻核酸序列可以是不重叠的或部分重叠的。在一些实施方案中，靶分析物中的相邻核酸序列可以分开0、约5、约10、约15、约20或更多个核苷酸。在一些实施方案中，靶分析物中的相邻核酸序列可以在约2、约5、约10、约15、约20或更多个核苷酸处重叠。
在本文公开的任何实施方案中，第一和第二探针可以是环状探针或可环化探针或探针组。在本文公开的任何实施方案中，第一和/或第二探针可以包含核糖核苷酸，如不多于四个、不多于三个或不多于两个核糖核苷酸。
在本文公开的任何实施方案中，第一和第二探针可以通过使用靶分析物中的核酸序列和/或夹板作为模板的连接而环化。在本文公开的任何实施方案中，第一和第二探针可以是可环化探针，并且可以使用靶分析物中的核酸序列作为模板来连接可环化探针的末端，在连接之前进行或不进行间隙填充。在本文公开的任何实施方案中，可环化探针可以包含脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸，并且靶分析物可以是DNA或RNA，任选地其中所述靶分析物为基因组DNA、mRNA、cDNA或报告寡核苷酸(例如，直接或间接与结合剂如抗体偶联的报告寡核苷酸)。在本文公开的任何实施方案中，可环化探针(例如，挂锁探针)可以包含脱氧核糖核苷酸主链中的3’核糖核苷酸。
在本文公开的任何实施方案中，连接可以包括酶促连接和/或化学连接，和/或连接可以包括模板依赖性连接和/或非模板依赖性连接。在一些实施方案中，酶促连接可以包括使用具有RNA模板化DNA连接酶活性和/或RNA模板化RNA连接酶活性的连接酶。在本文公开的任何实施方案中，酶促连接可以包括使用选自小球藻病毒DNA连接酶(PBCV DNA连接酶)、T4 RNA连接酶、T4DNA连接酶和单链DNA(ssDNA)连接酶的连接酶。在本文公开的任何实施方案中，酶促连接可以包括使用PBCV-1DNA连接酶或其变体或衍生物和/或T4 RNA连接酶2(T4 Rnl2)或其变体或衍生物。
在本文公开的任何实施方案中，所述方法还可以包括在连接之前从生物样品去除未与靶分析物(例如，靶核酸)稳定地结合的第一探针、第二探针和/或夹板的分子的步骤，任选地，去除步骤可以包括一次或多次严格洗涤。
在本文公开的任何实施方案中，所述方法还可以包括在生物样品中原位产生环化的第一探针和环化的第二探针的产物。在本文公开的任何实施方案中，所述产物可以是使用滚环扩增(RCA)产生的扩增产物，任选地RCA可以包括线型RCA、分支RCA、树状RCA或它们的任何组合。
在本文公开的任何实施方案中，所述产物可以使用选自以下的聚合酶产生：Phi29DNA聚合酶、Phi29样DNA聚合酶、M2 DNA聚合酶、B103 DNA聚合酶、GA-1DNA聚合酶、phi-PRD1聚合酶、Vent DNA聚合酶、Deep Vent DNA聚合酶、Vent(外切-)DNA聚合酶、KlenTaq DNA聚合酶、DNA聚合酶I、DNA聚合酶I的Klenow片段、DNA聚合酶III、T3 DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、T5DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Bst聚合酶、rBST DNA聚合酶、N29 DNA聚合酶、TopoTaqDNA聚合酶、T7 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶及其变体或衍生物。
在本文公开的任何实施方案中，所述产物可以固定在生物样品中和/或与生物样品中的一种或多种其他分子交联。
在本文公开的任何实施方案中，所述方法可以包括对生物样品成像以通过顺序杂交、边杂交边测序、边连接边测序、边合成边测序、边结合边测序或其组合原位检测产物。
在本文公开的任何实施方案中，所述产物可以是滚环扩增(RCA)产物并且可以通过以下方式检测：使所述生物样品与直接或间接与RCA产物杂交的一种或多种可检测地标记的探针接触，和使所述一种或多种可检测地标记的探针与RCA产物去杂交，任选地所述接触和去杂交步骤可以用所述一种或多种可检测地标记的探针和/或直接或间接与RCA产物杂交的一种或多种其他可检测地标记的探针来重复。
在本文公开的任何实施方案中，所述产物可以是滚环扩增(RCA)产物并且可以通过以下方式检测：使所述生物样品与直接或间接与RCA产物杂交的一种或多种中间探针接触，所述一种或多种中间探针可以是可使用一种或多种可检测地标记的探针检测的，和使所述一种或多种中间探针和/或所述一种或多种可检测地标记的探针与RCA产物去杂交，任选地所述接触和去杂交步骤可以用所述一种或多种中间探针、所述一种或多种可检测地标记的探针、一种或多种其他中间探针和/或一种或多种其他可检测地标记的探针来重复。
在本文公开的任何实施方案中，所述一种或多种中间探针可以各自包含与RCA产物之一杂交的序列和与可检测地标记的探针杂交但不与RCA产物杂交的一个或多个突出部。
在本文公开的任何实施方案中，所述方法可以包括：(i)使所述生物样品与与靶特异性条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针接触；(ii)对所述生物样品成像以检测步骤(b)的所述多个信号；(iii)任选地从所述靶特异性条形码序列或其互补序列去除所述可检测探针；(iv)使所述生物样品与与所述第一探针解析条形码序列和所述第二探针解析条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针接触；(v)对所述生物样品成像以在第一检测通道中检测与第一探针解析条形码序列相关联的信号；(vi)对所述生物样品成像以在不同于第一检测通道的第二检测通道中检测与第二探针解析条形码序列相关联的信号；以及(vii)任选地从第一和第二探针解析条形码序列或其互补序列去除可检测探针。
在本文公开的任何实施方案中，与靶特异性条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针可以包括与靶特异性条形码序列或其互补序列杂交的中间探针和与中间探针杂交的可检测地标记的探针。
在本文公开的任何实施方案中，与第一和第二探针解析条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针可以包括与第一和第二探针解析条形码序列或其互补序列杂交的中间探针和与中间探针杂交的可检测地标记的探针。
在本文公开的任何实施方案中，与靶特异性条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针可以用不同于与第一和第二探针解析条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针的荧光标记的荧光标记直接或间接标记。在本文公开的任何实施方案中，所述方法可以不包括从靶特异性条形码序列或其互补序列去除可检测探针。在本文公开的任何实施方案中，与靶特异性条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针和与第一和第二探针解析条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针的检测可以通过使生物样品与：与靶特异性条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针和与第一和第二探针解析条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针接触来同时进行。在本文公开的任何实施方案中，对生物样品成像以检测来自与靶特异性条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针的多个信号和对生物样品成像以检测与第一和第二探针解析条形码序列相关联的信号可以按任何次序进行。在本文公开的任何实施方案中，在对生物样品成像以检测与第二探针解析条形码相关联的信号之后可以从生物样品去除与靶特异性条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针和与第一和第二探针解析条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针。
在本文公开的任何实施方案中，与靶特异性条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针可以用可在与与第一和第二探针解析条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针的荧光标记相同的荧光通道中检测的荧光标记直接或间接标记。在本文公开的任何实施方案中，所述方法可以包括从靶特异性条形码序列或其互补序列去除可检测探针。在本文公开的任何实施方案中，对生物样品成像以检测与第一和第二探针解析条形码序列相关联的信号可以按任何次序进行。
在本文公开的任何实施方案中，在对生物样品成像以检测与第一和第二探针解析条形码序列相关联的信号之间，所述方法可以不包括使生物样品与探针接触和去除探针。
在本文公开的任何实施方案中，使生物样品与与靶特异性条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针接触的步骤、对生物样品成像以检测与靶特异性条形码序列相关联的多个信号的步骤和去除可检测探针的任选步骤可以在使生物样品与与第一和第二探针解析条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针接触的步骤、对生物样品成像以在第一检测通道中检测与第一探针解析条形码序列相关联的信号的步骤和对生物样品成像以在第二检测通道中检测与第二探针解析条形码序列相关联的信号的步骤之前进行。替代地，在本文公开的任何实施方案中，使生物样品与与靶特异性条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针接触的步骤、对生物样品成像以检测与靶特异性条形码序列相关联的多个信号的步骤和去除可检测探针的任选步骤可以在使生物样品与与第一和第二探针解析条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针接触的步骤、对生物样品成像以在第一检测通道中检测与第一探针解析条形码序列相关联的信号的步骤和对生物样品成像以在第二检测通道中检测与第二探针解析条形码序列相关联的信号的步骤之后进行。
在本文公开的任何实施方案中，所述方法还可以包括将接触步骤(与与靶特异性条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针接触)、成像步骤(以检测所述多个信号)、任选的去除步骤(从靶特异性条形码序列或其互补序列去除可检测探针)、接触步骤(与与第一和第二探针解析条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针接触)、成像步骤(以在第一检测通道中检测与第一探针解析条形码序列相关联的信号)、成像步骤(以在第二检测通道中检测与第二探针解析条形码序列相关联的信号)和任选的去除步骤(从第一和第二探针解析条形码序列或其互补序列去除可检测探针)中的任何一个或多个重复一次或多次，每次使用不同的多种与靶特异性条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针和/或使用相同或不同的多种与第一和第二探针解析条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针。
在一些实施方案中，与第一探针解析条形码序列相关联的信号和与第二探针解析条形码序列相关联的信号可以在生物样品中的相同位置处检测到。在一些实施方案中，与第一探针解析条形码序列相关联的信号和与第二探针解析条形码序列相关联的信号可以在生物样品中的不同位置处检测到。在一些实施方案中，所述方法还可以包括配准成像步骤的图像以检测与靶特异性条形码序列相关联的多个信号、与第一探针解析条形码序列相关联的信号和与第二探针解析条形码序列相关联的信号。在一些实施方案中，与靶特异性条形码序列相关联的多个信号、与第一探针解析条形码序列相关联的信号和与第二探针解析条形码序列相关联的信号可以使用配准图像进行关联。在一些实施方案中，与靶特异性条形码序列相关联的多个信号可以包括在生物样品中的相同位置处或相邻位置处的重叠信号。在一些实施方案中，每个重叠信号可以与与第一探针解析条形码序列相关联的信号或与第二探针解析条形码序列相关联的信号相关联，但不与两者都相关联，从而解析重叠信号。
在一些实施方案中，本文公开了一种用于分析生物样品的方法，其包括：(a)使生物样品与多种环状或可环化探针接触，所述多种环状或可环化探针包括第一环状或可环化探针和第二环状或可环化探针，其中所述第一环状或可环化探针包含靶特异性条形码序列和第一探针解析条形码序列，并且所述第二环状或可环化探针包含靶特异性条形码序列和第二探针解析条形码序列，并且其中所述多种环状或可环化探针与生物样品中的不同核酸分子杂交，所述靶特异性条形码序列对应于靶核酸；(b)产生所述第一环状或可环化探针和所述第二环状或可环化探针的滚环扩增(RCA)产物；(c)使所述生物样品与在所述靶特异性条形码序列的互补序列处与所述RCA产物杂交的可检测探针接触；(d)检测与所述靶特异性条形码序列相关联的信号；(e)使生物样品与在第一探针解析条形码序列的互补序列处与RCA产物杂交的可检测探针和与在第二探针解析条形码序列的互补序列处与RCA产物杂交的可检测探针接触；以及(f)在分开的检测通道中检测与第一探针解析条形码序列相关联的信号和与第二探针解析条形码序列相关联的信号。
在本文公开的任何实施方案中，靶核酸可以是DNA或RNA。在本文公开的任何实施方案中，靶核酸可以是基因组DNA、mRNA、cDNA或靶向生物样品中的靶分析物的探针的报告寡核苷酸。在本文公开的任何实施方案中，第一和第二环状或可环化探针可以与相同的靶核酸的不同分子杂交。
在本文公开的任何实施方案中，靶特异性条形码序列可以是第一靶特异性条形码序列，靶核酸可以是第一靶核酸，并且所述多种环状或可环化探针还可以包括各自包含对应于与第一靶核酸不同的第二靶核酸的第二靶特异性条形码序列的一种或多种环状或可环化探针。在本文公开的任何实施方案中，所述多种环状或可环化探针可以包括：包含第二靶特异性条形码序列和第一探针解析条形码序列的第一环状或可环化探针，以及包含第二靶特异性条形码序列和第二探针解析条形码序列的第二环状或可环化探针。
在本文公开的任何实施方案中，可检测探针可以包括与RCA产物杂交的荧光标记探针。在本文公开的任何实施方案中，可检测探针可以包括与RCA产物杂交的中间探针和进而与中间探针杂交的荧光标记探针。
在本文公开的任何实施方案中，与靶特异性条形码序列相关联的信号可以包括不在空间上解析成单独的点的重叠信号，例如，与靶特异性条形码序列相关联的信号与与靶特异性条形码序列相关联的一个或多个其他信号不在空间上解析开。在本文公开的任何实施方案中，与第一探针解析条形码序列相关联的信号可以在第一检测通道中检测到并与在第一检测通道中检测到的其他信号在空间上解析开。在本文公开的任何实施方案中，与第二探针解析条形码序列相关联的信号可以在第二检测通道中检测到并与在第二检测通道中检测到的其他信号在空间上解析开。在本文公开的任何实施方案中，与第一探针解析条形码序列相关联的空间解析信号和与第二探针解析条形码序列相关联的空间解析信号中的一者或两者可以各自对应于在与靶特异性条形码序列相关联的信号的检测中不在空间上解析的信号。
在一些方面，本文公开了一种用于分析生物样品的方法，其可以包括：(a)使生物样品与各自包含与靶分析物相关联的靶特异性条形码序列的多种探针接触，所述多种探针中的第一探针可以包含与第一生物体物种相关联的第一探针解析条形码序列，并且所述多种探针中的第二探针可以包含与第二生物体物种相关联的第二探针解析条形码序列，并且其中第一探针可以靶向第一生物体物种的靶分析物的第一核酸序列而第二探针可以靶向第二生物体物种的靶分析物的第二核酸序列，并且靶特异性条形码序列可以对应于靶分析物；(b)检测与所述多种探针的所述靶特异性条形码序列相关联的多个信号；(c1)检测与第一探针解析条形码序列相关联的信号；以及(c2)检测与第二探针解析条形码序列相关联的信号，其中步骤(c1)和(c2)的信号与靶分析物相关联。
在一些实施方案中，第一核酸序列和第二核酸序列可以分别是第一和第二生物体物种中的靶分析物的同源物。在本文公开的任何实施方案中，第一和第二探针可以是环状或可环化探针或探针组。在本文公开的任何实施方案中，靶核酸可以是DNA或RNA。在本文公开的任何实施方案中，靶核酸可以是基因组DNA、mRNA、cDNA或靶向生物样品中的靶分析物的探针的报告寡核苷酸。
在本文公开的任何实施方案中，所述方法可以包括使生物样品与与靶特异性条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针接触；和使生物样品与与第一探针解析条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针和与第二探针解析条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针接触。
在本文公开的任何实施方案中，与第一探针解析条形码序列相关联的信号和与第二探针解析条形码序列相关联的信号可以在分开的检测通道中检测到。
在一些方面，本文公开了一种用于分析生物样品的试剂盒，其包含各自包含靶特异性条形码序列的多种探针，其中所述多种探针中的第一探针包含第一探针解析条形码序列，并且所述多种探针中的第二探针包含第二探针解析条形码序列，并且其中所述多种探针靶向生物样品中靶分析物(例如，靶核酸)的不同分子，所述靶特异性条形码序列对应于靶分析物。在一些方面，试剂盒还包含直接或间接与靶特异性条形码序列或其互补序列结合的可检测探针。在本文公开的任何实施方案中，试剂盒还可包含直接或间接与第一探针解析条形码序列或其互补序列结合的可检测探针。在本文公开的任何实施方案中，试剂盒还可包含直接或间接与第二探针解析条形码序列或其互补序列结合的可检测探针。
在一些实施方案中，用于分析生物样品的试剂盒可以包含多种环状或可环化探针，所述多种环状或可环化探针包括第一环状或可环化探针和第二环状或可环化探针，其中所述第一环状或可环化探针包含靶特异性条形码序列和第一探针解析条形码序列，所述第二环状或可环化探针包含靶特异性条形码序列和第二探针解析条形码序列，并且其中所述多种环状和可环化探针与生物样品中的不同核酸分子杂交，所述靶特异性条形码序列对应于靶核酸。在一些方面，试剂盒还可包含与靶特异性条形码序列的互补序列杂交的第一中间探针和与第一中间探针杂交的第一荧光标记探针。在本文公开的任何实施方案中，试剂盒还可包含与第一探针解析条形码序列的互补序列杂交的第二中间探针和与第二中间探针杂交的第二荧光标记探针。在本文公开的任何实施方案中，试剂盒还可包含与第二探针解析条形码序列的互补序列杂交的第三中间探针和与第三中间探针杂交的第三荧光标记探针。在本文公开的任何实施方案中，第二和第三荧光标记探针可以是可在不同的荧光通道中检测的。在本文公开的任何实施方案中，第一荧光标记探针可以是可在与第二荧光标记探针或第三荧光标记探针相同的荧光通道中检测的，并且第一荧光标记探针可以在第二和/或第三荧光标记探针的检测之前从生物样品中去除。替代地，在本文公开的任何实施方案中，第一荧光标记探针可以是可在与第二荧光标记探针或第三荧光标记探针不同的荧光通道中检测的。在这样的情况下，第一荧光标记探针不需要但可以在第二和/或第三荧光标记探针的检测之前从生物样品中去除。
在本文公开的任何实施方案中，靶特异性条形码序列可以是第一靶特异性条形码序列，靶核酸可以是第一靶核酸，并且所述多种环状或可环化探针还可以包括各自包含对应于与第一靶核酸不同的第二靶核酸的第二靶特异性条形码序列的一种或多种环状或可环化探针。在一些实施方案中，试剂盒还可包含所述多种环状或可环化探针，其可以包括包含第二靶特异性条形码序列和第一探针解析条形码序列的第一环状或可环化探针，以及包含第二靶特异性条形码序列和第二探针解析条形码序列的第二环状或可环化探针。
附图说明
以下附图展示了本公开的特征和优点的某些实施方案。这些实施方案无意于以任何方式限制所附权利要求书的范围。
图1A-1C示出了说明探针解析条形码(高分辨率标签)策略的示意图。图1A示出了用于检测基因X的四种挂锁探针。所有四种挂锁探针可以含有对应于基因X的共同的靶特异性条形码序列(例如，基因特异性条形码序列)并且每种探针可以含有探针解析条形码序列(也称为HR标签1、HR标签2、HR标签3和HR标签4)，其可以用于将一种基因X探针与其他三种基因X探针区分开。图1B示出探针解析条形码序列可以通过其相应的可检测探针如中间探针(例如，图中示出的L形探针)和识别中间探针的荧光标记探针来检测。图1C示出探针解析条形码序列可以在靶向不同分析物的探针之间是共同的，例如，针对基因X的挂锁探针和针对基因Y的挂锁探针可以共享相同的探针解析条形码序列，而分别包含针对基因X和基因Y的不同基因特异性条形码序列。
图2A示出了探针解析条形码策略的图示。最初用针对对应于感兴趣的基因的RCA产物中的靶特异性条形码序列的可检测探针检测信号，其中一些信号是重叠的并导致光学拥挤(图2A，左)。用针对探针解析条形码序列的可检测探针检测样品中的RCA产物，使得与对应于相同的感兴趣的基因的RCA产物的不同子集相关联的信号可以在不同的颜色通道(通道1-4)中检测到(图2A，中间)。将来自不同通道的信号斑点叠置以说明通过检测探针解析条形码序列可以实现更高的分辨率(图2A，右)。用于检测靶特异性条形码的颜色通道可以与通道1-4中的任何一个相同或不同。探针解析条形码序列可以按任何次序检测，如由不同通道中图像之间的双向箭头所指示。
图2B-2C示出了新鲜冷冻小鼠脑组织切片上高表达基因Malat-1的原位检测。图2B示出了组织切片中代表性细胞的荧光图像，其示出了在一个荧光通道中的基因特异性条形码检测和在四个分开的荧光通道中的探针解析条形码检测。图2C示出了对Malat-1获得的解析出的RCA产物的总数，其用靶特异性条形码检测定量并随后用探针解析条形码检测定量。
图3A-3B示出了来自弥漫内生性脑桥神经胶质瘤(DIPG)的PDX小鼠模型的样品上人和小鼠Malat-1的原位检测。
具体实施方式
本申请中提及的所有出版物(包括专利文献、科学文章和数据库)均出于所有目的全文以引用方式并入本文中，并入程度如同每一单独的出版物均以引用方式单独地并入一样。如果本文阐述的定义与以引用方式并入本文中的专利、专利申请、已公布的专利申请和其他出版物中阐述的定义相反或者说相矛盾，则本文阐述的定义优先于以引用方式并入本文中的定义。
本文所使用的章节标题仅用于组织目的，而不应被解释为限制所描述的主题。
I.概述
在制备高表达或丰富的靶(例如，基因)的原位测序文库时，动态范围可能受到信号的光学拥挤的阻碍。光学拥挤可能是许多局部扩增探针紧挨着造成的，其阻碍高表达基因的表达水平的精确定量。例如，对于高表达基因，扩增的探针极有可能彼此重叠或挨的非常近。这些扩增的探针进而将产生重叠或非常接近的信号，使用常见的光学检测方法，这些信号将作为一个单一信号检测到。结果，检测到的信号的总数将减少，导致检测到的表达水平低于样品中存在的表达水平。因此，需要用于精确定量高表达基因的表达水平的方法和组合物。
在一些方面，本公开提供了用于精确定量高表达基因的表达水平的方法和组合物。在一些实施方案中，提供了原位测序文库和条形码检测的方法，例如通过顺序探针杂交或边杂交边测序(SBH)反应。在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法允许其中一个或若干个高表达基因引起光学拥挤并限制动态范围的高度多重反应的解析。在一些方面，本文提供了使用多种探针(例如，挂锁探针)靶向单个基因来检测高表达基因的表达水平的方法和组合物，其中每种探针含有单独的探针解析条形码序列(“高分辨率标签”)。通过使用其相应的可检测探针(例如，SBH读出探针)标记和检测这些单独的探针解析条形码序列，每个基因可以在不同的多个荧光通道中检测到。在一些实施方案中，与相同的基因相关联的扩增(例如，RCA)产物的不同子集可以在不同的荧光通道中检测到，从而克服光学拥挤并增加高度多重扩增(例如，RCA)反应或具有一个或若干个高表达基因的样品的动态范围。因此，在一些方面，本文的组合物和方法特别适用于分析具有高扩增(例如，RCA)产物密度的样品，例如通过在分开的荧光通道中检测RCA产物的子集以更好地解析与RCA产物相关联的信号。
在一些实施方案中，可以使用含有不同的探针解析条形码序列的多种挂锁探针来靶向样品中已知或怀疑高表达的基因。在一些实施方案中，样品中已知或怀疑高表达的多个基因可以各自被含有不同的探针解析条形码序列的多种挂锁探针靶向。在一些实施方案中，样品中待检测的所有基因均被含有不同的探针解析条形码序列的多种挂锁探针靶向。在一些实施方案中，在针对不同基因的挂锁探针中使用同一组不同的探针解析条形码序列，并使用基因特异性条形码来将针对一个基因的挂锁探针与针对不同基因的挂锁探针区分开。在一些实施方案中，针对一个基因的多种挂锁探针可以结合到该基因的不同区域。在一些实施方案中，使用含有不同的探针解析条形码序列的多种挂锁探针作为模板来原位产生RCA产物。在一些实施方案中，可以使用针对每种不同的探针解析条形码序列的可检测探针来与RCA产物中的探针解析条形码序列或其互补序列杂交。
在一些方面，本文提供了使用多种挂锁探针靶向单个基因来检测物种起源的方法和组合物，其中每种探针含有单独的探针解析条形码序列(“物种特异性标签”)。通过使用其相应的可检测探针(例如，物种特异性读出探针)标记和检测这些单独的探针解析条形码序列，每个基因可以在不同的多个荧光通道中检测到。在一些实施方案中，与相同的基因相关联的扩增产物的不同子集可以在不同的荧光通道中检测到，例如通过在第一荧光通道中检测与第一物种相关联的第一探针的探针解析条形码序列(“物种特异性标签A”)并在另一荧光通道中检测与第二物种相关联的第二探针的探针解析条形码序列(“物种特异性标签B”)。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于分析生物样品的方法，其包括使生物样品与以下探针接触：(i)包含第一靶特异性条形码序列和第一探针解析条形码序列的第一探针，以及(ii)包含第二靶特异性条形码序列和第二探针解析条形码序列的第二探针。在一些实施方案中，第一和第二靶特异性条形码序列是相同的。在一些实施方案中，第一和第二探针靶向生物样品中的靶核酸(例如，基因组DNA、mtDNA、mRNA、cDNA、RCA产物或与结合剂如抗体缀合的寡核苷酸)。在一些实施方案中，第一和第二靶特异性条形码序列对应于核酸分子，并且第一和第二探针解析条形码序列将第一和第二探针彼此区分开。在一些实施方案中，第一和/或第二探针为环状探针。在一些实施方案中，第一和/或第二探针为可环化探针，如挂锁探针。在一些实施方案中，第一和第二靶特异性条形码序列为相同的条形码序列。在一些实施方案中，第一和第二靶特异性条形码序列在序列上不同，但两者都对应于生物样品中存在或怀疑存在的相同核酸。在本文中的任何实施方案中，第一探针解析条形码序列可以在各自靶向不同的分析物如不同的感兴趣的核酸序列的第一多种探针之间是共同的。在本文中的任何实施方案中，第二探针解析条形码序列可以在各自靶向不同的分析物如不同的感兴趣的核酸序列的第二多种探针之间是共同的。在一些实施方案中，第一多种探针和第二多种探针可以靶向相同或不同的分析物。
在本文公开的任何实施方案中，所述方法还可包括使生物样品与与第一和第二靶特异性条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针接触。在本文中的任何实施方案中，所述方法还可包括检测与生物样品中的靶特异性条形码序列相关联的信号以提供指示核酸分子的信号。
在本文公开的任何实施方案中，所述方法还可包括使生物样品与与第一和第二探针解析条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针接触。在本文中的任何实施方案中，所述方法还可包括检测与生物样品中的第一和第二探针解析条形码序列相关联的信号以提供指示第一和第二探针的信号。
在一些实施方案中，生物样品中多个位置处与靶特异性条形码序列相关联的信号被同时检测，例如，在相同的显微镜视场中和在相同的荧光通道中，而多个位置处与第一和第二探针解析条形码序列相关联的信号不都同时检测。例如，与第一探针解析条形码序列相关联的信号在一个荧光通道中检测到，而与第二探针解析条形码序列相关联的信号在不同的荧光通道中检测到。显微镜视场优选在不同的荧光通道之间保持相同，但视场可以改变，只要可以跟踪样品中的相同位置即可。例如，与相同的扩增(例如，RCA)产物相关联但在不同的荧光通道中检测到的信号可以彼此相关。在一些方面，虽然通过检测多个扩增(例如，RCA)产物中的靶特异性条形码序列或其互补序列，指示靶核酸(例如，高表达基因转录物)的信号可能被检测为重叠的斑点，但与每个特定的探针解析条形码序列或其互补序列相关联的信号对应于多个扩增(例如，RCA)产物的仅一个子集。因此，可以通过分开检测跨不同检测通道传播的信号来解析指示靶核酸的重叠信号。在一些情况下，跨不同通道的信号检测使得更容易解析每个检测通道中的信号斑点以及不同检测通道中原本会重叠的信号斑点。在一些情况下，跨不同通道的信号检测允许鉴定与待与特定起源(例如，物种起源如小鼠和人)相关联的相同靶分析物相关联的信号子集。
II.样品、分析物和靶序列
A.样品
本文公开的样品可以是或源自任何生物样品。本文公开的方法和组合物可以用于分析生物样品，所述生物样品可以使用多种技术(包括但不限于活检、手术和激光捕获显微术(LCM))中的任何一种从受试者获得，并且通常包括来自受试者的细胞和/或其他生物材料。除了上文所述的受试者之外，生物样品可以从原核生物(诸如细菌、古细菌、病毒或类病毒)获得。生物样品也可以从非哺乳动物生物体(例如，植物、昆虫、节肢动物、线虫、真菌或两栖动物)获得。生物样品也可以从真核生物获得，诸如组织样品、患者来源的类器官(PDO)或患者来源的异种移植物(PDX)。来自生物体的生物样品可以包含一种或多种其他生物体或其组分。例如，除了哺乳动物细胞和非细胞组织组分之外，哺乳动物组织切片可以包含朊病毒、类病毒、病毒、细菌、真菌或来自其他生物体的组分。可以从其获得生物样品的受试者可以是健康或无症状的个体、患有或怀疑患有疾病(例如，患有疾病诸如癌症的患者)或易患上疾病的个体、和/或需要疗法或怀疑需要疗法的个体。
生物样品可以包含任意数量的大分子，例如，细胞大分子和细胞器(例如，线粒体和细胞核)。生物样品可以作为组织样品(诸如组织切片、活检样品、芯针活检样品、针抽吸物或细针抽吸物)获得。样品可以是流体样品，诸如血液样品、尿液样品或唾液样品。样品可以是皮肤样品、结肠样品、颊拭子、组织学样品、组织病理学样品、血浆或血清样品、肿瘤样品、活细胞、培养细胞、临床样品(例如，全血或血液衍生制品、血细胞或培养的组织或细胞，包括细胞悬浮液)。在一些实施方案中，生物样品可以包含沉积在表面上的细胞。
