CN115244185A

CN115244185A - 使用探针对连接的原位rna分析

Info

Publication number: CN115244185A
Application number: CN202180018772.6A
Authority: CN
Inventors: H·拉尔曼; J·克雷德尔
Original assignee: Johns Hopkins University
Current assignee: Johns Hopkins University
Priority date: 2020-01-03
Filing date: 2021-01-04
Publication date: 2022-10-25
Also published as: WO2021138676A1; EP4085151A4; US20230039899A1; CA3163623A1; EP4085151A1

Abstract

本发明涉及核糖核苷酸分析的领域。更具体而言，本发明提供使用探针对连接检测核酸的组合物和方法的。在具体实施方案中，本发明的组合物和方法使用的探针组包括(i)第一多部分探针，其包含5'磷酸化的供体探针和第一桥探针，其中，所述5'磷酸化的供体探针与靶标核酸特异性杂交；和(ii)第二多部分探针，其包含3'受体探针和第二桥探针，其中，所述3'受体探针与邻近所述5'供体探针的靶标核酸特异性杂交，且所述第二桥探针经5'磷酸化。

Description

使用探针对连接的原位RNA分析

相关申请的交叉引用

本申请主张2020年1月3日提交的美国临时申请第62/956,691号的优先权，此申请的全部内容通过引用整体并入本文。

政府资助

本发明在美国国立卫生研究院(NIH)授予的第CA202875号的政府资助下完成。政府拥有本发明的特定权利。

技术领域

本发明涉及核糖核苷酸分析的领域。更具体地，本发明提供使用探针对连接以用于原位RNA分析的组合物和方法。

对以电子形式提交的材料的通过引用的并入

本申请包含序列表。其已经以名为“P16123-02_ST25.txt”的ASCII格式经由EFS-Web以电子方式提交。所述序列表大小为2,942字节，且创建于2020年12月28日。其全部内容通过引用整体并入本文。

背景技术

使用块状RNA(bulk RNA)分析的传统基因表达方法缺乏解析转录物位置的能力，故无法捕获几乎存在于每个组织中的固有细胞异质性。映射到组织的特定区域的RNA转录物的丰度和定位，可补充组织学分析，提供额外的分子信息的层¹。在某些情况下，mRNA丰度和位置的亚细胞分辨率可用于对生物学上重要的细胞间变异性和相互作用进行分类^2-4。

肿瘤微环境(TME)描述了实体肿瘤周围的细胞组成，其特别关注此特定感兴趣的区域中的免疫细胞组成。基于抗体的方法(免疫荧光-IHC、免疫组织化学-IF)测量特异性蛋白质表达谱，所述特异性蛋白质表达谱有助于确定TME的免疫细胞组成。虽然有用，但IHC和IF分析在特异性方面通常是受限的(由于抗体交叉反应性)且难以多重分析⁵。因此，替代原位定量RNA的技术已成为基于抗体的测定的补充。在TME内原位检测的RNA可提供具有空间精度的高度多重的测量。此外，一些疾病具有mRNA定位的破坏作为定义性特征(例如，脊髓性肌萎缩、肌萎缩性侧索硬化)；因此，有必要开发改进的方法，以空间分辨率捕获RNA丰度^6,7。

为了原位测量RNA丰度和空间位置，已经开发了一些方法和技术平台。虽然使用连续重测(serial reprobing)(例如，seqFISH，MERFISH)的荧光原位杂交(FISH)和此技术的衍生物很有潜力，但未能超越某些诸如由于分子拥挤(<百个靶标测量)导致的多路复用(multiplexing)极限的技术限制，而需要具有低样品通量和高成本的专用成像平台(每个转录物需要>40个探针)^8-11。RNA分子的原位测序(例如，FISSEQ、Bar-Seq)，如基于FISH的方法，也面临许多的相同技术挑战^12,13。基于scRNA-seq的方法(例如，液滴测序(Drop-seq)、Slide-seq)可分析整个转录物组，然而，由于测序深度要求，再加上将转录物组连接回细胞位置的计算困难，故每个样品的成本很高(>$10,000)，阻止了这些方法被广泛采用^14-16。在这些技术中，空间分辨率是由像素大小所确定，所述像素大小可能没有足够的分辨率(例如，单细胞)用于某些应用。LISH(连接原位杂交)最近被证明是一种用于RNA的检测的稳健的高度多重的方法，是一种基于探针连接的技术，其尚未被用于测量原位丰度和转录物位置。¹⁸

发明内容

本发明至少部分基于一种称为“LISH-Lock'n'Roll”的多重的探针连接方法的开发。在特定实施方案中，LISH-Lock'n'Roll可使用一般实验室仪器并需要简单的单日工作流程，以最低成本被使用于荧光跟踪RNA丰度和位置。

与基于FISH(smFISH)的单分子及原位测序方法相比，使用单探针组以LISH-Lock'n'Roll进行的高水平的信号扩增提供了一些独特的优势。首先，在特定实施方案中，LISH-Lock'n'Roll探针的稳健扩增，使其可用单探针组原位检测任何RNA序列，而不是方法例如MERFISH所需的>40个探针/靶标。其次，在某些实施方案中，由于LISH-Lock'n'Roll使用单靶标识别探针，因此，基于单多核苷酸多态性(SNP)、突变、新颖剪接异构体和融合的存在或不存在，可以更好地区分感兴趣的RNA序列。第三，与其他需要几天到几周才能完成的方法(例如，FISSEQ)不同，LISH-Lock'n'Roll可在单日内完成，这一特质可影响通量(throughput)。LISH-Lock'n'Roll最大的商业优势是其简单性和成本，这些特征肯定将促进其在学术和临床实验室中的广泛采用，并超越其他原位转录物组平台。

因此，本发明提供了用于检测核酸的组合物和方法。在一方面，本发明提供了用于检测核糖核酸的组合物和方法。在另一方面，本发明可被使用于检测脱氧核糖核酸。应当理解，记载RNA的检测的实施方案为适用于DNA的检测。

在一个实施方案中，用于检测固定化靶标核糖核酸(RNA)的方法，包含以下步骤(a)将反应混合物中包含所述靶标RNA的生物样品与至少一个探针组接触，所述探针组包含(i)第一多部分探针，其包含5'磷酸化的供体探针和第一桥探针，其中，所述5'磷酸化的供体探针与所述靶标RNA特异性杂交；和(ii)第二多部分探针，其包含3'受体探针和第二桥探针，其中，所述3'受体探针与邻近所述5'供体探针的所述靶标RNA特异性杂交，且所述第二桥探针经5’磷酸化；(b)在允许所述至少一个探针组与所述生物样品中存在的所述靶标RNA的杂交的条件下，培育步骤(a)的所述反应混合物；(c)洗去未结合的探针组；(d)将所述5'磷酸化的供体探针和所述3'受体探针进行连接；(e)将所述反应混合物与至少一个桥引物接触，所述桥引物与所述第一桥探针和所述第二桥探针特异性杂交，其中，所述第一桥探针和所述第二桥探针退火到彼此相邻的所述桥引物；(f)将所述第一桥探针和所述第二桥探针进行连接，从而形成与所述靶标RNA杂交的环化探针；(g)将所述环化探针通过滚环扩增进行放大；以及(h)将所述靶标RNA进行检测。

应当理解，在本发明中可使用多于一个探针组，各自靶向具体且不同的RNA。在特定实施方案中，所述至少一个探针组是被配置用于1至30,000个不同的靶标RNA的多重检测。

在某些实施方案中，所述多部分探针的大小范围为30至1000个核苷酸。所述靶标RNA可为病毒RNA、细菌RNA、真菌RNA、线虫RNA、人类RNA、非人类哺乳动物RNA、非哺乳类动物RNA或其组合。

在特定实施方案中，本发明是使用于检测固定化靶标RNA。在一具体实施方案中，所述RNA是固定化以作为包含靶标RNA的固定的生物样品的一部分。所述固定的生物样品可包含固定的组织、冷冻固定的组织、福尔马林固定的石蜡包埋的组织、贴壁固定的细胞、悬浮固定的细胞或固定的细胞。

在替代实施方案中，在洗涤步骤(c)之前，所述靶标RNA是通过捕获固定化的。标记的靶标RNA捕获性探针(capture probe)可被使用于，包含但不限于，生物素、地高辛(diogexin)、亚磷酰胺(acrydite)、卤代烷或点击化学。捕获元件可包含抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、抗-地高辛抗体、点击化学、卤蛋白或其组合。固体支持物可用于捕获靶标RNA，且可包含可被使用于固定方法的磁性材料、聚苯乙烯、琼脂糖、二氧化硅、侧向流体试纸(lateral flow strip)、微流体室或其组合。

