CN116829735A

CN116829735A - 检测靶核酸序列的方法

Info

Publication number: CN116829735A
Application number: CN202180092675.1A
Authority: CN
Inventors: U·兰德格伦; 陈磊
Original assignee: Rare Bioscience Co
Current assignee: Rare Bioscience Co
Priority date: 2020-12-03
Filing date: 2021-12-02
Publication date: 2023-09-29
Also published as: US20240002917A1; EP4256081A1; WO2022117769A1; GB202019074D0

Abstract

本公开和发明涉及一种用于在生成第二代RCA产物的2阶段RCA反应(所谓的超级RCA(sRCA)，在本文也称为“SafeLock”)中使用挂锁探针和滚环扩增(RCA)检测靶分子中的靶核酸序列的方法，通过所述方法可以检测靶核酸序列，并与其他核酸序列区分开来。所述方法依赖于间隙‑填充‑连接挂锁探针技术，并且可以用于检测样品中可能出现的变异序列。还提供了用于所述方法的试剂盒。

Description

检测靶核酸序列的方法

技术领域

本公开和发明涉及核酸检测领域。特别地，本公开和发明涉及一种用于在生成第二代RCA产物的2阶段RCA反应(所谓的超级RCA(sRCA)，在本文中也称为“SafeLock”)中使用挂锁探针和滚环扩增(RCA)检测靶分子中靶核酸序列的方法，可以通过该方法检测靶核酸序列并与其他核酸序列区分开来。该方法依赖于间隙-填充-连接挂锁探针技术，并且可以用于检测样品中可能出现的变异序列。还提供了用于该方法的试剂盒。

背景技术

靶核酸序列的检测应用于包括以下的许多不同领域：特别是在临床上用于个性化医疗，和疾病(诸如癌症、传染病和遗传性或基因病症)的诊断、预后和/或治疗，以及研究和生物安全性。

使用标记的杂交探针可以容易地检测靶核酸序列，但是简单杂交探针具有相对高的检测下限，并且不能容易地用于区分相似的核酸序列。为了增加灵敏度，通常可以扩增含有靶序列的靶核酸分子以增加可用于检测的靶序列的量。本领域已知的多种技术中的任一种均可以用于扩增，包括RCA。

RCA利用链置换聚合酶，并且需要环状扩增模板。环状模板的扩增提供了串联的RCA产物，其包含与扩增模板的序列互补的序列的多个拷贝。此类串联体通常形成可以容易地被观察和检测的球或“团状物”，并且因此基于RCA的测定已被用于检测核酸，并且实际上更普遍地用作检测任何靶分析物的报告系统。本身可以被直接环化的两种靶核酸或探针或更普遍的报告核酸可以为RCA提供模板核酸环。

核酸检测方法的特异性可以通过使用需要双重识别或靶核酸序列的两个结合位点的探针(诸如挂锁探针)来改善。挂锁探针是线性寡核苷酸，具有由中间的“骨架”区域连接的两个单独的靶互补结合区。当探针已与其靶核酸序列结合(杂交)时，探针的末端可以连接在一起以使探针环化。然后可以将环化的挂锁探针用作RCA反应的模板，并且可以检测RCA产物。这构成了当今使用的许多检测测定的基础。因此，挂锁探针提供了额外的特异性层，因为只有在连接位点正确碱基配对的探针才会被连接以生成将被检测的分子的模板。当挂锁探针以其靶结合位点彼此直接相邻的方式与靶核酸序列杂交时，挂锁探针的末端可以直接彼此连接。可替代地，挂锁探针的靶结合位点可以与靶核酸杂交，其间存在间隙，并且可以通过间隙区域中一个或多个间隙寡核苷酸的杂交，或通过探针的杂交3'末端的聚合酶催化延伸来填充间隙。以这种方式，挂锁探针的杂交末端可以间接彼此连接，因为它们各自与中间的“间隙序列”杂交。此类“间隙填充”挂锁探针，也称为分子倒置探针，描述于Hiatt等人，2013,Genome Res,23,843-854中，其中分子倒置探针用于靶向高精度检测低频率变异。

已经描述了基于RCA的测定，其依赖于初始RCA产物的二次扩增以增加检测到的产物的量，从而提供测定中信号的扩增。这些包括例如超支化RCA。最近已经开发了所谓的“超级RCA(sRCA)”反应，其包含2轮或更多轮RCA扩增，其中第二RCA反应的产物与第一反应的产物连接。此类sRCA方法描述于WO2014/0796209中。在该方法中，使能够提供引物或充当引物的探针与初始RCA产物杂交，并用于引发与“引物-探针”杂交的第二RCA模板环的扩增。第二RCA模板可以通过与“引物-探针”杂交的挂锁探针的环化生成。在WO 2015/071445中描述了可替代的sRCA方法，称为“挂锁sRCA”，其中挂锁探针用于直接与初始RCA产物结合。

在许多应用中，待检测的核酸序列以低水平出现，例如在血浆或其他临床样品中存在罕见突变或无细胞DNA(cfDNA)的情况下，或者在可得样品量有限的情况下。在此类情况下，需要非常灵敏的检测方法，并且特别是允许实现靶核酸的高度扩增的方法。虽然上述sRCA方法在某种程度上朝着提供改善的和灵敏的测定的方向发展，但仍然需要高度灵敏的核酸检测方法。本公开和发明旨在提供此类方法。

发明内容

在本方法中，靶特异性第一挂锁探针用于通过间隙-填充延伸反应生成靶序列的互补拷贝。然后通过RCA扩增含有互补拷贝的环化第一挂锁探针以生成含有靶序列的多个拷贝的第一RCA产物。然后用对靶序列具有特异性的进一步的第二挂锁探针探测所得的第一RCA产物。使环化的第二挂锁探针进行进一步的第二RCA反应，该反应用于生成第二RCA产物，检测该产物以检测靶序列。如上所述，使用与第一RCA产物结合的第二挂锁探针的2阶段RCA反应在本文中称为“SafeLock”测定，并且因此第二挂锁也可以称为“SafeLock挂锁”。

因此，本方法依赖于至少两轮RCA扩增来生成待检测的产物。这本身就增加了可检测产物的数量。然而，通过另外设计该方法使第二挂锁探针靶向第一RCA产物中的序列，该序列是环化的第一挂锁探针中“间隙-填充”序列的互补序列(即由间隙-填充延伸反应创建以填充第一挂锁探针的杂交末端之间的间隙的序列)，改善了该方法的特异性。第二挂锁探针专门设计用于识别靶序列，该靶序列的多个拷贝已在第一RCA产物中创建。此外，已经进行了改进，增加了可以为第一RCA反应生成的RCA模板的量。该改进增加了间隙-填充延伸反应的效率，并且允许生成更多正确连接的环化第一挂锁探针。在一个实施例中，该改进允许探针结合、间隙-填充和连接反应在一个步骤中组合，即所谓的“间隙-填充-连接”步骤，其中一起添加挂锁探针和用于间隙-填充延伸和连接反应的试剂。这允许间隙-填充-连接反应循环，从而增加产生的环化第一挂锁探针的量，并因此增加检测方法的效率和灵敏度。在另一个实施例中，探针-结合步骤与间隙-填充延伸和连接步骤分开。本方法还提供了一种筛选DNA样品中是否存在极大量不同的靶序列的有效手段。

因此，在第一和广泛的方面，本文提供了一种用于检测样品中靶核酸分子中的靶核酸序列的方法，所述方法包括：

(i)使靶核酸分子与第一挂锁探针接触，该第一挂锁探针包含位于或靠近其相应的5'和3'末端的靶结合区，该靶结合区能够与靶核酸分子中位于靶核酸序列侧翼的互补结合位点杂交，并允许探针的靶结合区与靶核酸分子杂交；和

(ii)任选地在5'和/或3'末端裂解任何未杂交的核苷酸后，使用聚合酶延伸挂锁探针的杂交的3'末端以创建靶核酸序列的互补拷贝，并使延伸的3'末端与杂交的5'末端连接以环化挂锁探针；

(iii)使用环化的挂锁探针作为第一RCA模板进行第一RCA反应以生成第一RCA产物(RCP)，该第一RCA产物包含靶核酸序列的拷贝的多个重复序列；

(iv)使第一RCP与包含对靶核酸序列具有特异性的靶结合区的第二挂锁探针接触并允许探针与多个重复序列中的靶序列杂交；

(v)连接杂交的第二挂锁探针以环化杂交的挂锁探针；

(vi)使用环化的第二挂锁探针作为第二RCA模板进行第二RCA反应以生成含有第二挂锁探针的多个重复序列互补拷贝的第二RCP；

(vii)检测第二RCP以检测第二挂锁探针，从而检测靶核酸序列。

特别地，在步骤(ii)和(v)中使用连接酶来连接和环化挂锁探针。

在一个更特别的实施例中，提供了一种用于检测样品中靶核酸分子中的靶核酸序列的方法，所述方法包括：

(i)使靶核酸分子与第一挂锁探针接触，该挂锁探针包含位于或靠近其相应的5'和3'末端的靶结合区，该靶结合区能够与靶核酸分子中位于靶核酸序列侧翼的互补结合位点杂交，并允许探针的靶结合区与靶核酸分子杂交，其中挂锁探针的3'靶结合区比5'靶结合区短至少6个碱基，并且使挂锁探针与dNTP、聚合酶和连接酶一起与靶核酸分子接触，并且其中dNTP以不超过10μM的浓度提供并且聚合酶以不超过0.025U/uL的浓度提供；

(ii)任选地在5'和/或3'末端裂解任何未杂交的核苷酸后，使用聚合酶延伸挂锁探针的杂交的3'末端以创建靶核酸序列的互补拷贝，并使用连接酶使延伸的3'末端与杂交的5'末端连接以环化挂锁探针；

(v)连接杂交的第二挂锁探针以环化杂交的挂锁探针；

在进一步的更特别的实施例中，提供了一种用于检测样品中靶核酸分子中的靶核酸序列的方法，所述方法包括：

(i)(a)使靶核酸分子与第一挂锁探针接触，该第一挂锁探针包含位于或靠近其相应的5'和3'末端的靶结合区，该靶结合区能够与靶核酸分子中位于靶核酸序列侧翼的互补结合位点杂交，并允许探针的靶结合区与靶核酸分子杂交；和

(b)在探针已与靶核酸分子杂交后，使杂交的挂锁探针/靶核酸反应混合物与聚合酶接触；

(iv)使第一RCP与包含对靶核酸序列具有特异性的靶结合区的第二挂锁探针接触，并允许探针与多个重复序列中的靶序列杂交；

(v)连接杂交的第二挂锁探针以环化杂交的挂锁探针；

在该方法中，通过在第一挂锁探针已杂交后才提供聚合酶，探针-结合步骤与间隙-填充延伸步骤分开，因此，该方法提供了用于探针结合和间隙填充延伸的2步方案。在此类方法中，用于延伸反应的dNTP可以在聚合酶之前、与聚合酶一起或在聚合酶之后提供。用于连接反应的连接酶可以在聚合酶之前、与聚合酶一起或在聚合酶之后提供。在探针结合后，例如在添加聚合酶之前或在延伸反应发生之前，可以存在洗涤。特别地，步骤i(b)发生在5'靶结合区与靶核酸序列杂交之后。

上述方法可以特别用于检测样品中靶核酸分子中的变异靶核酸序列。靶核酸序列通常可以以变体形式出现，例如等位基因变体，或突变体和野生型序列，并且可以希望检测存在哪种变体。因此，在一个实施例中，靶核酸分子是样品中的分析物。然而，在另一个实施例中，靶核酸分子本身不是靶分析物，而是作为检测另一靶分析物的测定的一部分被检测到。因此，在此类实施例中，靶核酸分子可以是靶分析物的报告分子。

在一个实施例中，上述方法的步骤(iv)至(vii)可以包括：

(iv)使第一RCP与两个或更多个第二挂锁探针接触，该第二挂锁探针各自包含对靶核酸序列的不同变体具有特异性的靶结合区，并允许探针与多个重复序列中的其相应的变异靶序列(在存在时的)杂交；

(v)使已杂交的第二挂锁探针连接以环化杂交的挂锁探针；

(vi)使用环化的挂锁探针作为第二RCA模板进行第二RCA反应以生成含有第二挂锁探针的多个重复序列互补拷贝的第二RCP；

(vii)检测第二RCP以鉴定第二挂锁探针，从而鉴定变异靶核酸序列。

该方法可以用于检测DNA或RNA，并且可以以同质或异质形式进行。其可用于检测原位或呈分离形式或液体样品中的靶核酸序列。

有利地，该方法可以以多重方式进行以检测多个不同的靶核酸序列。

在一个实施例中，使间隙-填充延伸和连接步骤循环以增加生成的环化第一挂锁探针的量。

该方法可以涉及更多的循环或更多代的RCA。因此，可以重复步骤(iv)至(vi)，使用包含对第二RCP中的靶核酸序列具有特异性的靶结合区的第三挂锁探针，连接以环化第三挂锁探针，进行第三RCA反应等等以生成第3代、第4代或甚至更多代的RCP。