生物样品可以源自本文提及的受试者或生物体的均质培养物或群体，或者可替代地源自几种不同生物体的集合，例如，在群落或生态系统中。
生物样品可以包括一个或多个患病细胞。患病细胞可能具有改变的代谢特性、基因表达、蛋白质表达和/或形态学特征。疾病的实例包括炎症性障碍、代谢性障碍、神经系统障碍和癌症。癌细胞可以源自实体瘤、血液恶性肿瘤、细胞系，或者作为循环肿瘤细胞获得。生物样品还可以包括胎儿细胞和免疫细胞。
生物样品可以包括包埋在3D基质中的分析物(例如，蛋白质、RNA和/或DNA)。在一些实施方案中，源自分析物(例如，蛋白质、RNA和/或DNA)或与之相关的扩增子(例如，滚环扩增产物)可以包埋在3D基质中。在一些实施方案中，3D基质可以包含通过化学和/或以酶促方式连接(例如，通过交联)的天然分子和/或合成分子网络。在一些实施方案中，3D基质可以包含合成的聚合物。在一些实施方案中，3D基质包含水凝胶。
在一些实施方案中，本文的基底可以是不溶于水性液体的任何支持物，并且允许在所述支持物上定位生物样品、分析物、特征和/或试剂(例如，探针)。在一些实施方案中，生物样品可以附着到基底上。生物样品的附着可以是不可逆的或可逆的，这取决于样品的性质和分析方法中的后续步骤。在某些实施方案中，通过将合适的聚合物涂层应用到基底上并且使样品与所述聚合物涂层接触，可以使样品可逆地附着到基底上。然后，例如使用至少部分溶解聚合物涂层的有机溶剂，可以将样品从基底上分离。水凝胶是适合用于此目的的聚合物的实例。
在一些实施方案中，基底可以用一种或多种物质涂覆或功能化，以促进样品附着到基底上。可以用于涂覆或功能化基底的合适物质包括但不限于凝集素、聚赖氨酸、抗体和多糖。
可以执行各种步骤来为测定和/或在测定期间制备或处理生物样品。除非另有说明，否则下文所述的制备或处理步骤通常可以以任何方式和以任何顺序组合，以适当地制备或处理特定样品用于和/或进行分析。
(i)组织切片
生物样品可以从受试者获得(例如，通过手术活检、整个受试者切片)或在生长基质或培养皿上体外生长为细胞群，并且作为组织薄片或组织切片制备用于分析。生长的样品可以足够薄，而无需进一步的处理步骤即可进行分析。可替代地，生长的样品和经由活检或切片获得的样品可以使用机械切割装置诸如振动切片机(vibrating blade microtome)制备成薄的组织切片。作为另一种替代方案，在一些实施方案中，薄的组织切片可以通过将生物样品的触摸印记施加到合适的基底材料上来制备。
组织切片的厚度可以是细胞最大横截面尺寸的分数(例如，小于0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1)。然而，也可以使用厚度大于最大横截面细胞尺寸的组织切片。例如，可以使用冷冻切片(cryostat section)，其可以是例如10-20μm厚。
更一般地，组织切片的厚度通常取决于用于制备切片的方法和组织的物理特性，因此可以制备和使用具有各种不同厚度的切片。例如，组织切片的厚度可以是至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.7、1.0、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、20、30、40或50μm。如果需要或方便，也可以使用更厚的切片，例如至少70、80、90或100μm或更厚。通常，组织切片的厚度在1-100μm、1-50μm、1-30μm、1-25μm、1-20μm、1-15μm、1-10μm、2-8μm、3-7μm或4-6μm之间，但是如上文所提及，也可以分析厚度大于或小于这些范围的切片。
也可以从单个生物样品中获得多个切片。例如，通过使用切片刀片对活检样品进行系列切片，可以从手术活检样品获得多个组织切片。系列切片之间的空间信息可以以这种方式保存，并且可以连续分析所述切片以获得关于生物样品的三维信息。
(ii)冷冻
在一些实施方案中，可以通过在适合于维持或保存组织结构的完整性(例如，物理特性)的温度下深度冷冻来制备生物样品(例如，如上文所述的组织切片)。可以使用任何数量的合适方法将冷冻组织样品切片(例如切薄片)到基底表面上。例如，可以使用设置在适合于保持组织样品的结构完整性和样品中核酸的化学特性的温度的冷冻切片机(例如，低温恒温器)制备组织样品。这样的温度可以是例如低于-15℃、低于-20℃或低于-25℃。
(iii)固定和后固定
在一些实施方案中，可以使用已建立的方法福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)来制备生物样品。在一些实施方案中，可以使用福尔马林固定和石蜡包埋来制备细胞悬浮液和其他非组织样品。在固定样品并包埋在石蜡或树脂块中后，可以如上文所述对样品进行切片。在分析之前，可以通过在适当的溶剂(例如，二甲苯)中温育组织切片，然后冲洗(例如，99.5％乙醇持续2分钟，96％乙醇持续2分钟，和70％乙醇持续2分钟)，从组织切片中去除石蜡包埋材料(例如，脱蜡)。
作为上文所述的福尔马林固定的替代方案，可以将生物样品固定在多种其他固定剂中的任何一种中，以在分析之前保存样品的生物结构。例如，可以通过浸泡在乙醇、甲醇、丙酮、多聚甲醛(PFA)-Triton以及它们的组合中来固定样品。
在一些实施方案中，对新鲜冷冻样品使用丙酮固定，所述新鲜冷冻样品可以包括但不限于皮质组织、小鼠嗅球、人脑肿瘤、人死后脑和乳腺癌样品。当进行丙酮固定时，可以不进行预透化步骤(下文描述)。或者，丙酮固定可以与透化步骤结合进行。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括一个或更多个后固定(post-fixing，也称为postfixation)步骤。在一些实施方案中，在使样品与本文公开的多核苷酸例如一种或更多种探针如环状或挂锁探针接触之后进行一个或更多个后固定步骤。在一些实施方案中，在包含探针和靶的杂交复合物在样品中形成之后进行一个或更多个后固定步骤。在一些实施方案中，在本文公开的连接反应(诸如将挂锁探针环化的连接)之前进行一个或多个后固定步骤。
在一些实施方案中，在使样品与非核酸分析物诸如蛋白质分析物的结合剂或标记剂(例如，抗体或其抗原结合片段)接触之后进行一个或多个后固定步骤。标记剂可以包含核酸分子(例如，报告寡核苷酸)，其包含与标记剂对应并且因此与分析物对应(例如，唯一地鉴定)的序列。在一些实施方案中，标记剂可以包含含有一个或多个条形码序列的报告寡核苷酸。
可以使用本文公开的任何合适的固定试剂(例如，在DEPC-PBS中的3％(w/v)多聚甲醛)进行后固定步骤。
(iv)包埋
作为上文所述的石蜡包埋的替代方案，可以将生物样品包埋在多种其他包埋材料中的任何一种中，以在切片和其他处理步骤之前为样品提供结构基底。在一些情况下，可以例如在分析从样品获得的组织切片之前去除包埋材料。合适的包埋材料包括但不限于蜡、树脂(例如，甲基丙烯酸树脂)、环氧树脂和琼脂。
在一些实施方案中，可以将生物样品包埋在基质(例如，水凝胶基质)中。以这种方式包埋样品通常涉及将生物样品与水凝胶接触，使得生物样品变得被水凝胶包围。例如，可以通过使样品与合适的聚合物材料接触并且活化聚合物材料以形成水凝胶来包埋样品。在一些实施方案中，形成水凝胶使得水凝胶在生物样品中内化。
水凝胶-基质的组成和对生物样品的应用通常取决于生物样品的性质和制备(例如，切片的、非切片的、固定类型)。作为一个实例，在生物样品是组织切片时，水凝胶-基质可以包括单体溶液和过硫酸铵(APS)引发剂/四甲基乙二胺(TEMED)加速剂溶液。作为另一个实例，在生物样品由细胞(例如，培养的细胞或从组织样品解离的细胞)组成时，细胞可以与单体溶液和APS/TEMED溶液一起温育。对于细胞，水凝胶-基质凝胶在隔室中形成，所述隔室包括但不限于用于培养、维持或运输细胞的设备。例如，可以用添加到隔室中的单体溶液加APS/TEMED形成水凝胶-基质至约0.1μm至约2mm的深度范围。
生物样品的水凝胶包埋的另外的方法和方面描述于例如Chen等人,Science 347(6221):543–548,2015，其全部内容以引用方式并入本文。
(v)染色
为了便于显现，可以使用各种染色剂和染色技术对生物样品进行染色。在一些实施方案中，例如，可以使用任何数目的染色剂对样品染色，包括但不限于吖啶橙、俾斯麦棕、胭脂红、考马斯蓝、甲酚紫、DAPI、曙红、溴化乙锭、酸性品红、苏木精、Hoechst染色剂、碘、甲基绿、亚甲蓝、中性红、尼罗蓝、尼罗红、四氧化锇、碘化丙啶、罗丹明或番红。
可以使用苏木精和曙红(H&E)染色技术、使用帕帕尼科拉乌染色(Papanicolaoustaining)技术、马松三色染色(Masson’s trichrome staining)技术、银染色技术、苏丹染色技术和/或使用高碘酸希夫(PAS)染色技术对样品进行染色。PAS染色通常在福尔马林或丙酮固定之后进行。在一些实施方案中，可以使用罗曼诺夫斯基染色剂(包括瑞氏染色剂(Wright’s stain)、詹纳尔氏染色剂(Jenner’s stain)、坎-格二氏染色剂(Can-Grunwaldstain)、利什曼染色剂(Leishman stain)和吉姆萨染色剂(Giemsa stain))对样品进行染色。
在一些实施方案中，可以将生物样品脱去染色。使生物样品脱去染色或脱色的方法通常取决于应用到样品上的染色剂的性质。例如，在一些实施方案中，通过抗体偶联将一种或多种免疫荧光染色剂应用于样品。可以使用诸如通过用还原剂和去污剂洗涤处理来切割二硫键、离液盐处理、用抗原修复溶液处理和用酸性甘氨酸缓冲液处理等技术来去除此类染色剂。用于多重染色和脱去染色的方法描述于例如Bolognesi等人,J.Histochem.Cytochem.2017；65(8):431-444；Lin等人,Nat Commun.2015；6:8390；Pirici等人,J.Histochem.Cytochem.2009；57:567–75；以及Glass等人,J.Histochem.Cytochem.2009；57:899–905中，每篇文献的全部内容以引用方式并入本文。
(vi)等容膨胀(Isometric Expansion)
在一些实施方案中，可以将包埋在基质(例如，水凝胶)中的生物样品等容膨胀。可以使用的等容膨胀方法包括水合，其是膨胀显微术中的一个制备步骤，如Chen等人,Science 347(6221):543–548,2015中所述。
可以通过以下方式来进行等容膨胀：将生物样品的一种或多种组分锚定到凝胶上，然后凝胶形成、蛋白质水解和溶胀。在一些实施方案中，可以将样品中的分析物、分析物的产物和/或与样品中的分析物缔合的探针锚定到基质(例如，水凝胶)上。生物样品的等容膨胀可以发生在将生物样品固定在基底上之前或者发生在将生物样品固定在基底上之后。在一些实施方案中，可以在使基底与本文公开的探针接触之前，从基底上去除等容膨胀的生物样品。
通常，用于进行生物样品的等容膨胀的步骤可以取决于样品的特性(例如，组织切片的厚度、固定、交联)和/或感兴趣的分析物(例如，将RNA、DNA和蛋白质锚定到凝胶上的不同条件)。
在一些实施方案中，生物样品中的蛋白质被锚定到可溶胀的凝胶(诸如聚电解质凝胶)上。可抗体以在锚定到可溶胀凝胶上之前、之后或结合锚定到可溶胀凝胶上被引导至蛋白质。生物样品中的DNA和/或RNA也可以通过合适的接头锚定到可溶胀凝胶上。此类接头的实例包括但不限于6-((丙烯酰基)氨基)己酸(丙烯酰基-X SE)(可获自ThermoFisher,Waltham,MA)、Label-IT胺(可获自MirusBio,Madison,WI)和Label X(例如描述于Chen等人,Nat.Methods 13:679-684,2016，其全部内容以引用方式并入本文)。
样品的等容膨胀可以增加样品的后续分析的空间分辨率。空间分布中分辨率的增加可以通过比较等容膨胀的样品和尚未等容膨胀的样品来确定。
在一些实施方案中，生物样品被等容膨胀至如下尺寸：其未膨胀尺寸的至少2x、2.1x、2.2x、2.3x、2.4x、2.5x、2.6x、2.7x、2.8x、2.9x、3x、3.1x、3.2x、3.3x、3.4x、3.5x、3.6x、3.7x、3.8x、3.9x、4x、4.1x、4.2x、4.3x、4.4x、4.5x、4.6x、4.7x、4.8x或4.9x。在一些实施方案中，样品被等容膨胀至其未膨胀尺寸的至少2x且小于20x。
(vii)交联和去交联
在一些实施方案中，使生物样品在原位测定回合之前或期间可逆地交联。在一些方面，分析物、多核苷酸和/或与其结合的分析物或探针的扩增产物(例如，扩增子)可以锚定到聚合物基质。例如，聚合物基质可以是水凝胶。在一些实施方案中，可以将一种或多种多核苷酸探针和/或其扩增产物(例如，扩增子)修饰以含有官能团，所述官能团可以用作将多核苷酸探针和/或扩增产物附着到聚合物基质上的锚定位点。在一些实施方案中，包含寡dT的经修饰的探针可以用于结合感兴趣的mRNA分子，随后是mRNA分子的可逆交联。
在一些实施方案中，生物样品通过形成水凝胶的聚合物材料的交联而被固定在水凝胶中。交联可以通过化学和/或以光化学方式进行，或者可替代地通过任何其他水凝胶形成方法进行。水凝胶可以包括含有网状系统的大分子聚合物凝胶。在网状系统中，一些聚合物链可以任选地被交联，但是交联并不总是发生。
在一些实施方案中，水凝胶可以包括水凝胶亚单位，诸如但不限于丙烯酰胺、双丙烯酰胺、聚丙烯酰胺及其衍生物、聚(乙二醇)及其衍生物(例如，PEG-丙烯酸酯(PEG-DA)、PEG-RGD)、甲基丙烯酰化明胶(GelMA)、甲基丙烯酸酯化透明质酸(MeHA)、聚脂肪族聚氨酯、聚醚聚氨酯、聚酯聚氨酯、聚乙烯共聚物、聚酰胺、聚乙烯醇、聚丙二醇、聚四亚甲基氧化物、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚(丙烯酸羟乙酯)和聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、胶原、透明质酸、壳聚糖、葡聚糖、琼脂糖、明胶、海藻酸盐、蛋白质聚合物、甲基纤维素等、以及它们的组合。
在一些实施方案中，水凝胶包括杂化材料，例如，水凝胶材料包括合成聚合物和天然聚合物的要素。合适的水凝胶的实例描述于例如美国专利号6,391,937、9,512,422和9,889,422以及美国专利申请公开号2017/0253918、2018/0052081和2010/0055733中，每篇文献的全部内容以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，水凝胶可以形成基底。在一些实施方案中，基底包括水凝胶和一种或多种第二材料。在一些实施方案中，将水凝胶放置在一种或多种第二材料的顶部。例如，水凝胶可以预先形成，然后放置在一种或多种第二材料的顶部、底部或与一种或多种第二材料的任何其他构型中。在一些实施方案中，水凝胶形成发生在基底形成期间接触一种或多种第二材料之后。水凝胶形成也可以发生在位于基底上的结构(例如，孔、脊、突起和/或纹理)内。
在一些实施方案中，在向样品提供探针之前、同时或之后，发生基底上的水凝胶形成。例如，水凝胶形成可以在已经含有探针的基底上进行。
在一些实施方案中，水凝胶形成发生在生物样品内。在一些实施方案中，生物样品(例如，组织切片)被包埋在水凝胶中。在一些实施方案中，水凝胶亚单位被注入到生物样品中，并且水凝胶的聚合由外部或内部刺激引发。
在生物样品内形成水凝胶的实施方案中，可以使用官能化化学。在一些实施方案中，官能化化学包括水凝胶-组织化学(HTC)。适合于HTC的任何水凝胶-组织骨架(例如，合成的或天然的)都可以用于锚定生物大分子和调节官能化。使用HTC骨架变体的方法的非限制性实例包括CLARITY、PACT、ExM、SWITCH和ePACT。在一些实施方案中，生物样品内的水凝胶形成是永久性的。例如，生物大分子可以永久粘附到水凝胶上，允许多个回合的询问。在一些实施方案中，生物样品内的水凝胶形成是可逆的。
在一些实施方案中，在聚合之前、同时和/或之后，将另外的试剂添加到水凝胶亚单位中。例如，另外的试剂可以包括但不限于寡核苷酸(例如，探针)、使DNA片段化的核酸内切酶、DNA片段化缓冲液、DNA聚合酶、用于扩增核酸并将条形码附接到扩增片段的dNTP。可以使用其他酶，包括但不限于RNA聚合酶、转座酶、连接酶、蛋白质酶K和DNAse。另外的试剂还可以包括逆转录酶，包括具有末端转移酶活性的酶、引物和开关寡核苷酸。在一些实施方案中，在聚合之前、同时和/或之后，将光学标记添加到水凝胶亚单位中。
在一些实施方案中，在聚合之前、同时和/或之后，将HTC试剂添加到水凝胶中。在一些实施方案中，在聚合之前、同时和/或之后，将细胞标记剂添加到水凝胶中。在一些实施方案中，在聚合之前、同时和/或之后，将细胞渗透剂添加到水凝胶中。
可以使用任何合适的方法清除包埋在生物样品中的水凝胶。例如，电泳组织清除方法可以用于从水凝胶包埋的样品中去除生物大分子。在一些实施方案中，水凝胶包埋的样品在清除水凝胶之前或之后储存在介质(例如，固定介质、甲基纤维素或其他半固体介质)中。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括使可逆交联的生物样品解交联。解交联不需要是完全的。在一些实施方案中，可逆交联的生物样品中只有一部分交联分子被解交联并允许迁移。
(viii)组织透化和处理
在一些实施方案中，生物样品可以被透化以促进物质(诸如探针)转移到样品中。如果样品没有被充分透化，则样品中物质(诸如探针)的量可能太低而不能够进行充分的分析。相反，如果组织样品渗透性太强，则组织样品内分析物的相对空间关系可能会丧失。因此，在充分透化组织样品以获得良好的信号强度的同时仍然保持样品中分析物分布的空间分辨率之间的平衡是理想的。
通常，生物样品可以通过将样品暴露于一种或多种透化剂来进行透化。用于此目的的合适试剂包括但不限于有机溶剂(例如，丙酮、乙醇和甲醇)、交联剂(例如，多聚甲醛)、去污剂(例如，皂苷、Triton X-100TM或Tween-20TM)和酶(例如，胰蛋白酶、蛋白酶)。在一些实施方案中，可以将生物样品与细胞透化剂一起温育，以促进样品的透化。用于样品透化的另外的方法描述于例如Jamur等人,Method Mol.Biol.588:63-66,2010，其全部内容以引用方式并入本文。任何合适的样品透化方法通常都可以与本文所述的样品结合使用。
在一些实施方案中，可以通过向样品中添加一种或多种裂解剂来透化生物样品。合适的裂解剂的实例包括但不限于生物活性试剂，诸如用于裂解不同细胞类型(例如革兰氏阳性或阴性细菌、植物、酵母、哺乳动物)的裂解酶，诸如溶菌酶、无色肽酶、溶葡萄球菌素、labiase、立枯丝核菌裂解酶(kitalase)、溶壁酶和各种其他可商购获得的裂解酶。
可以另外地或可替代地将其他裂解剂添加到生物样品中以促进透化。例如，基于表面活性剂的裂解溶液可以用于裂解样品细胞。裂解溶液可以包含离子型表面活性剂，诸如十二烷基肌氨酸钠和十二烷基硫酸钠(SDS)。更一般地，化学裂解剂可以包括但不限于有机溶剂、螯合剂、去污剂、表面活性剂和离液剂。
在一些实施方案中，生物样品可以通过非化学透化方法进行透化。例如，可以使用的非化学透化方法包括但不限于物理裂解技术，诸如电穿孔、机械透化方法(例如，使用均化器和研磨球进行珠敲打以机械地破坏样品组织结构)、声学透化(例如，超声处理)和热裂解技术(诸如加热以诱导样品的热透化)。
在分析样品之前，可以向生物样品中添加另外的试剂以执行各种功能。在一些实施方案中，可以向样品中添加DNase和RNase灭活剂或抑制剂如蛋白质酶K和/或螯合剂如EDTA。例如，本文公开的方法可包括用于增加核酸的结合可及性的步骤，例如开放细胞中的DNA以供探针杂交的变性步骤。例如，可以使用蛋白质酶K处理来释放与其结合了蛋白质的DNA。
(ix)RNA种类的选择性富集
在一些实施方案中，当RNA是分析物时，可以选择性地富集一种或多种感兴趣的RNA分析物种类。例如，可以通过向样品中添加一种或多种寡核苷酸来选择一种或多种感兴趣的RNA种类。在一些实施方案中，另外的寡核苷酸是用于通过酶(例如，聚合酶)引发反应的序列。例如，可以使用与一种或多种目的RNA具有序列互补性的一种或多种引物序列来扩增所述一种或多种目的RNA，从而选择性地富集这些RNA。
在一些实施方案中，可以使用一种或多种核酸探针来与靶核酸(例如，cDNA或RNA分子，如mRNA)杂交并在模板化连接反应(例如，RNA-模板化连接(RTL)或DNA-模板化连接(例如，在cDNA上))中连接生成供分析的产物。在一些方面，在分析两种或更多种分析物时，使用对每种RNA或cDNA分析物特异性(例如，与每种RNA或cDNA分析物特异性杂交)的第一探针和第二探针。例如，在本文所提供的方法的一些实施方案中，模板化连接用于检测生物样品中的基因表达。可以靶向被标记剂或结合剂(例如，抗体或其表位结合片段)结合的感兴趣的分析物(诸如蛋白质)用于分析，其中结合剂与包含鉴定结合剂的报告序列的报告寡核苷酸缀合或以其他方式缔合。探针可以与报告寡核苷酸杂交，并在模板化连接反应中连接以产生用于分析的产物。在一些实施方案中，在连接之前，可以首先使用例如Mu聚合酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶、VENT聚合酶、Taq聚合酶和/或它们的任何组合、衍生物和变体(例如，工程化突变体)来填充探针寡核苷酸之间的缺口。在一些实施方案中，所述测定还可以包括模板化连接产物的扩增(例如，通过多重PCR)。
可替代地，可以使用多种方法中的任何一种向下选择(例如，去除)一种或多种RNA种类。例如，可以向样品施用探针，其选择性地与核糖体RNA(rRNA)杂交，从而减少样品中rRNA的池和浓度。另外和可替代地，双链特异性核酸酶(DSN)处理可以去除rRNA(参见例如，Archer等人,Selective and flexibledepletion of problematic sequences from RNA-seq libraries at the cDNA stage,BMC Genomics,15 401,(2014)，其全部内容以引用方式并入本文)。此外，羟基磷灰石层析可以去除丰富的种类(例如，rRNA)(参见例如，Vandernoot,V.A.,cDNA normalization by hydroxyapatite chromatography to enrichtranscriptome diversity in RNA-seq applications,Biotechniques,53(6)373-80,(2012)，其全部内容以引用方式并入本文)。
生物样品可以包含一种或多种感兴趣的分析物。提供了用于进行多重测定以分析单个生物样品中的两种或更多种不同分析物的方法。
B.分析物
可以使用本文公开的方法和组合物来检测和分析多种不同的分析物。在一些方面，分析物可以包括待分析的任何生物物质、结构、部分或组分。在一些方面，本文公开的靶可以类似地包括任何感兴趣的分析物。在一些实例中，可以直接或间接检测靶或分析物。
分析物可以源自特定类型的细胞和/或特定的亚细胞区域。例如，分析物可以源自胞质溶胶、源自细胞核、源自线粒体、源自微粒体，并且更一般地，源自细胞的任何其他隔室、细胞器或部分。特异性地靶向某些细胞隔室和细胞器的透化剂可以用于从细胞中选择性地释放出分析物以进行分析，和/或允许一种或多种试剂(例如，用于分析物检测的探针)接近细胞或细胞隔室或细胞器中的分析物。
分析物可以包括任何生物分子或化学化合物，包括大分子(诸如蛋白质或肽、脂质或核酸分子)或者小分子(包括有机或无机分子)。分析物可以是细胞或微生物，包括病毒或其片段或产物。分析物可以是任何物质或实体，可以为其开发特异性结合配偶体(例如亲和结合配偶体)。这样的特异性结合配偶体可以是核酸探针(用于核酸分析物)并且可以直接导致RCA模板(例如挂锁或其他可环化探针)的产生。可替代地，可以将特异性结合配偶体偶联到核酸上，所述核酸可以使用RCA策略进行检测，例如在使用或产生可以作为RCA模板的环状核酸分子的测定中。
特别感兴趣的分析物可以包括核酸分子，诸如DNA(例如，基因组DNA、线粒体DNA、质体DNA、病毒DNA等)和RNA(例如，mRNA、微小RNA、rRNA、snRNA、病毒RNA等)；以及合成的和/或经修饰的核酸分子(例如，包括包含合成的或经修饰的核苷酸诸如LNA、PNA、吗啉代等或由这些物质组成的核酸结构域)；蛋白质分子，诸如肽、多肽、蛋白质或朊病毒、或者包括蛋白质或多肽组分等的任何分子、或其片段；或脂质或碳水化合物分子或包含脂质或碳水化合物组分的任何分子。分析物可以是单个分子或含有两个或更多个分子亚单位的复合物，所述分子亚单位例如包括但不限于蛋白质-DNA复合物，所述分子亚单位可以或可以不彼此共价结合并且它们可以是相同的或不同的。因此，除了细胞或微生物之外，这样的复合分析物也可以是蛋白质复合物或蛋白质相互作用物。因此，这样的复合物或相互作用可以是同源多聚体或异源多聚体。分子(例如蛋白质)的聚集体也可以是靶分析物，例如相同蛋白质或不同蛋白质的聚集体。分析物也可以是蛋白质或肽与核酸分子(诸如DNA或RNA)之间的复合物，例如蛋白质与核酸(例如，调控因子(诸如转录因子)与DNA或RNA)之间的相互作用物。
(i)内源性分析物
在一些实施方案中，本文的分析物对于生物样品而言是内源的，并且可以包括核酸分析物和非核酸分析物。可以将本文公开的方法和组合物以任何合适的组合用于分析核酸分析物(例如，使用直接或间接与核酸分析物杂交的核酸探针或探针组)和/或非核酸分析物(例如，使用包含报告寡核苷酸并且直接或间接与非核酸分析物结合的标记剂)。
非核酸分析物的实例包括但不限于脂质、碳水化合物、肽、蛋白质、糖蛋白(N-连接的或O-连接的)、脂蛋白、磷蛋白、蛋白质的特定磷酸化或乙酰化变体、蛋白质的酰胺化变体、蛋白质的羟基化变体、蛋白质的甲基化变体、蛋白质的泛素化变体、蛋白质的硫酸化变体、病毒衣壳蛋白、细胞外蛋白质和细胞内蛋白质、抗体和抗原结合片段。在一些实施方案中，分析物在细胞内部或在细胞表面上，诸如跨膜分析物或附着于细胞膜的分析物。在一些实施方案中，分析物可以是细胞器(例如，细胞核或线粒体)。在一些实施方案中，分析物是细胞外分析物，诸如分泌的分析物。示例性分析物包括但不限于受体、抗原、表面蛋白、跨膜蛋白、分化蛋白簇、蛋白通道、蛋白泵、载体蛋白、磷脂、糖蛋白、糖脂、细胞-细胞相互作用蛋白质复合物、抗原呈递复合物、主要组织相容性复合物、工程化T细胞受体、T细胞受体、B细胞受体、嵌合抗原受体、细胞外基质蛋白、细胞表面蛋白的翻译后修饰(例如磷酸化、糖基化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化或脂化)状态、缺口连接或粘附连接。
核酸分析物的实例包括DNA分析物，诸如单链DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)、基因组DNA、甲基化DNA、特定甲基化DNA序列、片段化DNA、线粒体DNA、原位合成的PCR产物和RNA/DNA杂合体。DNA分析物可以是组织样品中存在的另一种核酸分子(例如，DNA或RNA(诸如mRNA))的转录物。
核酸分析物的实例还包括RNA分析物，诸如各种类型的编码和非编码RNA。不同类型的RNA分析物的实例包括信使RNA(mRNA)，包括新生RNA、前mRNA、初级转录RNA以及加工的RNA(诸如加帽的mRNA(例如，具有5'7-甲基鸟苷帽)、聚腺苷酸化mRNA(在3'末端的聚A尾)和一个或多个内含子已去除的剪接mRNA)。本文公开的分析物中还包括未加帽的mRNA、未聚腺苷酸化的mRNA和未剪接的mRNA。RNA分析物可以是组织样品中存在的另一种核酸分子(例如，DNA或RNA(诸如病毒RNA))的转录物。不翻译成蛋白质的非编码RNA(ncRNA)的实例包括转移RNA(tRNA)和核糖体RNA(rRNA)，以及小的非编码RNA，诸如微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、小核RNA(snRNA)、细胞外RNA(exRNA)、小卡哈尔体(Cajal body)特异性RNA(scaRNAs)和长ncRNA(诸如Xist和HOTAIR)。RNA可以是小的(例如，长度小于200个核酸碱基)或大的(例如，长度大于200个核酸碱基的RNA)。小RNA的实例包括5.8S核糖体RNA(rRNA)、5S rRNA、tRNA、miRNA、siRNA、snoRNA、piRNA、tRNA衍生的小RNA(tsRNA)和小rDNA衍生的RNA(srRNA)。RNA可以是双链RNA或单链RNA。RNA可以是环状RNA。RNA可以是细菌rRNA(例如，16s rRNA或23s rRNA)。
在一些实施方案中，分析物可以是变性核酸，其中所得的变性核酸是单链的。核酸可以是变性的，例如，任选地使用甲酰胺、热或者甲酰胺和热两者变性的。在一些实施方案中，核酸没有被变性而用于本文公开的方法中。
在某些实施方案中，可以从活细胞中提取分析物。可以调整处理条件，以确保生物样品在分析期间保持活的，并且从样品的活细胞中提取(或释放)分析物。活细胞来源的分析物只能从样品中获得一次，或者可以从持续保持活的状态的样品中以一定间隔获得。
本文公开的方法和组合物可以用于分析任何数量的分析物。例如，被分析的分析物的数量可以是存在于样品的一个区域中或基底的单独特征内的至少约2种、至少约3种、至少约4种、至少约5种、至少约6种、至少约7种、至少约8种、至少约9种、至少约10种、至少约11种、至少约12种、至少约13种、至少约14种、至少约15种、至少约20种、至少约25种、至少约30种、至少约40种、至少约50种、至少约100种、至少约1,000种、至少约10,000种、至少约100,000种或更多种不同的分析物。
在本文所述的任何实施方案中，分析物(例如，靶分析物)包含靶序列。在一些实施方案中，靶序列可以是样品的内源序列、在样品中产生的序列、添加到样品中的序列或与样品中的分析物缔合的序列。在一些实施方案中，靶序列是单链靶序列(例如，滚环扩增产物中的序列)。在一些实施方案中，分析物包含一个或多个单链靶序列。在一个方面，第一单链靶序列与第二单链靶序列不同。在另一个方面，第一单链靶序列与一个或多个第二单链靶序列相同。在一些实施方案中，一个或多个第二单链靶序列包含在与第一单链靶序列相同的分析物(例如，核酸)中。可替代地，一个或多个第二单链靶序列包含在与第一单链靶序列不同的分析物(例如，核酸)中。
(ii)标记剂