在某些实施方案中，所述3'受体探针包含至少一个3'末端核糖核苷酸。

在其他实施方案中，接触步骤(e)是在连接步骤(d)之前进行的。在此类实施方案中，连接步骤(d)和连接步骤(f)可为同时进行的。在另一实施方案中，接触步骤(e)和连接步骤(f)是在连接步骤(d)之前进行的。

在特定实施方案中，连接步骤(d)是使用选自T4 RNA连接酶2(Rnl2)、小球藻病毒DNA连接酶(PBCV-1DNA连接酶)、T4 DNA连接酶、其衍生物及其组合所组成群组的连接酶所进行的。

在某些实施方案中，检测步骤(h)包含对滚环扩增产物的测序。在一具体实施方案中，探针组包含条形码，所述条形码对所述靶标RNA是独特的，且其中，所述条形码的测序检测所述靶标RNA。在更具体的实施方案中，测序包含边合成边测序(sequencing bysynthesis)或边连接边测序(sequencing by ligation)。在一甚至更具体的实施方案中，方法是在固定的样品上原位进行的。在一替代实施方案中，测序包含边合成边测序，且其中，所述合成的序列产生独特的彩色条形码，所述彩色条形码检测所述靶标RNA。

在其他实施方案中，检测步骤(h)包含通过所述供体探针和所述受体探针所形成的所述连接的序列进行测序。在另一实施方案中，检测步骤(h)包含将所述反应混合物与可检测标记的检测器探针接触，所述检测器探针特异性杂交所述连接的序列，所述连接的序列通过所述供体探针和所述受体探针所形成。

在其他实施方案中，所述第一多部分探针和所述第二多部分探针各自进一步包含至少一个检测探针。在一具体实施方案中，所述第一多部分探针和所述第二多部分探针各自包含两个检测探针。在一甚至更具体的实施方案中，所述第一多部分探针和所述第二多部分探针各自包含在所述两个检测探针之间的间隔序列。

在此类实施方案中，检测步骤(h)包含将所述反应混合物接触与所述至少一个检测探针特异性杂交的至少一个检测器探针，并将所述至少一个可检测标记的检测器探针进行成像。在具体实施方案中，所述至少一个检测器探针是可检测标记的。在一具体实施方案中，所述方法进一步包含将所述样品中所述靶标RNA的位置进行识别的步骤。在另一个实施方案中，所述方法进一步包含将所述样品中所述靶标RNA进行定量的步骤。

在特定实施方案中，步骤(g)是使用链置换DNA聚合酶来进行的。在具体实施方案中，所述链置换DNA聚合酶包含Phi29聚合酶或Bst聚合酶。

在另一方面，本发明提供试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包含探针组，所述探针组包含(i)包含5'磷酸化的供体探针和第一桥探针的第一多部分探针，其中5'磷酸化的供体探针与靶标RNA特异性杂交；和(ii)第二多部分探针，其包含3'受体探针和第二桥探针，其中，所述3'受体探针与邻近所述5'供体探针的所述靶标RNA特异性杂交，且所述第二桥探针经5’磷酸化。应当理解，所述试剂盒可包含靶向不同RNA的多个探针组。

在另一实施方案中，所述试剂盒进一步包含与所述第一桥探针和所述第二桥探针特异性杂交的桥引物，其中，所述第一桥探针和所述第二桥探针退火到彼此相邻的所述桥引物。

在其他实施方案中，所述第一多部分探针和所述第二多部分探针各自进一步包含至少一个检测探针。在一具体实施方案中，所述第一多部分探针和所述第二多部分探针各自包含两个检测探针。在更具体的实施方案中，所述第一多部分探针和所述第二多部分探针各自包含在所述两个检测探针之间的间隔序列。在其他实施方案中，所述试剂盒进一步包含至少一个检测器探针，所述至少一个检测器探针与所述至少一个检测探针特异性杂交。在具体实施方案中，所述至少一个检测器探针是可检测标记的。

在特定实施方案中，所述多部分探针的大小范围为30至1000个核苷酸。在其他实施方案中，所述3'受体探针包含至少一个3'末端核糖核苷酸。

所述试剂盒可进一步包含连接酶，用于将所述5'磷酸化的供体探针和所述3'受体探针进行连接。更具体地，所述连接酶包含T4 RNA连接酶2(Rnl2)、小球藻病毒DNA连接酶(PBCV-1DNA连接酶)、T4 DNA连接酶及其衍生物。

所述试剂盒可进一步包含连接酶，用于将所述第一桥探针和所述第二桥探针进行连接，以形成杂交到所述靶标RNA的环化探针。

在其他实施方案中，所述试剂盒进一步包含链置换DNA聚合酶，用于将环化探针通过滚环扩增进行放大，所述环化探针是通过将所述第一桥探针和所述第二桥探针进行连接并杂交到所述靶标RNA所形成的。所述链置换DNA聚合酶包含Phi29聚合酶或Bst聚合酶。

附图说明

图1A和1B：LISH-Lock'n'Roll探针组组合。探针是以其闭合(锁定)形式表示。蓝色表示20+20nt LnR序列(靶标)，橙色表示单个30nt检测器序列(图1A-两个检测器序列，图1B-四个检测器序列，每个探针2个)。浅绿色表示4nt间隔序列且绿色表示组合的34nt桥序列(探针各自贡献17nt)，最后，红色表示二核糖核苷酸的位置。虚线把锁定的探针各自分成3'受体和5'供体半探针(probe halves)。

图2：LISH-Lock'n'Roll工作流程。在步骤1中，固定的细胞或组织是被培育的探针组，其杂交到其等靶向RNA序列。步骤2包含洗去未结合或部分退火的探针，随后为相邻探针对通过Rnl2的连接。在步骤3中，样品是与通用桥引物一起培育，所述引物与所有连接的探针对的桥序列杂交。步骤4包含两个17nt桥序列通过T4 DNA连接酶的连接，形成现在锁定到位的环化探针组。在步骤5中，样品是与Phi29一起培育，以进行锁定环的滚环扩增(RCA)，反应是由退火的桥引物所引发。在步骤6中，荧光团标记的检测器探针与RCA产物杂交。最后，样品是经成像和去卷积(deconvolute)以获取在单个光斑各自的荧光代码，以允许确定靶标数量和位置。

图3：靶标多路复用。靶标多路复用，其中多个探针组，各组具有不同的检测器序列，以允许两个或更多个靶标的同时检测的附图。

图4：彩色条形码。具有多个不同检测器序列的探针组，以允许荧光条形码的创建，来描述单个靶标的附图。

图5A至5C：靶标多路复用的代表性图像和量化。图5A：具有靶向GAPDH(检测器-1-Alexa-488，绿色)和β-肌动蛋白(检测器-2-Alexa-647，洋红色)与由DAPI(蓝色)突出显示的的探针组的固定细胞的图像。白色框表示放大区域(下)。图中显示为所使用的单个检测器探针(左，中)和叠加(右)。虚线表示细胞边界。图5B：通过qPCR对回收的LISH-Lock'n'Roll产物进行定量，显示通过Phi29聚合酶在被RCA(-Phi29-虚线条)锁定但未被扩增的样品上的滚环扩增(+Phi29-实心条)所达到的增加的信号。图5C：LISH-Lock'n'Roll光斑的特征：对于个别靶标探针组的每个细胞平均的光斑大小和光斑数量。

图6：通过Phi29介导的滚环扩增信号放大。具有靶标GAPDH(检测器-1-Alexa-488，绿色)和β-肌动蛋白(检测器-2-Alexa-647，洋红色)与由DAPI(蓝色)突出显示的细胞核的探针组的固定细胞图像。有Phi29 RCA(左图)和没有Phi29 RCA(右图)。

图7A和7B：彩色条形码的代表性图像和量化。图7A：具有四个不同的检测器序列(每个探针两个)的靶向β-肌动蛋白的探针组与固定细胞的图像。两个荧光标记的检测器探针(每个探针一个)是使用于RCA产物(检测器-1探针-Alexa-488，绿色和检测器-2探针-Alexa-647，洋红色)的杂交。细胞核是被DAPI(蓝色)染色。白色框表示放大的区域(下)，表示为所使用的各别检测器探针(左、中)和叠加(右)。虚线表示细胞边界。图7B：通过qPCR对回收的LISH-Lock'n'Roll产物进行定量，显示通过Phi29聚合酶在被RCA(-Phi29-虚线条)锁定但未被扩增的样品上的滚环扩增(+Phi29-实心条)所达到的增加的信号。