在第二方面，提供了一种用于检测靶核酸分子中的靶核酸序列的试剂盒，所述试剂盒包含：

(i)第一挂锁探针，其包含位于或靠近其相应的5'和3'末端的靶结合区，该靶结合区能够与靶核酸分子中位于靶核酸序列侧翼的互补结合位点杂交，并允许探针的靶结合区与靶核酸分子杂交；

(ii)第二挂锁探针，其包含对靶核酸序列具有特异性的靶结合区。

在一个实施例中，挂锁探针的3'靶结合区比5'靶结合区短至少6个碱基。

在一个实施例中，该试剂盒用于检测样品中靶核酸分子中的变异靶核酸序列，并且可以在部分(ii)中包含两个或更多个第二挂锁探针，该第二挂锁探针各自包含对靶核酸序列的不同变体具有特异性的靶结合区。在一个实施例中，第二挂锁探针各自包含检测序列，它们可以通过检测序列彼此区分(即检测序列不同于另一第二挂锁探针的检测序列)。

该试剂盒可包含一种或多种选自以下的进一步的组分：

(i)dNTP，特别是在dNTP在用于延伸步骤的反应介质中以不超过10μM的浓度提供使用时；

(ii)聚合酶，特别地，其中聚合酶在用于延伸步骤的反应介质中以不超过0.025U/uL的浓度提供使用；和

(iii)连接酶。

具体实施方式

本方法提供了一种高保真和高度灵敏的用于检测特定核苷酸序列(术语“核苷酸序列”和“核酸序列”在本文中可互换使用)的方法。该方法特别可用于检测可以存在于样品中的靶序列的变体，例如突变序列。特别地，可以检测罕见靶序列或序列变体，或者以低丰度或低水平存在的序列或变体。

挂锁探针用于通过探针的靶标杂交3'末端的间隙-填充延伸来捕获靶核酸序列，从而创建靶序列的互补拷贝。此类挂锁探针可以称为“间隙-填充挂锁”探针。在间隙-填充延伸之后，通过连接环化挂锁探针，并进行RCA以创建包含探针的多个重复串联互补拷贝的RCA产物，该重复串联互补拷贝包含靶序列的多个拷贝。然后用第二靶序列特异性挂锁探针探测这些扩增的靶序列，该探针在与靶序列杂交后又通过RCA环化和扩增，从而生成第二RCA产物，可以通过该产物检测靶序列。RCA产物的生成提供了可以容易地检测和计数的信号。可以实现数字计数读出。这允许对每个检测的靶分子的一种反应产物进行数字检测。此外，第二RCA反应的产物是大型产物，其含有靶序列的多个(数百个，并且可能高达大约一千个的级别)拷贝，并且具有显著的大小。此类突出的反应产物可以容易地收集，与反应中的任何其他材料混合的风险最小。

本方法提供了靶序列的高水平扩增，通过该高水平扩增改善了检测方法的灵敏度，使其能够检测和鉴定非常罕见的靶序列。因此，可以检测或鉴定或区分罕见序列变体或以低水平(“低丰度”)存在的序列或变体。此外，该方法允许靶核酸序列的准确定量。例如，不同靶核酸序列的比例可以以高精度确定，例如在确定染色体拷贝数的情况下，可以检测和比较来自2条不同染色体的靶序列。这可以特别用于检测三体，例如21号染色体的三体，例如在无创产前检测(NIPT)的情况下。该方法在图1中示意性显示。

如上所述，使用挂锁探针和间隙-填充延伸来检测靶核酸序列是本领域已知的。为了改善特异性，本方法将间隙填充延伸方案与第二挂锁探针的使用相结合，该第二挂锁探针特异性靶向间隙-填充序列(与靶序列相同或对应)。在一个实施例中，第二挂锁探针在其可以被环化之前也可以需要间隙-填充延伸，但这不是必需的特征。

靶向第一RCA产物中填充的序列的这种第二间隙填充挂锁反应具有进一步增加检测特异性的效果，因为来自第一间隙填充挂锁的任何虚假反应产物不会被第二间隙填充挂锁探针识别。这类似于使用嵌套PCR来提高检测特异性。

此外，在本方法中，已经对挂锁探针和间隙-填充延伸和连接反应进行了修改，以改善挂锁探针延伸和环化的效率，从而改善生成第一RCA反应的第一RCA模板的效率。这增加了生成的第一RCA产物的量，并最终增加了可以检测的信号量。该方法的效率得到改善，从而其灵敏度也得到了改善。

在本发明的基于间隙-填充挂锁探针的检测方法的一个实施例中，挂锁探针与靶核酸分子的结合以及挂锁探针的杂交3'末端的后续延伸在两个独立的步骤中进行，以确保在延伸反应发生之前，挂锁探针在其两个靶结合区完全和正确地杂交。方便地，该步骤中间可以存在洗涤步骤。这对于调节延伸步骤是重要的。在这方面，为了生成成功的间隙-填充产物，延伸反应应在连接位点停止，并且这是通过挂锁探针5'末端在探针3'末端下游的稳定结合来实现的。然而，如果在挂锁探针结合时存在允许延伸反应的聚合酶和试剂，则自间隙-填充-连接挂锁探针的3'末端的延伸可能会在5'末端就位之前发生，导致产生无法连接到DNA环中的过度延伸的产物，从而降低此类间隙-填充-连接挂锁探针的检测效率。这显示在下面的实例1和图2中。

通过分离间隙-填充-连接探测和延伸(聚合)步骤，可以在很大程度上消除此类副产物，从而产生更好的间隙-填充效率。我们可以使用此类方法定期检测复杂人类基因组DNA样品中约30％至40％的总靶标。

虽然探测步骤和聚合步骤可以合二为一，但这会降低间隙-填充-连接的效率，并使该方法不太适合临床或诊断用途。因此，需要改善合并的探针-结合和间隙-填充-连接方案的效率，以允许此类用途。

可以通过循环间隙-填充-连接步骤来改善经由间隙-填充-连接机制检测靶标的效率。为了实现这一点，需要单步程序，其中挂锁探针与用于延伸(聚合酶和dNTP)和连接步骤(连接酶)的试剂同时添加。这在本文中称为1步间隙-填充连接方法。此类程序的关键因素是确保挂锁探针的5'末端在3'末端延伸进行得太远之前与其靶标杂交。我们已经鉴定了有效的间隙-填充延伸和连接发生的条件。这是通过以下方式实现的：

a)设计第一挂锁探针，使其具有比5'靶结合位点短至少6个核苷酸的3'靶结合位点。

b)使用极低浓度的dNTP，将浓度从常见的200μM降低到不超过10μM。如下文进一步描述的，在一些实施例中，dNTP浓度可以低至0.2μM，即是常规条件的1000倍低。c)维持间隙-填充聚合酶的低浓度。如上所述，使聚合酶以不超过0.025U/μl的浓度与靶核酸分子接触。因此，与标准反应条件相比，可以使用十分之一浓度的聚合酶。

这些措施可以减慢或延迟延伸反应，以确保探针的5'末端稳定或充分地与靶分子杂交，从而最小化或避免任何不希望的过度延伸。

在另一个实施例中，已经详细阐述了使用上述条件的一步间隙-填充-连接方案，其允许更有效地生成连接的间隙-填充挂锁。虽然通过增加间隙填充延伸步骤的效率获得了改善，但通过循环间隙-填充延伸和连接步骤可以获得进一步的改善。因此，在进一步有利的实施例中，使一步法的步骤(i)和(ii)循环重复。

应当理解，此类循环通常会涉及热循环。这可以通过本领域众所周知的程序来完成。因此，该方法可以包括使靶核酸分子变性的加热步骤，然后可以降低温度以允许第一挂锁探针与其靶分子中的互补结合位点结合(杂交)(所谓的“退火”步骤)，随后使杂交探针进行延伸和连接步骤。这可以涉及进一步降低和/或增加温度，以优化后续延伸和连接步骤的条件，具体取决于所使用的聚合酶和连接酶。然后再次加热反应以去除连接的探针，并再次开始循环，即允许进一步的挂锁探针结合并被延伸和连接等。循环数可以根据选择而变化，并且可以取决于靶核酸、样品等的性质。在一个实施例中，进行至少2个循环，例如至少3或4个循环，例如从2、3、4或5个循环中的任一个到6、8、10、12、15、17、20、25或30个循环中的任一个。循环数并不重要，并且如果希望或合适，可以进行更多个循环。已经观察到产物积累与重复循环数成比例。这导致第一RCA模板的生成增加，从而导致第一RCA产物的生成增加，并且这种增加的扩增导致检测方法的效率和灵敏度增加。虽然此类循环可以是有利的，但它不是包括单循环反应的本方法的必要条件。

最一般地，该方法用于检测靶核酸分子中的靶核酸序列。术语“检测”在本文中广泛使用以包括确定靶核酸序列在靶核酸分子中的存在的任何方式。在本方法中，靶核酸通过检测生成的第二RCA产物的存在或量来检测，并且可以包括简单地检测它是否存在，或RCA产物的任何形式的测量。因此，步骤(vi)的RCA产物可被检测为靶核酸序列的“信号”。因此，在步骤(vii)中检测第二RCA产物包括以任何方式确定、测量、评估或测定第二RCA产物的存在或不存在或量或位置。第二RCA产物的存在(即确认其存在或数量)指示或鉴定靶核酸序列的存在，因为RCA产物的成功生成最终取决于靶核酸分子并且更具体地是其中的靶核酸序列的存在。

包括定量和定性确定、测量或评估，包括半定量。此类确定、测量或评估可以是相对的，例如当检测样品中的两个或更多个不同的靶核酸序列或靶分子时，或者是绝对的。因此，在一个实施例中，该方法可以用于定量或确定存在的靶核酸序列的量。当在定量样品中的靶核酸序列的背景下使用时，术语“定量”可以指绝对或相对定量。绝对定量可以通过包含已知浓度的一种或多种对照核酸分子和/或将靶核酸序列的检测水平与已知对照核酸分子或序列进行参考(例如通过生成标准曲线)来实现。可替代地，相对定量可以通过比较两种或更多种不同靶核酸分子或不同靶序列之间的检测水平或量以提供两种或更多种不同核酸分子或序列中每一种的相对定量(即，相对于彼此的定量)来实现。因此，如上所述，可以确定样品中存在的靶核酸序列的比例。因此，可以比较靶核酸分子(例如染色体)的拷贝数。

靶核酸序列是希望检测的任何核酸分子中的序列，或者换言之，是测定的靶标。如以下将更详细地描述的，该方法可以以多重方式进行以检测两个或更多个不同的靶序列，例如，在一个或多个靶核酸分子中的靶序列，和/或在两个或更多个靶分子中的靶序列。因此，为了检测两个或更多个不同靶分子中的靶序列，可以使用多个第一挂锁探针，该第一挂锁探针各自对不同的靶序列具有特异性，即具有与靶分子中位于不同靶序列侧翼的结合位点互补的靶结合区。在这方面应当理解，不同靶分子中的侧翼结合位点对于不同靶序列是不同的，以允许第一挂锁探针的特异性结合。可替代地或另外，可以再次使用多个不同的第一挂锁探针检测相同靶分子中不同和分开的靶序列，例如，染色体上不同基因中的不同序列，该第一挂锁探针各自对不同的靶序列具有特异性。然而，如上所述，在一个特定的实施例中，该方法可用于检测给定靶分子中存在多个可能的不同变异序列中的哪一个，例如是否存在野生型或突变序列，或者多个可能突变体或不同的等位基因变体或多态性等中的哪一个。在此类方案中，共同的第一挂锁探针用于在连接的第一挂锁中生成靶序列的互补拷贝，然后通过使用多个不同的第二挂锁探针确定存在哪个变体，该第二挂锁探针各自对靶序列的不同变体具有特异性。使第一RCP与多个第二挂锁探针接触的步骤(iv)可以方便地在相同反应介质中以多重方式进行。

如本文所用，术语“多个”是指两个或更多个，例如3、4、5、6、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、或100或更多个。事实上，可以使用数千或数万个挂锁探针。可以使用的挂锁数量没有限制并且可以变化。这将取决于方法的目的、样品的性质和待检测的靶核酸序列、可能的变体数量等。因此，例如为了检测野生型和突变变体，不同的第二挂锁的数量将取决于可能的不同突变体的数量，并且可以是例如2-6、2-5、2-4或2-3个不同的第二挂锁。应当理解，可以组合不同的方面以增加测定的总体多重性。例如在给定样品中，该方法可以用于检测不同靶序列的不同变体。