在一些实施方案中，本文提供了使用一种或多种标记剂分析样品中的内源分析物(例如，RNA、ssDNA和细胞表面或细胞内蛋白质和/或代谢物)的方法和组合物。在一些实施方案中，分析物标记剂可以包括与分析物(例如，样品中的内源分析物)相互作用的试剂。在一些实施方案中，标记剂可以包含指示与标记剂相互作用的分析物或其部分的报告寡核苷酸。例如，报告寡核苷酸可以包含允许鉴别标记剂的条形码序列。在一些情况下，被标记剂接触的样品可以进一步与探针(例如，单链探针序列)接触，所述探针与标记剂的报告寡核苷酸杂交，以便鉴定与标记剂缔合的分析物。在一些实施方案中，分析物标记剂包含分析物结合部分和标记剂条形码结构域，所述标记剂条形码结构域包含一个或多个条形码序列，例如与分析物结合部分和/或分析物对应的条形码序列。分析物结合部分条形码包括与分析物结合部分缔合或以其他方式鉴定分析物结合部分的条形码。在一些实施方案中，通过鉴定其相关的分析物结合部分条形码来鉴定分析物结合部分，也可以鉴定分析物结合部分所结合的分析物。分析物结合部分条形码可以是给定长度的核酸序列和/或与分析物结合部分缔合的序列。分析物结合部分条形码通常可以包括本文所述的条形码的方面中的任何一个。
在一些实施方案中，所述方法包括在使样品与一种或多种标记剂接触之后的一个或多个后固定步骤。
在本文所述的方法和系统中，能够结合于或以其他方式偶联至一个或多个特征的一种或多种标记剂可以用于表征分析物、细胞和/或细胞特征。在一些情况下，细胞特征包括细胞表面特征。分析物可以包括但不限于蛋白质、受体、抗原、表面蛋白、跨膜蛋白、分化蛋白簇、蛋白通道、蛋白泵、载体蛋白、磷脂、糖蛋白、糖脂、细胞-细胞相互作用蛋白质复合物、抗原呈递复合物、主要组织相容性复合物、工程化T细胞受体、T细胞受体、B细胞受体、嵌合抗原受体、缺口连接、粘附连接或它们的任何组合。在一些情况下，细胞特征可以包括细胞内分析物，诸如蛋白质、蛋白质修饰(例如，磷酸化状态或其他翻译后修饰)、核蛋白、核膜蛋白或它们的任何组合。
在一些实施方案中，分析物结合部分可以包括能够结合分析物(例如，生物分析物，例如，大分子成分)的任何分子或部分。标记剂可以包括但不限于蛋白质、肽、抗体(或其表位结合片段)、亲脂部分(诸如胆固醇)、细胞表面受体结合分子、受体配体、小分子、双特异性抗体、双特异性T细胞衔接体、T细胞受体衔接体、B细胞受体衔接体、抗体前药、适体、单抗体、affimer、darpin和蛋白质支架或它们的任何组合。标记剂可以包括(例如，连接至)报告寡核苷酸，该报告寡核苷酸指示结合基团所结合的细胞表面特征。例如，报告寡核苷酸可以包含允许鉴别标记剂的条形码序列。例如，对一种类型的细胞特征(例如，第一细胞表面特征)具有特异性的标记剂可以具有与之偶联的第一报告寡核苷酸，而对不同细胞特征(例如，第二细胞表面特征)具有特异性的标记剂可以具有与之偶联的不同报告寡核苷酸。关于示例性标记剂、报告寡核苷酸和使用方法的描述，参见例如美国专利10,550,429；美国专利公开20190177800；以及美国专利公开20190367969，这些专利均全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，分析物结合部分包括一种或多种抗体或其抗原结合片段。包括分析物结合部分的抗体或抗原结合片段可以特异性地结合靶分析物。在一些实施方案中，分析物是蛋白质(例如，生物样品(例如，细胞)表面上的蛋白质或细胞内蛋白质)。在一些实施方案中，包含多个分析物结合部分的多个分析物标记剂结合生物样品中存在的多种分析物。在一些实施方案中，所述多种分析物包括单个种类的分析物(例如，单个种类的多肽)。在其中所述多种分析物包括单个种类的分析物的一些实施方案中，所述多种分析物标记剂的分析物结合部分是相同的。在其中所述多种分析物包括单个种类的分析物的一些实施方案中，所述多种分析物标记剂的分析物结合部分是不同的(例如，所述多种分析物标记剂的成员可以具有两个或更多个种类的分析物结合部分，其中两个或更多个种类的分析物结合部分的每一个种类结合单个种类的分析物，例如在不同的结合位点)。在一些实施方案中，所述多种分析物包括多个不同种类的分析物(例如，多个不同种类的多肽)。
在其他情况下，例如为了促进样品复用，对特定细胞特征具有特异性的标记剂可以具有偶联至第一报告寡核苷酸的第一多种标记剂(例如，抗体或亲脂部分)和偶联至第二报告寡核苷酸的第二多种标记剂。
在一些方面，这些报告寡核苷酸可以包含一定核酸条形码序列，所述核酸条形码序列允许鉴定报告寡核苷酸与之偶联的标记剂。将寡核苷酸选择为报告子可以提供以下优点：能够在序列方面产生显著多样性，同时还易于连接至大多数生物分子(例如，抗体等)，而且是可检测的。
报告寡核苷酸连接(偶联)至标记剂可以通过多种直接或间接、共价或非共价缔合或连接中的任何一种来实现。例如，寡核苷酸可以使用化学缀合技术(例如，可从InnovaBiosciences获得的抗体标记试剂盒)共价连接至标记剂(诸如蛋白质，例如抗体或抗体片段)的一部分，以及使用其他非共价连接机制进行连接，例如使用生物素酰化抗体和带有亲和素或链霉亲和素接头的寡核苷酸(或包括偶联至寡核苷酸的一个或多个生物素酰化接头的珠粒)。抗体和寡核苷酸生物素酰化技术是可用的。参见例如Fang等人,“Fluoride-Cleavable Biotinylation Phosphoramidite for 5′-end-Labelling andAffinity Purification of Synthetic Oligonucleotides,”Nucleic Acids Res.2003年1月15日；31(2):708-715，其出于所有目的全文以引用方式并入本文。同样，蛋白质和肽生物素酰化技术已经被开发并且是现成的。参见例如美国专利号6,265,552，其出于所有目的以引用方式并入本文。此外，点击反应化学可以用于将报告寡核苷酸偶联到标记剂上。可商购获得的试剂盒(诸如来自Thunderlink和Abcam的那些)以及本领域中常见的技术可以在适当时用于将报告寡核苷酸偶联至标记剂。在另一个实例中，标记剂间接(例如，经由杂交)偶联至报告寡核苷酸，该报告寡核苷酸包含鉴别该标记剂的条形码序列。例如，标记剂可以直接偶联(例如，共价结合)至杂交寡核苷酸，该杂交寡核苷酸包含与报告寡核苷酸的序列杂交的序列。杂交寡核苷酸与报告寡核苷酸的杂交将标记剂偶联至报告寡核苷酸。在一些实施方案中，诸如在施加刺激时，报告寡核苷酸可从标记剂释放。例如，报告寡核苷酸可以通过不稳定键(例如，化学不稳定、光不稳定、热不稳定等)连接至标记剂，如本文其他地方针对从支持物释放分子大体描述的。
在一些情况下，标记剂可以包含报告寡核苷酸和标签。标签可以是荧光团、放射性同位素、能够发生比色反应的分子、磁性颗粒或者能够检测的任何其他合适的分子或化合物。标签可以直接或间接缀合至标记剂(或报告寡核苷酸)(或，标签可以缀合至可结合于标记剂或报告寡核苷酸的分子)。在一些情况下，标签缀合至与报告寡核苷酸的序列互补(例如，杂交)的第一寡核苷酸。
在一些实施方案中，来自生物样品的多个不同种类的分析物(例如，多肽)可以随后与生物样品的一种或多种物理特性相关联。例如，多种不同种类的分析物可以与生物样品中分析物的位置相关联。这样的信息(例如，当分析物结合部分识别多肽时的蛋白质组信息)可以与其他空间信息(例如，来自生物样品的遗传信息，诸如DNA序列信息、转录组信息(例如，转录物序列)或两者)结合使用。例如，细胞的细胞表面蛋白可以与细胞的一种或多种物理特性(例如，细胞的形状、尺寸、活性或类型)相关联。所述一种或多种物理特性可以通过对细胞成像来表征。细胞可以被分析物标记剂结合，所述标记剂包含结合细胞表面蛋白的分析物结合部分和鉴定该分析物结合部分的分析物结合部分条形码。样品(例如，组织样品或细胞)中的蛋白质分析结果可以与样品中的DNA和/或RNA分析相关联。
(iii)内源分析物和/或标记剂的产物
在一些实施方案中，本文提供了用于分析生物样品中内源分析物和/或标记剂的一种或多种产物的方法和组合物。在一些实施方案中，分析内源分析物(例如，病毒或细胞DNA或RNA)或其产物(例如，杂交产物、连接产物、延伸产物(例如，通过DNA或RNA聚合酶)、复制产物、转录/逆转录产物和/或扩增产物(诸如滚环扩增(RCA)产物))。在一些实施方案中，分析直接或间接与生物样品中的分析物结合的标记剂。在一些实施方案中，分析直接或间接与生物样品中的分析物结合的标记剂的产物(例如，杂交产物、连接产物、延伸产物(例如，通过DNA或RNA聚合酶)、复制产物、转录/逆转录产物和/或扩增产物(诸如滚环扩增(RCA)产物))。
(a)杂交
在一些实施方案中，内源分析物和/或标记剂的产物是杂交产物，其包含在两个不同分子内成对的基本上互补或互补的核酸序列，其中一个分子是内源分析物或标记剂(例如，与其连接的报告寡核苷酸)。另一个分子可以是另一种内源分子或另一种标记剂，诸如探针。配对可以通过任何方法实现，其中核酸序列通过碱基配对与基本上或完全互补的序列结合以形成杂交复合物。就杂交的目的而言，如果它们的各个碱基中的至少60％(例如，至少70％、至少80％或至少90％)彼此互补，则两个核酸序列是“基本上互补的”。
各种探针和探针组可以与内源分析物和/或标记剂杂交，并且每种探针可以包含一个或多个条形码序列并且可以用如IV部分中所述的探针解析条形码序列修饰。示例性的条形码化探针或探针组可以基于挂锁探针、缺口挂锁探针、SNAIL(夹板核苷酸辅助的分子内连接(Splint Nucleotide Assisted Intramolecular Ligation))探针组、PLAYR(RNA的邻近连接测定(Proximity Ligation Assay for RNA))探针组、PLISH(邻近连接原位杂交(Proximity Ligation in situ Hybridization))探针组和RNA模板化连接探针。特定的探针或探针组设计可以变化。在一些实施方案中，探针或探针组包括可环化探针或探针组。
(b)连接
在一些实施方案中，内源分析物和/或标记剂的产物是连接产物。在一些实施方案中，在两种或更多种内源分析物之间形成连接产物。在一些实施方案中，在内源分析物与标记剂之间形成连接产物。在一些实施方案中，在两种或更多种标记剂之间形成连接产物。在一些实施方案中，连接产物是内源分析物的分子内连接。在一些实施方案中，连接产物是标记剂的分子内连接，例如，在与靶序列杂交时可环化探针或探针组的环化。靶序列可以包含在内源分析物(例如，核酸，诸如基因组DNA或mRNA)或其产物(例如，来自细胞mRNA转录物的cDNA)中，或者包含在标记剂(例如，报告寡核苷酸)或其产物中。
在一些实施方案中，本文提供了能够进行DNA模板化连接(诸如从cDNA分子)的探针或探针组。参见例如美国专利8,551,710，其据此全文以引用方式并入。在一些实施方案中，本文提供了能够进行RNA模板化连接的探针或探针组。参见例如美国专利公开2020/0224244，其据此全文以引用方式并入。在一些实施方案中，探针组是SNAIL探针组。参见例如美国专利公开2019/0055594，其据此全文以引用方式并入。在一些实施方案中，本文提供了多重邻近连接测定。参见例如美国专利公开2014/0194311，其据此全文以引用方式并入。在一些实施方案中，本文提供了能够进行邻近连接的探针或探针组，例如RNA(例如，PLAYR)探针组的邻近连接测定。参见例如美国专利公开2016/0108458，其据此全文以引用方式并入。在一些实施方案中，环状探针可以间接与靶核酸杂交。在一些实施方案中，环状构建体由能够进行邻近连接的探针组(例如邻近连接原位杂交(PLISH)探针组)形成。参见例如美国专利公开2020/0224243，其据此全文以引用方式并入。
在一些实施方案中，连接涉及化学连接。在一些实施方案中，连接涉及模板依赖性连接。在一些实施方案中，连接涉及非模板依赖性连接。在一些实施方案中，连接涉及酶促连接。
在一些实施方案中，酶促连接涉及连接酶的使用。在一些方面，本文所用的连接酶包括通常用于将多核苷酸连接在一起或连接单个多核苷酸末端的酶。RNA连接酶、DNA连接酶或另一种连接酶可以用于将两个核苷酸序列连接在一起。连接酶包括ATP依赖性双链多核苷酸连接酶、NAD-i依赖性双链DNA或RNA连接酶和单链多核苷酸连接酶，例如在EC6.5.1.1(ATP依赖性连接酶)、EC 6.5.1.2(NAD+依赖性连接酶)、EC 6.5.1.3(RNA连接酶)中所述的任何一种连接酶。连接酶的具体实例包括细菌连接酶(诸如大肠杆菌DNA连接酶)、Tth DNA连接酶、热球菌属(Thermococcus)物种(菌株9°N)DNA连接酶(9°NTM DNA连接酶，NewEngland Biolabs)、Taq DNA连接酶、AmpligaseTM(Epicentre Biotechnologies)和噬菌体连接酶(诸如T3 DNA连接酶、T4 DNA连接酶和T7 DNA连接酶)以及它们的突变体。在一些实施方案中，连接酶是T4 RNA连接酶。在一些实施方案中，连接酶是splintR连接酶。在一些实施方案中，连接酶是单链DNA连接酶。在一些实施方案中，连接酶是T4 DNA连接酶。在一些实施方案中，连接酶是具有DNA夹板化DNA连接酶活性的连接酶。在一些实施方案中，连接酶是具有RNA夹板化DNA连接酶活性的连接酶。
在一些实施方案中，本文的连接是直接连接。在一些实施方案中，本文的连接是间接连接。“直接连接”意指多核苷酸的末端彼此紧邻杂交以形成连接酶的底物，从而导致它们彼此连接(分子内连接)。可替代地，“间接”意指多核苷酸的末端彼此不相邻地杂交，例如被一个或多个插入核苷酸或“缺口”隔开。在一些实施方案中，所述末端不直接彼此连接，而是通过一个或多个插入(所谓的“缺口”或“填充缺口的”(寡)核苷酸)的中间物或通过延伸探针的3'末端来“填充”与所述插入核苷酸对应的“缺口”而发生(分子间连接)。在一些情况下，多核苷酸杂交末端之间的一个或多个核苷酸的缺口可以被与夹板、挂锁探针或靶核酸互补的一个或多个“缺口”(寡)核苷酸“填充”。缺口可以是1个至60个核苷酸的缺口或1个至40个核苷酸的缺口或3个至40个核苷酸的缺口。在具体实施方案中，缺口可以是约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多个核苷酸的缺口、在所示值之间的任何整数(或整数范围)个的核苷酸的缺口。在一些实施方案中，所述末端区域之间的缺口可以通过缺口寡核苷酸或通过延伸多核苷酸的3'末端来填充。在一些情况下，连接涉及将探针的末端连接到至少一个缺口(寡)核苷酸上，使得缺口(寡)核苷酸掺入到所得的多核苷酸中。在一些实施方案中，在本文的连接之前进行缺口填充。在其他实施方案中，本文的连接不需要缺口填充。
在一些实施方案中，多核苷酸连接产生的多核苷酸的解链温度高于未连接的多核苷酸的解链温度。因此，在一些方面，在后续步骤(包括扩增和检测)之前，连接稳定了含有连接的多核苷酸的杂交复合物。
在一些方面，使用高保真连接酶，诸如热稳定的DNA连接酶(例如，Taq DNA连接酶)。热稳定的DNA连接酶在升高的温度下有活性，通过在接近DNA链的解链温度(Tm)的温度下温育连接允许进一步的区分。与退火的完全碱基配对的底物相比，这选择性地降低了退火的错配底物的浓度(预期在错配周围具有稍低的Tm)。因此，高保真连接可以通过连接酶活性位点的固有选择性和平衡条件的组合来实现，以降低退火错配dsDNA的发生率。
在一些实施方案中，本文的连接是连接彼此邻近的两个(或更多个)核酸序列的邻近连接，例如，通过酶促手段(例如，连接酶)。在一些实施方式中，邻近连接可以包括“缺口填充”步骤，其涉及跨越两个感兴趣的核酸分子之间的距离，基于模板核酸分子的核酸序列，通过聚合酶掺入一个或多个核酸(参见例如美国专利号7,264,929，其全部内容以引用方式并入本文)。各种不同的方法可以用于邻近连接核酸分子，包括(但不限于)“粘性末端”和“平末端”连接。此外，单链连接可以用于在单链核酸分子上进行邻近连接。粘性末端邻近连接涉及在连接事件本身之前，待连接的两个核酸分子之间互补单链序列的杂交。平末端邻近连接通常不包括来自每个核酸分子的互补区域的杂交，因为两个核酸分子在连接位点处都缺乏单链突出端。
(c)引物延伸和扩增
在一些实施方案中，产物是分析物、标记剂、与分析物结合的探针或探针组(例如，与基因组DNA、mRNA或cDNA结合的挂锁探针)、或与标记剂结合的探针或探针组(例如，与来自相同或不同标记剂的一种或多种报告寡核苷酸结合的挂锁探针)的引物延伸产物。
引物通常是可以在核酸延伸反应中用作核酸聚合酶底物的具有3'末端的单链核酸序列。RNA引物由RNA核苷酸形成并且用于RNA合成，而DNA引物由DNA核苷酸形成并且用于DNA合成。引物也可以包含RNA核苷酸和DNA核苷酸(例如，以随机或设计的模式)两者。引物还可以包含本文所述的可以具有另外的功能的其他天然或合成核苷酸。在一些实例中，DNA引物可以用于引发RNA合成，反之亦然(例如，RNA引物可以用于引发DNA合成)。引物的长度可以变化。例如，引物可以是约6个碱基至约120个碱基。例如，引物可以包含多达约25个碱基。在一些情况下，引物可以指引物结合序列。引物延伸反应通常是指两个核酸序列通过它们各自的末端互补核酸序列(例如，3'末端)的重叠而连接(例如，杂交)的任何方法。这样的连接之后可以是用另一个核酸序列作为延伸模板进行一个或两个末端的核酸延伸(例如，酶促延伸)。酶促延伸可以通过包括但不限于聚合酶和/或逆转录酶的酶来进行。
在一些实施方案中，内源分析物和/或标记剂的产物是一种或多种多核苷酸(例如，环状探针或可环化探针或探针组)的扩增产物。在一些实施方案中，通过执行滚环扩增(RCA)来实现扩增。在其他实施方案中，添加与环状探针或环化探针杂交的引物，并且原样用于扩增。在一些实施方案中，RCA包括线型RCA、分支RCA、树状RCA或它们的任何组合。
在一些实施方案中，扩增在或在约20℃与约60℃之间的温度下进行。在一些实施方案中，扩增在或在约30℃与约40℃之间的温度下进行。在一些方面，扩增步骤(诸如滚环扩增(RCA))在为或约25℃与为或约50℃之间的温度(诸如为或约25℃、27℃、29℃、31℃、33℃、35℃、37℃、39℃、41℃、43℃、45℃、47℃或49℃)下进行。
在一些实施方案中，在存在适当的dNTP前体和其他辅因子的情况下添加DNA聚合酶后，引物被延伸以产生环状模板的多个拷贝。该扩增步骤可以利用等温扩增或非等温扩增。在一些实施方案中，在杂交复合物形成和扩增探针结合之后，杂交复合物进行滚环扩增以产生含有多个拷贝的cDNA的cDNA纳米球(例如，扩增子)。滚环扩增(RCA)技术可以包括线型RCA、分支RCA、树状RCA或它们的任何组合。参见例如Baner等人,Nucleic AcidsResearch,26:5073-5078,1998；Lizardi等人,Nature Genetics 19:226,1998；Mohsen等人,Acc Chem Res.2016年11月15日；49(11):2540–2550；Schweitzer等人,Proc.NatlAcad.Sci.USA 97:101 13-1 19,2000；Faruqi等人,BMC Genomics 2:4,2000；Nallur等人,Nucl.Acids Res.29:e118,2001；Dean等人,Genome Res.11:1095-1099,2001；Schweitzer等人,Nature Biotech.20:359-365,2002；美国专利号6,054,274、6,291,187、6,323,009、6,344,329和6,368,801。用于RCA的示例性聚合酶包括DNA聚合酶，诸如phi29聚合酶、Klenow片段、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)DNA聚合酶(BST)、T4DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶或DNA聚合酶I。在一些方面，可以采用已经被工程化或突变以具有期待的特征的DNA聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶是phi29 DNA聚合酶。
在一些方面，在扩增步骤期间，可以将经修饰的核苷酸添加到反应中，以将经修饰的核苷酸掺入扩增产物(例如，纳米球)中。经修饰的核苷酸的实例包括胺修饰的核苷酸。在所述方法的一些方面，例如，用于将所产生的扩增产物(例如，纳米球)锚定或交联到支架、细胞结构和/或其他扩增产物(例如，其他纳米球)上。在一些方面，扩增产物包含经修饰的核苷酸，诸如胺修饰的核苷酸。在一些实施方案中，胺修饰的核苷酸包含丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺部分修饰。其他胺修饰的核苷酸的实例包括但不限于5-氨基烯丙基-dUTP部分修饰、5-炔丙基氨基-dCTP部分修饰、N6-6-氨基己基-dATP部分修饰或7-脱氮杂-7-炔丙基氨基-dATP部分修饰。
在一些方面，可以将多核苷酸和/或扩增产物(例如，扩增子)锚定到聚合物基质上。例如，聚合物基质可以是水凝胶。在一些实施方案中，可以将一种或多种多核苷酸探针修饰以含有官能团，所述官能团可以用作将多核苷酸探针和/或扩增产物附着到聚合物基质上的锚定位点。根据所提供的实施方案可以采用的示例性修饰和聚合物基质包括例如US2016/0024555、US2018/0251833、US 2017/0219465、US10,138,509、US10,494,662、US11,078,520、US11,299,767、US10,266,888、US 11,118,220、US2021/0363579和US2021/0215581中描述的那些，所有这些文献全文以引用方式并入本文。在一些实例中，支架还含有修饰或官能团，所述修饰或官能团能够与探针组或扩增产物的修饰或官能团反应或掺入探针组或扩增产物的修饰或官能团。在一些实例中，支架可以包含寡核苷酸、聚合物或化学基团，以提供基质和/或支持结构。
扩增产物可以固定在基质内，通常在核酸被扩增的位置，从而产生扩增子的局部集落。扩增产物可以通过空间因素固定在基质内。扩增产物也可以通过共价键或非共价键固定在基质内。以这种方式，可以认为扩增产物连接到基质上。通过固定到基质上，诸如通过共价键或交联，保持了原始扩增子的尺寸和空间关系。通过固定到基质上，诸如通过共价键或交联，扩增产物对机械应力下移动或散开有抗性。
在一些方面，扩增产物共聚合和/或共价连接到周围的基质上，从而保留了它们的空间关系和任何其固有的信息。例如，如果扩增产物是由在基质中包埋的细胞内的DNA或RNA产生的那些，则扩增产物也可以被官能化以形成与基质的共价连接，保留它们在细胞内的空间信息，从而提供亚细胞定位分布模式。在一些实施方案中，所提供的方法涉及在水凝胶亚单位的存在下包埋一种或多种多核苷酸探针组和/或扩增产物，以形成一种或多种水凝胶包埋的扩增产物。在一些实施方案中，所描述的水凝胶-组织化学包括将核酸共价连接到用于组织清除、酶扩散和多循环测序的原位合成水凝胶上，而现有的水凝胶-组织化学方法则不能。在一些实施方案中，为了使扩增产物能够包埋在组织-水凝胶设置中，将胺修饰的核苷酸包含在扩增步骤(例如，RCA)中，使用丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯官能化为丙烯酰胺部分，并且与丙烯酰胺单体共聚合以形成水凝胶。
在一些实施方案中，RCA模板可以包含靶分析物或其一部分，其中靶分析物是核酸，或者RCA模板可以作为分析物的替代物或标记来提供或产生。基于RCA的检测系统可以用于不同分析物的检测，例如，其中通过从在测定中提供或产生的环状RCA模板产生RCP来提供信号，并且检测RCP以检测分析物。因此，RCP可以被视为报告分子，其被检测以检测靶分析物。然而，RCA模板也可以被视为靶分析物的报告分子；RCP是基于RCA模板产生的，并且包含RCA模板的互补拷贝。RCA模板决定了被检测到的信号，并且因此指示靶分析物。如下文将更详细描述的，RCA模板可以是探针或探针的一部分或组分，或者可以由探针产生，或者可以是检测测定的组分(例如，检测测定中的试剂)，其用作测定的报告分子、或报告分子的一部分、或信号产生系统。因此，用于产生RCP的RCA模板可以是环状(例如，环化的)报告核酸分子，即来自任何基于RCA的检测测定，所述检测测定使用或产生环状核酸分子作为测定的报告分子。因为RCA模板产生RCP报告分子，所以其可以被视为测定的报告系统的一部分。
C.靶序列
本文公开的探针的靶序列可以包含在本文公开的任何分析物中，所述分析物包括内源分析物(例如，病毒或细胞核酸)、标记剂、或内源分析物和/或标记剂的产物。
在一些方面，靶序列中的一个或多个包含一个或多个条形码，例如至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个条形码。条形码可以在空间上解析生物样品中发现的分子组分，例如在细胞或组织样品内的分子组分。可以将条形码以可逆或不可逆方式连接至分析物或另一个部分或结构。可以在样品测序之前或期间将条形码添加到例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)样品的片段中。条形码可以允许鉴定和/或定量单独测序读段(例如，条形码可以是或可以包括独特的分子标识符或“UMI”)。在一些方面，条形码包含约4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或超过30个核苷酸。
在一些实施方案中，条形码包括一起充当单个条形码的两个或多个子条形码。例如，多核苷酸条形码可以包含被一个或多个非条形码序列分开的两个或更多个多核苷酸序列(例如，子条形码)。在一些实施方案中，一个或多个条形码还可以提供用于靶向功能的平台，诸如寡核苷酸、寡核苷酸-抗体缀合物、寡核苷酸-链霉亲和素缀合物、经修饰的寡核苷酸、亲和纯化、可检测部分、酶、用于检测测定或其他功能的酶、和/或用于多核苷酸的检测和鉴定的酶。
在一些实施方案中，可以使用任何合适的方法或技术来分析(例如，检测或测序)条形码(例如，如IV部分中所述的一级和/或二级条形码序列、靶特异性和/或探针解析条形码序列)，这些方法或技术包括本文描述的那些。在一些实施方案中，本文提供的方法可以包括通过用多种标记的探针(例如，检测寡核苷酸)顺序杂交和检测来分析条形码。
在一些实施方案中，在条形码测序方法中，检测条形码序列以鉴定包含比条形码序列本身更长的核酸分子(DNA或RNA)的其他分子，这与直接测序更长的核酸分子相反。在一些实施方案中，给定N个碱基的测序读段，N聚体条形码序列包含4N的复杂性，并且与非条形码测序方法诸如直接测序相比，分子鉴定可能需要短得多的测序读段。例如，使用5个核苷酸的条形码序列可以鉴定1024个分子种类(45＝1024)，而8个核苷酸的条形码可以用于鉴定多达65,536个分子种类，这个数字大于人类基因组中不同基因的总数。在一些实施方案中，检测在探针或RCP中所含的条形码序列，而不是内源序列，这就每个测序循环的信息而言可以是有效的读段。因为条形码序列是预先确定的，所以它们也可以被设计成以错误检测和纠正机制为特征，参见例如US2019/0055594和US2021/0164039，其据此全文以引用方式并入。
III.核酸探针
在一些方面，本文公开了核酸探针和/或探针组，其被引入到细胞中或用于以其他方式接触生物样品，如组织样品。探针可以包含通常可以通过Watson-Crick碱基配对与核酸杂交的多种实体中的任一种，如DNA、RNA、LNA、PNA等。核酸探针通常含有能够直接或间接与靶核酸的至少一部分结合的靶向序列。核酸探针可能能够与特定的靶核酸(例如，mRNA或如本文所讨论的其他核酸)结合。在一些实施方案中，核酸探针可以使用可检测标记和/或通过使用能够与核酸探针结合的二级核酸探针来检测。在一些实施方案中，核酸探针(例如，一级探针和/或二级探针)与一种或多种生物和/或化学反应相容。例如，本文公开的核酸探针可以充当聚合酶的模板或引物、连接酶的模板或底物、点击化学反应的底物和/或核酸酶(例如，用于切割或消化的核酸内切酶或核酸外切酶)的底物。
在一些实施方案中，可以使多于一种类型的一级核酸探针与样品接触，例如，同时或按任何合适的次序顺序接触，如在顺序探针杂交/去杂交循环中。在一些实施方案中，一级探针可以包括环状探针和/或可环化探针(如挂锁探针)。在一些实施方案中，可以使多于一种类型的二级核酸探针与样品接触，例如，同时或按任何合适的次序顺序接触，如在顺序探针杂交/去杂交循环中。在一些实施方案中，二级探针可以包括与靶向分析物的一级探针的产物(例如，RCA产物)结合的探针。在一些实施方案中，可以使多于一种类型的更高级核酸探针与样品接触，例如，同时或按任何合适的次序顺序接触，如在顺序探针杂交/去杂交循环中。在一些实施方案中，可以使多于一种类型的可检测地标记的核酸探针与样品接触，例如，同时或按任何合适的次序顺序接触，如在顺序探针杂交/去杂交循环中。在一些实施方案中，可检测地标记的探针可以包括与一种或多种一级探针、一种或多种二级探针、一种或多种更高级探针、一级/二级/更高级探针之间的一种或多种中间探针和/或一种或多种可检测地或非可检测地标记的探针(例如，如在杂交链反应(HCR)、分支DNA反应(bDNA)等的情况下)结合的探针。在一些实施方案中，可以使至少2、至少5、至少10、至少25、至少50、至少75、至少100、至少300、至少1,000、至少3,000、至少10,000、至少30,000、至少50,000、至少100,000、至少250,000、至少500,000或至少1,000,000种可区分的核酸探针(例如，一级、二级、更高级探针和/或可检测地标记的探针)与样品接触，例如，同时或按任何合适的次序顺序接触。在本文公开的任何探针接触步骤之间，方法可以包括一个或多个介于中间的反应和/或处理步骤，如靶核酸的修饰、探针或其产物的修饰(例如，通过杂交、连接、延伸、扩增、切割、消化、分支迁移、引物交换反应、点击化学反应、交联、可检测标记的附接、激活光反应性部分等)、探针或其产物的去除(例如，切割掉探针的一部分和/或对整个探针去杂交)、信号修饰(例如，猝灭、掩蔽、光漂白、信号增强(例如，通过FRET)、信号放大等)、信号去除(例如，切割掉或永久灭活可检测标记)、交联、去交联和/或信号检测。
探针的靶结合序列(有时也称为靶向区域/序列或识别区域/序列)可以位于探针内的任何地方。例如，与靶核酸结合的一级探针的靶结合序列可以位于一级探针中任何条形码序列的5’或3’处。同样，二级探针(其与一级探针或其互补序列或产物结合)的靶结合序列可以位于二级探针中任何条形码序列的5’或3’处。在一些实施方案中，靶结合序列可以包含与靶核酸的一部分大体上互补的序列。在一些实施方案中，所述部分可以是至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补的。
一级核酸探针的靶结合序列可以参考样品中存在或怀疑存在的靶核酸(例如，细胞RNA或细胞分析物的标记剂的报告寡核苷酸)来确定。在一些实施方案中，可以使用多于一种靶结合序列来鉴定包含靶核酸或与靶核酸相关联的特定分析物。所述多于一种靶结合序列可以在相同的探针中或在不同的探针中。例如，可以顺序和/或同时使用多种探针，其可以与相同的靶核酸的不同区域结合(例如，杂交)。在其他实例中，探针可以包含可以与不同的靶核酸序列结合的靶结合序列，例如，同一基因的各种内含子和/或外显子序列(例如，以检测剪接变体)，或不同基因的序列，例如，以检测包含所述不同靶核酸序列的产物，如基因组重排(例如，倒位、转座、易位、插入、缺失、复制和/或扩增)。