具体实施方式

应当理解，本发明不限于本文描述的特定方法和组分等，因为这些可以变化。还应理解，本文使用的术语是用于描述特定实施例的目的，并不旨在限制本发明的范围。必须注意，如本文和所附权利要求中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包含复数引用，除非上下文另有明确规定。因此，例如，对一“蛋白质”的引用，是对一种或多种蛋白质的引用，且包含本领域技术人员已知的其均等物。

除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。描述了具体的方法、装置和材料，尽管与本文所描述的那些相似或均等的任何方法和材料皆可被使用于本发明的实践或测试。

本文所引用的所有出版物，包含所有期刊文章、书籍、手册、已发表的专利申请和已发布的专利，皆通过引用并入本文。此外，提供了在说明书、实施例和所附权利要求中所用的某些术语和短语的含义。这些定义在本质上并不旨在限制且用于提供对本发明的某些方面的更清晰的理解。

I.定义

“检测”是指将待检测的核酸(例如，RNA)的存在、不存在或量进行鉴定。

“可检测标记”是指当与感兴趣的分子连接时使后者可通过例如光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段检测的组合物。例如，有用的标记可包含放射性同位素、磁珠、金属珠、胶体颗粒、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，如ELISA中常用的)、生物素、地高辛或半抗原。

“片段”是指核酸分子或多肽的一部分。此部分优选地包含参考核酸分子或多肽的全长的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。片段可包含10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个核苷酸或氨基酸。

“杂交”是指互补核碱基之间的氢键，其可为沃森-克里克(Watson-Crick)、胡斯坦(Hoogsteen)或反向胡斯坦氢键。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过氢键的形成配对的互补核碱基。

“标志物”是指任何具有与疾病或病症相关的表达水平或活性中的改变的蛋白质或多核苷酸。术语“生物标志物”可与术语“标志物”互换使用。

“多部分”是指具有一些或许多部分或分区。

“多部分探针组”是指具有多个部分或分区的探针组。

例如，本发明的多部分探针组可包含(i)第一多部分探针，其包含5'磷酸化的供体探针、至少一个检测探针和第一桥探针，其中5'磷酸化的供体探针与靶标RNA特异性杂交，和(ii)第二多部分探针，包含3'受体探针、至少一个检测探针和第二桥探针的，其中3'受体探针与邻近所述5'供体探针的靶标RNA特异性杂交，且所述第二个桥探针经5’磷酸化。

“病原体”是指任何可产生疾病的东西，例如包含细菌、病毒、真菌或其他微生物。

“感染”是指通过致病原(disease-causing agent)对生物的身体的入侵、它们的繁殖和宿主对这些生物的反应以及它们产生的毒素。感染可由任何微生物(microbe)/微生物(microorganism)引起，包含例如细菌、真菌和病毒。微生物可包含所有细菌、古细菌和原生物种。此组还包含真菌、藻类和某些动物的一些种类。在一些实施方案中，病毒也可归类为微生物。

“减少”是指至少10％、25％、50％、75％或100％的负改变。

“参考”是指标准或对照条件，诸如样品(人类细胞)或主体，其不含或实质上不含致病原诸如病原体。

“参考序列”是指用作序列比较基础的定义序列。参考序列可为指定序列的子集或全部；例如，全长cDNA、RNA或基因序列的片段，或完整的cDNA、RNA或基因序列。对于多肽，参考多肽序列的长度将通常为至少约16个氨基酸，优选地至少约20个氨基酸，更优选地至少约25个氨基酸，且甚至更优选地约35个氨基酸、约50个氨基酸或约100个氨基酸。对于核酸，参考核酸序列的长度将通常为至少约40个核苷酸，优选地至少约60个核苷酸，更优选地至少约75个核苷酸，且甚至更优选地约100个核苷酸或约300个核苷酸或任何整数左右或之间。

“敏感性”是指正确地识别为具有特定疾病或病症或病原体的主体的百分比。

“特异性”是指正确地识别为不具有特定疾病或病症或病原体的主体的百分比，即，正常或健康主体。

“特异性结合”是指识别和结合本发明的核苷酸序列但实质上不识别和结合例如生物样品的样品中的其他分子的多部分探针组，其天然地包含与所述发明无关的核苷酸序列。在一些实施方案中，5'磷酸化的供体探针和3'受体探针与靶标RNA特异性杂交或结合。在其他实施方案中，基因分型探针与具有特定单核苷酸多态性(SNP)的靶标核酸特异性结合，但不与具有替代SNP的核酸特异性结合。

“主体”是指任何应用本文所描述的方法的个体或患者。通常，主体是人类，尽管如本领域技术人员将理解的，主体可为动物(例如，宠物、农业动物、野生动物等)、疾病媒介(例如，蚊子、白蛉、蝽(triatomine bug)、黑蝇、蜱(tick)、舌蝇(tsetse fly)、螨、蜗牛、虱子等)或环境样品(例如污秽物、食品等)。因此，其他动物，包含哺乳动物，诸如啮齿动物(包含小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)、猫、狗、兔子，农场动物包含牛、马、山羊、绵羊、猪等，以及灵长类动物(包含猴子、黑猩猩、猩猩和大猩猩)是包含在主体的定义内。

可用于本发明的方法的核酸分子不需要100％相同于内源核酸序列，但通常将表现出实质同一性。与内源序列具有“实质同一性”的多核苷酸通常能够与靶标分子杂交。“杂交”是指互补多核苷酸序列或其部分之间在各种严格的条件下配对以形成双链分子。参见，例如，Wahl,G.M.和S.L.Berger(1987)Methods Enzymol.152:399；Kimmel,A.R.(1987)Methods Enzymol.152:507。

例如，严格的盐浓度通常小于约750mM NaCl和75mM柠檬酸三钠，优选地小于约500mM NaCl和50mM柠檬酸三钠，更优选地小于约250mM NaCl和25mM柠檬酸三钠。低严格性的杂交可于不存在有机溶剂例如甲酰胺的情况下所获得，而高严格性的杂交可于存在至少约35％甲酰胺，且更优选地至少约50％甲酰胺的情况下所获得。严格的温度条件通常将包含至少约30℃、更优选地至少约37℃且最优选地至少约42℃的温度。对本领域技术人员而言众所周知的是，改变附加参数，例如杂交时间、洗涤剂的浓度，例如，十二烷基硫酸钠(SDS)以及载体DNA的内含或排除。各种级别的严格性是通过根据需要将这些各种条件进行组合所实现的。

对于大多数应用而言，杂交后的洗涤步骤的严格性也将有所不同。洗涤严格性条件可通过盐浓度和温度来定义。如上所述，洗涤严格性可通过将盐浓度降低或通过将温度提高来增加。例如，洗涤步骤的严格盐浓度将优选地小于约30mM NaCl和3mM柠檬酸三钠，且最优选地小于约15mM NaCl和1.5mM柠檬酸三钠。洗涤步骤的严格温度条件通常包含至少约25℃，更优选至少约42℃，且有时高于50℃的温度。在优选的实施方案中，洗涤步骤将在25℃及30mM NaCl、3mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中发生。在一更优选的实施方案中，洗涤步骤将在42℃及15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中发生。在一更优选的实施方案中，洗涤步骤将在68℃及15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中发生。这些条件的附加变化对本领域技术人员来说将是显而易见的。杂交技术对本领域技术人员来说是众所周知的，且描述于例如Benton和Davis(Science 196:180,1977)；Grunstein和Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 72:3961,1975)；Ausubel等人(Current Protocols inMolecular Biology,Wiley Interscience,New York,2001)；Berger和Kimmel(Guide toMolecular Cloning Techniques,1987,Academic Press,New York)；和Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NewYork。