靶核酸序列可以是任何希望检测或鉴定的序列。它可以是DNA或RNA或其修饰变体。因此，核酸可以由核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸以及能够参与沃森-克里克类型或类似碱基对相互作用的合成核苷酸组成。因此，核酸可以是或可以包含例如亚硫酸氢盐转化的DNA、LNA、PNA或任何其他含有非核苷酸骨架的衍生物。

通常，靶序列将是希望检测的分析物，例如样品中存在的核酸，例如在细胞或组织样品或任何生物样品等中存在的核酸。因此，它可以是天然存在的序列或其衍生物或拷贝或扩增子。然而，这不是必需的，并且靶序列可以替代地是测定的分析物的报告分子。报告核酸可以在对样品中的任何分析物例如蛋白质或其他生物分子或小分子的测定过程中使用或生成。因此，报告核酸可以作为分析物的结合探针的标签或标记提供，并且可以被检测以检测分析物，例如在免疫测定中，例如如在免疫PCR或免疫RCA反应中。报告核酸可以在测定过程中生成，例如通过邻近延伸测定中的连接反应，或邻近延伸测定中的延伸反应，或通过裂解反应等生成。因此，此类报告靶核酸可以是合成或人工序列。

在一个实施例中，靶核酸是天然或合成的DNA分子。靶核酸分子可以是编码或非编码DNA，例如基因组DNA或其亚级分，或者可以源自基因组DNA，例如其拷贝或扩增子，或者靶核酸分子可以是cDNA或其亚级分，或其扩增子或拷贝等。

在另一个实施例中，靶核酸分子是靶RNA分子。它可以是RNA池中的RNA分子或其他核酸分子，例如基因组核酸，无论是人还是来自任何来源，来自转录组，或任何其他核酸(例如细胞器核酸，即线粒体或质体核酸)，无论是天然存在的还是合成的。因此，靶RNA分子可以是或可以源自编码(即前体mRNA或mRNA)或非编码RNA序列(诸如，tRNA、rRNA、snoRNA、miRNA、siRNA、snRNA、exRNA、piRNA和长ncRNA)。一个优选实施例，靶核酸分子是微小RNA(miRNA)。在一个实施例中，靶RNA分子是16S RNA，例如其中16S RNA来自并鉴定样品中的微生物(例如病原体微生物)。可替代地，靶RNA分子可以是基因组RNA，例如以RNA作为其遗传物质的病毒的ssRNA或dsRNA。值得注意的此类病毒包括埃博拉病毒、HIV、SARS、SARS-CoV2、流感、丙型肝炎、西尼罗热、脊髓灰质炎和麻疹。因此，靶RNA分子可以是来自病毒基因组的正义RNA、负义RNA或双链RNA，或来自逆转录病毒RNA基因组的正义RNA。

在靶分子是RNA分子的情况下，该方法可以包括生成靶RNA分子的cDNA拷贝的预备步骤。然后在步骤(i)中使cDNA分子与第一挂锁探针接触。

可替代地，靶RNA分子可以直接与第一挂锁探针接触。换言之，第一挂锁探针可以直接结合靶RNA分子。对于此类方法，用于间隙-填充延伸步骤的聚合酶将具有逆转录酶活性，特别是能够具有逆转录酶活性但不具有链置换活性的聚合酶。

为了检测变异靶序列，使用能够捕获给定靶序列的任何可能变体的第一挂锁探针。因此，第一挂锁探针对任何特定变体都没有选择性或特异性。然而，为了确保捕获希望的靶序列，它将被设计为在允许捕获靶序列的所有变体的位点特异性结合靶分子，即在位于靶序列侧翼且在不同变体之间共有的位点特异性结合靶分子。例如，变异序列可以是基因中特定位置或基因座处的突变或多态性。因此，靶序列可以是包括或包含该变异位置或基因座的序列，并且不同的靶序列可以通过在该位置或基因座具有不同的碱基来区分。第一挂锁探针可设计为具有与靶分子中的侧翼序列互补的结合位点，该侧翼序列在不同变体之间共享或保守(即，共有)。

因此，在一个实施例中，第一挂锁探针可以被视为共有探针，或视为一组靶序列或一组变异靶序列通用的。因此，第一挂锁探针可具有与靶分子中的结合位点(即侧翼区域)互补的靶结合区，该结合位点为不同靶序列所共有(即位于不同靶序列或靶序列的不同变体侧翼的共有结合位点)。可替代地，第一挂锁探针可以具有不同靶序列或不同变体共有或通用的或者一组靶序列或一组变体共有的靶结合区。也就是说，第一挂锁探针可以具有靶结合区，其能够与靶分子中不同的靶序列或靶序列的不同变体共有的互补结合位点杂交。然而，第二挂锁探针对靶序列或靶序列的不同变体具有特异性，如下文进一步描述的。

在一个不同的实施例中，第一挂锁探针可以对特定靶核酸序列具有特异性。因此，例如可以使用不同的第一挂锁探针，第一挂锁探针各自对不同的靶序列具有特异性。这可以用于诊断测试，例如NIPT，其中可以检测不同的序列，例如以检测不同的染色体(并确定它们的拷贝数，例如以检测三体)，或在任何希望检测一个或多个特定靶序列的情况下。

挂锁探针可以替代地定义为可环化探针。挂锁或可环化探针的使用是本领域众所周知的，包括在RCA反应的情况下。可环化探针包含一个或多个线性寡核苷酸，该寡核苷酸可以连接在一起形成环。挂锁探针是众所周知的并被广泛使用，并且在文献中有充分的报告和描述。因此，挂锁探测的原理是众所周知的，并且挂锁探针的设计和使用是本领域已知的并且在本领域中有描述。挂锁探针通常是线性可环化寡核苷酸，该寡核苷酸与其靶核酸序列或分子的杂交方式使探针的5'和3'可连接末端直接或如上所述间接地并置以连接在一起，其间有间隙。正是后者的间接或“间隙-填充”配置被用于本方法中的第一挂锁探针。第二挂锁探针可以具有直接或间接连接的可连接末端。通过连接探针的杂交5'和3'末端来环化探针。应理解，为了发生环化(连接)，挂锁探针的可连接5'末端具有游离的5'磷酸基团。

为了允许挂锁探针的末端并置以进行连接，挂锁探针被设计为具有位于或靠近其5'和3'末端的靶结合位点。也就是说，允许挂锁探针与其靶标结合的具有互补性的区域位于或靠近挂锁探针的末端。在第一挂锁探针的情况下，这些具有互补性的区域允许挂锁探针通过与靶分子中位于靶序列侧翼的特定序列、结合位点的杂交而与其靶分子特异性结合。

为了允许连接，待连接的3'和5'末端(“可连接的”3'和5'末端)与充当连接模板的靶分子或序列杂交。取决于探针设计，挂锁探针的可连接末端可以以各种方式并置以用于连接。当靶标结合位点位于挂锁探针的末端时，挂锁探针的结合可以使末端进入所述并置。当靶分子或序列中的互补结合位点直接彼此相邻(或连续)放置时，挂锁探针的末端将直接彼此相邻(即没有间隙)杂交，并且可以直接彼此连接。因此，在这种情况下，探针的可连接末端由探针的实际末端提供。对于第二挂锁探针可以采用此类配置(尽管该方法不限于此)。然而，第一挂锁探针是间隙-填充挂锁探针，并且因此挂锁探针末端的结合位点不会与相邻的结合位点杂交，而是与靶分子中位于靶序列侧翼的非相邻(非连续)结合位点杂交。在此类布置中，探针的5'可连接末端由探针的实际5'末端提供。然而，探针的可连接3'末端通过探针的杂交3'末端的延伸使用靶序列作为延伸模板来填充探针杂交末端之间的间隙生成。延伸反应使探针的延伸3'末端并置以进行连接。在这种情况下，探针的可连接3'末端因此是探针的延伸3'末端。

在其他实施例中，可连接的3'和/或5'末端可以通过裂解创建或生成。因此，在靶结合位点不位于挂锁探针的末端，而是位于末端内部，靠近(而不是位于)探针末端的情况下，探针将以其中存在位于探针末端的未杂交核苷酸的方式与靶标杂交。换言之，在探针杂交后，在探针的一个末端或两个末端存在突出端或瓣或未杂交的附加序列。如果未杂交的序列位于3'末端，则这将阻止杂交探针的连接，或甚至延伸。当探针与其靶标杂交时，这些未杂交的区域或核苷酸可以通过裂解去除，特别是通过酶促裂解去除(即通过裂解杂交探针)。

具有内部5'靶结合位点的挂锁探针的杂交将产生具有所谓的5'瓣的结构。以这种方式设计的挂锁探针是本领域已知的，用于裂解它们的程序和酶也是已知的。任何能够进行去除5'瓣的反应的酶都可以用于该步骤，即任何能够裂解、降解或消化未与靶核酸分子杂交的5'单链序列的酶，但通常这将是具有5'核酸酶和/或结构特异性裂解活性的酶。

结构特异性裂解酶是能够识别单链5'突出端和DNA双链体之间的连接并裂解单链突出端的酶。此类酶是本领域已知的并且包括瓣状核酸内切酶(FENS)，其是一类具有核酸内切活性并且能够催化单链和双链DNA连接处的磷酸二酯键的水解裂解的酶。例如，酶可以是来自激烈火球菌(P.furiosus(Pfu))、闪烁古生球菌(A.fulgidus(Afu))、甲烷球菌(M.jannaschii(Mja))或嗜热自养甲烷杆菌(M.thermoautotrophicum(Mth))的天然或重组古细菌FEN1酶。

具有5'核酸酶活性的酶包括具有5'核酸外切酶和/或5'核酸内切酶活性的酶，并且此类酶同样是本领域已知的，例如Taq DNA聚合酶及其5'核酸酶结构域，或核酸外切酶VIII。其他实例是RecJf和T5核酸外切酶。

对于未杂交的3'末端(或3'瓣)的裂解，可以使用具有3'核酸酶活性的酶。这可以是3'核酸外切酶或3'核酸内切酶活性。这可以由具有3'核酸外切酶活性的聚合酶或其3'核酸外切酶结构域提供，或由单独的核酸外切酶(例如核酸外切酶I)提供，或由核酸内切酶提供。作为代表性实例，酶可以是T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、DNA聚合酶I、DNA聚合酶I的Klenow片段、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus(Pfu))DNA聚合酶和/或沃氏热球菌(Pyrococcus woesei(Pwo))DNA聚合酶。

特别地，具有3'核酸外切酶活性的聚合酶可以用于在步骤(ii)中延伸探针的杂交3'末端的步骤-此类酶将去除未杂交的3'核苷酸以在发生延伸反应之前留下杂交的3'末端。具有3'核酸外切酶但没有链置换活性的聚合酶是希望的。在循环方案的情况下，应使用嗜热聚合酶。这些包括：Q5/Q5U DNA聚合酶、Phusion/Phusion U DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Stoffel DNA聚合酶、Pwo DNA聚合酶、κDNA聚合酶和SuperFi DNA聚合酶。对于没有循环的方案，包括没有循环的1步法，可以使用T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶或DNA聚合酶I。

在1步间隙填充方案的情况下，使用3'瓣可以是有利的，因为通过要求在延伸发生之前去除探针3'末端未杂交的核苷酸，可以产生延迟到延伸反应。这可以允许探针的5'末端在延伸反应发生之前或在延伸到达杂交的5'末端(或探针的杂交5'靶结合位点)之前杂交。

靶结合位点距挂锁探针的3'或5'末端的定位将决定3'或5'瓣的长度。一般而言，优选3'靶结合位点合理地接近3'末端，例如在3末端的7或6个或更少的核苷酸内，例如在末端的5、4、3、2或1个核苷酸内。对于5'靶结合位点，可以容忍更长的距离。在一个实施例中，“靠近”探针的5'或3'末端是指在末端的12个或更少的核苷酸的范围内，例如在末端的10、9、8、7或6个核苷酸内。在3'末端的情况下，这可以例如在末端的8、7、6、5、4、3、2或1个或更少的核苷酸内，例如在6个或更少的核苷酸内。

在另一个实施例中，第一挂锁探针的3'末端可以包含发夹结构，该结构包含3'靶结合区。换言之，3'靶结合区可以至少部分包含在挂锁探针3'末端的发夹结构内。当探针与靶分子杂交时，链置换会导致发夹打开，并且探针的3'末端与靶分子杂交，从而可以被延伸。这提供了替代地提供额外延伸延迟的方式(除了以上步骤(i)中指示的措施所提供的延迟之外)，以确保探针的5'末端在延伸发生或到达杂交的5'末端(或更具体地是杂交的5'靶结合位点)之前杂交。