在使核酸探针与样品接触之后，可以通过测定可检测标记(如果存在)来直接检测所述探针，和/或通过使用直接或间接与所述探针或其产物结合的一种或多种其他探针来检测所述探针。所述一种或多种其他探针可以包含可检测标记。例如，一级核酸探针可以与样品中的靶核酸结合，并可以引入二级核酸探针来与一级核酸探针的扩增产物结合，其中然后可以使用可检测地标记的探针来检测二级核酸探针或其产物。也可以使用直接或间接与二级核酸探针或其产物结合的更高级探针，并然后可以使用可检测地标记的探针来检测所述更高级探针或其产物。
在一些实施方案中，检测可以是空间的，例如，二维的或三维的。在一些实施方案中，检测可以是定量的，例如，可以确定一级核酸探针(和靶核酸)的量或浓度。在一些实施方案中，取决于应用，一级探针、二级探针、更高级探针和/或可检测地标记的探针可以包含能够与核酸杂交的多种实体中的任一种，例如，DNA、RNA、LNA和/或PNA等。
二级核酸探针可以含有能够与一级核酸探针或其产物结合或杂交的识别序列，例如，在一级核酸探针的条形码序列或其部分处，或在条形码序列的互补序列或其部分处(例如，在二级探针与一级探针的RCA产物杂交的情况下)。在一些实施方案中，二级核酸探针可以与一级核酸探针或其产物中条形码序列(其可以是连续的或彼此间隔开的)的组合结合。在一些实施方案中，结合是特异性的，或者结合可以使得识别序列优先与存在的条形码序列或其互补序列中的仅一者结合或杂交。二级核酸探针还可以含有一种或多种可检测标记。如果使用多于一种二级核酸探针，则可检测标记可以相同或不同。
识别序列可以具有任何长度，并且相同或不同的二级核酸探针中的多个识别序列可以具有相同或不同的长度。如果使用多于一个识别序列，则识别序列可以独立地具有相同或不同的长度。例如，识别序列的长度可以是至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40或至少50个核苷酸。在一些实施方案中，识别序列的长度可以不超过48、不超过40、不超过32、不超过24、不超过16、不超过12、不超过10、不超过8或不超过6个核苷酸。任何这些的组合也是可能的，例如，识别序列可以具有5至8个核苷酸之间、6至12个核苷酸之间或7至15个核苷酸之间等的长度。在一个实施方案中，识别序列具有与一级核酸探针或其产物的条形码序列或其互补序列相同的长度。在一些实施方案中，识别序列可以与条形码序列或其互补序列至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％互补。
在一些实施方案中，核酸探针，如一级或二级核酸探针，还可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个、20个或更多个、32个或更多个、40个或更多个、或50个或更多个条形码序列。条形码序列可以是如本文所述的任何靶特异性条形码序列或任何探针解析条形码序列。条形码序列可以位于核酸探针内的任何地方。如果存在多于一个条形码序列，则条形码序列可以彼此相邻定位，和/或与其他序列穿插。在一些实施方案中，条形码序列中的两个或更多个也可以至少部分地重叠。在一些实施方案中，同一探针中的两个或更多个条形码序列不重叠。在一些实施方案中，同一探针中的所有条形码序列由至少一个磷酸二酯键彼此分开(例如，它们可以彼此紧邻但不重叠)，如分开1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个核苷酸。
如果存在，条形码序列可以具有任何长度。如果使用多于一个条形码序列，则条形码序列可以独立地具有相同或不同的长度，如长度为至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少50个核苷酸。在一些实施方案中，条形码序列的长度可以不超过120、不超过112、不超过104、不超过96、不超过88、不超过80、不超过72、不超过64、不超过56、不超过48、不超过40、不超过32、不超过24、不超过16或不超过8个核苷酸。任何这些的组合也是可能的，例如，条形码序列可以在5至10个核苷酸之间、8至15个核苷酸之间等。
条形码序列可以是任意的或随机的。在某些情况下，条形码序列选择为减少或最小化与样品中其他组分的同源性，例如，使得条形码序列本身不与怀疑在细胞或其他样品内的其他核酸结合或杂交。在一些实施方案中，在特定的条形码序列与另一序列(例如，样品中的细胞核酸序列或添加到样品中的探针中的其他条形码序列)之间，同源性可以小于10％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％。在一些实施方案中，同源性可以小于20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个碱基，并且在一些实施方案中，所述碱基为连续碱基。
在一些实施方案中，核酸探针群体中的不同条形码序列的数量小于核酸探针的不同靶(例如，核酸分析物和/或蛋白质分析物)的数量，但不同的靶仍然可以例如通过用条形码序列的不同组合编码探针而从彼此唯一地鉴定。然而，并非需要使用给定的一组条形码序列的所有可能组合。例如，每种探针可以含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个等或更多个条形码序列。在一些实施方案中，核酸探针的群体可以各自含有相同数量的条形码序列，但在其他情况下，各种探针上可以存在不同数量的条形码序列。
作为说明性实例，第一探针可以含有第一靶结合序列、第一条形码序列和第二条形码序列，而第二不同的探针可以含有第二靶结合序列(其不同于第一探针中的第一靶结合序列)、与第一探针中相同的第一条形码序列、但第三条形码序列而不是第二条形码序列。由此可以通过确定样品中给定位置处存在的或与给定探针相关联的各种条形码序列组合来区分此类探针。
在一些实施方案中，本文公开的核酸探针可以使用4个碱基中的仅2个或仅3个来制备，例如在探针内将所有“G”排除在外和/或将所有“C”排除在外。缺少“G”或“C”的序列可以形成非常小的二级结构，并且在某些实施方案中可以有助于更均匀、更快速的杂交。
在一些实施方案中，本文公开的核酸探针可以含有可检测标记如荧光团。在一些实施方案中，测定中使用的多种核酸探针中的一种或多种探针可能缺少可检测标记，而所述多种核酸探针中的一种或多种其他探针各自包含选自不同可检测标记(例如，红色、绿色、黄色和蓝色荧光团)的有限池的可检测标记，并且可检测标记的不存在可以用作单独的“颜色”。因此，并非在所有情况下都需要可检测标记。在一些实施方案中，本文公开的一级核酸探针(例如，挂锁探针)缺少可检测标记。虽然可以将可检测标记掺入到一级核酸探针的扩增产物中，如通过将经修饰的核苷酸掺入到挂锁探针的RCA产物中，但在一些实施方案中，扩增产物未被可检测地标记。在一些实施方案中，与一级核酸探针或其产物结合的探针(例如，与一级核酸探针或其产物中的条形码序列或其互补序列结合的二级核酸探针)包含可检测标记并且可以用于检测一级核酸探针或其产物。在一些实施方案中，本文公开的二级核酸探针缺少可检测标记，可以使用与二级核酸探针或其产物结合的可检测地标记的探针(例如，在二级核酸探针或其产物中的条形码序列或其互补序列处)来检测二级核酸探针或其产物。在一些实施方案中，可以使用与可检测地标记的探针相关联的信号来检测二级探针中的一个或多个条形码序列和/或一级探针中的一个或多个条形码序列，例如，通过使用可检测地标记的探针的顺序杂交、边连接边测序和/或边杂交边测序。在一些实施方案中，使用条形码序列(例如，二级探针中的和/或一级探针中的)来组合地编码多种感兴趣的分析物。因此，可以使用与生物样品中特定位置处可检测地标记的探针相关联的信号来产生各自对应于样品中的分析物的不同信号签名，从而鉴定特定位置处的分析物，例如，以对样品进行原位空间分析。
在一些实施方案中，本文的核酸探针包含一种或多种其他组分，如一种或多种引物结合序列(例如，以允许探针的酶促扩增)、酶识别序列(例如，用于核酸内切酶切割)等。核酸探针的组分可以按任何合适的次序布置。
在一些方面，分析物被一级探针靶向，所述一级探针通过掺入与一级探针中直接或间接结合被靶向分析物的序列分开的一个或多个条形码序列(例如，可以被检测或以其他方式“读取”的序列)而被条形码化。在一些方面，一级探针进而被二级探针靶向，所述二级探针也通过掺入与二级探针中直接或间接结合一级探针或其产物的识别序列分开的一个或多个条形码序列而被条形码化。在一些实施方案中，二级探针可以与一级探针中的条形码序列结合。在一些实施方案中，二级探针可以与一级探针的RCA产物中的条形码序列的互补序列结合。在一些实施方案中，一组二级探针与RCA产物中的靶特异性条形码序列结合，并且第二组二级探针与RCA产物中的探针解析条形码序列结合。在一些方面，可以使用三级探针和任选地甚至更高级探针来靶向二级探针，例如在二级探针或其产物中的条形码序列或其互补序列处。在一些实施方案中，三级探针和/或甚至更高级探针可以包含一个或多个条形码序列和/或一个或多个可检测标记。在一些实施方案中，三级探针为与二级探针(或其产物)的条形码序列(或其互补序列)杂交的可检测地标记的探针。在一些实施方案中，通过检测与样品中可检测地标记的探针相关联的信号，可以确定样品中一种或多种分析物的位置和分析物的身份。在一些实施方案中，可以在样品中原位分析特定分析物的存在/不存在、绝对或相对丰度、量、水平、浓度、活性和/或与另一种分析物的关系。
在一些实施方案中，本文提供了结合靶核酸检测、信号放大(例如，通过核酸扩增如RCA和/或多种可检测地标记的探针的杂交，如在杂交链反应等中)和条形码解码的探针、探针组和测定方法。
在一些方面，一级探针(例如，包含如IV部分中所述的靶特异性条形码序列和探针解析条形码序列)、二级探针和/或更高级探针可以选自环状探针、可环化探针和线型探针。在一些实施方案中，环状探针可以是在与靶核酸和/或一种或多种其他探针杂交之前预环化的探针。在一些实施方案中，可环化探针可以是可以在与靶核酸和/或一种或多种其他探针如夹板杂交时环化的探针。在一些实施方案中，线型探针可以是包含靶识别序列和不与靶核酸杂交的序列的探针，如5’突出部、3’突出部和/或接头或间隔物(其可以包含核酸序列或非核酸部分)。在一些实施方案中，序列(例如，5’突出部、3’突出部和/或接头或间隔物)不与靶核酸杂交，但可以彼此杂交和/或与一种或多种其他探针如可检测地标记的探针杂交。
具体的探针设计可以随应用而异。例如，本文公开的一级探针、二级探针和/或更高级探针可以包括在与模板(例如，靶核酸和/或探针如夹板)杂交时需要间隙填充以环化的可环化探针(例如，挂锁探针)、间隙化挂锁探针(例如，在与模板杂交时需要间隙填充以环化的探针)、L形探针(例如，在与靶核酸或探针杂交时包含靶识别序列和5’或3’突出部的探针)、U形探针(例如，在与靶核酸或探针杂交时包含靶识别序列、5’突出部和3’突出部的探针)、V形探针(例如，在与靶核酸或探针杂交时包含至少两个靶识别序列和靶识别序列之间的接头或间隔物的探针)、用于邻近连接的探针或探针组(如US 7,914,987和US 8,580,504中描述的那些，其全文以引用方式并入本文，以及用于邻近连接测定(PLA)以同时检测和定量核酸分子和蛋白质-蛋白质相互作用的探针)或它们的任何合适组合。在一些实施方案中，本文公开的一级探针、二级探针和/或更高级探针可以包括挂锁样探针或探针组。在一些实施方案中，本文公开的核酸探针是SNAIL(夹板核苷酸辅助分子内连接)探针组的一部分，如US 2019/0055594或US 2021/0164039中描述的探针组，其全文以引用方式并入本文。在一些实施方案中，本文公开的核酸探针是PLAYR(RNA的邻近连接测定)探针组的一部分，如US 2016/0108458中描述的探针组，其全文以引用方式并入本文。在一些实施方案中，本文公开的核酸探针是PLISH(原位杂交中的邻近连接)探针组的一部分，如US 2020/0224243中描述的探针组，其全文以引用方式并入本文。可以使用本文描述的探针设计的任何合适的组合。
可以使用任何合适的可环化探针或探针组或实际上更一般地可环化报告分子来产生用于产生RCA产物的RCA模板。“可环化”指的是具有可连接末端的线型分子形式的探针或报告子(RCA模板)，其可以通过将末端直接或间接连接在一起(例如，彼此连接或连接到介于中间的(“间隙”)寡核苷酸的相应末端或连接到可环化RCA模板的延伸3’末端)而环化。可环化模板还可以以两个或更多个部分即两个或更多个分子(例如，寡核苷酸)提供，其可以连接在一起形成环。当所述RCA模板是可环化的时，其在RCA之前通过连接环化。可以使用连接模板对连接进行模板化，并且在挂锁探针和分子倒置探针等的情况下，靶分析物可以提供连接模板，或者它可以单独提供。可环化RCA模板(或模板一部分或部分)将在其相应的3’和5’末端区域处包含与连接模板中的对应同源互补区域(或结合位点)的互补性，所述互补区域可以与末端彼此直接连接的地方相邻，或者不相邻，具有介于中间的“间隙”序列，在这里将发生间接连接。
就挂锁探针而言，在一个实施方案中，可以通过与靶核酸分子(如靶分析物)上的相邻序列杂交来使挂锁探针的末端彼此靠近，靶核酸分子充当连接模板，从而允许末端连接在一起形成环状核酸分子，从而允许环化挂锁探针充当RCA反应的模板。在这样的实例中，与靶核酸分子杂交的挂锁探针的末端序列对于所讨论的靶分析物是特异性的，并将在RCA产物中重复复制。因此，它们可以充当指示该靶分析物的标记序列。因此，可以看出，RCA产物中的标记序列可以等同于靶分析物本身中存在的序列。替代地，可以在挂锁探针的非靶互补部分中提供标记序列(例如，标签或条形码序列)。在还进一步的实施方案中，标记序列可以存在于在挂锁探针的相应杂交末端之间杂交的间隙寡核苷酸中，在这里它们与靶分子中的不相邻序列杂交。这样的间隙填充挂锁探针类似于分子倒置探针。
在一些实施方案中，可以使用分子倒置探针来产生类似的环状RCA模板分子。与挂锁探针一样，这些通常也是能够与靶核酸分子(如靶分析物)杂交并被环化的线型核酸分子。分子倒置探针的两个末端可以在彼此接近但不直接相邻的位点处与靶核酸分子杂交，从而在两个末端之间导致间隙。在一些实施方案中，该间隙的大小可以在从一些实施方案中仅单个核苷酸到其他实施方案中100至500个核苷酸或更长的更大间隙的范围内。因此，需要供给聚合酶和核苷酸源或额外的间隙填充寡核苷酸，以填充分子倒置探针的两个末端之间的间隙，使得其可以被环化。
和挂锁探针一样，与靶核酸分子杂交的分子倒置探针的末端序列以及它们之间的序列对于所讨论的靶分析物将是特异性的，并将在RCA产物中重复复制。因此，它们可以充当指示该靶分析物的标记序列。替代地，可以在分子倒置探针的非靶互补部分中提供标记序列(例如，标签或条形码序列)。
在一些实施方案中，本文公开的探针可以是入侵探针，例如以产生环状核酸如环化探针。这样的探针在单核苷酸多态性的检测中特别有用。因此，本公开的检测方法可以用于检测靶核酸序列中的单核苷酸多态性或实际上任何变体碱基。用于这样的方法中的探针可以设计成使得探针的3’可连接末端与感兴趣的靶分子中的核苷酸(变体核苷酸)互补并能够与之杂交，并且在该探针的5’末端处的5’附加序列的3’末端处或在另一不同的探针部分的5’末端处的核苷酸与相同的所述核苷酸互补，但被阻止通过3’可连接末端(例如，其为移位核苷酸)与之杂交。切割探针以去除附加序列将提供5’可连接末端，如果3’可连接末端与靶核酸分子正确地杂交(例如，与靶核酸分子互补)，则该5’可连接末端可以与探针或探针部分的3’可连接末端连接。根据此原理设计的探针在感兴趣的位置处的不同变体之间提供高度区分，因为只有其中3’可连接末端与感兴趣的位置处的核苷酸互补的探针才可以参与连接反应。在一个实施方案中，探针以单个部分提供，并且3’和5’可连接末端由同一探针提供。在一些实施方案中，入侵探针为挂锁探针(入侵挂锁或“iLock”)，例如，如Krzywkowski等人,Nucleic Acids Research 45,e161,2017和US2020/0224244中所述，这些文献以引用方式并入本文。
Olink Bioscience(现在的Navinci Diagnostics AB)已经开发了产生可以通过RCA检测的环状分子并且包含靶分析物序列或其互补序列的其他类型探针，并包括美国专利号10,612,093中所述的选择器型探针，其包含能够引导靶核酸的切割以便从靶分析物释放包含靶序列的片段的序列和能够对片段的环化和连接进行模板化的序列。WO 2016/016452描述了探针，其包含能够与靶核酸杂交并充当引物以在靶核酸分子内产生靶序列的互补序列(例如，通过引物的靶模板化延伸)的3’序列以及能够对延伸探针的环化和连接进行模板化的内部序列，所述延伸探针包含靶分析物内的靶序列的反向互补序列和探针的一部分。在这两种探针的情况下，靶序列或其互补序列被掺入到环化分子中，该环化分子充当RCA反应的模板以产生RCA产物，所述RCA产物因此包含所述靶序列的串联重复序列。再次，所述靶序列可以充当RCA产物内或可以包含RCA产物内指示所讨论的靶分析物的标记序列。替代地，可以在探针的非靶互补部分中提供标记序列(例如，标签或条形码序列)。
在一些实施方案中，本文公开的核酸探针可以由多种组分预组装，例如，在使核酸探针与靶核酸或样品接触之前。在一些实施方案中，本文公开的核酸探针可以在使靶核酸或样品与多种组分接触期间和/或之后组装。在一些实施方案中，本文公开的核酸探针在样品中原位组装。在一些实施方案中，所述多种组分可以按任何合适的次序和以任何合适的组合与靶核酸或样品接触。例如，第一组分和第二组分可以与靶核酸接触，以允许组分之间的结合和/或第一和/或第二组分与靶核酸之间的结合。任选地，可以在组分之间和/或组分中的任一者或两者与靶核酸之间进行涉及组分中的任一者或两者和/或靶核酸的反应，如杂交、连接、引物延伸和/或扩增、化学或酶促切割、点击化学或它们的任何组合。在一些实施方案中，可以在反应之前、期间或之后添加第三组分。在一些实施方案中，可以在使样品与第一和/或第二组分接触之前、期间或之后添加第三组分。在一些实施方案中，第一、第二和第三组分可以以任何合适的组合顺序或同时与样品接触。在一些实施方案中，核酸探针可以以逐步方式原位组装，每个步骤添加一种或多种组分，或在所有组分被组装在一起的动态过程中组装。一个或多个去除步骤，例如通过在严格条件下洗涤样品，可以在组装过程期间的任何时间点进行，以去除或去稳定在此时间点不期望的中间体和/或组分并增加准确的探针组装和组装的探针的特异性靶结合的机会。
IV.使用靶特异性和探针解析条形码序列进行原位分析
在一些实施方案中，本文公开了一种用于分析生物样品的方法，其包括使生物样品与各自包含靶特异性条形码序列的多种探针接触，其中所述多种探针中的第一探针包含第一探针解析条形码序列，并且所述多种探针中的第二探针包含第二探针解析条形码序列。在一些实施方案中，所述多种探针靶向生物样品中的靶核酸，并且靶特异性条形码序列对应于靶核酸。在一些实施方案中，第一和第二探针解析条形码序列是不同的。在一些实施方案中，第一和第二探针解析条形码序列不对应于生物样品中的任何特定核酸分子，而是将第一探针与第二探针区分开，其中两种探针对应于相同的核酸分子。
在一些实施方案中，靶特异性条形码序列的长度可以为约5、约10、约15、约20、约25、约30或约35个核苷酸。在一些实施方案中，靶特异性条形码序列的长度可以为约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个核苷酸。
在一些实施方案中，第一和第二探针解析条形码序列的长度可以独立地为约3、约5、约10、约15、约20、约25、约30或约35个核苷酸。在一些实施方案中，第一和第二探针解析条形码序列的长度可以为约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，第一和第二探针解析条形码序列可以具有相同的长度。
在一些实施方案中，靶特异性条形码序列可以比第一和第二探针解析条形码序列长。在一些实施方案中，靶特异性条形码序列的长度可以在约15至约25个核苷酸之间，第一和第二探针解析条形码序列的长度可以在约3至约10个核苷酸之间。在一些实施方案中，靶特异性条形码序列的长度可以为约20个核苷酸，第一和第二探针解析条形码序列的长度可以为约5个核苷酸。
在一些实施方案中，当可以分析与多种不同的mRNA和/或cDNA分析物相关联的探针(或其扩增产物，例如，RCA产物)时，特定的环状或可环化(例如，挂锁)探针中的条形码序列可以唯一地对应于特定的mRNA或cDNA分子，并且特定的环状或可环化(例如，挂锁)探针还可包含锚定序列，该锚定序列在针对多种不同的mRNA和/或cDNA分析物的子集的环状或可环化(例如，挂锁)探针之间是共同的。在一些实施方案中，本文公开的第一和/或第二探针还可以包含锚定序列。在一些实施方案中，扩增产物(例如，RCA产物)中的锚定序列或其互补序列可以使用可检测探针来检测，例如与锚定序列或其互补序列杂交的中间探针(例如，L形探针)和与中间探针杂交的荧光标记探针。与锚定序列相关联的信号可以用于检测包含共同的锚定序列或其互补序列的所有扩增产物(例如，RCA产物)。因此，在一些实施方案中，与锚定序列相关联的信号可以在检测多种扩增产物(例如，RCA产物)中的靶特异性条形码序列和/或探针解析条形码序列(或其互补序列)的顺序循环期间用作对照。
在一些实施方案中，锚定序列可以与靶特异性条形码序列相邻。在一些实施方案中，锚定序列可以与靶特异性条形码序列的5’或3’核苷酸分开0、1、2、3、4、5个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，锚定序列可以在第一和第二探针之间是共同的。在一些实施方案中，锚定序列可以在所述多种探针之间是共同的。在一些实施方案中，锚定序列可以在靶向生物样品中的不同核酸分子的探针之间是共同的。在一些实施方案中，锚定序列的长度可以为约5、约10、约15、约20、约25、约30或约35个核苷酸。在一些实施方案中，锚定序列的长度可以为约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，锚定序列的长度可以为约20个核苷酸。在一些实施方案中，锚定序列可以是靶特异性条形码序列与探针解析条形码序列之间的接头序列。在一些实施方案中，锚定序列可以包含在靶特异性条形码序列与探针解析条形码序列之间的接头序列中或与之重叠。
在一些实施方案中，第一和/或第二探针还可以包含一个或多个接头序列。在一些实施方案中，第一和/或第二探针可以包含分别侧接第一或第二探针解析条形码序列的两个接头序列。在一些实施方案中，所述一个或多个接头序列中的每一个的长度可以独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，所述一个或多个接头序列可以在第一和第二探针之间是共同的。在一些实施方案中，所述一个或多个接头序列可以在所述多种探针之间是共同的。在一些实施方案中，所述一个或多个接头序列可以在靶向生物样品中的不同核酸分子的探针之间是共同的。在一些实施方案中，所述一个或多个接头序列可以用作锚定序列。也就是说，第一和/或第二探针不需要具有单独的锚定序列和接头序列。在一些实施方案中，所述一个或多个接头序列可以包含在锚定序列中或与锚定序列重叠。
在一些实施方案中，靶向第一物种中的靶核酸的第一探针包含与第一物种中的靶核酸中的靶序列互补的第一靶结合序列，而靶向第二物种中的相同靶核酸(或其同源物)的第二探针包含与第二物种中的靶核酸(或其同源物)中的靶序列互补的第二靶结合序列。在一些实施方案中，第一和第二探针中的靶结合序列可以是物种特异性的，并且第一和第二探针可以包含对应于靶核酸或其同源物的相同靶特异性条形码序列但分别对应于第一和第二物种的不同物种特异性条形码序列。例如，图1A中示出的四种靶向基因X的探针中的靶结合序列可以彼此不同并且是物种特异性的。类似地，图1C中示出的两种靶向基因Y的探针中的靶结合序列可以彼此不同并且是物种特异性的。
在一些实施方案中，第一和/或第二探针解析条形码序列可以与靶特异性条形码序列相邻。在一些实施方案中，第一和/或第二探针解析条形码序列可以与靶特异性条形码序列的5’或3’核苷酸分开0、1、2、3、4、5个或更多个核苷酸。
在一些实施方案中，所述多种探针还可以包括包含第三探针解析条形码序列的第三探针，所述方法还可以包括检测与第三探针解析条形码序列相关联的信号。在一些实施方案中，所述多种探针还可以包括包含第四探针解析条形码序列的第四探针，所述方法还可以包括检测与第四探针解析条形码序列相关联的信号。在一些实施方案中，与不同的探针解析条形码序列相关联的信号可以在分开的检测通道如不同的荧光通道中检测到。作为一个实例，可以使针对第一、第二、第三和第四探针解析条形码序列(或其互补序列)的可检测探针同时与生物样品接触，并且与每个探针解析条形码序列相关联的信号可以在红色、绿色、蓝色和黄色荧光通道中的一个中检测到。在一些实施方案中，第一、第二、第三和/或第四探针解析条形码序列可以在靶向相同核酸分子的探针之间是不同的。因此，靶向相同核酸分子的探针(例如，挂锁探针)可以基于每种特定探针中的探针解析条形码序列被分成子集，并且每个子集可以在单独的检测通道中检测到，但在一些实施方案中，不同的子集(由于探针中不同的探针解析条形码序列)可以在同一检测通道中(例如，同时)检测到。例如，包含相同的靶特异性条形码序列并靶向相同分析物的探针(例如，挂锁探针)可以被分成五个子集，每个探针子集包含不同的探针解析条形码序列。使用可检测探针(例如，L形探针和与L形探针结合的荧光标记探针)，挂锁探针的五个子集的扩增产物(例如，RCA产物)可以在五个单独的荧光通道中检测到，每个子集的RCA产物一个通道。替代地，任何两个或更多个子集的扩增产物(例如，RCA产物)可以在同一荧光通道中检测到。例如，两个子集的RCA产物可以检测为红色，而其他三个子集的RCA产物可以分别检测为绿色、蓝色和黄色。在一些实施方案中，不检测探针(例如，挂锁探针)的一个或多个子集。换句话说，不必检测靶向特定分析物的探针中的每一个不同的探针解析条形码序列。在一些实施方案中，针对特定分析物的探针中靶特异性条形码序列的检测和一个或多个(但非全部)不同的探针解析条形码序列的检测足以解析与分析物相关联的过度拥挤信号中的全部或一部分。在这样的实例中，可以但不需要检测剩余的探针解析条形码序列。
在一些实施方案中，生物样品可能含有一些高表达或丰富的靶，其可以通过使用探针解析条形码序列进行分析，而可用靶特异性条形码解析的其他靶可能不需要使用探针解析条形码序列。在一些实施方案中，可以首先使用靶特异性条形码序列分析生物样品，并且如果检测到重叠信号，则可以通过使用探针解析条形码序列来进一步分析样品。
在一些实施方案中，本文提供了用于检测生物样品中的细胞和细胞中和/或细胞上的分析物的起源的方法和组合物。在一些实施方案中，可以使生物样品与靶向单个基因(例如，基因组DNA、RNA或cDNA)的多种环状或可环化探针或探针组接触，其中每种探针或探针组包含对应于该探针或探针组所设计针对的物种的探针解析条形码序列(“物种特异性标签”)。在一些实施方案中，本文公开的物种特异性探针解析条形码序列不明确地对应于任何特定的靶分析物，但可以用于鉴定一种或多种靶分析物的物种起源。通过使用其相应的可检测探针(例如，包含用于探针解析条形码序列或其互补序列的杂交区域和用于通过荧光标记探针进行杂交和检测的突出部的L形探针)来标记和检测物种特异性探针解析条形码序列，每个基因可以在不同的多个荧光通道中检测到。在一些情况下，跨不同通道的信号检测允许鉴定与待与特定起源(例如，物种起源如小鼠和人)相关联的相同靶分析物相关联的信号子集。相同的靶分析物可以包括不同物种中相同基因的同源物，如小鼠Malat-1和人MALAT-1，并且靶向来自不同物种的相同靶分析物的探针可以具有相同或不同的靶结合序列(例如，取决于不同物种中的相同基因存在多少序列差异)、相同的靶特异性条形码序列(例如，对应于不同物种中的相同基因的基因特异性条形码序列)和各自对应于物种的不同物种特异性条形码序列。在一些实施方案中，靶向第一物种中的基因的第一探针包含与第一物种中的基因的靶序列互补的第一靶结合序列，而靶向第二物种中的相同基因或其同源物的第二探针包含与第二物种中的基因或同源物的靶序列互补的第二靶结合序列。第一和第二探针可以包含对应于基因或同源物的相同靶特异性条形码序列但分别对应于第一和第二物种的不同物种特异性条形码序列。
在一些实施方案中，生物样品可能含有一种或多种起源(例如，物种起源)的靶分析物，其可以通过使用探针解析条形码序列(例如，物种特异性标签)进行分析，而可用靶特异性条形码解析的其他靶可能不需要使用探针解析条形码序列。在一些实施方案中，可以使用靶特异性条形码序列分析生物样品，并且一旦检测到细胞的物种起源，就可以在不使用探针解析条形码序列的情况下进一步分析其他靶分析物。相同的探针解析条形码序列(例如，物种特异性标签)可以用于相同物种的多种不同靶分析物。在一些实施方案中，第一多种探针可以各自包含第一探针解析条形码序列，第一多种探针中的每种探针可以靶向第一物种的各种核酸序列(例如，多种靶分析物)，并且第二多种探针可以各自包含第二探针解析条形码序列，第二多种探针中的每种探针可以靶向第二物种的各种核酸序列(例如，多种靶分析物)。
在一些实施方案中，第一、第二、第三和/或第四探针解析条形码序列可以在靶向生物样品中的不同核酸分子的探针之间是共同的。例如，分别靶向基因X和基因Y的第一对探针可以共享共同的第一探针解析条形码序列，分别靶向基因X和基因Y的第二对探针可以共享共同的第二探针解析条形码序列，分别靶向基因X和基因Y的第三对探针可以共享共同的第三探针解析条形码序列，并且分别靶向基因X和基因Y的第四对探针可以共享共同的第四探针解析条形码序列。在一些情况下，在不同的靶之间共享的共同探针解析条形码序列可以节省靶探针组的成本和试剂。在一些实施方案中，针对每种靶的每个探针组使用一组探针解析条形码序列。例如，可以在针对多种不同靶的探针中使用四个探针解析条形码序列，并且每种靶可以被四种探针(例如，挂锁探针)靶向，每种探针包含所述四个探针解析条形码序列中之一。
在一些实施方案中，所述多种探针可以直接或间接与核酸分子中的相同序列结合。在一些实施方案中，第一和第二探针可以与核酸分子中的相同序列杂交。在一些实施方案中，所述多种探针中的两种或更多种可以直接或间接与相同核酸分子中的不同序列结合。在一些实施方案中，第一和第二探针可以与相同核酸分子中的不同序列杂交。
在一些实施方案中，第一和第二探针可以是可环化探针或探针组，例如，包括间隙填充挂锁探针的挂锁探针、SNAIL探针、分子倒置探针、包括入侵挂锁探针的入侵探针以及III部分中描述的任何探针或探针组。在一些实施方案中，第一和/或第二探针可以包含核糖核苷酸，如不多于四个、不多于三个或不多于两个核糖核苷酸。在一些实施方案中，第一和第二探针可以是挂锁探针，并且可以使用核酸分子作为模板来连接挂锁探针的末端，在连接之前进行或不进行间隙填充。在一些实施方案中，挂锁探针可以包含脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸，并且核酸分子可以是RNA分子，如mRNA。在一些实施方案中，挂锁探针可以在脱氧核糖核苷酸主链中包含3’核糖核苷酸。