如本文所用的“测序”或任何语法均等物，可指用于对扩增的靶标核酸替代物(proxy)进行测序的方法。测序技术可包含，例如，下一代测序(NGS)、深度测序、基于质谱的序列或长度分析，或通过凝胶电泳或毛细管电泳的DNA片段序列或长度分析。可使用的相容测序技术，包含单分子实时测序(Pacific Biosciences)、离子半导体(Ion Torrent测序)、焦磷酸测序(454)、边合成边测序(Illumina)、边连接边测序(SOLiD测序)、链终止(Sanger测序)、纳米孔DNA测序(Oxford Nanosciences Technologies)、Helicos单分子测序(Helicos Inc.)、质谱测序、DNA纳米球测序、杂交测序和隧穿电流DNA测序。

“NGS”是指下一代测序。NGS平台执行大规模并行测序，在此期间，来自单样品的数百万个DNA的片段是一致测序的。大规模并行测序技术促进了高通量测序，以允许整个基因组在不到一天的时间内被测序。NGS平台的创建使更多实验室可进行测序，迅速将使用核酸测序进行的研究和临床诊断的数量增加。

“实质上相同”是指对参考氨基酸序列(例如，本文所描述的氨基酸序列的任一者)或核酸序列(例如，本文所描述的核酸序列的任一者)表现出至少50％同一性的多肽或核酸分子。优选地，此类序列在氨基酸水平或核酸与用于比较的序列至少相同60％、更优选地80％或85％、且更优选地90％、95％或甚至99％相同。

序列同一性通常是使用序列分析软件所测量的(例如，遗传学计算机组的序列分析软件包,University of Wisconsin Biotechnology Center,1710 University Avenue,Madison,Wis.53705,BLAST、BESTFIT、GAP或PILEUP/PRETTYBOX程序)。此类软件通过将同源性的程度分配给各种取代、缺失和/或其他修饰来匹配相同或相似的序列。保守的取代通常包含以下群组内的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。在一范例性方法中，为了将同一性的程度进行确定，可使用BLAST程序，其概率分数在e-3和e-100之间，指示密切地相关的序列。

“引物组”是指可被使用于，例如，聚合酶链式反应(PCR)中的寡核苷酸的组。引物组包含至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、30、40、50、60、80、100、200、250、300、400、500、600或更多引物。

本文所提供的范围应被理解为所述范围内所有值的简写。例如，1到50的范围被理解为包含由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50所组成的群组中的任何数字、数字的组合或子范围，以及上述整数之间的所有中间十进制值，例如，1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8和1.9。关于子范围，从所述范围的任一端点延伸的“嵌套子范围(nested sub-range)”是被具体考虑的。例如，1到50的范例性范围的嵌套子范围，可包含在一个方向中的1到10、1到20、1到30和1到40，或在另一个方向中的50到40、50到30、50到20和50到10。

如本文所用，术语“亚探针”可指两个或更多个探针中的任一者，其结合连续靶标序列而不将任何未结合的插入核苷酸留下。在一些实施方案中，本文所描述的多部分探针可包含至少两个“子探针”。在另一实施方案中，多数的多部分探针的至少两个子探针各自的长度可为约10-50个核苷酸。一旦探针被连接，连接的多部分探针(或者，“连接的亚探针”)可从RNA中被释放。在一些实施方案中，子探针可包含附加的引物结合位点(例如，连接物)以促进靶标核酸替代物的后续扩增。在其他实施方案中，两个或更多个子探针中的至少一个子探针可被称为“受体子探针”，其具有至少两个RNA碱基的3'-末端。

如本文所用，“附加的引物结合”位点可指本文所描述的多部分探针或亚探针内促进靶标核酸替代物扩增的结合位点。“附加的引物结合位点”也可被称为“连接物(adapter)”。

如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”等，是指将与其相关的失调(disorder)和/或症状(symptoms)减少或改善。可以理解的是，尽管不排除，治疗失调或病症(condition)，是不要求把与之相关的失调、病情或症状完全消除的。

如本文所用，术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”、“预防(prevention)”、“预防性治疗(prophylactic treatment)”等，是指将主体中患上失调或病症的可能性降低，所述主体不具有、但有患上失调或病症的风险的。

除非特别说明或从上下文显而易见，如本文所用，术语“或”被理解为具有包容性(inclusive)。除非特别说明或从上下文显而易见，如本文所用，术语“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”应理解为单数或复数。

除非特别说明或从上下文显而易见，如本文所用，术语“约”被理解为在本领域的正常公差范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。约可被理解为在所说明的数值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。除非上下文另有明确说明，否则本文提供的所有数值皆是由术语约所修饰的。

II.LISH-Lock'n'Roll

样品中探针的杂交，随后原位连接(“LISH”)，将特定环化的探针组锁定在RNA靶标序列周围。滚环扩增(“LISH-Lock'n'Roll”)，随后将荧光标记的检测器探针杂交，能够以亚细胞精度同时进行RNA序列的原位定量和定位。此技术是其他原位RNA分析方法的一种具有时间和成本效益的替代方法。

在先前的工作中，发明人已经描述了T4 RNA连接酶2(Rnl2)的效用，当受体探针的两个3'碱基由核糖核苷酸组成时，酶以非常高的效率执行DNA探针的RNA模板化的连接^17,18。此连接化学能够在称为RNA介导的寡核苷酸退火、选择和测序连接(‘RASL-seq’)的高通量测定中对RNA进行多重的定量。本发明人还将此连接化学应用于在称为连接原位杂交测序(LISH-seq)的测定中分析福尔马林固定的组织样品中的RNA序列。在这里，发明人提出了LISH-Lock'n'Roll，这是一种新颖但相关的方法，用于在固定的生物样品中对RNA序列进行多重的定量和定位。靶标RNA序列的长度优选地大于40个核苷酸且可能与宿主或传染病特异性转录物相关。

LISH-Lock'n'Roll探针组的示意图是如图1所示。所述LISH-Lock'n'Roll探针组是由3'受体探针和5'供体探针(LnR探针组)所组成。受体探针组的3'末端是由在3'末端的两个核糖核酸碱基所组成，其通过T4 RNA连接酶、Rnl2来促进高效连接。5'供体探针在5'末端是被磷酸化的。探针组的靶向序列(targeting sequence)是被设计为在RNA靶标上彼此相邻退火。靶向序列可为约20个核苷酸，但也可实质上更长或更短。只有当LnR探针在靶标序列上彼此相邻退火时，它们才能通过Rnl2被连接在一起。连接探针退火至相邻序列的这一要求，提供了高水平的测定特异性。此外，受体和供体探针各自的特征在于一个或两个30-核苷酸的检测器序列和一17-核苷酸桥接序列(图1)。LISH-Lock'n'Roll工作流程是在图2中说明的。在步骤1和步骤2中，LnR受体和供体探针退火至靶标RNA序列，随后与Rnl2连接。然后冲洗掉多余的探针。在相邻的供体和受体探针连接后，两个半探针将呈现完整的34-核苷酸桥序列(17nt来自各个探针)，既而通过桥引物被杂交(步骤3)并通过T4 DNA连接酶被连接(步骤4)。在此阶段，探针组已在两端被连接，将一个圆圈完成，如此一来，由于双螺旋的扭曲，把其锁定在靶标mRNA周围的位置。然后把Phi29聚合酶添加到组织，使其能够进行原位滚环扩增(RCA)，因为它是通过使用于环化的退火的桥引物所引发的(步骤5)。RCA产物本质上是单链的DNA的“纳米球”，包含许多检测器序列的拷贝。由于周围组织的广泛交联，纳米球仍然被困在一位置，所述位置接近模板RNA分子的位置。在RCA完成后，荧光标记的寡核苷酸(检测器探针)是退火到互补的检测器序列，其中现在有许多空间定位的拷贝(步骤6)。所述组织现在已准备好待处理以用于进行成像。

探针组通常被设计为具有1至4个独特的检测器序列。图3说明了靶标多路复用，其是将不同检测器序列使用于靶向不同mRNA转录物的探针组的用途。图4说明了基于颜色条形码的多路复用，其中探针组具有两个或更多个不同的检测器序列，用于将两个或更多个不同颜色的检测器探针的同时结合。颜色条形码能够实现更高级别的组合多路复用，以及用于编码纠错颜色组合的机会。靶标多路复用与彩色条形码相结合，能够同时对许多不同的mRNA转录物进行空间定量。例如，LnR探针组的板，每个探针组具有两个不同的检测器序列和五个独特地颜色的检测器探针，可用于在成像的单循环期间同时测量超过15个靶标。额外的探针去除和检测器探针杂交，可成倍地放大可实现的多路复用水平。