挂锁探针可以以连接在一起的2个或更多部分提供。这可以涉及提供额外的连接模板，例如在2部分探针的情况下，其中每个部分仅包含一个靶结合区，并且每个部分的另一端与共有的连接模板杂交。在另一个实施例中，2部分挂锁可以采用“连接器”寡核苷酸的形式，其具有分别位于或靠近5'和3'末端的两个靶结合区，该靶结合区与靶标杂交，其间存在间隙，以及在末端之间的间隙中杂交的间隙寡核苷酸。间隙寡核苷酸可以部分或完全填充间隙。在间隙-填充挂锁探针的情况下，延伸的3'末端可以是间隙寡核苷酸或骨架寡核苷酸的杂交3'末端。然而，在一个典型的实施例中，挂锁作为单个可环化寡核苷酸提供，无论是否作为间隙填充挂锁(这是第一挂锁探针所需要的)。

在特定实施例中，挂锁探针不具有二级结构，并且更具体地不包含分子内双链区域或茎环结构。然而，具有二级结构的哑铃探针是挂锁探针的特定子类型。哑铃探针包含两个茎环结构，茎与茎相连，其中一个“环”未闭合，而是开放的，具有可用于彼此连接的游离5'和3'末端。这个“开环”充当探针的靶结合结构域。闭环只充当连接双链体末端的间隔物(茎)。换句话说，它可以被看作挂锁探针，在挂锁的互补序列(区域)之间形成双链体区域。双链体区域充当信号传导结构域，嵌入剂可以与之结合。因此，哑铃探针的“开环”可以包含具有互补性的靶结合区。

该方法中待检测的变异序列可以包含一个或多个变异碱基。因此，它可以是单核苷酸变体，例如单核苷酸多态性(SNP)或突变，或者它可以包含两个或更多个碱基。因此，变异序列可以包含一段核苷酸，其中2个或更多个碱基可以是变异的。变异碱基可以是连续的或不连续的。

靶序列的长度并不重要，并且可以根据环境和靶分子的性质、靶序列或变异位置或基因座而变化。因此，仅作为代表性实例，靶序列可以是1至10，例如1-15、1-12、1-10、1-8、1-7或1-6个核苷酸长。然而，在某些实施例中，长于单核苷酸的靶序列可以有利于改善特异性，并且在此类实施例中，靶序列可以是从2、3、4、5或6个核苷酸长中的任一个到6、7、8、9、10、12、15或20个核苷酸长中的任一个。示例性靶序列因此可以是例如4-10、4-8、4-7、4-6、5-10、5-8、5-7或6-8个核苷酸长。

应当理解，靶序列的长度将对应于第一挂锁的杂交靶结合位点末端之间的间隙长度，并且因此间隙长度可以是上述范围中的任一个。

在上述一步间隙-填充-连接方法中，步骤(i)的特征用于延迟或减慢延伸反应，以避免会阻止或减少探针连接的过度延伸。

第一个此类特征是设计具有比5'靶结合位点短至少6个核苷酸的3'靶结合位点的第一挂锁探针。在一个实施例中，3'靶结合位点比5'结合位点短至少7或8个核苷酸。作为代表性实例，3'靶结合位点为至少6个核苷酸长，例如至少7或8个核苷酸长，例如6-20、6-18、6-15或6-12个核苷酸长。5'靶结合位点可以为至少12个核苷酸长，例如至少13、14或15个核苷酸长，例如12-30、12-25、12-20、12-18或12-15个核苷酸长。这种不同的长度有助于确保5'靶结合位点在3'靶结合位点之前或至少同时稳定杂交。

其次，用于延伸反应的试剂(即dNTP和聚合酶)以远低于本领域常规反应中使用的低水平提供或添加到用于组合的探针结合、延伸和连接步骤的反应混合物中。如上所述，对于dNTP，这可以最高达1000倍低。所用dNTP的浓度可以取决于所用的聚合酶。

用于延伸步骤的聚合酶以不超过0.025U/μl的浓度提供。更特别地，浓度不超过0.02、0.015、0.01、0.005、0.004、0.003或0.0025U/μl。浓度可以是例如常规或通常使用的10倍低。虽然这可能会减慢和降低延伸反应本身的效率，但这可以导致可接受的延伸水平，并且在整个方法的背景下导致生成检测方案中第一RCA反应的第一RCA模板的有效间隙-填充-连接步骤。例如可以使用0.0025U/μl聚合酶。

用于延伸反应的聚合酶是没有链置换活性的聚合酶或其结构域或部分。非链置换聚合酶是本领域已知的，并且包括例如Q5/Q5U DNA聚合酶、Phusion/Phusion U DNA聚合酶(Thermo Fisher)、T4聚合酶、T7聚合酶、Pwo DNA聚合酶、κDNA聚合酶、SuperFi DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶。Taq聚合酶不是链置换的，但具有5'核酸外切酶活性，这可能是不希望的。没有这种5'核酸外切酶活性的Taq衍生物和片段是可用的并且可以使用，包括例如Stoffel片段。在一个实施例中，使用高保真DNA聚合酶。这包括Stoffel和Phusion DNA聚合酶，它们可从各种来源广泛获得。

如上所述，待使用的dNTP的浓度可以取决于所使用的聚合酶。例如，对于Stoffel片段，浓度可以不超过1μM，特别是不超过0.5μM，并且更特别是不超过0.3μM或0.25μM。

在聚合酶是Phusion聚合酶的情况下，dNTP可以不超过10μM、特别是不超过3μM、更特别是不超过1μM的浓度提供。

为了进行一步法，使靶核酸与第一挂锁探针和其他试剂接触。含有靶核酸分子或其部分或级分或等分试样的样品可以与试剂接触。例如，对于原位分析，细胞或组织样品可以直接与试剂接触。样品可以在接触之前预先处理或加工，例如通过固定处理或加工。在其他实施例中，靶核酸可以首先从样品中分离或去除。从各种类型样品提取或纯化核酸(例如DNA)是本领域众所周知的。例如，核酸可从细胞或无细胞样品诸如血浆中分离。在某些情况下，可能还希望将核酸分子片段化。用于此的程序在本领域中是已知的，并且包括特异性消化，例如使用核酸酶，包括例如限制酶，或通过非特异性手段，诸如剪切进行。

接触步骤制备用于探针结合、延伸和连接反应的反应混合物。

为了进行探针结合、延伸和连接反应，第一挂锁探针与靶核酸分子、dNTP、聚合酶和连接酶一起孵育。为了允许探针结合，可以存在初始加热步骤，例如以使双链核酸分子变性。

反应混合物可以在适合促进或实现挂锁探针结合的条件下孵育(所谓的“退火”步骤)。如果存在在先变性步骤，则这可以涉及降低温度。这些步骤的条件是本领域已知的，并且在本领域技术人员选择或设计的常规技能范围内。可以选择退火温度以促进或优化探针的5'靶结合区的退火。例如，可以使用50℃-65℃的退火温度，例如53℃至60℃或更特别地55℃至60℃。

可以降低延伸步骤的退火温度。同样，可以根据本领域已知的和特定的试剂(例如使用的酶)选择适当的条件。例如，在初始退火步骤之后，温度可以降低到28℃-40℃，例如28℃-35℃、30℃-35℃、28℃-33℃、30℃-33℃、28℃-33℃或30℃-32℃等。较低温度(例如约32℃)可以有利于防止或减少过度延伸。

可以选择延伸温度以允许或促进探针的3'靶结合位点杂交，然后进行延伸。因此，可以通过选择适当的条件(包括温度)获得平衡，这允许稳定杂交第一挂锁探针的5'靶结合位点，随后杂交3'靶结合位点并延伸杂交的3'末端。

一旦发生延伸反应以及任选的去除5'瓣可能需要的任何裂解步骤，就连接挂锁探针以使其环化，从而生成第一RCA反应的模板。连接是靶核酸分子的模板。可以使用任何方便的连接酶，并且感兴趣的代表性连接酶包括但不限于温度敏感连接酶，诸如噬菌体T4DNA连接酶、噬菌体T7连接酶和大肠杆菌(E.coli)连接酶，以及热稳定连接酶，诸如Taq连接酶、Tth连接酶、Pfu连接酶和9°N^TMDNA连接酶。

用于连接的合适条件是本领域已知的，并且任何必需和/或希望的试剂可以与反应混合物合并并保持在足以进行连接的条件下。显然，连接条件可以取决于本发明方法中使用的连接酶。因此，例如，可以使用扩增酶，并且可以在延伸步骤之后增加温度以用于连接步骤。

方便地，该方法可以在热循环仪器中进行。这允许对温度变化进行即时控制。热循环仪允许控制变温速度，即温度变化的速度，并且已经发现也可以选择变温速度来优化反应，并改善间隙-填充连接的第一挂锁探针的产量。例如，可以使用仪器变温速度的100％(例如3.3℃/s)。较慢的变温速度，例如4％的变温速度(例如0.13℃/s)，可以改善产量，但可能需要更长的孵育时间。

可以根据本领域已知的原理通过常规实验优化间隙-填充延伸和连接反应的条件。因此，可以调整温度、缓冲液、孵育时间、升温速度等以找到最佳条件。

已经观察到在反应混合物中包含拥挤剂可以是有益的。合适的拥挤剂是本领域已知的，并且包括例如PEG、甘油或诸如Sephadex的凝胶。

对于2步法，探针-结合步骤在不存在聚合酶的情况下进行，但其他条件和细节可以如上所述。对于2步反应，探针-结合步骤在没有聚合酶的情况下进行，但靶核酸与挂锁探针接触和孵育等的其他条件和细节以及延伸和连接反应可以如上所述。用于延伸反应(例如dNTP)和连接反应(例如连接酶)的其他试剂可以在探针已经结合之后与聚合酶一起接触杂交的探针/靶核酸，任选地在洗涤步骤之后去除未结合的挂锁探针。可替代地，聚合酶以外的试剂可与第一挂锁探针一起与靶核酸分子接触，随后可以添加聚合酶以在挂锁探针杂交后开始延伸反应。用于连接步骤的连接酶可以在延伸后添加，或者可以包括在聚合酶和/或其他延伸试剂中。因此，可以在添加聚合酶之前、期间或之后添加其他试剂(即聚合酶以外的试剂)。

一旦生成了间隙-填充连接的第一挂锁探针，就进行第一RCA反应。在RCA反应之前，例如，如果该方法以异质或固相形式进行，例如当样品固定或固定化在固体支持物上时，可以存在任选的洗涤步骤。这可以用于去除未连接或未杂交的探针。

可替代地或另外，在第一RCA反应之前可以存在使用核酸外切酶降解的清理步骤，从而去除未结合和/或未连接的并且因此未环化的探针，以及在适当时去除过量或不需要的核酸，例如过量的基因组DNA。此类步骤可以特别地以均相或溶液相形式进行。用于进行此类清理的核酸外切酶是本领域已知的，例如核酸外切酶I、III或λ，或其混合物。此外，聚合酶的核酸外切酶活性可用于实现这一点，例如3'核酸外切酶活性。通过在连接步骤后添加具有核酸外切酶活性的酶可以方便地进行此类通过核酸外切的清理。这可能是或可能包括用于RCA反应的聚合酶。可替代地，可以在连接步骤之前添加具有核酸外切酶活性的酶以去除未杂交的探针—在此类情况下，应选择具有严格单链特异性活性的酶，例如ExoI、RecJf。

如上所述，RCA反应在本领域中是众所周知的，并且因此可以根据文献中已知和描述的方案和原理来设计或选择该步骤的条件。使用链置换聚合酶，诸如Phi29或其衍生物。用于RCA反应的引物可以添加到反应混合物中，或者可以与第一挂锁探针预杂交。RCA引物的结合位点可以提供在挂锁探针的不同于靶结合区的区域中(即在挂锁的骨架区域中)。在一些情况下，靶核酸分子可以用作或提供引物，例如在原位应用中。如果需要，聚合酶的3'核酸外切酶作用或单独的核酸外切酶可以用于消化靶核酸以提供适合充当环化挂锁探针的RCA的RCA引物的杂交3'末端。

可以在清理步骤之后添加用于RCA反应的试剂，或者可以在净化步骤中包括一种或多种试剂，并且可以在之后添加引发RCA反应的其他试剂。为清理而添加的单独的核酸外切酶可以被灭活，例如在RCA开始之前通过加热或用蛋白酶(例如蛋白酶K)处理灭活，然后可以添加用于RCA的试剂。