在一些实施方案中，本文公开的探针通过滚环扩增来扩增。在一些实施方案中，一级探针，如挂锁探针或包括挂锁探针的探针组，含有一个或多个条形码。在一些实施方案中，条形码由检测一级探针结合，检测一级探针不需要是荧光的，但包括靶结合部分(例如，用于与一种或多种一级探针杂交)和多个其他条形码(例如，二级条形码，相对于一级探针上的一级条形码而言)。在一些实施方案中，检测一级探针的条形码被可检测地标记的检测寡核苷酸如荧光标记的寡核苷酸靶向。在一些实施方案中，使用一个或更多个解码方案来解码信号，如荧光，用于序列确定。示例性解码方案见述于Eng等人,“Transcriptome-scaleSuper-Resolved Imaging in Tissues by RNA SeqFISH+,”Nature 568(7751):235-239(2019)；Chen等人,“Spatially resolved,highly multiplexed RNA profiling insingle cells,”Science；348(6233):aaa6090(2015)；US10,457,980B2；US2016/0369329A1；WO 2018/026873A1；和US2017/0220733 A1中，所有这些文献均全文以引用方式并入。在一些实施方案中，这些测定使得能够同时实现信号放大、组合解码和纠错方案。
在一些实施方案中，所述方法包括使用与感兴趣的多核苷酸杂交的环状或可环化构建体来产生环状核酸。在一些实施方案中，RCA包括线型RCA。在一些实施方案中，RCA包括分支RCA。在一些实施方案中，RCA包括树状RCA。在一些实施方案中，RCA包括前述的任何组合。在一些实施方案中，环状核酸为使用连接形成的构建体。在一些实施方案中，使用模板引物延伸然后连接来形成环状构建体。在一些实施方案中，通过在待连接的末端之间提供插入物来形成环状构建体。在一些实施方案中，使用任何前述的组合来形成环状构建体。在一些实施方案中，连接为DNA-DNA模板化连接。在一些实施方案中，连接为RNA-RNA模板化连接。示例性的RNA模板化连接探针和方法见述于US2020/0224244中，其全文以引用方式并入本文。在一些实施方案中，连接为RNA-DNA模板化连接。在一些实施方案中，提供夹板作为连接的模板。
在一些实施方案中，本文公开的探针(例如，挂锁探针)可以包含5’侧翼，其可以由结构特异性切割酶(例如，能够识别单链5’突出部与DNA双链体之间的衔接点并切割单链突出部的酶)识别。应理解，为结构特异性切割酶的底物的支化三链结构可以由一个探针部分的5’末端和另一个探针部分的3’末端(当二者均已与靶核酸分子杂交时)以及由单部分探针的5’和3’末端形成。适合于此类切割的酶包括侧翼核酸内切酶(FENS)，其是一类具有核酸内切活性并且能够催化单链与双链DNA的衔接点处磷酸二酯键的水解切割的酶。因此，在一些实施方案中，通过结构特异性切割酶(例如，侧翼核酸内切酶)进行在第一靶特异性结合位点的5’处的附加序列的切割。合适的侧翼核酸内切酶见述于Ma等人,2000.JBC 275,24693-24700中和US2020/0224244中，并且可以包括P.furiosus(Pfu)、A.fulgidus(Afu)、M.jannaschii(Mja)或M.thermoautotrophicum(Mth)。在其他实施方案中，能够识别和降解具有游离5’末端的单链寡核苷酸的酶可以用于从如上所述的结构切割附加序列(5’侧翼)。因此，具有5’核酸酶活性的酶可以用于切割5’附加序列。这样的5’核酸酶活性可以是5’核酸外切酶活性和/或5’核酸内切酶活性。5’核酸酶能够识别单链寡核苷酸的游离5’末端并降解所述单链寡核苷酸。5’核酸外切酶通过将寡核苷酸从其5’末端降解成组成单核苷酸来降解具有游离5’末端的单链寡核苷酸。5’核酸内切酶活性可以在一个或多个核苷酸处内部切割5’侧翼序列。一旦该酶识别出游离5’末端，该酶就会穿过单链寡核苷酸到达双链体区域，并将单链区域切割成较大的组成核苷酸(例如，二核苷酸或三核苷酸)，或切割整个5’单链区域，从而发生5’核酸酶活性，例如如Lyamichev等人,1999.PNAS 96,6143-6148中针对Taq DNA聚合酶和其5’核酸酶所描述。具有5’核酸酶活性的优选酶包括核酸外切酶VIII，或来自水生栖热菌(Taq)、嗜热栖热菌或黄色栖热菌的天然或重组DNA聚合酶，或来自其的核酸酶结构域。
在一些情况下，在形成环状核酸后，添加扩增引物。在其他情况下，扩增引物与一级和/或二级探针一起添加。在一些情况下，扩增引物也可以与靶核酸和挂锁探针(例如，SNAIL探针)互补。在一些实施方案中，进行洗涤步骤以去除任何未结合的探针、引物等。在一些实施方案中，洗涤为严格洗涤。洗涤步骤可以在过程期间的任何时间点进行以去除非特异性结合的探针、已连接的探针等。
在一些情况下，在存在适当的dNTP前体和其他辅因子的情况下添加DNA聚合酶后，扩增引物通过模板的多个拷贝的复制而被延长。扩增步骤可以利用等温扩增或非等温扩增。在一些实施方案中，在形成杂交复合物和任何后续的环化(如例如挂锁探针的连接)之后，将环状探针滚环扩增以产生含有环状的多个拷贝的DNA多联体(例如，扩增子)。
可以使用的DNA聚合酶的合适实例包括但不限于：大肠杆菌DNA聚合酶I、Bsu DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、VENTTM DNA聚合酶、DEEPVENTTM DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、/>Hot Start Taq DNA聚合酶、Crimson/>TaqDNA聚合酶、Crimson Taq DNA聚合酶、/>DNA聚合酶、/>DNA聚合酶、Hemo/>DNA聚合酶、/>DNA聚合酶、/>DNA聚合酶、/>High-Fidelity DNA聚合酶、Platinum Pfx DNA聚合酶、AccuPrime Pfx DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、Klenow片段、Pwo DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶和T7 DNA聚合酶。
在一些实施方案中，滚环扩增产物使用选自以下的聚合酶产生：Phi29 DNA聚合酶、Phi29样DNA聚合酶、M2 DNA聚合酶、B103 DNA聚合酶、GA-1DNA聚合酶、phi-PRD1聚合酶、Vent DNA聚合酶、Deep Vent DNA聚合酶、Vent(外切-)DNA聚合酶、KlenTaq DNA聚合酶、DNA聚合酶I、DNA聚合酶I的Klenow片段、DNA聚合酶III、T3 DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、T5 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Bst聚合酶、rBST DNA聚合酶、N29 DNA聚合酶、TopoTaq DNA聚合酶、T7 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶及其变体或衍生物。
在一些实施方案中，聚合酶包含经修饰的重组Phi29型聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶包含经修饰的重组Phi29、B103、GA-1、PZA、Phi15、BS32、M2Y、Nf、G1、Cp-1、PRD1、PZE、SF5、Cp-5、Cp-7、PR4、PR5、PR722或L17聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶包含与野生型Phi29聚合酶相比具有至少一个氨基酸取代或取代的组合的经修饰重组DNA聚合酶。示例性的聚合酶见述于美国专利号8,257,954；8,133,672；8,343,746；8,658,365；8,921,086；和9,279,155中，所有这些文献均以引用方式并入本文。在一些实施方案中，在接触样品之前，不将聚合酶直接或间接固定至基底，如珠或平面基底(例如，玻璃载玻片)，但可以将样品固定在基底上。在一些实施方案中，不将聚合酶附着至纳米孔、纳米孔膜或其绝缘支撑物。
扩增后，例如通过使用可检测地标记的探针和成像来确定或以其他方式分析扩增子或其部分的序列。扩增产物的测序或分析可以包括边杂交边测序、边连接边测序和/或荧光原位测序，和/或其中原位杂交包括顺序荧光原位杂交。在一些情况下，使用例如本文描述的二级和更高级探针及检测寡核苷酸进行测序。
V.信号放大、检测和分析
在一些方面，所提供的方法涉及分析(例如，检测或确定)多核苷酸中(例如，III部分中描述的探针；如IV部分中所述包含靶特异性条形码序列和探针解析条形码序列的探针)和/或其产物或衍生物中如扩增产物(例如，扩增的挂锁探针)中存在的一个或多个序列。
在一些实施方案中，本公开解决了在涉及检测核酸序列(作为靶分析物或作为一种或多种靶分析物(诸如一种或多种靶蛋白)的标记或报告分子)的方法(包括检测样品中分析物的定位的原位测定)中的信号拥挤。有许多需要同时检测样品中的几种不同分析物的情况，例如当在可能存在宽范围的不同表达水平的情况下原位检测样品中不同基因的表达时。在一些实施方案中，核酸分子在样品中作为靶分析物被原位检测。在一些实施方案中，核酸分子作为其他非核酸分析物(包括例如蛋白质)的报告分子被检测，或者实际上作为核酸分析物的报告分子或信号放大器被检测。因此，在这样的分析物的检测测定中，核酸分子可以作为例如抗体或其他基于亲和结合剂的探针(例如在免疫PCR或免疫RCA中)的标签或报告分子使用，或者例如通过基于邻近探针的测定中的连接或延伸而产生。例如，邻近连接反应可以包括报告寡核苷酸连接至抗体对，如果抗体已经例如通过结合相同的靶蛋白(复合物)而彼此接近，则所述抗体对可以通过连接而结合，并且形成的DNA连接产物然后被用于模板PCR扩增，如例如在等人,Methods(2008),45(3):227-32中所述，所述文献的全部内容以引用方式并入本文。在一些实施方案中，邻近连接反应可以包括报告寡核苷酸连接至抗体，每种抗体与结合对或复合物的一个成员结合，例如以便分析结合对或复合物的成员之间的结合。对于使用邻近的寡核苷酸检测分析物，参见例如美国专利申请公开号2002/0051986，其全部内容以引用方式并入本文。在一些实施方案中，邻近的两种分析物可以被两种标记剂(例如，抗体)特异性地结合，每种标记剂连接至报告寡核苷酸(例如，DNA)，所述报告寡核苷酸当邻近时当结合至它们各自的靶时可以参与连接、复制和/或序列解码反应。核酸分子可以以反映分析物水平的量存在，并且可以作为靶分析物的“替代物”被检测到。用于检测样品中的多个核酸序列的合适方法可以包括使用杂交探针和边杂交边测序。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括用可检测标记(直接或间接)标记待检测的分析物，使用例如杂交探针，并且然后检测来自那些标记的信号以便鉴定核酸序列。在一些实施方案中，一些靶核酸序列在样品中存在的浓度显著高于或低于其他靶核酸序列。如果特定的靶核酸序列以高浓度存在于样品中，那么大量的杂交探针将与该靶核酸序列结合并且将产生大量的信号。在一些实施方案中，同时产生和检测多个信号，并且从每种靶核酸序列产生的信号的数量与样品中存在的靶核酸序列的量有关。因此，来自以高浓度存在的靶核酸序列的信号或与来自其他靶核酸序列的信号非常接近的信号可能会过度拥挤并掩蔽来自靶核酸序列的信号。在一些实施方案中，本文公开的方法防止和/或改善了其中期望检测许多不同核苷酸序列的多重测定中的信号拥挤，而不管标记序列的方式和使用的标记类型(例如，光信号、放射性信号等)。本公开在多个不同的信号在非常邻近的地方同时产生的情况下特别有用。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括检测和鉴定给定细胞中的RNA转录物，以便分析该细胞的基因表达。在一些实施方案中，本文公开的方法包括用荧光标记探针标记RNA转录物(或一种或多种与其结合的一级或更高级探针)。然后可以显现来自荧光标记的信号，以便确定在例如组织样品的给定细胞中存在哪些RNA转录物。这也可以用于提供关于不同RNA转录物的位置和相对量的信息(以及因此相应基因表达的位置和相对水平)。如果一个特定的基因(或多个基因)显著过表达，则样品中将存在大量与该基因对应的RNA转录物，并且因此将产生大量指示该RNA转录物存在的荧光信号。在某一点上，信号密度将是这样的，使得使用常规荧光显微术不能解析至少一些单独的信号，从而抑制或甚至阻止来自其他RNA转录物的信号的检测，所述其他RNA转录物对应于在样品中以较低水平表达或在物理上重叠或以其他方式非常接近的基因(在2D或3D空间中)，这导致信息丢失和基因表达的不准确图像。应当理解，这个问题可能出现在许多其他核酸检测方法中。在一些方面，本公开提供了一种检测样品中的多种靶核酸序列的方法，其中信号拥挤被减少。
在一些实施方案中，本公开中提供的方法用于分析物(诸如核酸)的多重检测，即用于检测样品(例如一个或多个组织样品，诸如单个组织切片或一系列组织切片)中的多种靶分析物。在一些实施方案中，所述方法使用杂交探针，同时减少来自所述杂交探针的信号拥挤。在一些实施方案中，本文所提供的方法包括用于检测样品中的核酸序列的探针的边杂交边测序(SBH)或顺序杂交，包括用于检测在样品中同时具有宽范围的分布和丰度的不同靶核酸序列(例如，一种或多种靶分析物的标记或报告子)的探针的多重SBH或顺序杂交。在一些实施方案中，本文所提供的方法解决了由于指示以高浓度和/或紧密邻近存在的靶核酸序列的信号可能掩蔽和/或过度拥挤其他信号而导致的信号拥挤问题。
在一些方面，信号过度拥挤可能会阻止与靶核酸序列有关的信号被产生、检测或以其他方式与样品中的其他信号区分开来。例如，如果杂交探针由于空间位阻而不能成功地与它们的同源靶核酸序列杂交，或者如果检测探针不能与杂交探针杂交，那么将不会产生信号，并且因此将不会检测到靶核酸序列。这可能被称为空间拥挤。可替代地，有可能从所有靶核酸序列中正确地产生了信号，但是在样品的特定区域中或在整个样品中产生了如此多的信号(例如，信号密度太大)，以至于不能正确地检测到并解析所有的信号。在通过光学手段检测信号的情况下，这可以被称为光学拥挤，并且本发明的方法特别适合于解决或减少光学拥挤。在一些方面,“光学手段”意指在视觉上或通过视觉手段检测到信号，即信号被显现。因此，在一些情况下，所产生的信号涉及光或其他视觉上可检测的电磁辐射(诸如荧光)的检测。在一些方面，信号可以是光学信号、视觉信号或视觉上可检测的信号。信号可以通过视力进行检测，典型地在放大之后，但是更典型地，它们在用于信号检测的自动化系统中被检测和分析。
在一些方面，可以通过显微术来检测信号。在一些方面，可以产生其中可以看到和检测到信号的图像，例如显微镜视场的图像或从照相机获得的图像。信号可以通过成像来检测，更具体地通过对样品或其一部分或反应混合物成像来检测。举例来说，图像中的信号可以作为图像中可以看见的“斑点”进行检测。在一些方面，信号可以作为图像中的斑点被看见。在一些方面，当单独的斑点不能被分辨或彼此区分时，例如当它们重叠或彼此遮蔽时，会发生光学拥挤。通过使用本文的方法减少斑点的数量，使得单独的斑点或信号可以被解析，可以减少光学拥挤。在一些方面，本发明的方法对信号进行光学去拥挤。
在一些方面，本文的方法涉及减少在所述方法的检测步骤中同时检测到的信号的数量。这在不同的方法中以不同的方式实现，以阻止或阻断在给定的检测循环中从某些靶(例如，样品中丰富或高度表达的靶)产生信号。靶可以包括高表达基因(例如，mRNA转录物)或被标记剂(例如，报告寡核苷酸缀合抗体)靶向的丰富分子。
在一些实施方案中，本文公开的方法还可以包括一个或多个信号放大部件。在一些实施方案中，本公开涉及使用探针杂交原位检测核酸序列(例如，靶特异性条形码序列和/或探针解析条形码序列)并产生与探针相关联的放大信号，其中背景信号减少、灵敏度增加。
在一些实施方案中，条形码序列(例如，靶特异性条形码序列、探针解析条形码序列或物种特异性条形码序列)可以在滚环扩增(RCA)产物分子、包含用于杂交链反应(HCR)的引发剂和扩增子的复合物、包含用于线型寡核苷酸杂交链反应(LO-HCR)的引发剂和扩增子的复合物、引物交换反应(PER)产物分子、包含用于分支DNA(bDNA)的预扩增子和扩增子的复合物或包含前述分子和复合物中的任何两种或更多种的复合物中。例如，bDNA复合物或HCR复合物可以组装在RCA产物上。参见例如US2021/0198727，其全文以引用方式并入本文。
与本文公开的探针相关联的信号(例如，与靶特异性条形码序列、探针解析条形码序列或物种特异性条形码序列相关联的信号)可以使用包括以下的方法检测：在探针杂交位点周围靶向沉积可检测反应性分子，靶向组装分支结构(例如，bDNA或使用锁核酸(LNA)进行分支测定)，通过酶促滚环扩增(RCA)编程多联体的原位生长(例如，如US2019/0055594中所述，其以引用方式并入本文)，杂交链反应，使用连续轮次的化学连接(clampFISH)组装拓扑连接的DNA结构，通过发夹介导的多联体化进行信号放大(例如，如US2020/0362398中所述，其以引用方式并入本文)，例如，引物交换反应如通过交换反应进行信号放大(SABER)或SABER与DNA-交换(交换-SABER)。
可检测反应性分子可以包括酪胺，如用于酪胺信号放大(TSA)或多重催化报告沉积(CARD)-FISH中。在一些实施方案中，可检测反应性分子可以从可检测标记如荧光团释放和/或切割。在一些实施方案中，本文公开的方法包括生物样品的多重分析，包括探针杂交、荧光成像和信号去除的连续循环，其中信号去除包括从荧光团标记的反应性分子(例如，酪胺)去除荧光团。示例性的可检测反应性试剂和方法见述于US 6,828,109、US2019/0376956、US2019/0376956、US2022/0026433、US2022/0128565和US2021/0222234中，所有这些专利均全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，可以使用杂交链反应(HCR)来检测与本文公开的探针相关联的信号(例如，与靶特异性条形码序列、探针解析条形码序列或物种特异性条形码序列相关联的信号)。HCR是一种基于核酸分子的杂交触发链的无酶核酸扩增，从HCR单体开始，这些单体彼此杂交形成带切口的核酸聚合物。该聚合物是HCR反应的产物，其最终被检测以指示靶分析物的存在。HCR详细描述于Dirks和Pierce,2004,PNAS,101(43),15275-15278中以及US 7,632,641和US 7,721,721中(也参见US2006/00234261；Chemeris等人,2008DokladyBiochemistry and Biophysics,419,53-55；Niu等人,2010,46,3089-3091；Choi等人,2010,Nat.Biotechnol.28(11),1208-1212；和Song等人,2012,Analyst,137,1396-1401)。HCR单体通常包含发夹或其他亚稳态核酸结构。在最简单的HCR形式中，当引入“引发剂”核酸分子时，两种不同类型的稳定发夹单体(这里称为第一和第二HCR单体)经历杂交链反应事件，形成带长切口的双链DNA分子。HCR单体具有发夹结构，该发夹结构包含双链茎区、连接茎区的两条链的环区和在双链茎区的一端处的单链区。当单体处于发夹结构中时暴露(并因此可用于与另一分子例如引发剂或其他HCR单体杂交)的单链区可以被称为“立足点区”(或“输入结构域”)。第一HCR单体各自还包含与第二HCR单体的暴露的立足点区中的序列互补的序列。第一HCR单体中的这种互补性序列可以被称为“相互作用区”(或“输出结构域”)。类似地，第二HCR单体各自包含相互作用区(输出结构域)，例如与第一HCR单体的暴露的立足点区(输入结构域)互补的序列。在不存在HCR引发剂的情况下，这些相互作用区受到二级结构的保护(例如，它们不暴露)，因此发夹单体是稳定的或动力学被困的(也称为“亚稳态”)，并保持为单体(例如，防止系统快速平衡)，因为第一和第二组HCR单体不能彼此杂交。然而，一旦引入引发剂，它就能够与第一HCR单体的暴露的立足点区杂交，并侵入它，导致其打开。这将暴露第一HCR单体的相互作用区(例如，与第二HCR单体的立足点区互补的序列)，从而允许其与立足点区处的第二HCR单体杂交并侵入第二HCR单体。这种杂交和侵入进而打开第二HCR单体，暴露其相互作用区(其与第一HCR单体的立足点区互补)，并允许其与另一第一HCR单体杂交并侵入另一第一HCR单体。反应以这种方式继续，直至所有HCR单体都被耗尽(例如，所有HCR单体都并入到聚合物链中)。最终，该链反应导致形成第一和第二单体物种的交替单元的带切口的链。因此需要HCR引发剂的存在以便通过与第一HCR单体杂交并侵入第一HCR单体来触发HCR反应。第一和第二HCR单体被设计成彼此杂交并因此可以定义为彼此同源。它们还与给定的HCR引发剂序列同源。彼此相互作用(杂交)的HCR单体可以被描述为一组HCR单体或HCR单体或发夹系统。
HCR反应可以用多于两种物种或类型的HCR单体进行。例如，可以使用涉及三种HCR单体的系统。在这样的系统中，每个第一HCR单体可以包含与第二HCR单体的立足点区结合的相互作用区；每个第二HCR可以包含与第三HCR单体的立足点区结合的相互作用区；并且每个第三HCR单体可以包含与第一HCR单体的立足点区结合的相互作用区。然后，HCR聚合反应将如上所述进行，不同的是所得产物将是连续具有第一、第二和第三单体的重复单元的聚合物。可以容易地设想具有更大数量的HCR单体组的相应系统。对于示例性的复合物，参见例如US2020/0399689和US2022/0064697，它们以引用方式完全并入本文。
在一些实施方案中，可以使用线型寡核苷酸杂交链反应(LO-HCR)来检测与本文公开的探针相关联的信号(例如，与靶特异性条形码序列、探针解析条形码序列或物种特异性条形码序列相关联的信号)。在一些实施方案中，本文提供了一种检测样品中的分析物的方法，其包括：(i)进行线型寡核苷酸杂交链反应(LO-HCR)，其中使引发剂与至少第一和第二物种的多种LO-HCR单体接触以产生与靶核酸分子杂交的聚合LO-HCR产物，其中第一物种包含与引发剂互补的第一杂交区和与第二物种互补的第二杂交区，其中第一物种和第二物种是线型的单链核酸分子；其中所述引发剂以一个或多个部分提供，并且直接或间接与靶核酸分子杂交或包含在靶核酸分子中；以及(ii)检测聚合物产物，从而检测分析物。在一些实施方案中，第一物种和/或第二物种可以不包含发夹结构。在一些实施方案中，所述多种LO-HCR单体可以不包含亚稳态二级结构。在一些实施方案中，LO-HCR聚合物可以不包含分支结构。在一些实施方案中，进行线型寡核苷酸杂交链反应包括使靶核酸分子与引发剂接触以提供与靶核酸分子杂交的引发剂。在本文的任何实施方案中，靶核酸分子和/或分析物可以是内源分析物或RCA产物的序列。用于LO-HCR的示例性方法和组合物见述于US2021/0198723中，其全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，条形码序列(例如，包含如IV部分中所述的靶特异性和/或探针解析条形码序列的探针或RCA产物的条形码序列)可以用包括通过进行引物交换反应(PER)进行信号放大的方法来检测。在各种实施方案中，在其3’末端上具有结构域的引物与催化发夹结合，并通过链置换聚合酶延伸出新结构域。例如，在其3’末端上具有结构域1的引物与催化发夹结合，并通过链置换聚合酶延伸出新结构域1，重复循环产生重复的结构域1序列的多联体。在各种实施方案中，链置换聚合酶为Bst。在各种实施方案中，催化发夹包括释放链置换聚合酶的终止子。在各种实施方案中，分支迁移置换延伸的引物，然后延伸的引物可以解离。在各种实施方案中，引物经历重复循环以形成多联体引物。在各种实施方案中，使多种多联体引物与样品接触，所述样品包含使用本文所述的方法产生的探针或RCA产物(例如，包含如IV部分中所述的靶特异性和/或探针解析条形码序列)。在各种实施方案中，探针或RCA产物(例如，包含如IV部分中所述的靶特异性和/或探针解析条形码序列)可以与多种多联体引物和多种标记的探针接触。关于示例性的分子和PER反应组分，参见例如美国专利公开号US2019/0106733，其以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，探针或RCA产物(例如，包含如IV部分中所述的靶特异性和/或探针解析条形码序列)可以通过提供检测探针如用于进行形成扩增产物的链反应(例如，HCR)的探针来检测。在一些实施方案中，分析包括确定扩增产物的全部或一部分的序列。在一些实施方案中，分析包括检测扩增产物中存在的序列。在一些实施方案中，扩增产物的全部或一部分的序列指示靶核酸中感兴趣的区域的身份。在其他实施方案中，所提供的方法涉及分析(例如，检测或确定)存在于多核苷酸探针中的一个或多个序列(例如，存在于第一和/或第二探针的突出部区域中的条形码序列)。
在一些实施方案中，所述方法包括对扩增产物的全部或一部分进行测序，如存在于扩增产物中的一个或多个条形码序列(例如，如IV部分中所述的靶特异性和/或探针解析条形码序列)。在一些实施方案中，分析和/或序列确定包括对扩增产物或探针的全部或一部分进行测序和/或与扩增产物或探针原位杂交。在一些实施方案中，测序步骤涉及边杂交边测序、边连接边测序和/或荧光原位测序、基于杂交的原位测序和/或其中原位杂交包括顺序荧光原位杂交。在一些实施方案中，分析和/或序列确定包括检测通过杂交链反应(HCR)反应产生的聚合物，对于示例性的探针和HCR反应组分，参见例如US2017/0009278，其以引用方式并入本文。在一些实施方案中，检测或确定包括使用荧光团、同位素、质量标签或其组合标记的检测寡核苷酸与扩增产物杂交。在一些实施方案中，检测或确定包括对扩增产物成像。在一些实施方案中，靶核酸为组织样品中的mRNA，并且在靶核酸和/或扩增产物位于组织样品中原位时进行检测或确定。
在一些方面，所提供的方法包括对扩增产物(例如，扩增子)和/或多核苷酸的一个或多个部分成像，例如，通过检测探针的结合并检测可检测标记。在一些实施方案中，检测探针包含可以测量和定量的可检测标记。术语“标记”和“可检测标记”包含与待检测分子相关联(例如，与之缀合)的直接或间接可检测部分，例如可检测探针，包括但不限于荧光团、放射性同位素、荧光剂、化学发光剂、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、发色团、染料、金属离子、金属溶胶、配体(例如，生物素或半抗原)等。
术语“荧光团”包括能够表现出在可检测范围内的荧光的物质或其一部分。可以根据所提供的实施方案使用的标记的特定实例包括但不限于藻红蛋白、Alexa染料、荧光素、Ypet、CyPet、Cascade blue、别藻蓝蛋白、Cy3、Cy5、Cy7、罗丹明、丹酰、伞形酮、Texas red、鲁米诺、吖啶酯、生物素、绿色荧光蛋白(GFP)、增强的绿色荧光蛋白(EGFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、增强的黄色荧光蛋白(EYFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、红色荧光蛋白(RFP)、萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶、NADPH、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶、氯霉素乙酰转移酶和脲酶。
组织样品中的荧光检测常常会因强背景荧光的存在而受到阻碍。“自发荧光”是用于区分背景荧光(其可以由多种来源产生，包括醛固定、细胞外基质组分、红细胞、脂褐素等)与来自荧光标记抗体或探针的所需免疫荧光的通用术语。组织自发荧光可能导致难以将归因于荧光抗体或探针的信号与一般背景区分开来。在一些实施方案中，本文公开的方法利用一种或多种试剂来减少组织自发荧光，例如自发荧光消除剂(Sigma/EMDMillipore)、TrueBlack脂褐素自发荧光淬灭剂(Biotium)、MaxBlock自发荧光减少试剂盒(MaxVision Biosciences)和/或非常强烈的黑色染料(例如，苏丹黑或相当的深色发色团)。
在一些实施方案中，可以使用含有可检测标记的可检测探针来检测本文所述的一种或多种多核苷酸和/或扩增产物(例如，扩增子)。在一些实施方案中，所述方法涉及将含有可检测标记的可检测探针与样品一起温育，洗涤未结合的可检测探针，和例如通过成像来检测标记。
可检测标记的实例包括但不限于各种放射性部分、酶、辅基、荧光标记、发光标记、生物发光标记、金属颗粒、蛋白质-蛋白质结合对和蛋白质-抗体结合对。荧光蛋白的实例包括但不限于黄色荧光蛋白(YFP)、绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白(CFP)、伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三吖嗪胺荧光素、丹酰氯和藻红蛋白。
生物发光标记的实例包括但不限于荧光素酶(例如，细菌、萤火虫和叩甲)、荧光素、水母素等。具有视觉可检测信号的酶系统的实例包括但不限于半乳糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、磷酸酶、过氧化物酶和胆碱酯酶。可鉴定标记还包括放射性化合物如125I、35S、14C或3H。可鉴定标记可从多种来源商购获得。