为了确定LISH-Lock'n'Roll靶标多路复用的效率和特异性，本发明人设计了靶向GAPDH和β-肌动蛋白的探针组，以用于作为模型组织的固定的HeLa细胞(图5)。探针组各自可被两个光谱不同的荧光团标记的检测器探针，检测器-1(GAPDH，Alexa-488标记的寡核苷酸)和检测器-2(β-肌动蛋白，Alexa-647标记的寡核苷酸)，的仅一个所结合(图5A)。放大的图像(主图像中的白色框)显示了叠加时的单个检测器探针，显示单个检测器探针没有空间重叠。当使用特定于单个靶向序列特异的引物通过qPCR测量产物时，锁定的环的Phi29依赖性扩增比未扩增的样品高>1,000倍(图5B)。每个细胞的平均光斑和平均光斑直径是使用imageJ软件计算的(图5C)。β-肌动蛋白有150+/-50个光斑/细胞，GAPDH有270+/-70个光斑/细胞，两个探针组直径中产生50-500nM的光斑大小。当Phi29被省略时，没有光斑被检测到(图6)，这表明LISH-Lock'n'Roll方法可实现的特异性的高程度。为了确定LISH-Lock'n'Roll颜色多路复用的效率和特异性，本发明人设计了具有两个不同的检测器序列的靶向β-肌动蛋白的单探针组，它们也在固定的HeLa细胞中被测试(图7A)。产生于单探针组的RCA产物是等效地通过两个光谱不同的荧光团标记的检测器探针，检测器-1(Alexa-488标记)和检测器-2(Alexa-647标记)，所结合。正如预期的，放大的图像(主图像中的白色框)显示两个探测器探针的完全重叠。在此实验中，当使用特定于单个靶向序列的引物通过qPCR测量产物时，锁定的环的Phi29依赖性扩增比未扩增的样品高>600倍(图7B)。例如，LnR探针组的板，每个探针组具有四个不同的检测器序列(每个探针两个)和五个独特地颜色的检测器探针，可用于在成像的单循环期间同时测量30个靶标。额外的探针去除和检测器探针杂交，可成倍地放大可实现的多路复用水平。

III.LISHLock'n'Roll实施方案

应当理解，实施方案记载的RNA的检测适用于DNA的检测，就像那些实施方案是为DNA的检测而编写的。因此，在一方面，本发明提供用于检测核糖核酸的组合物和方法。在另一方面，本发明可被用于检测脱氧核糖核酸。

在一个实施方案中，一种用于检测固定化靶标的方法，包含以下步骤：(a)将反应混合物中包含所述靶标核酸的生物样品与至少一个探针组接触，所述探针组包含(i)第一多部分探针，其包含5'磷酸化的供体探针和第一桥探针，其中，所述5'磷酸化的供体探针与所述靶标核酸特异性杂交；和(ii)第二多部分探针，其包含3'受体探针和第二桥探针，其中，所述3'受体探针与邻近所述5'供体探针的所述靶标核酸特异性杂交，且所述第二桥探针经5’磷酸化；(b)在允许所述至少一个探针组与所述生物样品中存在的所述靶标核酸的杂交的条件下，培育步骤(a)的所述反应混合物；(c)洗去未结合的探针组；(d)将所述5'磷酸化的供体探针和所述3'受体探针进行连接；(e)将所述反应混合物与至少一个桥引物接触，所述桥引物与所述第一桥探针和所述第二桥探针特异性杂交，其中，所述第一桥探针和所述第二桥探针退火到彼此相邻的所述桥引物；(f)将所述第一桥探针和所述第二桥探针进行连接，从而形成杂交到所述靶标核酸的环化探针；(g)将所述环化探针通过滚环扩增进行放大；以及(h)将所述靶标核酸进行检测。

在另一个实施方案中，接触步骤(e)是在连接步骤(d)之前进行的。因此，用于检测固定化靶标核酸的方法可包含以下步骤：(a)将反应混合物中包含所述靶标核酸的生物样品与至少一个探针组接触，所述探针组包含(i)第一多部分探针，其包含5'磷酸化的供体探针和第一桥探针，其中，所述5'磷酸化的供体探针与所述靶标核酸特异性杂交；和(ii)第二多部分探针，其包含3'受体探针和第二桥探针，其中，所述3'受体探针与邻近所述5'供体探针的所述靶标核酸特异性杂交，且所述第二桥探针经5’磷酸化；(b)在允许所述至少一个探针组与所述生物样品中存在的所述靶标核酸的杂交的条件下，培育步骤(a)的所述反应混合物；(c)洗去未结合的探针组；(d)将所述反应混合物与至少一个桥引物接触，所述桥引物与所述第一桥探针和所述第二桥探针特异性杂交，其中，所述第一桥探针和所述第二桥探针退火到彼此相邻的所述桥引物；(e)将所述5'磷酸化的供体探针和所述3'受体探针进行连接；(f)将所述第一桥探针和所述第二桥探针进行连接，从而形成杂交到所述靶标核酸的环化探针；(g)将所述环化探针通过滚环扩增进行放大；以及(h)将所述靶标核酸进行检测。在进一步的实施方案中，连接步骤(在紧接前一实施方案中的步骤(e)和(f))是用相同或不同的连接酶同时进行的。接触步骤(d)也可在洗涤步骤(c)之前进行。

在一替代实施方案中，桥引物的接触步骤以及第一桥探针和第二桥探针的连接步骤在5'磷酸化探针和3'受体探针的连接步骤之前进行。因此，所述方法可包含(a)将反应混合物中包含所述靶标核酸的生物样品与至少一个探针组接触，所述探针组包含(i)第一多部分探针，其包含5'磷酸化的供体探针和第一桥探针，其中，所述5'磷酸化的供体探针与所述靶标核酸特异性杂交；和(ii)第二多部分探针，其包含3'受体探针和第二桥探针，其中，所述3'受体探针与邻近所述5'供体探针的所述靶标核酸特异性杂交，且所述第二桥探针经5’磷酸化；(b)在允许所述至少一个探针组与所述生物样品中存在的所述靶标核酸的杂交的条件下，培育步骤(a)的所述反应混合物；(c)洗去未结合的探针组；(d)将所述反应混合物与至少一个桥引物接触，所述桥引物与所述第一桥探针和所述第二桥探针特异性杂交，其中，所述第一桥探针和所述第二桥探针退火到彼此相邻的所述桥引物；(e)将所述第一桥探针和所述第二桥探针进行连接，从而形成杂交到所述靶标核酸的环化探针；(f)将所述5'磷酸化的供体探针和所述3'受体探针进行连接；(g)将所述环化探针通过滚环扩增进行放大；以及(h)将所述靶标核酸进行检测。

本发明可被使用于检测多个靶标核酸。探针组各自靶向特定且不同的核酸(5'磷酸化的供体探针和3'受体探针特异性杂交(彼此相邻)特定靶标核酸。在这类多重实施方案中，至少一个探针组是被配置以用于1至30,000个不同的靶标核酸的多重检测。在其他实施方案中，至少一个探针组包含组合的1至20,000、10至10,000、20至5000或50至1000个探针组的范围。在特定实施方案中，至少一个探针组是被配置为检测SNP、突变、新颖剪接异构体、融合体等的存在与不存在。

在其他实施方案中，多于一个探针组可被设计为结合相同核酸的不同位置/区域。通过对生物样品添加不可连接的探针序列，可把每个靶标核酸形成的滚环扩增(RCA)产物的数量减少。在扩增期间，所形成的RCA产物的大小可通过掺入双脱氧核苷酸或其他链终止子来减少。

在某些实施方案中，多部分探针的大小范围为30至1000个核苷酸。在其他实施方案中，本发明的多部分探针的大小范围可为约30至约1000个核苷酸、约25至约9000个核苷酸、约30至约8000个核苷酸、约25至约5000个核苷酸、约40至约2000个核苷酸、约50至约1000或约30至约200个核苷酸。

靶标RNA可为病毒RNA、细菌RNA、真菌RNA、线虫RNA、人类RNA、非人类哺乳动物RNA、非哺乳类动物RNA或其组合。

在特定实施方案中，本发明是被使用于检测固定化靶标RNA。在一具体实施方案中，RNA是固定化以作为包含靶标RNA的固定的生物样品的一部分。固定的生物样品可包含固定的组织、冷冻固定的组织、福尔马林固定的石蜡包埋的组织、贴壁固定的细胞、悬浮固定的细胞或固定的细胞。