在第一RCA反应之后，在随后的步骤之前(例如在添加第二挂锁探针之前，或在其连接之前)，可以存在使所用的聚合酶失活(例如通过加热)的步骤。

RCA反应产生串联的第一RCA产物(RCP)，其包含间隙-填充和连接的第一挂锁探针的互补物的多个重复拷贝。因此它包含复制到间隙-填充探针中的靶序列的多个重复拷贝。以这种方式扩增靶序列。靶序列提供第二挂锁探针的结合位点。因此，第一RCP提供了用于第二靶序列特异性挂锁探针的多个结合位点。因此，更具体地，给定的第二挂锁探针的多个拷贝可以与第一RCP杂交。然而，应当理解，并非第一RCP中的每个可用结合位点都需要被第二挂锁探针占据或结合—第一RCP中的一些或多个结合位点被第二挂锁探针结合就足够了。更特别地，串联的第一RCP的至少一个单体中的靶序列被第二挂锁探针结合，但更特别地，在至少2、4、6、8、10、12、15、20、25、30、40、50、80、100、150或200个或更多个单体中的靶序列被第二挂锁探针结合。

该方法依赖于能够与第一RCA产物杂交的多个探针。因此，应当理解，第一RCA产物需要可用于探针杂交。此要求是所有基于RCA的检测方法的特征并且在本领域中是众所周知的，其中通过使探针(例如检测探针)与产物杂交来检测RCA产物。因此，第一RCA产物具有低二级结构可以是有利的。然而，根据本领域众所周知的原理，可以通过在有利于杂交的条件下进行该方法来补偿该特征。因此，例如，该方法中结合第二挂锁探针的步骤可以在甲酰胺(例如，在含有甲酰胺的缓冲液中)的存在下进行，尽管一般来说，在进行第二RCA反应之前去除甲酰胺是希望的，例如通过洗涤去除。在不使用洗涤的形式中，例如如果需要，可以替代地使用溶液形式的DMSO或甜菜碱来增强第二挂锁探针的结合。

第二挂锁对靶序列具有特异性并且因此用于鉴定或检测靶序列或其变体。因此，第二挂锁探针包含对特定靶序列或特定变体具有特异性的靶特异性结合区。因此，靶结合区被设计为与靶序列中的特定序列互补，或在不同的靶序列或变体之间区分或区别。变体特异性或等位基因特异性探针的设计是本领域已知的，并且因此可以容易地设计第二挂锁的结合区以检测或鉴定希望的靶序列或变体。第二挂锁探针因此允许对第一RCP中的靶序列进行基因分型并且可以称为基因分型挂锁探针。

如上所讨论的，在检测变异靶序列的情况下，可以使用两个或更多个第二挂锁探针，该第二挂锁探针各自对不同的变异序列具有特异性，并且可以检测其中哪一个产生第二RCP，以便检测或鉴定存在哪个变体。

如上所述，变异序列中可以存在一个或多个变异碱基，并且这些变异碱基是连续的或不连续的。

变异碱基在靶序列中的位置可以影响前面的间隙-填充连接反应的效率和/或第二挂锁探针检测的灵敏度或准确性。例如，如果变异碱基位于靶序列的特定位置，并且因此位于间隙中的特定位置，则这可以影响是否在间隙-填充连接反应中产生错误(即非特异性)产物。

在一个实施例中，变异靶核酸序列包含单变异碱基，并且变异碱基不位于对应于第一挂锁探针的杂交的末端之间的间隙的第一或最后一个碱基的位置(或换言之，不位于靶序列的第一或最后一个位置)。

熟练的从业者会知道如何就优化间隙-填充-连接和随后的检测反应而言来设计第一和第二挂锁探针，并且这可以涉及例行试错，例如，就间隙大小(靶序列长度)和/或变异碱基位置而言。

第二挂锁探针可以具有上面讨论的任何设计或配置。因此，如上文所讨论的，它可以直接或间接连接，并且靶结合区可以位于或靠近相应的5'和3'末端，并且它们可以与靶序列中相邻或不相邻的结合位点杂交。因此，第二挂锁可以是间隙填充挂锁，并且在与第一RCP杂交后可以生成或可以不生成5'和/或3'瓣。它可以分为1个或多个部分。

然而，在一个实施例中，第二挂锁探针是单可环化寡核苷酸，其在其相应的5'和3'末端包含5'和3'靶结合区。在进一步的此类实施例中，第二挂锁探针可以杂交，使得杂交的5'和3'末端直接相邻并且可以直接连接。

在替代实施例中，第二挂锁探针可以杂交，使得杂交的5'和3'末端不直接相邻并且在连接发生之前需要间隙-填充反应，例如延伸步骤。在此类实施例中，第二挂锁探针的间隙填充设计有助于此类探针的质量控制，例如通过对第二挂锁探针进行测序来排除不相关序列的掺入。这一相同的特征也可以通过确认已经由掺入的间隙填充片段检测预期序列有助于常规使用，从而进一步保证靶标选择性。第二挂锁探针的间隙-填充反应可以是完全的或部分的。换言之，在第二挂锁探针的情况下填补的间隙可以是靶序列的全长，或小于全长，使得只有一部分靶序列被复制到第二挂锁探针。因此，第一和第二间隙-填充步骤(例如间隙-填充延伸反应)可以完全或部分重叠。

为了检测变异碱基，第二挂锁探针的5'或3'末端(或更普遍的靶结合区)可以例如设计为与变异碱基或与紧接在变异碱基之前或之后的碱基杂交或互补。如上所述，本领域技术人员知道如何设计第二挂锁探针的结合区以实现特定变异碱基或序列的特异性检测。通常，单变异碱基将放置在第二挂锁探针的3'靶结合位点，或者更具体地是3'靶结合位点的最后一个碱基，但靶碱基也可以存在于不超过3'靶结合位点上游6nt的碱基处或存在于靶结合位点5'末端或不超过5'靶结合位点末端上游6nt处。

一旦第二挂锁探针被杂交，它们就被连接以环化它们。这可以如上所讨论的进行。

在连接第二挂锁之后，使用连接的挂锁探针作为RCA模板进行第二RCA。第二RCA反应可以由单独添加到反应混合物中的引物引发。如上所讨论的，用于进行RCA反应的试剂、程序和方案是本领域已知的并且可以在这里使用。如果希望，可以存在一个或多个中间洗涤和/或清理步骤以去除任何未结合和/或未连接的第二挂锁探针，如果希望的话。例如，洗涤可以在第二挂锁探针与第一RCP杂交之后和/或在探针连接之后发生。这可以例如通过以固相形式实施该方法容易地实现。在溶液相形式中，酶可以用于降解未反应的第二挂锁，例如如上所述的核酸外切酶。通常，可以在每个探针环化反应之后应用清理步骤以去除剩余的未反应的探针和样品核酸序列，但保留成功环化的探针。核酸外切酶清理步骤最适合在第一挂锁连接反应之后。如果在第二挂锁连接反应后应用核酸外切酶清理步骤，则这必须以保留第一代RCA产物的方式进行。

本文的方法需要由间隙-填充和环化的第一挂锁探针模板化的第一RCA步骤，以及由环化的第二挂锁探针模板化的至少第二RCA步骤，该第二挂锁探针可以是或可以不是间隙填充挂锁探针。如上所述，该方法可以包括进一步的RCA步骤，以使用第三或第四挂锁探针等等生成第三代或更多代的RCA产物，该探针各自靶向靶核苷酸序列。换言之，如果希望，可以重复步骤(iv)至(vi)或(iv)至(vii)。可以检测最后一代RCA产物。

应当理解，此类更多代的RCA可以起到增加最终检测信号的作用。这可以相应地导致增加的信号扩增。然而，还应当理解，当第二和进一步的挂锁探针是间隙-填充挂锁时，这将导致靶核苷酸序列或其一部分的拷贝的合成增加(取决于连续间隙-填充反应是完全还是部分重叠)。换言之，该方法可以导致大量填充序列的克隆产生。又换言之，可以扩增填充序列(即靶核酸序列或其一部分)。这可以用于制备反应。如果多个连续的(即两个或更多个)第二和进一步的挂锁探针连接步骤涉及相同或重叠序列的间隙-填充，则可以生成特定靶序列的更多拷贝。

该方法可以以异质或同质形式进行。也就是说，它可以在固相(或支持物)上，或在溶液或悬浮液(即没有固相或支持物)中，或甚至以两者进行，因为固相可以在稍后阶段引入，例如在检测第二RCP的步骤或者在生成第二RCP的阶段等引入。

该方法的形式可以基于样品的性质、或靶核酸分子、或所使用的希望读出或检测技术来选择。例如，对于液体或液化或溶解的样品，或对于分离或纯化的核酸等，或对于样品中非核酸分析物的检测(例如，血清或血浆或其他体液等中的蛋白质的检测)，可以采用溶液相形式。另一方面，为了检测固体样品诸如组织或细胞中的靶序列，例如用于原位检测，可以使用固相形式。出于其他原因，例如对于特定的测定形式或者只是根据选择，可能还希望固定化样品或靶核酸。因此，可以将分离的细胞样品固定在支持物上，或者可以将核酸从样品中分离或捕获到固体支持物上，等等。在另一个实施例中，第二RCA反应的引物可以固定化在固体支持物上。

在一个实施例中，该方法可以用于靶核酸序列的定位检测。“定位”检测是指使引起核酸检测的信号定位到核酸，在这种情况下第二RCP定位到靶核酸。因此核酸可以在样品中或在样品中其位置处检测。换言之，可以确定(或“检测”)样品内核酸的空间位置(或定位)。这意味着核酸可以定位到或定位在其所在或表达的细胞内，或者定位到细胞或组织样品内的位置。因此，“定位检测”可以包括以任何方式确定、测量、评估或测定核酸的存在或数量和位置或不存在。

在特定的实施例中，该方法可用于靶核酸序列的定位(特别是原位)检测。更特别地，该方法可用于细胞样品中的核酸(特别是mRNA)的定位(特别是原位)检测。

如本文所用，术语“原位”是指在检测靶核酸序列的天然环境中检测靶核酸序列，即在检测靶核酸序列通常出现的细胞或组织中检测靶核酸序列。因此，这可以指靶核酸序列(例如，RNA)的自然或天然定位。换言之，可以在核酸在其天然环境或形势中出现的位置或在其天然环境或形势中出现时检测核酸。因此，核酸不会从其正常位置移动，即其不会以任何方式分离或纯化，或转移到另一位置或介质等。通常，该术语是指出现在细胞内或细胞或组织样品内(例如其在细胞或组织内和/或在其正常或天然细胞环境内的天然定位)时的核酸。特别地，原位检测包括检测组织样品并且特别是组织切片内的靶核酸(例如RNA，尤其是mRNA)。在其他实施例中，该方法可以在分离的细胞样品上进行，使得细胞本身不在原位。

在其他实施例中，如上所述，检测不是定位的，或者不是原位的。在其他实施例中，该方法可以在溶液中进行。特别地，核酸可以在溶液中。因此，例如，该方法可以在包含分离的核酸的样品上进行。

靶核酸分子可以存在于样品内。样品可以是含有来自任何来源或任何起源的任何量的核酸的任何样品，其中希望检测靶核酸分子中的靶核酸序列。因此，样品可以是任何临床或非临床样品，并且可以是其中可能存在靶核酸分子的任何生物、临床或环境样品。

样品可以是任何含有靶核酸分子的样品，并且包括天然样品和合成样品二者，即，天然存在的材料或已经制成的制剂。天然存在的样品可以在进行本文的方法之前被处理或加工。包括所有生物和临床样品，例如生物体的任何细胞或组织样品，或任何体液或源自其的制剂，以及诸如细胞培养物、细胞制剂、细胞裂解物等的样品。还包括环境样品，例如，土壤和水样品或食物样品。样品可以是新鲜制备的，或者它们可以任何方便的方式预先处理例如以用于存储。

因此，代表性样品包括可以含有靶核酸分子的任何材料，包括例如食物和类似产品、临床和环境样品。样品可以含有任何病毒或细胞材料，包括所有原核或真核细胞、病毒、噬菌体、支原体、原生质体和细胞器。此类生物材料因此可以包含所有类型的哺乳动物和非哺乳动物动物细胞、植物细胞、包括蓝绿藻在内的藻类、真菌、细菌、原生动物等，或病毒。细胞可以是例如人细胞、鸟类细胞、爬行动物细胞等，但不限于此。

因此，代表性样品包括全血和血液衍生产品(诸如血浆、血清和血沉棕黄层)、血细胞、尿液、粪便、脑脊髓液或任何其他体液(例如呼吸道分泌物、唾液、乳汁等)、组织、活组织检查、细胞培养物、细胞悬浮液、条件培养基或细胞培养物成分的其他样品等。可以以任何方便或希望的方式(例如通过细胞裂解或纯化、分离核酸等)预处理样品以准备用于该方法。

在一个实施例中，样品包含已从临床样品或临床样品的培养物中分离的微生物细胞或病毒。在此类样品中，靶核酸分子可以是存在于微生物细胞中的核苷酸序列，例如具有微生物细胞或病毒在任何水平(例如在类型、组、纲、属、种或品系水平)上的特点、区别或特征的核苷酸序列。