荧光标记和与这样的荧光标记缀合的核苷酸和/或多核苷酸的实例包括例如以下中描述的那些：Hoagland,Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals,第九版(Molecular Probes,Inc.,Eugene,2002)；Keller和Manak,DNA Probes,第2版(Stockton Press,New York,1993)；Eckstein,editor,Oligonucleotides andAnalogues:A Practical Approach(IRL Press,Oxford,1991)；以及Wetmur,CriticalReviews in Biochemistry and Molecular Biology,26:227-259(1991)。在一些实施方案中，适用于所提供的实施方案的示例性技术和方法包括例如US 4,757,141、US 5,151,507和US 5,091,519中描述的那些。在一些实施方案中，使用一种或多种荧光染料作为标记的靶序列的标记，例如，如以下中所述：US 5,188,934(4,7-二氯荧光素染料)；US 5,366,860(可光谱解析的罗丹明染料)；US 5,847,162(4,7-二氯罗丹明染料)；US 4,318,846(醚取代的荧光素染料)；US 5,800,996(能量转移染料)；US 5,066,580(黄嘌呤染料)；和US 5,688,648(能量转移染料)。也可以用量子点进行标记，如US 6,322,901、US 6,576,291、US 6,423,551、US 6,251,303、US 6,319,426、US 6,426,513、US 6,444,143、US 5,990,479、US6,207,392、US2002/0045045和US2003/0017264中所述。如本文所用，术语“荧光标记”包含信号传导部分，其通过一种或多种分子的荧光吸收和/或发射性质传送信息。示例性的荧光性质包括荧光强度、荧光寿命、发射谱特性和能量转移。
容易掺入到核苷酸和/或多核苷酸序列中的可商购获得的荧光核苷酸类似物的实例包括但不限于Cy3-dCTP、Cy3-dUTP、Cy5-dCTP、Cy5-dUTP(Amersham Biosciences,Piscataway,N.J.)、荧光素-！2-dUTP、四甲基罗丹明-6-dUTP、TEXAS REDTM-5-dUTP、CASCADEBLUETM-7-dUTP、BODIPY TMFL-14-dUTP、BODIPY TMR-14-dUTP、BODIPY TMTR-14-dUTP、RHODAMINE GREENTM-5-dUTP、OREGON GREENRTM 488-5-dUTP、TEXAS REDTM-l2-dUTP、BODIPYTM630/650-14-dUTP、BODIPYTM 650/665-14-dUTP、ALEXA FLUORTM 488-5-dUTP、ALEXA FLUORTM532-5-dUTP、ALEXA FLUORTM 568-5-dUTP、ALEXA FLUORTM 594-5-dUTP、ALEXA FLUORTM 546-14-dUTP、荧光素-12-UTP、四甲基罗丹明-6-UTP、TEXAS REDTM-5-UTP、mCherry、CASCADEBLUETM-7-UTP、BODIPYTMFL-14-UTP、BODIPY TMR-14-UTP、BODIPYTM TR-14-UTP、RHOD AMINEGREENTM-5-UTP、ALEXA FLUORTM 488-5-UTP和ALEXA FLUORTM 546-14-UTP(MolecularProbes,Inc.Eugene,Oreg.)。用于定制合成具有其他荧光团的核苷酸的方法可以包括Henegariu等人,(2000)Nature Biotechnol.18:345中描述的那些，其以引用方式并入本文。
可得到的用于合成后附着的其他荧光团包括但不限于ALEXA FLUORTM 350、ALEXAFLUORTM 532、ALEXA FLUORTM 546、ALEXA FLUORTM 568、ALEXA FLUORTM 594、ALEXA FLUORTM647、BODIPY 493/503、BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY 530/550、BODIPY TMR、BODIPY 558/568、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、Cascade Blue、Cascade Yellow、丹酰、丽丝胺罗丹明B、MarinaBlue、Oregon Green 488、Oregon Green 514、太平洋蓝、罗丹明6G、罗丹明绿、罗丹明红、四甲基罗丹明、Texas Red(可得自Molecular Probes,Inc.,Eugene,Oreg.)、Cy2、Cy3.5、Cy5.5和Cy7(Amersham Biosciences,Piscataway,N.J.)。还可以使用FRET串联荧光团，包括但不限于PerCP-Cy5.5、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、APC-Cy7、PE-Alexa染料(610、647、680)和APC-Alexa染料。
在一些情况下，可以使用金属银或金颗粒来增强来自荧光标记的核苷酸和/或多核苷酸序列的信号(Lakowicz等人,(2003)Bio Techniques 34:62)。
生物素或其衍生物也可以用作核苷酸和/或多核苷酸序列上的标记，并随后由可检测地标记的抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白衍生物(例如，藻红蛋白缀合的链霉抗生物素蛋白)或可检测地标记的抗生物素抗体结合。地高辛可以作为标记掺入并随后由可检测地标记的抗地高辛抗体(例如，荧光素化抗地高辛)结合。氨基烯丙基-dUTP残基可以掺入到多核苷酸序列中并随后与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)衍生的荧光染料偶联。一般来说，缀合物对的任何成员都可以掺入到检测多核苷酸中，条件是可检测地标记的缀合物配对物可以结合以允许检测。如本文所用，术语抗体是指任何类别的抗体分子或其任何子片段，如Fab。
针对多核苷酸序列的其他合适的标记可以包括荧光素(FAM)、地高辛、二硝基苯酚(DNP)、丹酰、生物素、溴脱氧尿苷(BrdU)、六聚组氨酸(6xHis)和磷-氨基酸(例如，P-tyr、P-ser、P-thr)。在一些实施方案中，使用以下半抗原/抗体对进行检测，其中每种抗体都用可检测标记衍生化：生物素/a-生物素、地高辛/a-地高辛、二硝基苯酚(DNP)/a-DNP、5-羧基荧光素(FAM)/a-FAM。
在一些实施方案中，核苷酸和/或多核苷酸序列可以被间接标记，尤其是用半抗原，半抗原然后由捕获剂结合，例如，如US 5,344,757、US 5,702,888、US 5,354,657、US 5,198,537和US 4,849,336及US 5,073,562中所公开。许多不同的半抗原-捕获剂对可供使用。示例性的半抗原包括但不限于生物素、脱生物素(des-biotin)和其他衍生物、二硝基苯酚、丹酰、荧光素、Cy5和地高辛。对于生物素，捕获剂可以是抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或抗体。抗体可以用作其他半抗原的捕获剂(许多染料-抗体对可商购获得，例如，Molecular Probes,Eugene,Oreg.)。
在一些方面，分析和/或序列确定可以在室温下进行，以在低背景噪声和减少错误的情况下最好地保存组织形态。在一些实施方案中，分析和/或序列确定包括随着测序的进行消除错误累积。
在一些实施方案中，分析和/或序列确定涉及洗涤以去除未结合的多核苷酸，其后显露荧光产物以便成像。
在一些方面，检测涉及使用检测方法如流式细胞术、测序、探针结合和电化学检测、pH改变、由与DNA标签结合的酶诱导的催化、量子缠结、拉曼光谱、太赫兹波技术和/或扫描电子显微术。在一些方面，流式细胞术为质量细胞术或荧光激活的流式细胞术。在一些方面，检测包括进行显微术、扫描质谱法或本文描述的其他成像技术。在这样的方面，检测包括测定信号，例如荧光信号。
在一些方面，使用许多不同类型的显微术中的任何一种来进行检测(包括成像)，例如共聚焦显微术、双光子显微术、光场显微术、完整组织扩张显微术和/或CLARITYTM-优化的光片显微术(COLM)。
在一些实施方案中，使用荧光显微术来进行检测探针的检测和成像。在一些方面，荧光显微镜为光学显微镜，其使用荧光和磷光代替或补充反射和吸收来研究有机或无机物质的性质。在荧光显微术中，用在样品中激发荧光的波长的光照射样品。然后通过显微镜物镜对荧光成像，荧光波长通常比照射波长长。该技术中可以使用两个滤光片；照射(或激发)滤光片，其确保照射接近单色且在正确的波长下，和第二发射(或屏障)滤光片，其确保没有激发光源到达检测器。或者，这些功能都可以由单个二向色滤光片实现。“荧光显微镜”包括使用荧光来产生图像的任何显微镜，无论其是像落射荧光显微镜这样的更简单的装置，还是像共聚焦显微镜这样的更复杂的设计，其都使用光学切片来获得荧光图像的更好分辨率。
在一些实施方案中，使用共聚焦显微术来进行检测探针的检测和成像。共聚焦显微镜使用点照射和检测器前方光学共轭平面中的针孔来消除离焦信号。由于只能检测到非常靠近焦平面的荧光产生的光，故图像的光学分辨率，特别是在样品深度方向上，比宽视场显微镜要好得多。然而，由于来自样品荧光的许多光在针孔处被阻挡，故分辨率的这种提高是以信号强度的降低为代价的——因此通常需要长的曝光时间。由于一次仅照射样品中的一个点，故2D或3D成像需要在试样中以规则光栅(例如，平行扫描线的矩形图案)扫描。焦平面的可实现厚度主要由所用光的波长除以物镜的数值孔径限定，但也由试样的光学性质限定。薄光学切片使得这些类型的显微镜在样品的3D成像和表面轮廓分析方面特别好。CLARITYTM-优化的光片显微术(COLM)提供了用于大型澄清样品的快速3D成像的替代显微术。COLM询问大型免疫染色组织，允许提高采集速度并产生更高质量的生成数据。
可以采用的其他类型的显微术包括明场显微术、斜照显微术、暗场显微术、相差显微术、微分干涉差(DIC)显微术、干涉反射显微术(也称为反射干涉差或RIC)、单平面照明显微术(SPIM)、超高分辨率显微术、激光显微术、电子显微术(EM)、透射电子显微术(TEM)、扫描电子显微术(SEM)、反射电子显微术(REM)、扫描透射电子显微术(STEM)和低电压电子显微术(LVEM)、扫描探针显微术(SPM)、原子力显微术(ATM)、弹道电子发射显微术(BEEM)、化学力显微术(CFM)、导电原子力显微术(C-AFM)、电化学扫描隧道显微镜(ECSTM)、静电力显微术(EFM)、流体力显微镜(FluidFM)、力调制显微术(FMM)、特征导向扫描探针显微术(FOSPM)、开尔文探针力显微术(KPFM)、磁力显微术(MFM)、磁共振力显微术(MRFM)、近场扫描光学显微术(NSOM)(或SNOM、扫描近场光学显微术、SNOM、压电响应力显微术(PFM)、PSTM、光子扫描隧道显微术(PSTM)、PTMS、光热显微光谱/显微术(PTMS)、SCM、扫描电容显微术(SCM)、SECM、扫描电化学显微术(SECM)、SGM、扫描门显微术(SGM)、SHPM、扫描霍尔探针显微术(SHPM)、SICM、扫描离子电导显微术(SICM)、SPSM自旋偏振扫描隧道显微术(SPSM)、SSRM、扫描扩散电阻显微术(SSRM)、SThM、扫描热显微术(SThM)、STM、扫描隧道显微术(STM)、STP、扫描隧道电位法(STP)、SVM、扫描电压显微术(SVM)、同步加速器x-射线扫描隧道显微术(SXSTM)和完整组织扩张显微术(exM)。
在一些实施方案中，测序可以原位进行。原位测序通常涉及以顺序的、模板依赖性方式掺入标记的核苷酸(例如，荧光标记的单核苷酸或二核苷酸)或使标记的引物(例如，标记的无规六聚体)与核酸模板杂交使得可以确定掺入的核苷酸或标记的引物延伸产物的身份(例如，核苷酸序列)，并因此确定相应的模板核酸的核苷酸序列。原位测序的方面见述于例如Mitra等人,(2003)Anal.Biochem.320,55-65和Lee等人,(2014)Science,343(6177),1360-1363中。另外，用于进行原位测序的方法和系统的实例见述于US2016/0024555、US2019/0194709中以及US10,138,509、US10,494,662和US.10,179,932中。用于原位测序的示例性技术包括但不限于STARmap(见述于例如Wang等人,(2018)Science,361(6499)5691中)、MERFISH(见述于例如Moffitt,(2016)Methods in Enzymology,572,1-49中)、基于杂交的原位测序(HybISS)(见述于例如Gyllborg等人,Nucleic Acids Res(2020)48(19):e112中)和FISSEQ(见述于例如US2019/0032121中)。
在一些实施方案中，测序可以通过边合成边测序(SBS)来进行。在一些实施方案中，测序引物与一个或更多个条形码处或附近的序列互补。在这样的实施方案中，边合成边测序可以包括逆转录和/或扩增以生成引物序列可从其结合的模板序列。示例性SBS方法包括例如但不限于US 2007/0166705、US2006/0188901、US 7,057,026、US2006/0240439、US2006/0281109、US 2011/005986、US2005/0100900、US 9,217,178、US2009/0118128、US2012/0270305、US 2013/0260372和US2013/0079232描述的那些。
在一些实施方案中，核酸的序列分析可以通过顺序杂交(例如，边杂交边测序和/或顺序原位荧光杂交)来进行。顺序荧光杂交可以涉及包含寡核苷酸和可检测标记的检测探针的顺序杂交。在一些实施方案中，本文公开的方法包括本文公开的可检测探针的顺序杂交，包括可检测地标记的探针(例如，荧光团缀合寡核苷酸)和/或本身未被可检测地标记但能够结合可检测地标记的探针(例如，经由核酸杂交)并被可检测地标记的探针检测的探针。包含可检测探针的顺序荧光杂交的示例性方法见述于US2019/0161796、US2020/0224244、US2022/0010358、US2021/0340618和WO 2021/138676中，所有这些文献均以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，测序可以使用单个分子边连接边测序来进行。这样的技术利用DNA连接酶来并入寡核苷酸并鉴别这样的寡核苷酸的并入。寡核苷酸通常具有与寡核苷酸与之杂交的序列中的特定核苷酸的身份相关的不同标记。边连接边测序中涉及的方面和特征见述于例如Shendure等人,Science(2005),309:1728-1732中，以及US 5,599,675；US5,750,341；US 6,969,488；US 6,172,218；和US 6,306,597中。
在一些实施方案中，探针(例如，挂锁探针或第一和/或第二探针)的条形码被可检测地标记的检测寡核苷酸如荧光标记的寡核苷酸靶向。在一些实施方案中，使用一个或更多个解码方案来解码信号，如荧光，用于序列确定。在一些实施方案中，可以使用任何合适的方法或技术来分析(例如，检测或测序)条形码(例如，一级和/或二级条形码序列)，包括本文描述的那些，如靶的RNA连续探测(RNA SPOT)、连续荧光原位杂交(seqFISH)、单分子荧光原位杂交(smFISH)、多重错误鲁棒荧光原位杂交(MERFISH)、基于杂交的原位测序(HybISS)、原位测序、靶向原位测序、荧光原位测序(FISSEQ)或空间分辨转录物扩增子读出映射(STARmap)。在一些实施方案中，本文提供的方法包括通过用多个标记的探针(例如，检测寡核苷酸)顺序杂交和检测来分析条形码。示例性解码方案见述于Eng等人,“Transcriptome-scale Super-Resolved Imaging in Tissues by RNA SeqFISH+,”Nature 568(7751):235-239(2019)；Chen等人,“Spatially resolved,highlymultiplexed RNA profiling in single cells,”Science；348(6233):aaa6090(2015)；Gyllborg等人,Nucleic Acids Res(2020)48(19):e112；US10,457,980B2；US2016/0369329A1；WO 2018/026873 A1；和US2017/0220733A1中，所有这些文献均全文以引用方式并入。在一些实施方案中，这些测定使得能够同时实现信号放大、组合解码和纠错方案。
在一些实施方案中，可以使用核酸杂交来进行测序。这些方法利用与条形码序列的至少一部分互补的标记的核酸解码器探针。可以用具有可区分标签的许多不同探针的池来进行多重解码。核酸杂交测序的非限制性实例见述于例如US 8,460,865中和Gunderson等人,Genome Research 14:870-877(2004)中。
在一些实施方案中，可以在测序期间使用DNA聚合酶活性的实时监测。例如，可以通过荧光共振能量转移(FRET)来检测核苷酸并入，如例如Levene等人,Science(2003),299,682-686、Lundquist等人,Opt.Lett.(2008),33,1026-1028和Korlach等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2008),105,1176-1181中所述。
在一些情况下，对捕获的一个或更多个图像进行分析，并且可以包括处理所述一个或更多个图像和/或量化观察到的信号。在一些实施方案中，可以比较和分析来自一个荧光通道中的靶特异性条形码检测和分开的荧光通道中的探针解析条形码检测的信号的图像。在一些实施方案中，可以将来自一个荧光通道中的靶特异性条形码检测和分开的荧光通道中的探针解析条形码检测的信号的图像对准以解析各个信号。例如，分析可以包括处理在样品的特定区域中检测到的一种或多种细胞类型、一种或多种类型的生物标志物、生物标志物的数量或水平、和/或细胞的数量或水平的信息。在一些实施方案中，分析包括检测序列，例如样品中存在的条形码。在一些实施方案中，分析包括小点(puncta)的定量(例如，如果检测到扩增产物)。在一些情况下，分析包括确定是否存在与来自特定面板的一种或多种生物标志物相关的特定细胞和/或信号。在一些实施方案中，可以将获得的信息与阳性和阴性对照相比较，或与特征的阈值相比较以确定样品是否表现出某种特征或表型。在一些情况下，信息可以包括来自细胞、区域的信号，和/或包括来自多个可检测标记的读数。在一些情况下，分析还包括显示来自分析或检测步骤的信息。在一些实施方案中，可以使用软件来使数据的处理、分析和/或显示自动化。
在一些实施方案中，本文描述了一种对样品中的多种靶核酸进行定位检测的方法，其中每种靶核酸由对所述靶核酸特异性的环状或可环化一级探针靶向，并且可环化一级探针可以在与靶核酸杂交时环化。多种环状或环化探针中的每一种可以包含对应于靶核酸的靶特异性条形码序列，并且所述多种环状或环化探针可以包含包含不同的探针解析条形码序列的探针的不同子集。所述多种环状或环化探针可以在样品中的多个位置处与靶核酸的不同分子结合，并且可以通过滚环扩增(RCA)原位扩增以产生滚环产物(RCP)。每个RCP可以包含靶特异性条形码序列和不同探针解析(例如，物种特异性)条形码序列之一的多个互补拷贝，其中靶特异性条形码序列和/或探针解析条形码序列可以在多个顺序解码循环中解码，每个解码循环使用杂交探针(例如，中间探针，如L形探针)，其与RCP中的条形码序列的互补拷贝杂交并允许产生可检测信号。在顺序解码循环中与靶特异性条形码序列相关联的信号一起产生信号代码序列，其可以用于鉴定靶特异性条形码序列及其对应的靶核酸序列。同样，在顺序解码循环中与探针解析(例如，物种特异性)条形码序列相关联的信号可以产生信号代码序列，其可以用于鉴定探针解析(例如，物种特异性)条形码序列。
在一些实施方案中，本文提供了一种分析样品的方法，其包括：a)在样品中产生扩增产物如RCA产物，所述扩增产物包含靶特异性条形码序列和多种不同的探针解析条形码序列之一的多个拷贝，其中靶特异性条形码序列与靶分析物相关联并被分配信号代码序列，并且其中样品为细胞或组织样品；b)使样品与第一中间探针和第一可检测探针接触以产生第一复合物，所述第一复合物包含与扩增产物杂交的第一中间探针和与第一中间探针杂交的第一可检测探针，其中第一中间探针包含(i)与靶特异性条形码序列互补的杂交区和(ii)第一突出部序列，并且其中第一可检测探针包含(i)与第一突出部序列互补的序列和(ii)第一光学可检测部分；c)对样品成像以检测来自第一光学可检测部分的第一信号，其中第一信号对应于信号代码序列中的第一信号代码；b)使样品与第二中间探针和第二可检测探针接触以产生第二复合物，所述第二复合物包含与扩增产物杂交的第二中间探针和与第二中间探针杂交的第二可检测探针，其中第二中间探针包含(i)与靶特异性条形码序列互补的杂交区和(ii)第二突出部序列，并且其中第二可检测探针包含(i)与第二突出部序列互补的序列和(ii)第二光学可检测部分；和e)对样品成像以检测来自第二光学可检测部分的第二信号，其中第二信号对应于信号代码序列中的第二信号代码，其中至少包含第一信号代码和第二信号代码的信号代码序列在样品中一定位置处测得，从而解码样品中该位置处的靶特异性条形码序列并鉴定靶分析物。在一些实施方案中，与靶分析物相关联的靶特异性条形码序列选自多个条形码序列，其中所述方法包括使样品与中间探针的第一池和可检测探针的通用池接触，其中中间探针的第一池包含第一中间探针并且可检测探针的通用池包含第一可检测探针和第二可检测探针，其中中间探针的第一池中的每种中间探针包含(i)与所述多个靶特异性条形码序列中之一互补的杂交区和(ii)与可检测探针的通用池的可检测探针互补的突出部序列；并且所述方法包括使样品与中间探针的第二池和可检测探针的通用池接触，其中中间探针的第二池包含第二中间探针，并且其中中间探针的第二池中的每种中间探针包含(i)与所述多个靶特异性条形码序列中之一互补的杂交区和(ii)与可检测探针的通用池的可检测探针互补的突出部序列。在一些实施方案中，所述方法包括鉴定存在于样品中的位置处的多种不同的靶分析物，其中每种不同的靶分析物被分配不同的信号代码序列并由可环化探针或探针组靶向，所述可环化探针或探针组包含所述多个靶特异性条形码序列的不同靶特异性条形码序列的互补序列。在一些实施方案中，中间探针的每个池中的不同中间探针的数量大于可检测探针的通用池中的不同可检测探针的数量。在一些实施方案中，可检测探针的通用池中的不同可检测探针的数量为四。在一些实施方案中，中间探针的每个池中的不同中间探针的数量为约10、约20、约50、约100、约200、约500、约1,000、约2,000、约5,000或更多。
在一些实施方案中，本文公开的每个探针解析条形码序列或物种特异性条形码序列可以如本文针对靶特异性条形码序列的检测所述使用中间探针(例如，L形探针)和可检测探针(例如，荧光标记探针)的顺序杂交来检测。图1B示出可以使用包含与荧光标记探针杂交的突出部的中间探针的顺序杂交来检测探针解析条形码序列。中间探针的突出部可以介导和/或引发信号增强或放大，如杂交链反应(HCR)、线型寡核苷酸杂交链反应(LO-HCR)或引物交换反应(PER)或任何其他本文描述的信号增强或放大方法。
与探针解析条形码序列相关联的信号可以用于促进在顺序循环中检测到的信号的配准以便解码。在一些实施方案中，与相同的基因相关联的扩增产物的不同子集可以在不同的荧光通道中检测到，例如通过在第一荧光通道中检测第一探针的探针解析条形码序列并在另一荧光通道中检测第二探针的不同探针解析条形码序列。探针解析条形码序列的不同子集可以分开检测(例如，在不同的“颜色”通道中)，从而减轻由于与相同的靶特异性条形码序列相关联的信号的重叠而导致的信号拥挤。
在一些实施方案中，顺序解码方案涉及在多个循环中检测来自给定靶的重复信号，并且靶可以在不同的循环中处于样品中的相同位置。在一些实施方案中，本文公开的方法包括靶核酸序列的定位检测。在一些实施方案中，靶核酸序列存在于样品中的固定或限定位置处，并在该位置处检测。靶核酸序列可以借助于原位存在于样品(例如，细胞或组织样品)中其天然位置处或者附着或以其他方式定位于原位存在于样品中其天然位置处的靶分析物来定位。靶核酸序列可以例如通过与样品中或包埋样品的基质中的其他分子交联而固定在样品中。
在一些实施方案中，进行图像配准。在一些方面，图像配准包括将从各种循环获得的信号和/或图像对准到共同的坐标系上。当跨多个循环从样品获得图像或检测信号时，样品或成像装置可能移位，从而导致图像从一个循环到另一个循环的偏移。在一些方面，图像配准将补偿这些移位，从而允许用户在不同的图像和/或空间上对准的叠置图像之间鉴定样品内的相同相对位置。在一些实施方案中，与探针解析条形码序列相关联的信号被用于图像配准。在一些实施方案中，与每个单独的探针解析条形码序列相关联的信号可以在样品内提供可用于对准多个图像的多个物理地标。在一些实施方案中，图像配准允许将来自多个循环的解码信号分配给同一位置，从而允许为该位置构建信号代码序列。在一些实施方案中，使用计算方法来进行图像配准。在一些实施方案中，图像配准由用户手动进行、引导或调整。
图2A示意了最初用针对对应于靶分析物的靶特异性条形码序列的可检测探针检测信号，其中一些信号是重叠的并导致光学拥挤。一些信号部分重叠，而其他信号(例如，由箭头指示的信号)可以完全重叠。通过检测与探针解析条形码序列相关联的信号，与相同的靶分析物相关联的信号可以在不同颜色的通道(例如，通道1-4，诸如图2B中示出的Cy5、AF750、Cy3和AF488)中检测到。在一些情况下，在不同颜色的通道中的每一个中检测到的信号不重叠并且可以在空间上解析。使用图像配准，与探针解析条形码序列相关联的信号可以与与靶特异性条形码序列相关联的信号相关联，从而解析重叠的信号(例如，部分或完全重叠的信号)。
VI.试剂盒
本文还提供了试剂盒，其例如包含一种或多种多核苷酸，例如III和IV部分中描述的包含靶特异性和/或探针解析条形码序列的任何多核苷酸，和用于进行本文所提供的方法的试剂，例如包括如本文所述的杂交、连接、扩增、检测、测序和/或样品制备的一个或多个步骤所需的试剂。在一些实施方案中，试剂盒还包含靶核酸，例如III和IV部分中描述的任何靶核酸。在一些实施方案中，任何或所有多核苷酸为DNA分子。在一些实施方案中，靶核酸为信使RNA分子。在一些实施方案中，试剂盒还包含连接酶，例如用于从挂锁探针形成环状探针。在一些实施方案中，连接酶具有DNA夹板化DNA连接酶活性。在一些实施方案中，连接酶具有RNA夹板化连接酶活性。在一些实施方案中，试剂盒还包含聚合酶，例如用于例如使用V部分中描述的任何方法进行挂锁探针的扩增。在一些实施方案中，试剂盒还包含用于扩增的引物。
在一些实施方案中，本文公开了一种用于分析生物样品的试剂盒，其包含多种探针，每种探针包含靶特异性条形码序列，例如对应于靶如核酸分析物或蛋白质分析物的条形码序列。在一些实施方案中，所述多种探针包括第一探针和第二探针，所述第一探针包含第一探针解析条形码序列，所述第二探针包含不同于第一探针解析条形码序列的第二探针解析条形码序列。在一些实施方案中，试剂盒包含第一多种探针和第二多种探针，所述第一多种探针包含靶向第一物种的分析物(例如，核酸序列)的第一探针解析条形码序列，所述第二多种探针包含靶向第二物种的分析物(例如，核酸序列)的第二探针解析条形码序列。在一些实施方案中，所述多种探针靶向生物样品中的核酸分子，如核酸分析物(例如，基因组DNA、mtDNA、细胞RNA如mRNA、miRNA等、cDNA或细胞核酸的产物)或标记剂的报告寡核苷酸(例如，与感兴趣的蛋白质的抗体缀合的核酸标签)。在一些实施方案中，靶特异性条形码序列对应于核酸分子。在一些实施方案中，试剂盒还包含直接或间接与靶特异性条形码序列或其互补序列结合的可检测探针。在一些实施方案中，试剂盒还包含直接或间接与第一探针解析条形码序列或其互补序列结合的可检测探针。在一些实施方案中，试剂盒还包含直接或间接与第二探针解析条形码序列或其互补序列结合的可检测探针。
在一些实施方案中，本文公开了一种用于分析生物样品的试剂盒，其包含多种挂锁探针，所述多种挂锁探针包括第一挂锁探针和第二挂锁探针，其中第一挂锁探针包含靶特异性条形码序列和第一探针解析条形码序列，第二挂锁探针包含所述靶特异性条形码序列和第二探针解析条形码序列，并且其中所述多种挂锁探针与生物样品中的不同核酸分子杂交，并且靶特异性条形码序列对应于特定的核酸分子。在一些实施方案中，试剂盒还包含与靶特异性条形码序列的互补序列杂交的第一中间探针和与第一中间探针杂交的第一荧光标记探针。在一些实施方案中，试剂盒还包含与第一探针解析条形码序列的互补序列杂交的第二中间探针和与第二中间探针杂交的第二荧光标记探针。在一些实施方案中，试剂盒还包含与第二探针解析条形码序列的互补序列杂交的第三中间探针和与第三中间探针杂交的第三荧光标记探针。在一些实施方案中，第二和第三荧光标记探针可在不同的荧光通道中检测到。在一些实施方案中，第一荧光标记探针可在与第二荧光标记探针或第三荧光标记探针相同或不同的荧光通道中检测到。
试剂盒的各种组分可以存在于单独的容器中，或者某些相容的组分可以预先组合到单个容器中。在一些实施方案中，试剂盒还含有使用试剂盒组分实施所提供的方法的说明书。
在一些实施方案中，试剂盒可以含有用于进行所提供的方法的一个或多个步骤所需的试剂和/或消耗品。在一些实施方案中，试剂盒含有用于固定、包埋和/或透化生物样品的试剂。在一些实施方案中，试剂盒含有试剂，诸如用于连接和/或扩增的酶和缓冲液，诸如连接酶和/或聚合酶。在一些方面，试剂盒还可以包含本文所述的任何试剂，例如洗涤缓冲液和连接缓冲液。在一些实施方案中，试剂盒含有用于检测和/或测序的试剂，如条形码检测探针或可检测标记。在一些实施方案中，试剂盒任选地含有其他组分，例如核酸引物、酶和试剂、缓冲液、核苷酸、经修饰的核苷酸、用于另外的测定的试剂。
VII.应用
在一些方面，所提供的实施方案可以应用于分析核酸序列的原位方法中，如原位转录组分析或原位测序，例如来自其中空间信息已被保留的完整组织或样品的核酸序列。在一些方面，实施方案可以应用于用于多重核酸分析的成像或检测方法中。在一些方面，所提供的实施方案可以用于鉴定或检测靶核酸中感兴趣的区域。
在一些实施方案中，感兴趣的区域包含单核苷酸多态性(SNP)。在一些实施方案中，感兴趣的区域为单核苷酸变体(SNV)。在一些实施方案中，感兴趣的区域包含单核苷酸置换。在一些实施方案中，感兴趣的区域包含点突变。在一些实施方案中，感兴趣的区域包含单核苷酸插入。
在一些方面，实施方案可以应用于研究和/或诊断应用中，例如，用于表征或评估来自受试者的特定细胞或组织。所提供的方法的应用可以包括生物医学研究和临床诊断。例如，在生物医学研究中，应用包括但不限于用于生物研究或药物筛选的空间解析基因表达分析。在临床诊断中，应用包括但不限于检测患者样品的基因标志物如疾病、免疫反应、细菌或病毒DNA/RNA。
在一些方面，实施方案可以应用于以亚细胞分辨率可视化整个组织中遗传编码标志物的分布，例如染色体异常(倒位、重复、易位等)、遗传杂合性的丧失、指示疾病倾向或良好健康的等位基因的存在、对治疗有反应的可能性，或个性化医疗或世系中。