在本发明的一些方法中，固定的生物样品包含细胞且样品中滚环扩增产物的位置是被使用于推断一细胞或复数细胞的类型或表现型。在本发明的一些方法中，固定的生物样品是被加工成具有1至1000、10至900、20至800、30至500或40至200微米的厚度的切片的组织。

在特定实施方案中，RCA产物可通过将RCA产物与生物样品交联而被固定化在样品中。交联可通过将试剂应用于RCA产物来发生，其中所述试剂是多聚甲醛、甲醛、福尔马林、戊二醛、四氧化锇、重铬酸钾、铬酸和高锰酸钾以及Hepes-谷氨酸缓冲液-介导的有机溶剂固定剂或其组合。

本发明中所使用的桥引物可包含反应部分且RCA产物可通过桥引物上的反应部分被固定化在样品内。

在替代实施方案中，在洗涤步骤(c)之前，所述靶标RNA是通过捕获固定化的。标记的靶标RNA捕获性探针可被使用于，包含但不限于，生物素、地高辛、亚磷酰胺、卤代烷或点击化学。捕获元件可包含抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、抗-地高辛抗体、点击化学、卤蛋白或其组合。固体支持物可用于捕获靶标RNA，且可包含可被使用于固定方法的磁性材料、聚苯乙烯、琼脂糖、二氧化硅、侧向流体试纸、微流体室或其组合。

在特定实施方案中，所述连接步骤是使用选自T4 RNA连接酶2(Rnl2)、小球藻病毒DNA连接酶(PBCV-1DNA连接酶)、T4 DNA连接酶、其衍生物及其组合所组成群组的连接酶所进行的。

在特定实施方案中，检测步骤(h)包含测序或杂交。

在某些实施方案中，检测步骤(h)包含对滚环扩增产物的测序。滚环扩增产物的所有或部分可被测序。在一具体实施方案中，探针组包含条形码，所述条形码对所述靶标RNA是独特的，且其中，所述条形码的测序检测所述靶标RNA。在更具体的实施方案中，测序包含边合成边测序或边连接边测序。在一甚至更具体的实施方案中，方法是在固定的样品上原位进行的。在一替代实施方案中，测序包含边合成边测序，且其中，所述合成的序列产生独特的彩色条形码，所述彩色条形码检测所述靶标RNA。

在其他实施方案中，检测步骤(h)包含通过所述供体探针和所述受体探针所形成的所述连接的序列进行测序。

在另一实施方案中，检测步骤(h)包含将所述反应混合物与可检测标记的检测器探针接触，所述检测器探针特异性杂交所述连接的序列，所述连接的序列通过所述供体探针和所述受体探针所形成。

在此类实施方案中，检测步骤(h)包含将所述反应混合物接触与与所述至少一个检测探针特异性杂交的至少一个检测器探针，并将所述至少一个可检测标记的检测器探针进行成像。在具体实施方案中，所述至少一个检测器探针是可检测标记的。在一具体实施方案中，所述方法进一步包含将所述样品中所述靶标RNA的位置进行识别的步骤。在另一个实施方案中，所述方法进一步包含将所述样品中所述靶标RNA进行定量的步骤。

本发明中所使用的检测器探针的实施例，包含结合到检测元件的10至100个核苷酸范围内的荧光地标记的核酸序列。检测器探针是用荧光探针，诸如荧光团、荧光蛋白、量子点、生物素、地高辛、重金属质量标签、表面增强的拉曼散射标签或过氧化物酶，来荧光地标记的。

在进一步的实施方案中，检测探针的多轮杂交和剥离是可以被进行的。在一个具体实施方案中，检测探针杂交到探针组中存在的检测序列。在另一个具体实施方案中，检测探针杂交到探针组中存在的条形码。在一非限制性实施方案中，RCA产物是被制备在，例如，1000个靶标上，制造在组织中DNA的纳米球。用荧光探针进行十轮杂交。探针被剥离，并重复所述方法，直到所有靶标被检测到。如果探针组包含多个检测探针，则荧光检测器探针的不同组合可被使用来识别不同的靶标核酸。在特定实施方案中，扩增步骤(g)是使用链置换DNA聚合酶所进行的。在具体实施方案中，链置换DNA聚合酶包含Phi29聚合酶或Bst聚合酶。

IV.LISH Lock'n'Roll试剂盒

本文所描述的任何组合物都可被包含在试剂盒中。在一非限制性实施例中，一个或多个本发明的多部分探针包含3'受体和5'供体探针、一个或多个桥引物、一个或多个DNA聚合酶、一个或多个连接酶和一个或多个检测器探针。

在一个实施方案中，试剂盒包含探针组，所述探针组包含(i)包含5'磷酸化的供体探针和第一桥探针的第一多部分探针，其中5'磷酸化的供体探针与靶标核酸特异性杂交；和(ii)第二多部分探针，其包含3'受体探针和第二桥探针，其中，所述3'受体探针与邻近所述5'供体探针的所述靶标核酸特异性杂交，且所述第二桥探针经5’磷酸化。应当理解，所述试剂盒可包含靶向不同RNA的多个探针组。在其它实施方案中，多于一个探针组可结合到相同靶标的不同位置/区域。

在其他实施方案中，所述第一多部分探针和所述第二多部分探针各自进一步包含至少一个检测探针。在一具体实施方案中，所述第一多部分探针和所述第二多部分探针各自包含两个检测探针。在更具体的实施方案中，所述第一多部分探针和所述第二多部分探针各自包含在所述两个检测探针之间的间隔序列。

在其他实施方案中，所述试剂盒进一步包含至少一个检测器探针，所述至少一个检测器探针与所述至少一个检测探针特异性杂交。在具体实施方案中，所述至少一个检测器探针是可检测标记的。

所述试剂盒可进一步包含连接酶，用于将所述第一桥探针和所述第二桥探针进行连接，以形成杂交到所述靶标核酸的环化探针。

在其他实施方案中，所述试剂盒进一步包含链置换DNA聚合酶，用于将环化探针通过滚环扩增进行放大，所述环化探针是通过将所述第一桥探针和所述第二桥探针进行连接并杂交到所述靶标核酸所形成的。所述链置换DNA聚合酶包含Phi29聚合酶或Bst聚合酶。

所述试剂盒可包含本文所包含的任何组合物的适当大小的等分试样，并在一些情况下，还可包含一种或多种额外的试剂，诸如缓冲液。试剂盒的组分可被包装在水性介质中或冻干形式中。

所述试剂盒的容器装置通常包含至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器装置，其中，组分可被放置，且优选地，适当地等分。在所述试剂盒中存在多于一种组分的情况下，所述试剂盒通常也将包含第二、第三或其他额外的容器，额外的组分可被分开放置于其中。然而，组分的各种组合可被包含在小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括用于包含本文所描述的任何组合物的装置和用于商业销售的任何其他试剂容器。此类容器可包含注射或吹塑的(blow-molded)塑料容器，所需的小瓶被保留在其中。

当试剂盒的组分是以一种和/或多种液体溶液被提供时，所述液体溶液是水溶液，特别优选的为无菌水溶液。然而，所述试剂盒的组分可作为干粉被提供。当试剂和/或组分是以干粉形式所提供时，所述粉末可通过合适溶剂的添加来重构。可设想的是，所述溶剂也可在所述试剂盒内的另一个容器装置中被提供。

无需进一步阐述，据信，本领域技术人员使用前面的描述，可最大限度地利用本发明。以下实施例仅是说明性的，且不以任何方式限制本揭露的其余部分。

实施例

提出以下实施例是为了向本领域普通技术人员提供关于本文所描述和所请求保护的化合物、组合物、制品、装置和/或方法如何被制造和评估的完整公开和描述，且旨在纯粹说明，而不旨在限制发明人认为其发明的范围。已努力确保数字(例如，数量、温度等)的准确性，但本文应考虑一些错误和偏差。除非另有说明，否则份数为以重量计份数，温度为摄氏度或在环境温度，且压力为在大气压或接近大气压。此处有反应条件的多种变化和组合，例如，组分浓度、所需溶剂、溶剂混合物、温度、压力和其他反应范围和条件，可被使用于优化从所描述的方法所获得的产物纯度和产率。仅将需要合理和常规的实验来优化此类方法条件。