在另一个实施例中，样品可以含有无细胞DNA。样品可以是直接含有无细胞DNA的样品，诸如血浆或血清，或者可以分离无细胞DNA。

在另一个实施例中，样品可以含有外来体。

对于定位的原位检测，样品可以是其中可以存在核酸分子的任何细胞样品，只要此类样品适合定位的原位检测。这可以是其中核酸存在于样品中固定的、可检测的或可视的位置的样品。因此，样品将是反映核酸(例如RNA)通常或天然(“原位”)定位的任何样品，即核酸通常或天然存在的任何样品。此类样品将有利地是或包含细胞或细胞群，诸如组织。实例是样品，诸如培养的或收获的或活检的细胞或组织样品，其中可以检测核酸以揭示核酸的定性性质，即存在核酸，或核酸的核苷酸序列或核酸中一个或多个核苷酸的存在和/或身份，以及相对于细胞其他特征的定位。细胞样品可以新鲜制备或可以任何方便的方式(诸如通过固定或冷冻)预先处理。因此，可以使用新鲜的、冷冻的或固定的细胞或组织，例如FFPE组织(福尔马林固定石蜡包埋)。样品可以包含含有核酸的任何细胞类型，包括如上所讨论的所有类型的细胞。

用于原位检测的代表性样品可以包含固定的组织切片、新鲜冷冻组织或包含一个或多个细胞的细胞学制剂。样品可以被透化以呈现可触及的核酸，例如RNA。使细胞透化的适当方法是本领域众所周知的并且包括例如使用去污剂，例如适当稀释的Triton X-100溶液，例如0.1％ Triton X-100，或Tween，0/1％ Tween，或酸处理，例如使用0.1M HCl的酸处理。组织样品的透化还可以包括用一种或多种酶处理样品，例如胃蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶原或链霉蛋白酶等。此外，可以如本领域已知的那样对样品进行微波处理。

也可以处理样品以将含在细胞中的核酸(例如RNA)固定到样品，例如将其固定到细胞基质。此类程序是已知的并且在本领域中有描述。例如，在原位杂交领域，用于将mRNA固定到细胞的试剂是已知的。特别地，RNA中的5'磷酸基团可以经由EDC介导的缀合与存在于细胞基质中的蛋白质上的胺连接(EDC：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)，从而有助于保持RNA相对于其他细胞组分的定位。此类技术以前已经关于微小RNA及其经由原位杂交的检测进行了描述。可替代地，在进行逆转录步骤以从RNA靶标生成cDNA的程序中，可以对cDNA引物和/或cDNA分子的5'末端进行交联活动。这可以使用例如DSP化学品或丙烯酸NHS酯来实现。

由于靶核酸分子本身不需要是测定的靶分析物，但可以是例如在任何希望分析物的测定过程中使用或生成的报告分子，因此样品不需要是天然含有核酸或核酸来源(例如细胞或病毒，或生物或临床材料等)的样品。如上所述，样品可以是合成或人工样品。因此，它可以是已经对其进行分析物检测测定的样品，在该样品中已经生成了靶核酸或已经向其中添加了靶核酸分子。它可以是反应混合物或反应产物，例如由检测靶分析物的免疫测定产生的产物，例如免疫PCR、免疫RCA或邻近测定(例如邻近连接测定(PLA)或邻近延伸测定(PEA))，如上所讨论的。

靶分析物可以是任何希望检测的分析物。如上所述，在实施例中，本文方法的靶核酸分子是靶分析物。在其他实施例中，在靶核酸分子是报告分子的情况下，靶分析物可以是任何希望检测的分析物。分析物可以是核酸、蛋白质(该术语包括肽和多肽)或任何其他化学或生物分子或部分，包括例如碳水化合物，例如诸如可以作为蛋白质上的糖基出现。靶分析物因此可以是修饰的蛋白质，例如具有在分析物测定中检测到的翻译后修饰。

在一个实施例中，靶分析物可以是在细胞或囊泡或其他细胞或亚细胞区室的表面上检测到的蛋白质或蛋白质分子的组分。例如，细胞外囊泡或外泌体可以通过其表面存在的不同蛋白质来检测和区分。前列腺小体已被提议作为前列腺癌的生物标记物，并且特定的或选择的前列腺小体或其他细胞外囊泡可以通过检测其上的一种或多种表面蛋白来检测和区分。

挂锁探针可以包含一个或多个进一步的序列，该序列可以用于将序列引入连接产物，从而引入RCP(作为互补拷贝)。这可以是例如标签或检测序列，例如条形码或鉴定基序，或检测探针或引物的结合位点。对于第二挂锁探针，尤其如此。例如，可以在挂锁探针的骨架区域的一部分(即靶结合区之间的区域)中发现此类进一步的序列。在哑铃探针中，它可以位于探针的双链体区域。标签诸如条形码或探针/引物结合位点可以根据不同的需要/目的进行设计，例如，以引入通用或共有序列以使多重设置中的不同连接探针能够一起加工，例如，以引入通用或共有扩增引物的结合位点。这将使不同的连接探针能够一起扩增，例如在通过PCR或RCA进行的文库扩增中。

特别地，第二挂锁探针可以含有检测序列，通过该检测序列可以检测到第二挂锁探针。检测序列的互补序列将掺入到第二RCP中，并且可以通过例如检测探针与其的结合或通过测序来检测。检测序列可以对挂锁探针具有特异性，并且因此对靶序列或希望检测的序列变体具有特异性。因此，每个第二挂锁探针可以具有不同的检测序列。可以检测检测序列以检测或鉴定哪个第二挂锁探针在RCA中被扩增，并因此检测或鉴定存在靶序列。例如，可以在用于检测靶序列变体的方法的情况下应用此类方案，其中每个第二挂锁都提供有对特定变体具有特异性的检测序列。因此，检测序列可被视为标记或鉴定序列。如本文所用，术语“检测序列”包括出现在挂锁探针中的检测序列和出现在RCP中的互补拷贝二者。

因此，标签/条形码序列(特别包括检测序列)可以用于“标记”不同的挂锁探针，使得它们或它们的连接或扩增产物可以容易地彼此区分。此外，此类序列可以用于标记不同的样品等，例如使得它们可以被合并(即“样品”标签或标记物)。因此，在多重设置中，不同的探针(即针对不同靶核酸序列或不同变体的探针)可以提供有不同的标签序列(例如不同的标记物或检测序列)和/或它们可以提供有相同的标签序列例如以用于引入共有或通用序列。此类方法可以与特定检测方法结合使用，包括使用检测探针或测序方法，诸如杂交测序、连接测序或其他下一代测序化学，例如在样品中多个靶核酸的多重检测中。

如本文所用，术语“杂交”或“杂交”是指在核苷酸序列之间形成双链体，该核苷酸序列足够互补以经由沃森-克里克碱基配对或任何类似的碱基对相互作用形成双链体。当那些分子共享碱基对组织同源性时，两个核苷酸序列彼此“互补”。因此，分子或探针或序列中的具有互补性的区域是指能够形成双链体的分子或探针或序列的一部分。杂交不需要序列之间的100％互补性，并且因此彼此具有互补性的区域不需要序列完全互补，但不排除这一点。因此，具有互补性的区域可以含有一个或多个错配。因此，如本文所用，“互补”是指“功能互补”，即足以介导生产性杂交的互补性水平，其涵盖小于100％的互补性程度。可以通过适当调整杂交条件来控制所容忍的错配程度。核酸技术领域的技术人员可以根据经验考虑许多变量，按照本领域提供的指导来确定双链体稳定性，该变量包括例如各个分子或探针寡核苷酸的长度和碱基对组成、离子强度和错配碱基对的发生率。因此，合适的探针及其结合区的设计，以及它们与其各自靶标杂交的条件完全在本领域技术人员的常规技能范围内。

具有互补性的区域，诸如例如与挂锁探针结合区中的靶序列具有互补性的区域，或在检测序列与检测探针之间的具有互补性的区域，或RCA引物与环化挂锁探针具有互补性的区域等，可以是至少6个核苷酸长以确保结合的特异性，或更特别地至少7、8、9或10个核苷酸长。该区域的长度上限并不重要，但可以例如高达50、40、35、30、25、20或15个核苷酸。因此，互补区域的长度可以在上述长度下限中的任一个与长度上限中的任一个之间的范围内。在挂锁探针的情况下，单个靶结合区的长度可以在较低范围内，使得当与其靶标杂交时两个结合区的总长度在较高范围内。例如，单个靶结合区可以是8-15个核苷酸，例如10-12个核苷酸，使得总杂交长度为16-30个核苷酸长，例如20-24个核苷酸长。在探针的构象和结构域的间距以及希望或有利的杂交的限制下，可能希望最小化挂锁探针的总长度以最小化进行RCA的环的大小，并因此在可能时最小化互补区域的长度。

可以使用任何方便的方案来检测第二RCP(和/或任何更多代的RCP)。根据待检测的靶序列、方法的目的和/或方法中采用的程序的具体细节，采用的检测方案可以非特异性或特异性地检测RCP。

例如，可以直接检测RCP，例如串联体可以被裂解以生成单体，其可以使用凝胶电泳来检测，或者更典型地通过杂交与RCP中的检测序列杂交的标记检测探针来检测，如上所讨论的。后者可以特别用于原位方法。然而，检测探针不必直接标记。例如，检测探针可以是用作夹心探针的未标记探针。夹心探针的概念在本领域中是众所周知的，并且可以根据任何方便的方案来应用。夹心探针可以与RCP结合，但自身不直接标记；相反，它们包含标记的二级寡核苷酸可以与之结合的序列，从而在RCP和标记的二级寡核苷酸之间形成“夹心”。

RCP还可以使用非序列特异性核酸标记方法检测，例如在文献中广泛已知的DNA结合染色剂或染料，或者通过使用标记的核苷酸掺入RCP。可替代地，可以间接检测RCP，例如该产物可以通过PCR扩增并且可以检测扩增产物。

RCP可以使用文献中已知的用于分析核酸分子的任何确立已久的方法来检测，包括液相色谱法、电泳法、包括CyTOF在内的质谱法、显微术、实时PCR、荧光探针、微阵列、诸如ELISA的比色分析、流式细胞术、质谱法，或通过基于浊度测量、磁性、颗粒计数、电、表面传感、重量的检测技术来检测。一般而言，此类技术与溶液测定相关。

对于定位的原位检测方法，通常可以使用标记的检测探针来检测RCA产物，该检测探针可以用任何可检测的标记进行标记，该可检测的标记可以是直接或间接给出信号的。例如，标记可以是光谱法或显微镜法可检测的，例如它可以是荧光或比色标记、颗粒或酶标记。可以使用免疫组织化学技术中使用的任何标记。

在用于检测不同靶序列和/或变异靶序列的多重程序中，不同的第二RCP产物可以通过原位测序(包括例如合成测序、杂交测序和连接测序)，下一代测序和/或序列条形码解码技术(包括通过合成测序、连接测序或杂交测序进行)和/或通过使用检测探针来检测和区分。根据本领域众所周知的技术，根据多重水平，可以使用组合标记方法。例如，sRCA(SafeLock)产物中的大量重复序列可以经由使用荧光或其他分光光度法可检测探针进行比例标记来实现大量此类产物的区分。此类比例标记的检测探针可以在流式细胞术或显微检测技术(例如检测大量序列的成像)期间使用，例如至少两个不同比例的荧光团的组合可以导致生成多个荧光标记群。例如，已经发现使用不同比例的两种荧光团的组合可以创建7个不同的群体。这可以使用3色或4色组合进行扩展。

在涉及使用检测探针的方法中，检测探针或任何二级标记探针可以用直接或间接可检测的标记进行标记。直接可检测标记是无需使用额外试剂即可直接检测的标记，而间接可检测标记是可通过使用一种或多种额外试剂检测的标记，例如，其中标记是由两个或更多个组件构成的信号产生系统的成员。在许多实施例中，标记是直接可检测的标记，其中感兴趣的直接可检测的标记包括但不限于：荧光标记、放射性同位素标记、化学发光标记等。在许多实施例中，标记是荧光标记，其中在此类实施例中使用的标记试剂是荧光标记的核苷酸，例如荧光标记的CTP(诸如Cy3-CTP、Cy5-CTP)等。可以用于标记核苷酸以产生标记的探针核酸(即检测探针)的荧光部分包括但不限于：荧光素、花菁染料，诸如Cy3、Cy5、Alexa 555、Bodipy 630/650等。如本领域已知的，也可以使用其他标记，诸如上述那些。