VIII.术语
在整个本公开中使用特定术语来解释所描述的装置、系统、方法和组合物的各个方面。
已经描述了本公开的一些示意性实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，前述内容仅是示意性的而非限制性的，已仅以举例的方式呈现。许多修改和其他示意性实施方案在本领域普通技术人员的范围内并且被视为落在本公开的范围内。特别地，尽管本文中呈现的许多实例涉及方法动作或系统要素的特定组合，但应理解，这些动作和这些要素可以以其他方式组合以实现相同的目标。
如本文所用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个(a/an)”和“该”包括复数指代物。例如，“一个”或“一种”意指“至少一个(种)”或“一个(种)或多个(种)”。
如本文所用，术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的通常误差范围。本文对“约”值或参数的引用包括(并描述)涉及该值或参数本身的实施方案。
在整个本公开中，所要求保护的主题的各个方面以范围形式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对要求保护的主题的范围的不灵活限制。因此，范围的描述应被认为已经具体公开了在该范围内的所有可能的子范围以及单独的数值。例如，在提供值的范围的情况下，应当理解，在该范围的上限和下限之间的每个居间值以及该陈述的范围中的任何其他陈述的或居间的值均涵盖在要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围中，并且也涵盖在要求保护的主题内，但受制于陈述的范围中的任何具体排除的极限。在陈述的范围包括这些极限中的一个或两个极限的情况下，排除那些包括的极限中的任一个或两个极限的范围也包括在要求保护的主题中。不管范围的广度如何，这都适用。
在权利要求中使用诸如“第一”、“第二”、“第三”等序数词来修饰权利要求要素本身并不意味着一个权利要求要素优于另一个权利要求要素的任何优先级、先后次序或顺序，也不意味着执行方法的多个动作的时间顺序，而是仅用作将具有某一名称的一个权利要求要素与具有用于区分权利要求要素的相同名称(但使用的序数词不同)的另一个要素区分开的标签。类似地，在权利要求中使用a)、b)等或i)、ii)等本身并不意味着任何优先级、先后次序或步骤顺序。类似地，在说明书中使用这些术语本身并不意味着任何要求的优先级、先后次序或顺序。
(i)条形码
“条形码”为传达或能够传达信息(例如，关于样品、珠和/或捕获探针中的分析物的信息)的标记或标识符。条形码可以是分析物的一部分，也可以独立于分析物。条形码可以附接到分析物。特定条形码相对于其他条形码可以是独特的。
条形码可以具有多种不同的形式。例如，条形码可以包括多核苷酸条形码、随机核酸和/或氨基酸序列以及合成核酸和/或氨基酸序列。可以将条形码以可逆或不可逆方式连接至分析物或另一个部分或结构。可以在样品测序之前或期间将条形码添加到例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)样品的片段中。条形码可以允许鉴定和/或定量单独测序读段(例如，条形码可以是或可以包括独特的分子标识符或“UMI”)。
条形码可以例如以单细胞分辨率在空间上解析存在于生物样品中的分子组分(例如，条形码可以是或可以包括“空间条形码”)。在一些实施方案中，条形码包括UMI和空间条形码两者。在一些实施方案中，条形码包括一起充当单个条形码的两个或多个子条形码。例如，多核苷酸条形码可以包含被一个或多个非条形码序列分开的两个或更多个多核苷酸序列(例如，子条形码)。
(ii)核酸和核苷酸
术语“核酸”和“核苷酸”旨在符合其在本领域中的用途并且包括天然存在的物质或其功能类似物。核酸的特别有用的功能类似物能够以序列特异性方式与核酸杂交(例如，能够与两种核酸杂交，使得可以在两种杂交的核酸之间发生连接)或能够用作特定核苷酸序列的复制模板。天然存在的核酸一般具有含磷酸二酯键的骨架。类似物结构可以具有替代的骨架连接。天然存在的核酸一般具有脱氧核糖(例如，存在于脱氧核糖核酸(DNA)中)或核糖(例如，存在于核糖核酸(RNA)中)。
核酸可以含有具有糖部分的多种类似物中的任一种的核苷酸。核酸可以包含天然或非天然核苷酸。就这一点而言，天然脱氧核糖核酸可以具有选自由腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)组成的组的一个或多个碱基，并且核糖核酸可以具有选自由尿嘧啶(U)、腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)组成的组的一个或多个碱基。
(iii)探针和靶
“探针”或“靶”，当用于指核酸或核酸序列时，在方法或组合物的上下文中旨在作为核酸或序列的语义标识符，并且不将核酸或序列的结构或功能限制在明确指出的范围之外。
(iv)寡核苷酸和多核苷酸
术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用，是指长度为约2个至约500个核苷酸的单链核苷酸多聚体。寡核苷酸可以是合成的、酶促(例如，通过聚合)或使用“分割池(split-pool)”方法制备的。寡核苷酸可以包括核糖核苷酸单体(例如，可以是寡核糖核苷酸)和/或脱氧核糖核苷酸单体(例如，寡脱氧核糖核苷酸)。在一些实例中，寡核苷酸可以包括寡核苷酸中脱氧核糖核苷酸单体和核糖核苷酸单体的组合(例如，脱氧核糖核苷酸单体和核糖核苷酸单体的随机或有序组合)。例如，寡核苷酸可以为4至10、10至20、21至30、31至40、41至50、51至60、61至70、71至80、80至100、100至150、150至200、200至250、250至300、300至350、350至400、或400-500个核苷酸的长度。寡核苷酸可以包括一个或多个与多聚体结构(例如，共价或非共价)连接的功能部分。例如，寡核苷酸可以包括一个或更多个可检测标记(例如，放射性同位素或荧光团)。
(v)杂交(Hybridizing、Hybridize)、退火(Annealing、Anneal)
术语“杂交(hybridizing、hybridize)”、“退火(annealing、anneal)”在本公开中可互换使用，并且是指两个不同分子内基本上互补或互补的核酸序列的配对。配对可以通过任何方法实现，其中核酸序列通过碱基配对与基本上或完全互补的序列结合以形成杂交复合物。就杂交的目的而言，如果它们的各个碱基中的至少60％(例如，至少70％、至少80％或至少90％)彼此互补，则两个核酸序列是“基本上互补的”。
(vi)引物
“引物”为具有3’末端的单链核酸序列，所述3’末端可以用作核酸延伸反应中的核酸聚合酶的底物。RNA引物由RNA核苷酸形成并且用于RNA合成，而DNA引物由DNA核苷酸形成并且用于DNA合成。引物也可以包含RNA核苷酸和DNA核苷酸(例如，以随机或设计的模式)两者。引物还可以包含本文所述的可以具有另外的功能的其他天然或合成核苷酸。在一些实例中，DNA引物可以用于引发RNA合成，反之亦然(例如，RNA引物可以用于引发DNA合成)。引物的长度可以变化。例如，引物可以是约6个碱基至约120个碱基。例如，引物可以包含多达约25个碱基。在一些情况下，引物可以指引物结合序列。
(vii)引物延伸
两个核酸序列可以通过它们各自的末端互补核酸序列(例如，3'末端)的重叠而连接(例如，杂交)。这样的连接之后可以是用另一个核酸序列作为延伸模板进行一个或两个末端的核酸延伸(例如，酶促延伸)。酶促延伸可以通过包括但不限于聚合酶和/或逆转录酶的酶来进行。
(viii)核酸延伸
“核酸延伸”通常涉及以模板依赖性方式向分子(如但不限于核酸序列)中并入一种或多种核酸(例如，A、G、C、T、U、核苷酸类似物或其衍生物)，使得连续的核酸被酶(如聚合酶或逆转录酶)并入，从而生成新合成的核酸分子。例如，可以通过使用互补核酸序列作为核酸合成的模板将与互补核酸序列杂交的引物用于合成新的核酸分子。类似地，可以使用与聚(dT)序列(例如，捕获结构域)杂交的mRNA转录物的3’多腺苷酸化尾作为相应的cDNA分子的单链合成的模板。
(ix)PCR扩增
“PCR扩增”是指使用聚合酶链反应(PCR)来生成遗传物质的拷贝，包括DNA和RNA序列。用于实施PCR的合适试剂和条件描述于例如美国专利4,683,202、4,683,195、4,800,159、4,965,188和5,512,462中，所述专利的全部内容以引用方式并入本文。在典型的PCR扩增中，反应混合物包括待扩增的遗传物质、酶、一种或多种用于引物延伸反应的引物和用于反应的试剂。寡核苷酸引物具有足够的长度以在退火条件下提供与互补遗传物质的杂交。引物的长度通常取决于扩增结构域的长度，但通常将为至少4个碱基、至少5个碱基、至少6个碱基、至少8个碱基、至少9个碱基、至少10个碱基对(bp)、至少11bp、至少12bp、至少13bp、至少14bp、至少15bp、至少16bp、至少17bp、至少18bp、至少19bp、至少20bp、至少25bp、至少30bp、至少35bp，并且可以长达40bp或更长，其中引物的长度通常将在18至50bp的范围内。遗传物质可以与单个引物或一组两个引物(正向引物和反向引物)接触，这取决于是否需要引物延伸、遗传物质的线性或指数扩增。
在一些实施方案中，PCR扩增过程使用DNA聚合酶。DNA聚合酶活性可以由一种或多种不同的DNA聚合酶提供。在某些实施方案中，DNA聚合酶来自细菌，例如，DNA聚合酶是细菌DNA聚合酶。例如，DNA聚合酶可以来自埃希氏菌属、芽孢杆菌属、嗜热菌属或火球菌属的细菌。
可以使用的DNA聚合酶的合适实例包括但不限于：大肠杆菌DNA聚合酶I、Bsu DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、VENTTM DNA聚合酶、DEEPVENTTM DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、/>Hot Start Taq DNA聚合酶、Crimson/>TaqDNA聚合酶、Crimson Taq DNA聚合酶、/>DNA聚合酶、/>DNA聚合酶、Hemo/>DNA聚合酶、/>DNA聚合酶、/>DNA聚合酶、/>High-Fidelity DNA聚合酶、Platinum Pfx DNA聚合酶、AccuPrime Pfx DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、Klenow片段、Pwo DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶和T7 DNA聚合酶。
术语“DNA聚合酶”不仅包括天然存在的酶，还包括其所有经修饰的衍生物，还包括天然存在的DNA聚合酶的衍生物。例如，在一些实施方案中，DNA聚合酶可能已经被修饰以去除5'-3'核酸外切酶活性。可以使用的DNA聚合酶的序列修饰衍生物或突变体包括但不限于保留了野生型序列的至少一些功能(例如DNA聚合酶活性)的突变体。突变可以影响在不同的反应条件下(例如温度、模板浓度、引物浓度等)酶的活性分布，例如提高或降低聚合速率。突变或序列修饰也可能影响核酸外切酶活性和/或酶的热稳定性。
在一些实施方案中，PCR扩增可以包括反应，诸如但不限于链置换扩增反应、滚环扩增反应、连接酶链反应、转录介导的扩增反应、等温扩增反应和/或环介导的扩增反应。
在一些实施方案中，PCR扩增使用与靶DNA片段的3'标签互补的单一引物。在一些实施方案中，PCR扩增使用第一引物和第二引物，其中所述第一引物的至少3'末端部分与靶核酸片段的3'标签的至少一部分互补，并且其中所述第二引物的至少3'末端部分展示靶核酸片段的5'标签的至少一部分的序列。在一些实施方案中，第一引物的5'末端部分与靶核酸片段的3'标签不互补，并且第二引物的5'末端部分不展示靶核酸片段的5'标签的至少一部分的序列。在一些实施方案中，第一引物包含第一通用序列和/或第二引物包含第二通用序列。
在一些实施方案中(例如，当PCR扩增扩增捕获的DNA时)，可以使用DNA连接酶将PCR扩增产物与另外的序列连接。DNA连接酶活性可以由一种或多种不同的DNA连接酶提供。在一些实施方案中，DNA连接酶来自细菌，例如，DNA连接酶是细菌DNA连接酶。在一些实施方案中，DNA连接酶来自病毒(例如，噬菌体)。例如，DNA连接酶可以是T4 DNA连接酶。适合于连接步骤的其他酶包括但不限于Tth DNA连接酶、Taq DNA连接酶、嗜热球菌(菌株9oN)DNA连接酶(9oNTM DNA连接酶，可得自New England Biolabs,Ipswich,MA)和AmpligaseTM(可得自Epicentre Biotechnologies,Madison,WI)。也可以使用它们的衍生物(例如序列修饰的衍生物)和/或突变体。
在一些实施方案中，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)来扩增遗传物质。所需逆转录酶活性可以由一种或多种不同的逆转录酶提供，其合适的实例包括但不限于：M-MLV、MuLV、AMV、HIV、ArrayScriptTM、MultiScribeTM、ThermoScriptTM及I、II、III和IV酶。“逆转录酶”不仅包括天然存在的酶，还包括其所有此类修饰的衍生物，还包括天然存在的逆转录酶的衍生物。
此外，逆转录可以使用M-MLV、MuLV、AMV和HIV逆转录酶的序列修饰的衍生物或突变体(包括保留野生型序列的至少一些功能活性(例如逆转录酶活性)的突变体)来进行。逆转录酶可以作为组合物的一部分提供，所述组合物包括其他组分，例如增强或改善逆转录酶活性的稳定组分，诸如RNA酶抑制剂、DNA依赖性DNA合成抑制剂，例如放线菌素D。逆转录酶的许多序列修饰的衍生物或突变体(例如M-MLV)、以及包括未经修饰和经修饰的酶的组合物是可商购获得的，例如ArrayScriptTM、MultiScribeTM、ThermoScriptTM、以及I、II、III和IV酶。
某些逆转录酶(例如禽成髓细胞白血病病毒(AMV)逆转录酶和莫洛尼鼠白血病病毒(M-MuLV、MMLV)逆转录酶)可以使用RNA(cDNA合成)和单链DNA(ssDNA)两者作为模板合成互补DNA链。因此，在一些实施方案中，逆转录反应可以使用能够使用RNA和ssDNA两者作为延伸反应模板的酶(逆转录酶)，例如AMV或MMLV逆转录酶。
在一些实施方案中，通过实时PCR(也称为定量PCR或qPCR)进行RNA和/或DNA的定量，诸如但不限于“TAQMANTM”或或在毛细管(“/>毛细管”)上。在一些实施方案中，通过光学吸光度和用实时PCR来确定遗传物质的定量。在一些实施方案中，通过数字PCR来确定遗传物质的定量。在一些实施方案中，可以将分析的基因与对应于表达(mRNA)和数量(DNA)的参考核酸提取物(DNA和RNA)进行比较，以便比较靶核酸的表达水平。
(x)抗体
“抗体”为识别并结合互补靶抗原的多肽分子。抗体通常具有类似于Y形状的分子结构形状。天然存在的抗体，称为免疫球蛋白，属于免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE中之一。抗体也可以以合成方式产生。例如，为单克隆抗体的重组抗体可以使用合成基因来合成，做法是从源细胞回收抗体基因、扩增到适当的载体中并将该载体引入到宿主中以使得宿主表达重组抗体。一般而言，重组抗体可以使用合适的寡核苷酸引物和/或杂交探针从任何物种的产生抗体的动物克隆。可以使用重组技术来生成抗体和抗体片段，包括非内源性物种。
合成抗体可以来源于非免疫球蛋白来源。例如，抗体可以从核酸(例如，适体)和从非免疫球蛋白蛋白支架(如肽适体)产生，高变环被插入其中以形成抗原结合位点。基于核酸或肽结构的合成抗体可以比免疫球蛋白衍生的抗体小，从而导致更大的组织穿透。
抗体还可以包括affimer蛋白，其是分子量通常为约12-14kDa的亲和试剂。Affimer蛋白通常以高亲和力和高特异性两者与靶(例如，靶蛋白)结合。此类靶的实例包括但不限于泛素链、免疫球蛋白和C反应蛋白。在一些实施方案中，affimer蛋白衍生自半胱氨酸蛋白酶抑制剂，并包括肽环和提供结合位点的可变N-末端序列。
抗体还可以指“表位结合片段”或“抗体片段”，如本文所用，其通常是指能够结合与完整抗体相同的表位的完整抗体的一部分，虽然其程度不一定相同。尽管多种类型的表位结合片段是可能的，但是表位结合片段通常包含至少一对结合在一起(例如，通过二硫键)以保留抗原结合位点的重链可变区和轻链可变区(分别为VH和VL)，并且不包含Fc区的全部或一部分。抗体的表位结合片段可以通过任何合适的技术(例如，重组DNA技术，或者完整抗体的酶促或化学切割)从给定抗体获得，并且通常能够以与筛选完整抗体相同的方式来筛选特异性。在一些实施方案中，表位结合片段包括F(ab’)2片段、Fab’片段、Fab片段、Fd片段或Fv片段。在一些实施方案中，术语“抗体”包括抗体衍生的多肽，诸如单链可变片段(scFv)、双体或其他多聚体scFv、重链抗体、单结构域抗体，或者包含抗体的足够部分(例如，一个或更多个互补决定区(CDR))以赋予多肽特异性抗原结合能力的其他多肽。
(xi)标记、可检测标记和光学标记
术语“可检测标记”、“光学标记”和“标记”在本文中可互换使用，是指与待检测的分子相关联(例如，缀合至待检测的分子)的可直接或可间接检测部分，待检测的分子有例如用于原位测定的探针、捕获探针或分析物。可检测标记可以是本身可直接检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或者在酶促标记的情况下，可以是可间接检测的，例如，通过催化底物化合物或组合物的化学改变，所述底物化合物或组合物是可直接检测的。可检测标记可以适用于小规模检测和/或适用于高通量筛选。因此，合适的可检测标记包括但不限于放射性同位素、荧光团、化学发光化合物、生物发光化合物和染料。
可检测标记可以被定性地检测(例如，光学地或光谱地)，或者可以被定量。定性检测通常包括其中确认可检测标记的存在或出现的检测方法，而可量化检测通常包括具有可量化(例如，数值可报告)值如强度、持续时间、极化和/或其他性质的检测方法。在一些实施方案中，可检测标记与特征或和特征相关联的捕获探针结合。例如，可检测地标记的特征可以包括附接到珠的荧光、比色或化学发光标记(参见例如Rajeswari等人,J.MicrobiolMethods 139:22-28,2017和Forcucci等人,J.Biomed Opt.10:105010,2015，这些文献中的每一者的全部内容以引用方式并入本文)。
在一些实施方案中，可以向待检测的特征、捕获探针或组合物附接多个可检测标记。例如，可检测标记可以在核酸聚合或扩增期间并入(例如，-标记的核苷酸，如/>-dCTP)。可以使用任何合适的可检测标记。在一些实施方案中，可检测标记为荧光团。例如，荧光团可以来自包括以下的组：7-AAD(7-氨基放线菌素D)、吖啶橙(+DNA)、吖啶橙(+RNA)、Alexa/>350、Alexa/>430、Alexa/>488、Alexa/>532、Alexa/>546、Alexa/>555、Alexa/>568、Alexa/>594、Alexa/>633、Alexa/>647、Alexa/>660、Alexa/>680、Alexa/>700、Alexa/>750、别藻蓝蛋白(APC)、AMCA/AMCA-X、7-氨基放线菌素D(7-AAD)、7-氨基-4-甲基香豆素、6-氨基喹啉、苯胺蓝、ANS、APC-Cy7、ATTO-TAGTM CBQCA、ATTO-TAGTM FQ、金胺O-福尔根、BCECF(高pH)、BFP(蓝色荧光蛋白)、BFP/GFP FRET、BOBOTM-1/BO-PROTM-1、BOBOTM-3/BO-PROTM-3、/>FL、/>TMR、/>TR-X、/>530/550、/>558/568、/>564/570、/>581/591、/>630/650-X、/>650-665-X、BTC、钙黄绿素、钙黄绿素蓝、CalciumCrimsonTM、Calcium Green-1TM、Calcium OrangeTM、/>白、5-羧基荧光素(5-FAM)、5-羧基萘基荧光素、6-羧基罗丹明6G、5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)、羧基-X-罗丹明(5-ROX)、Cascade/>Cascade YellowTM、CCF2(GeneBLAzerTM)、CFP(青色荧光蛋白)、CFP/YFP FRET、色霉素A3、Cl-NERF(低pH)、CPM、6-CR 6G、CTC甲/> Cychrome(PE-Cy5)、丹酰胺、丹酰尸胺、丹酰氯、DAPI、Dapoxyl、DCFH、DHR、DiA(4-Di-16-ASP)、DiD(DilC18(5))、DIDS、Dil(DilC18(3))、DiO(DiOC18(3))、DiR(DilC18(7))、Di-4 ANEPPS、Di-8 ANEPPS、DM-NERF(4.5-6.5pH)、DsRed(红色荧光蛋白)、EBFP、ECFP、EGFP、/>-97醇、曙红、赤藓红、溴化乙锭、乙锭均二聚体-1(EthD-1)、氯化铕(III)、5-FAM(5-羧基荧光素)、坚牢蓝、荧光素-dT亚磷酰胺、FITC、Fluo-3、Fluo-4、/>Fluoro-GoldTM(高pH)、Fluoro-GoldTM(低pH)、Fluoro-Jade、/>1-43、Fura-2(高钙)、Fura-2/BCECF、Fura RedTM(高钙)、Fura RedTM/Fluo-3、GeneBLAzerTM(CCF2)、GFP Red Shifted(rsGFP)、GFP野生型、GFP/BFP FRET、GFP/DsRed FRET、Hoechst33342&33258、7-羟基-4-甲基香豆素(pH 9)、1,5IAEDANS、Indo-1(高钙)、Indo-1(低钙)、吲哚二羰花青、吲哚三羰花青、JC-1、6-JOE、JOJOTM-1/JO-PROTM-1、LDS 751(+DNA)、LDS 751(+RNA)、LOLOTM-1/LO-PROTM-1、荧光黄、LysoSensorTM蓝(pH5)、LysoSensorTM绿(pH 5)、LysoSensorTM黄/蓝(pH 4.2)、/>绿、/>红、/>黄、Mag-Fura-2、Mag-Indo-1、Magnesium GreenTM、Marina/>4-甲基伞形酮、光辉霉素、/>绿、橙、/>红、NBD(胺)、尼罗红、Oregon/>488、Oregon/>500、Oregon/>514、太平洋蓝、PBF1、PE(R-藻红蛋白)、PE-Cy5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白)、PerCP-Cy5.5(TruRed)、PharRed(APC-Cy7)、C-藻青蛋白、R-藻青蛋白、R-藻红蛋白(PE)、PI(碘化丙啶)、PKH26、PKH67、POPOTM-1/PO-PROTM-1、POPOTM-3/PO-PROTM-3、碘化丙啶(PI)、PyMPO、芘、派若宁Y、Quantam Red(PE-Cy5)、喹吖因氮芥、R670(PE-Cy5)、Red 613(PE-Texas Red)、红色荧光蛋白(DsRed)、试卤灵、RH 414、Rhod-2、罗丹明B、Rhodamine GreenTM、Rhodamine RedTM、罗丹明鬼笔环肽、罗丹明110、罗丹明123、5-ROX(羧基-X-罗丹明)、S65A、S65C、S65L、S65T、SBFI、SITS、/>-1(高pH)、/>-2、/>-1(高pH)、/>-1(低pH)、Sodium GreenTM、/>#1、#2、/> 11、/>13、/>17、/>45、/>蓝、/>绿、/>橙、5-TAMRA(5-羧基四甲基罗丹明)、四甲基罗丹明(TRITC)、Texas/>/Texas/>-X、Texas/>-X(NHS酯)、硫杂二羰花青、噻唑橙、/>-1//>-1、/>-3//>-3、/>-5、Tri-color(PE-Cy5)、TRITC(四甲基罗丹明)、TruRed(PerCP-Cy5.5)、WW 781、X-罗丹明(XRITC)、Y66F、Y66H、Y66W、YFP(黄色荧光蛋白)、/>-1//>-1、/>-3//>-3、6-FAM(荧光素)、6-FAM(NHS酯)、6-FAM(叠氮化物)、HEX、TAMRA(NHS酯)、Yakima Yellow、MAX、TET、TEX615、ATTO 488、ATTO532、ATTO 550、ATTO 565、ATTO Rho101、ATTO 590、ATTO 633、ATTO 647N、TYE 563、TYE665、TYE 705、5’/>700、5’/>800、5’/>800CW(NHS酯)、WellRED D4染料、WellRED D3染料、WellRED D2染料、/>640(NHS酯)和Dy 750(NHS酯)。
如上文所提及的，在一些实施方案中，可检测标记为发光或化学发光部分或者包括发光或化学发光部分。常见的发光/化学发光部分包括但不限于过氧化物酶，诸如辣根过氧化物酶(HRP)、大豆过氧化物酶(SP)、碱性磷酸酶和荧光素酶。给定适当的底物(例如，氧化试剂加上化学发光化合物)，这些蛋白质部分可以催化化学发光反应。许多化合物家族可以在各种条件下提供化学发光。化学发光化合物家族的非限制性实例包括5-氨基-6,7,8-三甲氧基-2,3-二氢-1,4-酞嗪二酮鲁米诺和二甲基氨基[ca]苯并类似物。这些化合物可以在碱性过氧化氢或次氯酸钙和碱的存在下发光。化学发光化合物家族的其他实例包括例如，2,4,5-三苯基咪唑、对二甲基氨基和-甲氧基取代基、草酸酯诸如草酰活性酯、对硝基苯基、N-烷基吖啶酯、荧光素、光泽精或吖啶酯。在一些实施方案中，可检测标记是或包括基于金属或基于质量的标记。例如，小簇金属离子、金属或半导体可以充当质量代码。在一些实例中，金属可以选自周期表的第3-15族，例如Y、La、Ag、Au、Pt、Ni、Pd、Rh、Ir、Co、Cu、Bi或其组合。
实施例
包括以下实施例仅用于说明目的，并不旨在限制本公开的范围。
实施例1：增加小鼠脑组织切片中高表达基因的动态范围
在制备用于原位检测高表达基因的核酸文库时，动态范围可能受到与核酸探针相关联的信号的光学拥挤的阻碍。这可能是由许多紧挨着的局部扩增探针造成的，从而阻碍了高表达基因的表达水平的精确定量。本实施例展示如何通过使用探针解析条形码策略(高分辨率标签)来克服这一限制，通过将各个高表达基因的信号拆分成可以在不同时间(例如，在不同荧光通道中)检测的信号来实现更高的动态范围。
方法
经固定小鼠脑组织切片上的挂锁探针靶向和原位RCA：
将新鲜冷冻的小鼠脑样品冷冻切片为10μm，并收集在ThermoFisher Superfrost玻璃载玻片上。让载玻片在室温下解冻并用在PBS中的PFA固定。然后在PBS中洗涤载玻片以确保在透化前去除PFA。然后将载玻片在PBS中洗涤两次，然后用乙醇系列脱水。随后空气干燥载玻片，然后将安全密封室(Grace Bio-Labs)应用于每个切片。
为了进行探针杂交，向安全密封室中的每个组织切片添加靶向Malat-1转录物的不同序列的四种Malat-1挂锁探针并温育。每种挂锁探针含有相同的共同的Malat-1特异性条形码序列和四个探针解析条形码序列之一。探针温育后，然后洗涤样品。为了进行挂锁探针连接，将T4 RNA连接酶和RNAse抑制剂混合并添加到每个安全密封室中并温育。然后用PBS-T洗涤样品两次。为了进行探针扩增，向安全密封室中的每个组织切片添加Phi29。将样品温育，然后在PBS-T中洗涤，此后样品准备好用于原位边杂交边测序(SBH)反应。所得扩增产物含有靶特异性条形码序列(例如，Malat-1基因特异性条形码序列)的互补序列和来自用作模板的挂锁探针的探针解析条形码序列的互补序列。
用基因特异性条形码标记：
通过提供含有SSC、甲酰胺和SBH基因特异性寡核苷酸(例如，与RCA产物中的靶特异性条形码序列的互补序列杂交的L形探针，每种L形探针具有与荧光标记探针杂交的突出部)的SBH混合物来进行各个基因标记。温育反应，然后去除混合物，并在PBS-T中洗涤组织切片。然后将切片与含有SSC、甲酰胺和SBH检测寡核苷酸(例如，与与RCA产物中的靶特异性条形码序列的互补序列结合的L形探针的突出部杂交的荧光标记探针)的检测混合物一起温育。去除混合物，将组织切片在PBS-T中洗涤两次并用乙醇洗涤。将载玻片晾干，用封固介质和盖玻片封固，并使用20x物镜Nikon显微镜(Eclipse Ti2)成像。
用探针解析条形码标记：
将载玻片浸入PBS中以去除盖玻片和封固介质。洗涤组织切片并然后与含有SSC、甲酰胺和高分辨率SBH探针(例如，与RCA产物中的探针解析条形码序列的互补序列杂交的L形探针，每种L形探针具有与荧光标记探针杂交的突出部)的杂交混合物一起温育。然后去除混合物，并在PBS-T中洗涤组织切片。然后将切片与含有SSC、甲酰胺和SBH检测寡核苷酸(例如，与与RCA产物中的探针解析条形码序列的互补序列结合的L形探针的突出部杂交的荧光标记探针)的检测混合物一起温育。去除混合物，并在PBS-T、然后乙醇中洗涤组织切片。将载玻片晾干，用封固介质和盖玻片封固，并使用20x物镜Nikon显微镜(Eclipse Ti2)成像。
结果
用挂锁探针和RCA检测Malat-1(一种高表达的非编码RNA)可能导致光学拥挤。因此，该基因的表达水平的精确定量受到限制，因为不可能解析和定量单个扩增分子。图2A-2C示出了探针解析条形码(高分辨率标签)策略的图示：当仅用针对靶特异性条形码的探针检测时，将发生信号拥挤(左小图)；当除了针对靶特异性条形码的探针之外还用针对附加的探针解析条形码的探针检测时，信号可以在不同颜色的通道中检测到并且可以实现更高的分辨率(图2A)。在本实施例中，以实例示出了小鼠脑组织切片中Malat-1的检测(图2B)。图2B的左小图示出了使用针对靶特异性条形码序列的探针时组织切片中的代表性细胞在单个通道中的荧光图像。由于其局部接近性，故一些个别信号未得到解析。图2B的中间小图和右小图示出了使用针对探针解析条形码序列的探针检测的组织切片中相同的代表性细胞的荧光图像，每个在四个不同颜色的通道：Cy5、AF750、Cy3和AF488中的一个中检测到。与单独使用针对靶特异性条形码序列的探针(图2C，左条)相比，使用这种方法总共解析和定量了多约三倍的RCP(图2C，右条)，从而增加了涉及高表达基因如Malat-1的检测的动态范围。
实施例2：检测患者来源异种移植(PDX)小鼠模型中的物种起源
将来自弥漫内生性脑桥神经胶质瘤(DIPG)的PDX小鼠模型的新鲜冷冻冷冻切片样品收集在玻璃载玻片上。将载玻片在PBS中洗涤，透化，在PBS中洗涤两次，然后用乙醇系列脱水。随后空气干燥载玻片，然后应用安全密封室(Grace Bio-Labs)。