实施例1：LISH-Lock'n'Roll探针设计。LISH-LLock'n'Roll探针是被设计为包含以下序列。分别地，第一桥探针包含5'-AGATCGGAAGAGCACAC-3'(SEQ ID NO：1)且第二桥探针包含5'-/5PHOS/-GGAGCTGTCGTTCACTC-3'(SEQ ID NO：2)。第一、第二、第三和第四检测器序列分别是5'-CAAGTATGCAGCGCGATTGACCGTCTCGTT-3'(SEQ ID NO：3)、5'-CGCAACGCTTGGGACGGTTCCAATCGGATC-3'(SEQ ID NO：4)、5'-ACAAATCCGACCAGATCGGACGATCATGGG-3'(SEQ ID NO：5)和5'-CAAGTATGCAGCGCGATTGACCGTCTCGTT-3'(SEQ ID NO：6)。GAPDH靶标特异性受体和供体序列分别是5'-TTGAGCACAGGGTACTTTrArT-3'(SEQ ID NO：7)(核苷酸19和20之前的‘r'表示核糖核苷酸)和5'-/5Phos/-tgatggtacatgacaaggtg-3'(SEQ ID NO：8)，以及β-肌动蛋白靶标特异性受体和供体序列是5'-AAGGTGTGCACTTTTATTrCrA-3'(SEQ ID NO：9)(在核苷酸19和20之前的‘r'表示核糖核苷酸)和5'-/5Phos/-ACTGGTCTCAAGTCAGTGTA-3'(SEQ ID NO：10)。从LISH-Lock'n'Roll探针对分离的桥寡核苷酸，具有以下序列，5'-AGTGAACGACAGCTCCGTGTGCTCTTCCGA*T*C-3'(SEQ ID NO：11)，星号表示含有硫代磷酸酯键取代的核苷酸，其导致它们不容易通过核酸酶降解。互补到检测器序列1的检测器探针1是使用5'-ATTO-647荧光标签所合成的。互补到检测器序列4的检测器探针4是使用5'-Alexa-488荧光标签所合成的。通常来说，靶标特异性序列可使用参考文献中公开的指南来设计。^17-18所有探针和寡核苷酸都是由Integrated DNA Technologies(Coralville，IA 52241，USA)所合成的。探针对是以等摩尔量混合以创建简化的多重面板(multiplex panel)，其被等分并储存在-80℃，然后稀释至每个探针1uM的储备浓度(10×最终工作浓度)以用于LISH-Lock'n'Roll测定。

实施例2：LISH-Lock'n'Roll。样品由在18mm#1圆形聚赖氨酸涂布的盖玻片(ThermoFisher,Waltham,MA 02451,USA)上生长至～80％融合的贴壁细胞所组成。用1％多聚甲醛(ThermoFisher)固定样品15分钟，然后用1X-PBS洗涤3次。样品在1X-PBS、0.1％Triton X-100中渗透20分钟。接下来，用0.1N HCl处理样品10分钟，然后在1X-PBS中洗涤3次。样品与在杂交缓冲液(6X-SSC，10％甲酰胺)中稀释至100nM的100uL的LISH-Lock'n'Roll探针组面板一起培育，并在45℃培育2小时。在室温杂交缓冲液中把样品洗涤3次，随后用T4 RNA连接酶反应缓冲液(50mM Tris-HCl、10mM MgCl₂、5mM DTT、1mM ATP、pH 7.6@25℃)进行单缓冲液交换洗涤。在37℃200uL中，使用在T4 RNA连接酶反应缓冲液中稀释至0.375U/uL的T4 RNA连接酶(Qiagen,Hilden,Germany)，把样品培育2小时。在室温杂交缓冲液中把样品洗涤3次(3X)，随后在37℃使用桥寡核苷酸在1X-PBS中稀释至200nM培育1小时。在室温1X-PBS中把样品洗涤3次，随后使用室温T4 DNA连接酶反应缓冲液(50mM Tris-HCl、10mM MgCl₂、10mM DTT、1mM ATP、pH 7.6@25℃)进行单缓冲液交换洗涤。在37℃200uL中，使用在T4 DNA连接反应缓冲液中稀释至50U/uL的T4 DNA酶(New England Biolabs,Ipswich,MA 01938,USA)，把样品培育1小时。在1X-PBS中把样品洗涤，随后在4℃Phi29反应缓冲液(50mM Tris-HCl、10mM(NH₄)₂SO₄、4mM二硫苏糖醇、10mM MgCl₂、pH 7.5@25℃)中单缓冲液交换。然后，在30℃200uL中，使用在补充有dNTP(最终浓度0.8mM总核苷酸)的Phi29反应缓冲液中稀释至1U/uL的Phi29聚合酶(Lucigen Corporation，Middleton，WI 53562，USA)，把样品培育2小时。在2X-SSC中把样品洗涤3次，并在200uL中使用在6X-SSC中稀释至500nM的检测器探针，于黑暗中在室温培育30分钟。在6X-SSC中把样品洗涤3次，并使用含有DAPI的ProLong Gold抗萤光淬灭试剂(antifade reagent)(ThermoFisher)固定在标准显微镜载玻片上。最后，在带有Airyscan(Oberkochen,Germany)的蔡司LSM 880上对样品进行成像，并使用ImageJ(National Institutes of Health,USA)对图像进行后处理。

实施例3：LISH-Lock'n'Roll指导癌症治疗并建立预测

转移性黑色素瘤患者接受外科手术切除肿瘤，以研究癌细胞附近免疫微环境的组成。通过在福尔马林中固定和在石蜡中嵌入保存所切除的组织；把组织块的薄切片切割并镶于显微镜载玻片上。LISH-Lock'n'Roll面板被设计为用于检测和区分约100种不同的RNA分子，其中许多已知为与对免疫疗法的反应有关，其中许多是特定于某些细胞群，且其中许多是用于数据归一化的持家基因。在把LISH-Lock'n'Roll测定进行并把数据分析之后，确定了在此类特定的黑色素瘤微环境中，高水平的浸润性CD8+T细胞位于肿瘤细胞附近，且肿瘤细胞本身表达高水平的免疫抑制分子程序性死亡配体1(PD-L1)。患者被告知，他们对PD-L1(或PD-1)检查点抑制剂治疗，诸如阿特珠单抗(atezolizumab)、纳武利尤单抗(nivolumab)等，具有高度可能性的反应，且经此方案给药的患者具有利结局。

实施例4：LISH-Lock'n'Roll作为包涵体肌炎(IBM)的诊断测试。IBM是一种慢性、衰弱、进行性的炎症性肌病，其对于诊断可具有挑战性。RNA错误处理的作用，因其在疾病病理学中的作用而日益得到认可。在所述领域中所期望的是，尤其是mRNA错误剪接将在疾病诊断中得到越来越多地应用。剪接因子TAR DNA结合蛋白43(TDP43)的核排除及其抑制的隐性外显子的表达正在成为IBM的标志。疑似患有IBM的患者通常会接受肌肉活检，作为其诊断性检查的一部分。类似于实施例1，组织被保存并切片，以用于病理学检查。含有LISH-Lock'n'Roll探针的TDP-43隐性外显子检测面板，是用于搜索似乎已经失去拼接隐秘外显子能力的细胞。所预期的是，把包含mRNA在内的隐性外显子输出到胞质溶胶中，可能先于TDP-43的核外积累，从而可作为更敏感的诊断测试以用于IBM。如果把对应于所输出的含有隐性外显子的mRNA(因相关于此类探针的颜色条形码设计)的含有LISH-Lock'n'Roll产物的细胞识别出来，则可放心地进行IBM的诊断。

实施例5：把LISH-Lock'n'Roll使用在执行用于生物医学研究应用的基因筛查。在基于LISH-Lock'n'Roll的分析中的多种方式，在生物医学研究的背景中是有用的。一个说明性实施例是使用“条形码”序列对遗传构建体的组合追踪的用途，其可使用LISH-Lock'n'Roll探针组而被破译。考虑到已经使用编码大量的CRISPR-Cas9引导RNA(gRNA)序列的慢病毒文库把细胞转化。还有，从相同载体所表达的是RNA分子，所述RNA分子包含单独或组合的一个或更多个序列，所述序列是与gRNA序列各自唯一相关。活细胞成像是使用于，在基线和存在于不同剂量不同候选化学疗法的情况下，观察细胞各自的迁移模式。观察期结束后，把细胞固定到位并进行LISH-Lock'n'Roll测定，以把光斑的图案使用于识别LISH-Lock'n'Roll条形码和细胞各自所表达的gRNA。因此，此信息被使用于，把gRNA靶向基因的功能与其在基线和候选化学疗法存在时对细胞行为的影响联系起来。例如，此类领悟可被使用于建立组合癌症疗法。