尽管可以采用各种检测模式，但可以方便地通过显微术或流式细胞术检测第二RCP。在这两种情况下，都可以使用直接或间接标记的检测探针，例如使用可以容易检测的荧光标记。特别地，在基于显微术的方法中，可以通过成像检测RCP，如下面的实例所示。此类检测技术的使用有利地允许第二RCP被数字记录。事实上，由于本方法提供的信号扩增程度允许第二RCP被可视化，因此它们可以被相机或任何包括相机的装置(诸如手机)检测。

为了检测以同质形式生成的第二RCP，可以将它们捕获或降到固体支持物或表面，以促进成像或更普遍的显微检测。作为第二代RCA产物的第二RCP更大且更重，并且因此容易通过离心降到表面。因此，例如，可以容易地旋转板以将第二RCP降到孔的底部以用于通过显微术(特别是成像)检测。

如上所述，本文还提供了用于进行这些方法的试剂盒。试剂盒可以包括如上所讨论的挂锁探针，任选地以及一种或多种试剂和/或试剂盒的使用说明。此类试剂包括dNTP和聚合酶和连接酶，以及用于第一和/或第二RCA反应的RCA引物。此外，组分可以包括用于各种反应中的一种或多种的缓冲液或其他反应组分。更进一步的任选组分可以包括用于检测第二RCP的工具或试剂。这可以包括例如检测探针和任何必要的二级标记试剂，包括例如如上所讨论的。其他任选组分可以包括固体支持物和/或用于捕获和/或固定化靶核酸分子或反应组分的工具。说明可以是例如印刷形式，或在计算机可读介质上，或作为网站地址。

如上所述，该方法可以使用固相进行，例如，其中第一RCA产物固定化在固相上，从而允许使用洗涤步骤。这可以由靶分子的固定化引起，例如在原位检测程序中。固相测定的使用提供了以下优势，特别是对于困难样品的检测：洗涤步骤可以帮助去除未结合和/或未连接的探针等，抑制组分，并且可以从不希望的大样品体积中富集目标或分析物。

第一RCA产物和/或靶分子在固相上的固定化可以以多种方式实现。因此，考虑了固相测定的若干实施例。在一个此类实施例中，样品可以提供在固体支持物上，诸如例如在原位应用中。可替代地，固定化(或可固定化)的捕获探针可以捕获靶核酸分子，并且可以生成第一RCA产物以使其与分析物附着，例如通过为靶分子或与靶分子附着的第一RCA的引物与分析物连接。可替代地，可以将第一RCA产物简单地固定化到固体支持物。例如，第一RCA的引物可以提供有可固定化的基团或部分或用于固定化的工具，或者可以在第一RCA之前被固定化。

固定化的方式或工具和固体支持物可以根据选择选自本领域广泛已知和文献中描述的任何数量的固定化工具和固体支持物。因此，捕获探针或第一RCA引物或第一RCA产物可以与支持物直接结合(例如化学交联)，它可以通过连接基团或通过中间结合基团(例如通过生物素-链霉亲和素相互作用)间接结合。因此，捕获探针或第一RCA引物或第一RCA产物可以提供有在支持物上提供的固定化工具(例如，亲和结合伴侣，例如生物素或半抗原或核酸分子，该亲和结合伴侣能够结合其结合伴侣，即同源结合伴侣，例如链霉亲和素或抗体或核酸分子)。捕获探针可以在结合靶分子之前或之后固定化。此外，此类“可固定化”捕获探针可以与支持物一起与样品接触。类似地，第一RCA引物可以在第一RCA等之前或之后固定化。

捕获探针可以是例如能够特异性结合靶分子的抗体或核酸分子。

固体支持物可以是目前广泛使用或建议用于固定化、分离等的任何众所周知的支持物或基质。它们可以采取颗粒(例如，可以是磁性或非磁性的珠)、片材、凝胶、过滤器、膜、纤维、毛细管或微量滴定条、管、板或孔等的形式。

支持物可以由玻璃、二氧化硅、乳胶或聚合材料制成。合适的是呈现用于结合分析物的高表面积的材料。此类支持物可以具有不规则的表面并且可以是例如多孔的或颗粒状的，例如，颗粒、纤维、网状物、烧结物或筛子。颗粒状材料(例如珠)因其更大的结合能力而有用，特别是聚合物珠。

方便地，颗粒状固体支持物可以包含球形珠。单分散颗粒，即大小基本均匀(例如直径标准偏差小于5％的大小)的颗粒具有提供非常均匀的反应再现性的优点。

如上所述，靶核酸本身可以固定化(或可固定化)在固相上，例如通过非特异性吸收固定化。在特定的此类实施例中，分子可存在于细胞内，任选地被固定和/或透化，其附着(能够附着)于固体支持物，例如包含靶分子的组织样品可以固定化在显微镜载玻片上。

上面讨论了本文方法的优点。此类优点在检测复杂样品中的靶序列或变体或它们以低丰度存在的情况下特别有益。如上所讨论的，本方法提供了高度的信号扩增，使该方法非常灵敏。因此，该方法特别适用于检测或鉴定非常罕见的序列变体。例如，该方法可以用于发现和检测患者样品中源自肿瘤的突变DNA序列，尤其包括血浆中的无细胞DNA。因此，该方法可以用于癌症的诊断或监测，或例如用于揭示癌症的复发。该方法可用于任何无细胞DNA的情况，并且也可以用于产前检测，特别包括NIPT。该技术速度快，对仪器的要求极低，并允许对序列变体进行多重分析以提高灵敏度。

低频或罕见序列变体或突变的检测也需要高检测特异性，以及引入可能被误认为变异序列的人工序列改变的风险最小化。这也由使用间隙-填充挂锁机制和RCA扩增，以及通过第二挂锁探针靶向挂锁填充的本方法的组合提供。

在本方法中，第一RCP以高度特异性的方式生成，并且第二RCP的高扩增生成依赖于第一RCP的存在。

每个RCA产物通常含有数百个或在某些情况下大约数千个用于生成它的RCA模板环(例如环化挂锁探针)的互补物。第二代RCA产物是通过环化的第二挂锁探针在第一代RCA产物上的RCA得到的，因此可以含有例如1000X1000个单体序列，因此尺寸大并且分子量可以达到数十千兆道尔顿。此外，如上所述，更多的单体序列拷贝可以通过更多代的RCA反应生成。可以容易地检测此类反应产物。第二RCA产物的尺寸可以达到几微米，并且它们可以容易地可视化为单个产物，例如通过显微术可视化。每个第二或进一步的RCA产物都可以作为克隆产物进行检测，由单一靶核酸分子生成，而不需要对RCA反应进行区室化。例如，当用荧光检测探针标记时，突出的明亮荧光反应产物允许在低放大倍数(例如20X)下跨越宽视野对单一分子的单独扩增产物进行计数和区分。第二或进一步的RCA反应产物足够大和明亮，可以通过标准流式细胞术记录。这允许使用普遍可用的仪器在几分钟内准备好计数和数字评分，从而在宽动态范围内提供出色的定量精度。如上所述，存在于串联的第二或进一步的RCA产物中的重复序列允许分析通过比例标记技术用不同荧光团组合标记的产物，从而允许增加多重化。由于它们的大尺寸和相当大的分子量，sRCA(SafeLock)产物也可以通过在普通台式离心机或类似设备中离心来富集。事实上，低速离心或单位重力可能就足够了。因此，本文的新方法实现了多个优点。

如上所讨论的，第二RCA反应提供的强信号扩增允许信号的即时和容易的可视化，例如在低放大倍数的显微镜下或在数字扫描图像上的可视化，因此可以允许在临床场景中快速和容易地目视检查测定结果，例如在常规使用中检查病理结果。因此，本发明的方法特别适用于临床分析程序。

该方法可以有助于鉴定人类组织中罕见的病毒基因组整合拷贝，或以其他方式检测罕见的RCA产物，诸如组织的无效突变检测。另一个容易鉴定罕见事件可能有帮助的实例是在绝大多数非CTC细胞中筛查循环肿瘤细胞(CTC)的存在。该方法产生的强信号允许在低放大倍数下快速且容易地鉴定事件(检测CTC)。

该方法允许加速检测测定，这在诸如医生办公室等的护理地点可能是有价值的。在这方面，可以在相对短的时间内进行第二RCA。

信号强度/速度的增加可以允许除传统的基于荧光的方法之外的其他检测手段，例如使用基于浊度测量、磁力、颗粒计数、电、表面传感和重量的检测技术。例如，来自第二代RCA的一个单独sRCA产物在1小时扩增后具有几飞克的潜在重量。这种重量增加可以通过本领域已知的方法和手段检测，诸如悬臂梁、表面等离子体方法和微量天平，例如石英晶体微量天平等。此外，如上所述，第二RCP的大小和重量增加允许它通过离心有效地定位到表面。方便地，这可以在15分钟内以3000X进行，这与第一代RCA产物形成对比，后者无法使用台式离心机通过离心有效地捕获。

本方法可以使得能够生成定位到第一RCA产物的增强信号，它还赋予使用标准流式细胞仪或分布在平面表面上等对单独反应产物(第二RCA产物)计数的能力以用于高精度数字检测。特别地，第二RCP可以用诸如HRP的显色试剂染色，并经由智能手机摄像头成像。因此，该方法可以允许与数字PCR等效的反应，但不需要乳液或微加工结构，或寻找每个区室恰好存在一个模板的条件。

源自本发明方法的明显扩增产物将进一步允许克隆单独的RCP，因为从单独的第一RCA模板获得的产物可以被可视化。因此可以鉴定和分离单独的第二RCA产物。例如，借助于本发明的扩增方法，可以在低熔点分离用琼脂糖中实现可视化而无需放大倍数，然后可以分离产物，例如用牙签划出范围，类似于细菌菌落的分离。

罕见突变的检测对于临床诊断非常重要。例如，某些基因的突变(例如KRAS突变)在诊断上可以是重要的，并且可以用于鉴定对特定疗法(例如抗EGFR疗法)的获得性抗性的出现。近年来，许多努力都集中在开发检测此类突变的方法上。本发明的方法可以为此类方法提供有用的补充。

除了使得能够检测DNA样品中以低频率存在的点突变外，本方法还提供了一种以PCR或任何其他当前方法不能进行的方式筛选DNA样品中是否存在任何和所有极大量的不同靶序列的有效手段。通过需要间隙填充挂锁探针两个末端的靶标识别的本方法实现的靶标选择性类似于使用其引物对的PCR。然而，与PCR不同，间隙填充挂锁探针的分子内反应允许平行应用数十万个探针，而不会降低靶标选择性。

在这种方法中，靶向填充序列的第二挂锁反应具有进一步增加检测特异性的效果，因为来自第一间隙填充挂锁的任何虚假反应产物都不会被第二挂锁探针识别，无论间隙填充与否。这类似于使用嵌套PCR来提高检测特异性。

在每个探针环化反应后，剩余未反应的探针和样品核酸序列可以使用保留成功环化探针的核酸外切酶混合物去除。

此外，sRCA产物的离散性质允许通过为每个检测的靶分子产生一种反应产物并收集这些明显的反应产物来进行数字检测，并将与反应中任何其他材料混合的风险最小化。例如，可以为所有类型的细菌或所有种类的昆虫或真菌创建探针混合物。然后这可以用于鉴定阳性反应产物，例如通过PCR扩增二级挂锁探针上的标签序列，并将产物与标签阵列或类似物杂交来鉴定阳性反应产物。

更进一步地，如上所述，其中使用间隙-填充挂锁进行第二和任选进一步的连接和RCA反应，然后靶核酸序列拷贝的制备性生产成为可能。

目前的sRCA(SafeLock)方法还通过询问单独RCA产物的重复序列而不是单独靶序列来增加基因分型的精度。因此，挂锁探针偶尔出现的错误输入可以容忍并且不会导致错误结果，只要该错误输入比单独RCA产物中的正确结果少得多。这允许经由多数表决机制进行基因分型。这也会对基于挂锁探针的基因分型的完成方式产生影响，只要正确和错误反应之间的比例令人满意并且挂锁探针检测到足够数量的重复序列，就可能能够通过使用未以100％效率检测到任何变体的条件来增强序列区分。

现在将参考以下附图和非限制性实例更详细地描述该方法。

附图说明

图1：方法的示意性说明。显示了间隙-填充-连接、第一RCA、第二挂锁(称为基因分型挂锁)连接和第二RCA步骤。第二RCP由差异标记的检测探针检测。

图2：间隙-填充过度延伸的演示。传统的挂锁连接是间隙-填充-连接探针的一个条件，其中间隙为零。泳道1显示10nM挂锁/10nM连接模板(ligtemp)+带dNTP的扩增酶；泳道2显示I10 nM挂锁/10nM连接模板(ligtemp)+扩增酶＝带dNTP的聚合酶；泳道3显示10nM挂锁/10nM连接模板(ligtemp)对照。当泳道1、2和3在没有聚合酶的情况下从变性温度冷却到退火温度时，完整的环有效地形成(无连接酶对照参见泳道3)。然而，当在变性→退火步骤期间存在聚合酶时，形成过度延伸产物(泳道2)。dNTP存在于泳道1和泳道2中加载的两个反应中。