为了进行探针杂交，向安全密封室中的每个组织切片添加靶向人MALAT-1转录物的四种MALAT-1挂锁探针和靶向小鼠Malat-1转录物的四种Malat-1挂锁探针并温育。还向样品中添加靶向RPLP0的挂锁探针。每种挂锁探针含有相同的共同的条形码序列(对应于人MALAT-1和小鼠Malat-1两者)和对应于人物种的探针解析(物种特异性)条形码序列(针对靶向人MALAT-1转录物的探针)或对应于小鼠物种的探针解析(物种特异性)条形码序列(针对靶向小鼠Malat-1转录物的探针)。探针温育后，然后洗涤样品。为了进行挂锁探针连接，将T4 RNA连接酶和RNAse抑制剂混合并添加到每个安全密封室中并温育。然后用PBS-T洗涤样品两次。为了进行探针扩增，向安全密封室中的每个组织切片添加Phi29。将样品温育，然后在PBS-T中洗涤，此后样品准备好用于通过与荧光标记探针杂交来检测条形码序列。所得扩增产物含有靶特异性(例如，基因特异性)条形码序列的互补序列和来自用作模板的挂锁探针的探针解析(物种特异性)条形码序列的互补序列。
大体上如实施例1中所述进行各个基因标记并成像。将载玻片浸入PBS中以去除盖玻片和封固介质。洗涤组织切片并然后与含有SSC、甲酰胺和探针解析(针对小鼠物种特异性条形码的Cy5和针对人物种特异性条形码的Cy7)SBH探针(例如，与对应于人或小鼠物种的RCA产物中的条形码序列的互补序列杂交的L形探针，每种L形探针具有与荧光标记探针杂交的突出部)的杂交混合物一起温育。然后去除混合物，并在PBS-T中洗涤组织切片。然后将切片与含有SSC、甲酰胺和SBH检测寡核苷酸(例如，与与RCA产物中的探针解析条形码序列的互补序列结合的L形探针的突出部杂交的荧光标记探针)的检测混合物一起温育。去除混合物，并在PBS-T、然后乙醇中洗涤组织切片。将载玻片晾干、封固并成像。
图3A示出了在三个不同颜色的通道：DAPI、Cy5、Cy7中检测到的组织切片的代表性图像的荧光图像和合并图像。为了建立基本真相，在连续的组织切片上使用用于靶向检测人特异性H3F3A突变(H3F3Amut)的人转录物的cDNA靶向挂锁探针和用于靶向检测小鼠特异性Olig1的小鼠转录物的cDNA靶向挂锁探针(例如，按照Ke等人,“In situ sequencing forRNA analysis in preserved tissue and cells,”(2013)Nature Methods 10:857–860发表的方法进行)。图3B示出了显示小鼠特异性条形码(对应于Olig1)和人特异性条形码(对应于H3F3Amut)的检测的叠置图像。图3A中的使用针对物种特异性条形码序列的探针原位检测到的人MALAT-1(Cy7)和小鼠Malat-1(Cy5)表达的模式与图3B中检测到的人特异性H3F3Amut和小鼠特异性Olig1的表达模式一致。使用这种方法，鉴定了PDX组织样品中细胞的物种起源。
本公开不旨在在范围上限制于特定公开的实施方案，这些特定公开的实施方案是例如为了示意公开内容的各种方面而提供的。根据本文的描述和教导，对所描述的这些组合物和方法的各种修改将变得显而易见。可以在不脱离本公开的真实范围和实质的情况下实践此类变化，并且此类变化旨在落入本公开的范围内。

Claims (97)

1.一种用于分析生物样品的方法，所述方法包括：
(a)使所述生物样品与各自包含靶特异性条形码序列的多种探针接触，
其中所述多种探针中的第一探针包含第一探针解析条形码序列，并且所述多种探针中的第二探针包含第二探针解析条形码序列，并且
其中所述第一探针靶向所述生物样品中靶分析物的第一分子，并且所述第二探针靶向所述生物样品中靶分析物的第二分子，并且所述靶特异性条形码序列对应于所述靶分析物；
(b)检测与所述多种探针的所述靶特异性条形码序列相关联的多个信号；
(c1)检测与所述第一探针解析条形码序列相关联的信号；以及
(c2)检测与所述第二探针解析条形码序列相关联的信号，
其中步骤(c1)和(c2)的所述信号与所述靶分析物相关联。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)中检测到的所述多个信号包括在步骤(b)中未在空间上解析成单个点的重叠信号。
3.根据权利要求2所述的方法，其中对于与所述靶特异性条形码序列相关联的重叠信号，每个重叠信号能够与步骤(c1)的所述信号或步骤(c2)的所述信号相关联，但不与两者都相关联，由此将所述重叠信号解析成分别与所述第一探针和所述第二探针相关联的信号。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中步骤(b)中的所述多个信号在所述生物样品中的多个位置处检测到，(c1)中的所述信号在所述多个位置的第一子集处检测到，(c2)中的所述信号在所述多个位置的第二子集处检测到，并且其中所述多个位置的所述第一子集和所述第二子集不完全重叠。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中步骤(b)、(c1)和/或(c2)中的所述信号分别使用直接或间接与所述靶特异性条形码序列或其互补序列、所述第一探针解析条形码序列或其互补序列、和所述第二探针解析条形码序列或其互补序列结合的可检测探针检测，并且任选地所述检测包括滚环扩增(RCA)、杂交链反应(HCR)、线型寡核苷酸杂交链反应(LO-HCR)或引物交换反应(PER)或其任何组合。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述靶特异性条形码序列的长度为约5、约10、约15、约20、约25、约30或约35个核苷酸。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述第一探针解析条形码序列和所述第二探针解析条形码序列的长度独立地为约3、约5、约10、约15、约20、约25、约30或约35个核苷酸。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述靶特异性条形码序列的长度为约20个核苷酸，并且所述第一探针解析条形码序列和所述第二探针解析条形码序列的长度为约5个核苷酸。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述第一探针和/或所述第二探针还包含锚定序列。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述锚定序列与所述靶特异性条形码序列相邻，任选地其中所述锚定序列与所述靶特异性条形码序列的5’或3’核苷酸分开0、1、2、3、4、5个或更多个核苷酸。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述锚定序列在所述第一探针和所述第二探针之间是共同的。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的方法，其中所述锚定序列在所述多种探针之间是共同的。
13.根据权利要求9-12中任一项所述的方法，其中所述锚定序列在靶向所述生物样品中的不同靶分析物的探针之间是共同的。
14.根据权利要求9-13中任一项所述的方法，其中所述锚定序列的长度为约5、约10、约15、约20、约25、约30或约35个核苷酸，任选地其中所述锚定序列的长度为约20个核苷酸。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述第一探针和/或所述第二探针还包含一个或多个接头序列。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一探针和/或所述第二探针包含分别侧接所述第一探针解析条形码序列或所述第二探针解析条形码序列的两个接头序列。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述一个或多个接头序列中的每一个的长度独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个核苷酸。
18.根据权利要求15-17中任一项所述的方法，其中所述一个或多个接头序列在所述第一探针和所述第二探针之间是共同的。
19.根据权利要求15-18中任一项所述的方法，其中所述一个或多个接头序列在所述多种探针之间是共同的。
20.根据权利要求15-19中任一项所述的方法，其中所述一个或多个接头序列在靶向所述生物样品中的不同靶分析物的探针之间是共同的。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述第一探针解析条形码序列和/或所述第二探针解析条形码序列与所述靶特异性条形码序列相邻，任选地其中所述第一探针解析条形码序列和/或所述第二探针解析条形码序列与所述靶特异性条形码序列的5’或3’核苷酸分开0、1、2、3、4、5个或更多个核苷酸。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述多种探针还包括包含第三探针解析条形码序列的第三探针，并且所述方法还包括(c3)检测与所述第三探针解析条形码序列相关联的信号。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述多种探针还包括包含第四探针解析条形码序列的第四探针，并且所述方法还包括(c4)检测与所述第四探针解析条形码序列相关联的信号。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述第一探针解析条形码序列、所述第二探针解析条形码序列、所述第三探针解析条形码序列和/或所述第四探针解析条形码序列在靶向相同的靶分析物的探针之间是不同的。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述第一探针解析条形码序列、所述第二探针解析条形码序列、所述第三探针解析条形码序列和/或所述第四探针解析条形码序列在各自靶向所述生物样品中的不同靶分析物的两种或更多种探针之间是共同的。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述第一探针解析条形码序列、所述第二探针解析条形码序列、所述第三探针解析条形码序列和/或所述第四探针解析条形码序列与相同的生物体物种相关联。
27.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述第一探针解析条形码序列、所述第二探针解析条形码序列、所述第三探针解析条形码序列和/或所述第四探针解析条形码序列与不同的生物体物种相关联。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述靶分析物的所述第一分子属于第一物种，并且所述靶分析物的所述第二分子属于与所述第一物种不同的第二物种，并且其中所述第一探针解析条形码序列和所述第二探针解析条形码序列分别与所述第一物种和所述第二物种相关联。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述靶分析物包含核酸序列。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述多种探针直接或间接与所述靶分析物的不同分子中的相同核酸序列结合。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述多种探针中的两种或更多种各自直接或间接与所述靶分析物的不同分子中的不同核酸序列结合。
32.根据权利要求29-31中任一项所述的方法，其中所述第一探针包含与所述靶分析物的第一核酸序列互补的第一靶结合序列，并且所述第二探针包含与所述靶分析物的第二核酸序列互补的第二靶结合序列。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述第一靶结合序列和所述第二靶结合序列是相同的。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述第一靶结合序列和所述第二靶结合序列是不同的。
35.根据权利要求32-34中任一项所述的方法，其中所述第一靶结合序列和所述第二靶结合序列与所述靶分析物中的相同核酸序列杂交。
36.根据权利要求32-34中任一项所述的方法，其中所述第一靶结合序列和所述第二靶结合序列与所述靶分析物中的相邻核酸序列杂交。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述靶分析物中的所述相邻核酸序列是不重叠的或部分重叠的。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述靶分析物中的所述相邻核酸序列分开0、约5、约10、约15、约20或更多个核苷酸。
39.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述靶分析物中的所述相邻核酸序列在约2、约5、约10、约15、约20或更多个核苷酸处重叠。
40.根据权利要求1-39中任一项所述的方法，其中所述第一探针和所述第二探针为环状探针或可环化探针或探针组。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述第一探针和/或所述第二探针包含核糖核苷酸。
42.根据权利要求40或41所述的方法，其中所述第一探针和所述第二探针通过使用所述靶分析物中的核酸序列和/或夹板作为模板的连接而环化。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述第一探针和所述第二探针为可环化探针，并且使用所述靶分析物中的所述核酸序列作为模板来连接所述可环化探针的末端，在连接之前进行或不进行间隙填充。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述可环化探针包含脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸，并且所述靶分析物为DNA或RNA，任选地其中所述靶分析物为基因组DNA、mRNA、cDNA或报告寡核苷酸。
45.根据权利要求42-44中任一项所述的方法，其中所述连接包括酶促连接和/或化学连接，并且/或者所述连接包括模板依赖性连接和/或非模板依赖性连接。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述酶促连接包括使用具有RNA模板化DNA连接酶活性和/或RNA模板化RNA连接酶活性的连接酶。
47.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述酶促连接包括使用选自小球藻病毒DNA连接酶(PBCV DNA连接酶)、T4 RNA连接酶、T4 DNA连接酶和单链DNA(ssDNA)连接酶的连接酶。
48.根据权利要求45-47中任一项所述的方法，其中所述酶促连接包括使用PBCV-1 DNA连接酶或其变体或衍生物和/或T4 RNA连接酶2(T4 Rnl2)或其变体或衍生物。
49.根据权利要求42-48中任一项所述的方法，所述方法还包括在所述连接之前从所述生物样品去除未与所述靶分析物稳定地结合的所述第一探针、所述第二探针和/或所述夹板的分子的步骤，任选地所述去除步骤包括一次或多次严格洗涤。
50.根据权利要求42-49中任一项所述的方法，所述方法还包括在所述生物样品中原位产生环化的第一探针和环化的第二探针的产物。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述产物为使用滚环扩增(RCA)产生的扩增产物，任选地其中所述RCA包括线型RCA、分支RCA、树状RCA或它们的任何组合。
52.根据权利要求50或51所述的方法，其中所述产物使用选自以下的聚合酶产生：Phi29 DNA聚合酶、Phi29样DNA聚合酶、M2 DNA聚合酶、B103 DNA聚合酶、GA-1DNA聚合酶、phi-PRD1聚合酶、Vent DNA聚合酶、Deep Vent DNA聚合酶、Vent(外切-)DNA聚合酶、KlenTaq DNA聚合酶、DNA聚合酶I、DNA聚合酶I的Klenow片段、DNA聚合酶III、T3 DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、T5 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Bst聚合酶、rBST DNA聚合酶、N29 DNA聚合酶、TopoTaq DNA聚合酶、T7 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶及其变体或衍生物。
53.根据权利要求50-52中任一项所述的方法，其中所述产物固定在所述生物样品中和/或与所述生物样品中的一种或多种其他分子交联。
54.根据权利要求50-53中任一项所述的方法，其中所述方法包括对所述生物样品成像以通过顺序杂交、边杂交边测序、边连接边测序、边合成边测序、边结合边测序或其组合原位检测所述产物。
55.根据权利要求50-54中任一项所述的方法，其中所述产物为滚环扩增(RCA)产物并通过以下方式检测：
使所述生物样品与直接或间接与所述RCA产物杂交的一种或多种可检测地标记的探针接触，以及
使所述一种或多种可检测地标记的探针与所述RCA产物去杂交，
任选地其中所述接触和去杂交步骤用所述一种或多种可检测地标记的探针和/或直接或间接与所述RCA产物杂交的一种或多种其他可检测地标记的探针来重复。
56.根据权利要求50-54中任一项所述的方法，其中所述产物为滚环扩增(RCA)产物并通过以下方式检测：
使所述生物样品与直接或间接与所述RCA产物杂交的一种或多种中间探针接触，其中所述一种或多种中间探针是可使用一种或多种可检测地标记的探针检测的，以及
使所述一种或多种中间探针和/或所述一种或多种可检测地标记的探针与所述RCA产物去杂交，
任选地其中所述接触和去杂交步骤用所述一种或多种中间探针、所述一种或多种可检测地标记的探针、一种或多种其他中间探针和/或一种或多种其他可检测地标记的探针来重复。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述一种或多种中间探针各自包含与所述RCA产物之一杂交的序列和与可检测地标记的探针杂交但不与所述RCA产物杂交的一个或多个突出部。
58.根据权利要求1-57中任一项所述的方法，所述方法包括：
(i)使所述生物样品与与所述靶特异性条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针接触；
(ii)对所述生物样品成像以检测步骤(b)的所述多个信号；
(iii)任选地从所述靶特异性条形码序列或其互补序列去除所述可检测探针；
(iv)使所述生物样品与与所述第一探针解析条形码序列和所述第二探针解析条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针接触；
(v)对所述生物样品成像以在第一检测通道中检测步骤(c1)的所述信号；
(vi)对所述生物样品成像以在不同于所述第一检测通道的第二检测通道中检测步骤(c2)的所述信号；以及
(vii)任选地从所述第一探针解析条形码序列和所述第二探针解析条形码序列或其互补序列去除所述可检测探针。
59.根据权利要求58所述的方法，其中步骤(i)中的所述可检测探针包括与所述靶特异性条形码序列或其互补序列杂交的中间探针和与所述中间探针杂交的可检测地标记的探针。
60.根据权利要求58或59所述的方法，其中步骤(iv)中的所述可检测探针包括与所述第一探针解析条形码序列和所述第二探针解析条形码序列或其互补序列杂交的中间探针和与所述中间探针杂交的可检测地标记的探针。
61.根据权利要求58-60中任一项所述的方法，其中：
步骤(i)中的所述可检测探针用与步骤(iv)中的所述可检测探针的荧光标记不同的荧光标记直接或间接标记；
所述方法不包括步骤(iii)；
(i)和(iv)的步骤通过使所述生物样品与：与所述靶特异性条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针以及与所述第一探针解析条形码序列和所述第二探针解析条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针接触而同时进行；并且
步骤(ii)、(v)和(vi)按任何次序进行。
62.根据权利要求61所述的方法，其中在步骤(vi)之后从所述生物样品去除步骤(i)中的所述可检测探针和步骤(iv)中的所述可检测探针。
63.根据权利要求58-60中任一项所述的方法，其中：
步骤(i)中的所述可检测探针用可在与步骤(iv)中的所述可检测探针的荧光标记相同的荧光通道中检测的荧光标记直接或间接标记；
所述方法包括步骤(iii)；并且
步骤(v)和(vi)按任何次序进行。
64.根据权利要求58-63中任一项所述的方法，其中在步骤(v)与(vi)之间，所述方法不包括使所述生物样品与探针接触或去除所述探针。
65.根据权利要求58-64中任一项所述的方法，其中步骤(i)-(iii)在步骤(iv)-(vii)之前进行。
66.根据权利要求58-64中任一项所述的方法，其中步骤(i)-(iii)在步骤(iv)-(vii)之后进行。
67.根据权利要求58-66中任一项所述的方法，所述方法还包括每次用不同的多种与所述靶特异性条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针和/或用相同或不同的多种与所述第一探针解析条形码序列和所述第二探针解析条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针将步骤(i)-(vii)中的任何一个或多个重复一次或多次。
68.根据权利要求58-67中任一项所述的方法，其中步骤(c1)的所述信号和步骤(c2)的所述信号在所述生物样品中的相同位置处检测到。
69.根据权利要求58-67中任一项所述的方法，其中步骤(c1)的所述信号和步骤(c2)的所述信号在所述生物样品中的不同位置处检测到。
70.根据权利要求58-69中任一项所述的方法，所述方法还包括配准所述成像步骤的图像以检测步骤(b)的所述多个信号、步骤(c1)的所述信号和步骤(c2)的所述信号。
71.根据权利要求70所述的方法，其中步骤(b)的所述多个信号、步骤(c1)的所述信号和步骤(c2)的所述信号使用配准图像相关联。
72.根据权利要求58-71中任一项所述的方法，其中步骤(b)的所述多个信号包括在所述生物样品中的相同位置处或相邻位置处的重叠信号。
73.根据权利要求72所述的方法，其中每个重叠信号与步骤(c1)的所述信号或步骤(c2)的所述信号相关联，但不与两者都相关联，从而解析所述重叠信号。
74.一种用于分析生物样品的方法，所述方法包括：
(a)使所述生物样品与多种环状或可环化探针接触，所述多种环状或可环化探针包括第一环状或可环化探针和第二环状或可环化探针，
其中所述第一环状或可环化探针包含靶特异性条形码序列和第一探针解析条形码序列，并且所述第二环状或可环化探针包含所述靶特异性条形码序列和第二探针解析条形码序列，并且
其中所述多种环状或可环化探针与所述生物样品中的不同核酸分子杂交，并且所述靶特异性条形码序列对应于靶核酸；
(b)产生所述第一环状或可环化探针和所述第二环状或可环化探针的滚环扩增(RCA)产物；
(c)使所述生物样品与在所述靶特异性条形码序列的互补序列处与所述RCA产物杂交的可检测探针接触；
(d)检测与所述靶特异性条形码序列相关联的信号；
(e)使所述生物样品与在所述第一探针解析条形码序列的互补序列处与所述RCA产物杂交的可检测探针和与在所述第二探针解析条形码序列的互补序列处与所述RCA产物杂交的可检测探针接触；并且
(f)在分开的检测通道中检测与所述第一探针解析条形码序列相关联的信号和与所述第二探针解析条形码序列相关联的信号。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述靶核酸为DNA或RNA，任选地其中所述靶核酸为基因组DNA、mRNA、cDNA或靶向所述生物样品中的靶分析物的探针的报告寡核苷酸。
76.根据权利要求74或75所述的方法，其中所述第一环状或可环化探针和所述第二环状或可环化探针与相同的靶核酸的不同分子杂交。
77.根据权利要求76所述的方法，其中：
所述靶特异性条形码序列为第一靶特异性条形码序列，
所述靶核酸为第一靶核酸，并且
所述多种环状或可环化探针还包括各自包含对应于与所述第一靶核酸不同的第二靶核酸的第二靶特异性条形码序列的一种或多种环状或可环化探针，
任选地其中所述多种环状或可环化探针包括：i)包含所述第二靶特异性条形码序列和所述第一探针解析条形码序列的第一环状或可环化探针，和ii)包含所述第二靶特异性条形码序列和所述第二探针解析条形码序列的第二环状或可环化探针。
78.根据权利要求74-77中任一项所述的方法，其中所述可检测探针包括与所述RCA产物杂交的荧光标记探针。
79.根据权利要求74-78中任一项所述的方法，其中所述可检测探针包括与所述RCA产物杂交的中间探针和进而与所述中间探针杂交的荧光标记探针。
80.根据权利要求74-79中任一项所述的方法，其中步骤(d)中的与所述靶特异性条形码序列相关联的所述信号包含不在空间上解析成单独的点的重叠信号。
81.根据权利要求74-80中任一项所述的方法，其中在步骤(f)中在第一检测通道中检测和空间解析与所述第一探针解析条形码序列相关联的所述信号。
82.根据权利要求74-81中任一项所述的方法，其中在步骤(f)中在第二检测通道中检测和空间解析与所述第二探针解析条形码序列相关联的所述信号。
83.根据权利要求81或82所述的方法，其中步骤(f)中的空间解析信号中的一者或两者各自对应于步骤(d)中未在空间上解析的信号，任选地其中步骤(f)中的空间解析信号对应于步骤(d)中检测到的与所述靶特异性条形码序列相关联的完全或部分重叠的信号。
84.一种用于分析生物样品的方法，所述方法包括：
(a)使所述生物样品与各自包含与靶分析物相关联的靶特异性条形码序列的多种探针接触，
其中所述多种探针中的第一探针包含与第一生物体物种相关联的第一探针解析条形码序列，并且所述多种探针中的第二探针包含与第二生物体物种相关联的第二探针解析条形码序列，并且
其中所述第一探针靶向所述第一生物体物种的所述靶分析物的第一核酸序列，并且所述第二探针靶向所述第二生物体物种的所述靶分析物的第二核酸序列，并且所述靶特异性条形码序列对应于所述靶分析物；
(b)检测与所述多种探针的所述靶特异性条形码序列相关联的多个信号；
(c1)检测与所述第一探针解析条形码序列相关联的信号；以及
(c2)检测与所述第二探针解析条形码序列相关联的信号，
其中步骤(c1)和(c2)的所述信号与所述靶分析物相关联。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列分别为所述第一生物体物种和所述第二生物体物种中的所述靶分析物的同源物。
86.根据权利要求84或权利要求85所述的方法，其中所述第一探针和所述第二探针为环状探针或可环化探针或探针组。
87.根据权利要求84-86中任一项所述的方法，其中所述靶核酸为DNA或RNA。
88.根据权利要求87所述的方法，其中所述靶核酸为基因组DNA、mRNA、cDNA或靶向所述生物样品中的靶分析物的探针的报告寡核苷酸。
89.根据权利要求84-88中任一项所述的方法，所述方法包括：
使所述生物样品与与所述靶特异性条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针接触；以及
使所述生物样品与与所述第一探针解析条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针和与所述第二探针解析条形码序列或其互补序列杂交的可检测探针接触。
90.根据权利要求84-89中任一项所述的方法，其中与所述第一探针解析条形码序列相关联的所述信号和与所述第二探针解析条形码序列相关联的所述信号在分开的检测通道中检测到。
91.一种用于分析生物样品的试剂盒，所述试剂盒包含：
(i)各自包含靶特异性条形码序列的多种探针，
其中所述多种探针中的第一探针包含第一探针解析条形码序列，并且所述多种探针中的第二探针包含第二探针解析条形码序列，并且
其中所述多种探针靶向所述生物样品中的靶分析物的不同分子，并且所述靶特异性条形码序列对应于所述靶分析物；
(ii)直接或间接与所述靶特异性条形码序列或其互补序列结合的可检测探针；
(iii)直接或间接与所述第一探针解析条形码序列或其互补序列结合的可检测探针；以及
(iv)直接或间接与所述第二探针解析条形码序列或其互补序列结合的可检测探针。
92.一种用于分析生物样品的试剂盒，所述试剂盒包含：
(i)多种环状或可环化探针，所述多种环状或可环化探针包括第一环状或可环化探针和第二环状或可环化探针，
其中所述第一环状或可环化探针包含靶特异性条形码序列和第一探针解析条形码序列，并且第二环状或可环化探针包含所述靶特异性条形码序列和第二探针解析条形码序列，并且
其中所述多种环状或可环化探针与所述生物样品中的不同核酸分子杂交，并且所述靶特异性条形码序列对应于靶核酸；
(ii)与所述靶特异性条形码序列的互补序列杂交的第一中间探针和与所述第一中间探针杂交的第一荧光标记探针；
(iii)与所述第一探针解析条形码序列的互补序列杂交的第二中间探针和与所述第二中间探针杂交的第二荧光标记探针；以及
(iv)与所述第二探针解析条形码序列的互补序列杂交的第三中间探针和与所述第三中间探针杂交的第三荧光标记探针。
93.根据权利要求92所述的试剂盒，其中所述第二荧光标记探针和所述第三荧光标记探针可在不同的荧光通道中检测。
94.根据权利要求92或93所述的试剂盒，其中所述第一荧光标记探针可在与所述第二荧光标记探针或所述第三荧光标记探针相同的荧光通道中检测。
95.根据权利要求92或93所述的试剂盒，其中所述第一荧光标记探针可在与所述第二荧光标记探针或所述第三荧光标记探针不同的荧光通道中检测。
96.根据权利要求92-95中任一项所述的试剂盒，其中：
所述靶特异性条形码序列为第一靶特异性条形码序列，
所述靶核酸为第一靶核酸，并且
所述多种环状或可环化探针还包括各自包含对应于与所述第一靶核酸不同的第二靶核酸的第二靶特异性条形码序列的一种或多种环状或可环化探针。
97.根据权利要求96所述的试剂盒，其中所述多种环状或可环化探针包括第一环状或可环化探针和第二环状或可环化探针，所述第一环状或可环化探针包含所述第二靶特异性条形码序列和所述第一探针解析条形码序列，所述第二环状或可环化探针包含所述第二靶特异性条形码序列和所述第二探针解析条形码序列。
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