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序列表

<110> 约翰·霍普金斯大学

<120> 使用探针对连接的原位RNA分析

<130> P16123-02

<150> 62/956,691

<151> 2020-01-03

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 3' 受体探针

<400> 1

agatcggaag agcacac 17

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 5' 磷酸化的供体探针

<400> 2

ggagctgtcg ttcactc 17

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 第一检测探针

<400> 3

caagtatgca gcgcgattga ccgtctcgtt 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 第二检测探针

<400> 4

cgcaacgctt gggacggttc caatcggatc 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 第三检测探针

<400> 5

acaaatccga ccagatcgga cgatcatggg 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 第四检测探针

<400> 6

caagtatgca gcgcgattga ccgtctcgtt 30

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 与 GAPDH 靶标特异性杂交的 3' 受体探针

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(20)

<223> 3' 末端核糖核苷酸

<400> 7

ttgagcacag ggtactttat 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 与 GAPDH 靶标特异性杂交的 5' 磷酸化的供体探针

<400> 8

actggtctca agtcagtgta 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 与 β-肌动蛋白靶标特异性杂交的 3' 受体探针

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(20)

<223> 3' 末端核糖核苷酸

<400> 9

aaggtgtgca cttttattca 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 与β-肌动蛋白靶标特异性杂交的 5' 磷酸化的探针

<400> 10

actggtctca agtcagtgta 20

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 桥式寡核苷酸引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(20)

<223> 含有硫代磷酸酯键取代的核苷酸，

使其等不易通过核酸酶降解

<400> 11

agtgaacgac agctccgtgt gctcttccga tc 32

Claims

1.一种检测固定化靶标核糖核酸(RNA)的方法，包含以下步骤：

a.将反应混合物中包含所述靶标RNA的生物样品与至少一个探针组接触，所述探针组包含(i)第一多部分探针，其包含5'磷酸化的供体探针和第一桥探针，其中，所述5'磷酸化的供体探针与所述靶标RNA特异性杂交；和(ii)第二多部分探针，其包含3'受体探针和第二桥探针，其中，所述3'受体探针与邻近所述5'供体探针的所述靶标RNA特异性杂交，且所述第二桥探针经5'磷酸化；

b.在允许所述至少一个探针组与所述生物样品中存在的所述靶标RNA的杂交的条件下，培育步骤(a)的所述反应混合物；

c.洗去未结合的探针组；

d.将所述5'磷酸化的供体探针和所述3'受体探针进行连接；

e.将所述反应混合物与至少一个桥引物接触，所述桥引物与所述第一桥探针和所述第二桥探针特异性杂交，其中，所述第一桥探针和所述第二桥探针退火到彼此相邻的所述桥引物；

f.连接所述第一桥探针和所述第二桥探针，从而形成与所述靶标RNA杂交的环化探针；

g.通过滚环扩增放大所述环化探针；以及

h.检测所述靶标RNA。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述生物样品是固定的。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述固定的生物样品包含固定的组织、冷冻固定的组织、福尔马林固定的石蜡包埋的组织、贴壁固定的细胞、悬浮固定的细胞或固定的细胞。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(c)之前，所述靶标RNA通过捕获固定化的。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述3'受体探针包含至少一个3'末端核糖核苷酸。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(e)在步骤(d)之前进行。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，连接步骤(d)和步骤(f)同时进行。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(e)和步骤(f)在步骤(d)之前进行。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，使用选自T4 RNA连接酶2(Rnl2)、小球藻病毒DNA连接酶(PBCV-1DNA连接酶)、T4 DNA连接酶、其衍生物及其组合所组成群组的连接酶进行连接步骤(d)。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，检测步骤(h)包含对滚环扩增产物的测序。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述探针组包含对所述靶标RNA独特的条形码，且其中，所述条形码的测序检测所述靶标RNA。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述测序包含边合成边测序或边连接边测序。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述方法在固定的样品上原位进行。

14.根据权利要求10所述的方法，其中，所述测序包含边合成边测序，以及其中，所述合成的序列产生独特的彩色条形码，且所述彩色条形码检测所述靶标RNA。

15.根据权利要求1所述的方法，其中，检测步骤(h)包含通过所述供体探针和所述受体探针所形成的连接的序列进行测序。

16.根据权利要求1所述的方法，其中，检测步骤(h)包含将所述反应混合物接触可检测标记的检测器探针，所述检测器探针特异性杂交由所述供体探针和所述受体探针所形成的连接的序列。

17.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一多部分探针和所述第二多部分探针各自进一步包含至少一个检测探针。

18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述第一多部分探针和所述第二多部分探针各自包含两个检测探针。

19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述第一多部分探针和所述第二多部分探针各自包含在所述两个检测探针之间的间隔序列。

20.根据权利要求17所述的方法，其中，检测步骤(h)包含将所述反应混合物接触与所述至少一个检测探针特异性杂交的至少一个可检测标记的检测器探针，并将所述至少一个可检测标记的检测器探针进行成像。

21.根据权利要求20所述的方法，进一步包含识别所述样品中所述靶标RNA的位置的步骤。

22.根据权利要求20所述的方法，进一步包含定量所述样品中所述靶标RNA的步骤。

23.根据权利要求1所述的方法，其中，使用链置换DNA聚合酶来行步骤(g)。

24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述链置换DNA聚合酶包含Phi29聚合酶或Bst聚合酶。

25.根据权利要求1所述的方法，其中，所述靶标RNA是病毒RNA、细菌RNA、真菌RNA、线虫RNA、人类RNA、非人类哺乳动物RNA、非哺乳类动物RNA或其组合。

26.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多部分探针的尺寸范围为30至1000个核苷酸。

27.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一个探针组配置为用于1至30,000个不同的靶标RNA的多重检测。

28.一种试剂盒，包含：探针组，其包含(i)第一多部分探针，其包含5'磷酸化的供体探针和第一桥探针，其中，所述5'磷酸化的供体探针与靶标RNA特异性杂交；和(ii)第二多部分探针，其包含3'受体探针和第二桥探针，其中，所述3'受体探针与邻近所述5'供体探针的所述靶标RNA特异性杂交，且所述第二桥探针经5’磷酸化。

29.根据权利要求28所述的试剂盒，进一步包含与所述第一桥探针和所述第二桥探针特异性杂交的桥引物，其中，所述第一桥探针和所述第二桥探针退火到彼此相邻的所述桥引物。

30.根据权利要求28所述的试剂盒，其中，所述第一多部分探针和所述第二多部分探针各自进一步包含至少一个检测探针。

31.根据权利要求30所述的探针组，其中，所述第一多部分探针和所述第二多部分探针各自包含两个检测探针。

32.根据权利要求31所述的探针组，其中，所述第一多部分探针和所述第二多部分探针各自包含在所述两个检测探针之间的间隔序列。

33.根据权利要求28所述的试剂盒，进一步包含至少一个检测器探针，所述至少一个检测器探针与所述至少一个检测探针特异性杂交。

34.根据权利要求33所述的试剂盒，其中，所述至少一个检测器探针是可检测标记的。

35.根据权利要求28所述的试剂盒，其中，所述3'受体探针包含至少一个3'末端核糖核苷酸。

36.根据权利要求28所述的试剂盒，进一步包含连接所述5'磷酸化的供体探针和所述3'受体探针的连接酶。

37.根据权利要求36所述的试剂盒，其中，所述连接酶包含T4 RNA连接酶2(Rnl2)、小球藻病毒DNA连接酶(PBCV-1DNA连接酶)、T4 DNA连接酶及其衍生物。

38.根据权利要求28所述的试剂盒，进一步包含连接所述第一桥探针和所述第二桥探针的连接酶，以形成与所述靶标RNA杂交的环化探针。

39.根据权利要求24所述的试剂盒，进一步包含通过滚环扩增放大环化探针的链置换DNA聚合酶，所述环化探针通过连接所述第一桥探针和所述第二桥探针进行并与所述靶标RNA杂交所形成。

40.根据权利要求39所述的试剂盒，其中，所述链置换DNA聚合酶包含Phi29聚合酶或Bst聚合酶。

41.根据权利要求28所述的试剂盒，其中，所述多部分探针的尺寸范围为30至1000个核苷酸。