图3：单循环一步间隙-填充-连接方案研究。在这个实验中，使用了50ng gDNA。研究了退火温度和变温速度以及拥挤剂的影响。

图4：在循环间隙-填充-连接反应中，对于指定循环数使用50ng基因组DNA。进行第二RCA以产生可容易检测的sRCA产物，该产物通过显微术和使用图像处理算法进行计数。

图5：在4个反应循环后，在循环间隙-填充-连接方案中评估拥挤剂(PEG)的作用。

图6检测样品中的基因组DNA掺入的来自循环间隙-填充方案与sRCA方案的组合的图像数据，KRAS G12D基因组DNA以50ng gDNA水平掺入野生型基因组。图像分别显示野生型(WT)(顶部)和突变(G12D)(底部)图像通道。

图7：在经由sRCA方案检测到等位基因特异性后，对连续稀释实验的产物进行量化，如图7所示。进行了两次重复，并且每个数据点都根据在随机位置的同一反应中获取的四个不同数据图像计算。

图8：50ng野生型gDNA样品用间隙-填充-连接sRCA方案进行分析。KRAS野生型和KRAS G12S第二RCA探针用于检测间隙填充环，并且它们在图中指示的其相应通道中产生第二RCA产物。图像分别显示野生型(WT)(顶部)和突变(G12S)(底部)图像通道。从突变通道检测到信号，每个序列上的矩形表示间隙大小，并且三角形表示基因分型探针正在检测的靶碱基。

图9：原位靶向细胞RNA分子的KRAS检测。A549细胞系是KRAS G12S突变的纯合子。当应用野生型和KRAS G12S sRCA特异性探针二者时，用不同颜色检测所得sRCA产物，但没有看到两种颜色的组合。细胞核、WT和突变(G12S)通道分别从上到下显示。

图10：原位靶向细胞RNA分子的KRAS检测。HaCAT细胞系是野生型KRAS基因的纯合子。当应用野生型和KRAS G12S sRCA检测探针二者来检测间隙-填充产物时，sRCA产物始终呈红色，表明存在野生型KRAS。细胞核、WT和突变(G12S)通道分别从上到下显示。

图11：原位靶向细胞RNA分子的KRAS检测。HaCAT细胞系是野生型KRAS的纯合子，而A549细胞系是突变KRAS G12S等位基因的纯合子。来自两个细胞系的细胞在相同的载玻片上以每个A549细胞100个HaCAT的比例共培养。我们使用野生型KRAS探针和KRAS G12S sRCA探针应用间隙-填充-连接sRCA方案来检测相应细胞系中RNA衍生的间隙-填充-连接产物。数据是在10X物镜下记录的。DAPI、HaCaT细胞系的WT和A549细胞系的突变(G12S)通道分别从上到下显示。

图12：淋巴瘤组织样品中DNMT3A的SafeLock RNA检测。图12A显示了使用DNMT3A-MUT(I66T+E733G)探针和DNMT3A野生型探针在来自患者HI185-13的样品上进行的DNMT3ARNA检测，该患者是DNMT3A基因中的I66T和E733G突变的杂合子。图12B显示了使用DNMT3A-MUT(I66T+E733G)探针和DNMT3A野生型探针在来自患者A23066-10的样品上进行的DNMT3A RNA检测，该患者是DNMT3A野生型基因的纯合子。使用DNMT3A-MUT(I66T+E733G)和DNMT3A野生型探针应用间隙-填充-连接sRCA方案来检测样品中RNA衍生的间隙-填充-连接产物。数据是在40X物镜下记录的。组合的DNMT3A-MUT(I66T+E733G)突变和DNMT3A野生型通道显示在两个患者样品的显微照片的左侧，并且探针的单独通道分别显示在中心和右侧。

实例

溶液相方案的材料和方法

无细胞血浆DNA的提取。

使用QIAamp循环核酸试剂盒(Qiagen cat.55114)从血浆中提取DNA。从每位患者的多达2mL血浆中提取DNA，并在50μL洗脱缓冲液中洗脱。

基于间隙-填充循环的探测和扩增。

在20μl反应中利用含有以下的混合物将无细胞血浆DNA中感兴趣的序列以循环方式掺入间隙-填充探针(“第一挂锁探针”)：1X phi29缓冲液、0.25μM dNTP、100nM间隙-填充探针、1mM NAD、0.5U/μl扩增酶和0.0025U/μl Stoffel DNA聚合酶、2.5ng/μl cfDNA样品和15％ PEG4000。循环孵育计划如下：95℃持续60秒，10个95℃持续60秒的循环，60℃持续120秒，32℃持续120秒，45℃持续300秒。

核酸外切酶清理。10uL的清理混合物含有0.5U/μl核酸外切酶I(NEB)、2.5U/μl核酸外切酶III(NEB)和0.1U/μl核酸外切酶λ(NEB)，并将其与20μl间隙-填充产物混合。将混合物在37℃下孵育60分钟，然后在85℃下孵育20分钟。

通过第一RCA扩增靶序列。通过滚环扩增来扩增含有靶核苷酸的间隙-填充环状产物(连接的第一挂锁探针)。将含有1X Phi29缓冲液、700nM引物、1.4mM dNTP(ThermoScientific)和1U/μl Phi29聚合酶的5μl RCA缓冲液添加到反应混合物中。将反应在37℃下孵育30分钟，然后在65℃下孵育10分钟。

经由第二挂锁探针连接对RCA产物进行基因分型。使基因分型挂锁探针(第二挂锁探针)与第一代RCA产物(第一RCP)杂交，并且通过将5μL连接混合物添加到反应混合物中并在45℃下孵育30分钟以序列特异性方式连接，该连接混合物含有1xPhi29缓冲液、3mM NAD、0.6U/μl扩增酶和100nM基因分型挂锁探针对。

第二RCA-sRCA。包围第一代RCA产物的连接的基因分型(第二)挂锁探针在二次RCA反应中被扩增。将含有1X Phi29缓冲液和1.2U/μl Phi29 DNA聚合酶的30μL RCA混合物添加到基因分型连接混合物中，并在37℃下孵育10分钟。然后向反应混合物中添加5μL含有2.4mM dNTP(Thermo Scientific)和1.3μM引物的反应混合物，并将反应在37℃下孵育30分钟。

通过流式细胞术对sRCA产物(第二RCA产物)进行数字记录。将含有sRCA产物的最终反应混合物稀释到在20mM Tris-HCl、20mM EDTA、0.1％ Tween 20和1M NaCl中的杂交缓冲液中至最终体积为250μl，该杂交缓冲液含有100nM荧光团标记的对不同sRCA产物具有特异性的寡核苷酸探针。将该溶液施加到Fortessa流式细胞仪(BD Bioscience)，并以“慢”速度对sRCA产物进行计数，每个样品持续150秒。

其他方法

基于非循环间隙-填充的探测和扩增。(图3和实例2)

在20μl反应中利用含有以下的混合物将无细胞血浆DNA中感兴趣的序列以非循环方案掺入间隙-填充探针：1X phi29缓冲液、0.25μM dNTP、100nM间隙-填充探针、1mM NAD、0.5U/μl扩增酶和0.0025U/μl Stoffel DNA聚合酶、2.5ng/μl cfDNA样品，根据实验设置，在一半的反应中添加10％ PEG4000，并且在对照反应中没有添加PEG4000。孵育计划如下：95℃持续60秒，65℃/60℃/55℃持续600秒(在Veriti PCR机器(Applied Biosystem)上此步骤的变温速度设置为100％或4％)，32℃持续600秒，45℃持续1200秒。

实例8的附加方案

细胞和预处理。人HaCaT和人肺癌A549细胞系在不含酚红、含10％胎牛血清(Sigma)、2mM L-谷氨酰胺(Sigma)的杜氏改良伊格尔培养基(Gibco)中培养。两个细胞系在SuperFrost plus载玻片(Thermo Scientific)上以100:1的比例培养，并在PBS中洗涤后在室温下固定在70％乙醇中。通过使用在0.1M HCl中的来自猪胃粘膜的0.01％胃蛋白酶(Sigma,CAS#9001–75–6)在37℃下进行透化90秒，然后在PBS中洗涤并通过在乙醇(70％、85％、100％)中连续孵育脱水。

用于mRNA检测的cDNA合成。cDNA合成在提供的M-MuLV RT反应缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.3、75mM KCl、3mM MgCl2、10mM DTT)、0.5mM dNTP、0.2g/BSA(New EnglandBiolabs)、0.1μM各引物和10U/l的TRANSCRIPTME M-MuLV逆转录酶(DNA Gdansk,Poland)中在45℃下进行2小时。载玻片在PBS中洗涤两次，然后在3％多聚甲醛中固定5分钟，并在缝隙-填充挂锁探针杂交前在PBS中洗涤两次。

间隙-填充探针的杂交。在含有0.1M挂锁间隙探针1x扩增酶缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.3、25mM KCl、10mM MgCl2、0.5mM NAD和0.01％ Triton X-100)、0.2g/l BSA和100mM KCl的混合物中在45℃下进行杂交60分钟。

间隙-填充挂锁探针的间隙-填充和连接。将含有1X Stoffel缓冲液、10μM dNTP、1mM NAD、0.5U/μl扩增酶和0.0025U/μl Stoffel DNA聚合酶的聚合和连接反应混合物添加到样品中，并在37℃下孵育1小时，然后在45℃下孵育1小时。

通过第一RCA扩增靶序列。通过滚环扩增来扩增含有靶核苷酸的间隙-填充环状产物(连接的第一挂锁探针)。将含有1X Phi29缓冲液、100nM引物、200μM dNTP(ThermoScientific)和0.1U/μl Phi29聚合酶的滚环扩增混合物添加到反应混合物中。反应在37℃下孵育60分钟，然后用1X PBS-T洗涤三次。

经由第二挂锁探针连接对RCA产物进行基因分型。使基因分型挂锁探针(第二挂锁探针)与第一代RCA产物(第一RCP)杂交，并且通过将连接混合物添加到反应混合物中并在45℃下孵育60分钟以序列特异性方式连接，该连接混合物含有1x扩增酶缓冲液、0.6U/μl扩增酶和100nM基因分型挂锁探针对。

第二RCA-sRCA。包围第一代RCA产物的连接的基因分型(第二)挂锁探针在二次RCA反应中被扩增。将含有1X Phi29缓冲液、0.1U/μl Phi29 DNA聚合酶、200μM dNTP(ThermoScientific)和0.1μM引物的RCA混合物添加到反应混合物中，并将反应在37℃下孵育60分钟。

通过成像对sRCA产物(第二RCA产物)进行数字记录。最终的sRCA产物在20mMTris-HCl、20mM EDTA、0.1％ Tween 20、10ng/mL DAPI和1M NaCl中被杂交缓冲液标记并在37℃孵育60分钟，该杂交缓冲液含有100nM荧光团标记的对不同sRCA产物具有特异性的寡核苷酸探针。将最终的细胞样品安装在Vectashield封固剂(Vector Laboratories)中，并使用AxioPlan2荧光显微镜(Ziess,Germany)成像。

实例1

在存在聚合酶的情况下过度延伸的演示

在这个实验中，使用传统的非间隙-填充挂锁探针来显示过度延伸的原理。挂锁可以被视为具有零间隙。挂锁和连接模板在(1)连接酶和dNTPS或(2)连接酶和聚合酶以及dNTP的存在下孵育。使用单独的挂锁和连接模板(无连接酶、聚合酶或dNTP)作为对照(3)。结果如图2所示。泳道3(对照)显示没有像预期的那样创建连接环。当泳道1在没有聚合酶的情况下从变性温度冷却到退火温度时，有效地形成了完整的环(无连接酶对照参见泳道3)。然而，当在变性→退火步骤期间存在聚合酶时，形成过度延伸的产物(泳道2)。这解释了延迟延伸反应直到退火步骤完成并且挂锁探针的5'末端被杂交的必要性。

实例2

单循环一步间隙-填充-连接方案研究

我们最初研究了一些可能影响间隙-填充-连接效率(甚至是一步方案的单轮间隙-填充-连接)的条件(图3)。我们得出结论，可以优化稳定的杂交条件以及影响探针和模板杂交的其他条件，诸如升温速度和拥挤剂，以实现高间隙-填充-连接产量。

结果显示，在存在拥挤剂(PEG)的情况下，在55℃下的产量得到改善。

实例3

在循环间隙-填充-连接反应中连接挂锁探针累积的演示

我们使用实例2确定的条件对基因组DNA样品进行循环-连接间隙-填充-连接方案测试。产生的DNA环由RCA复制，然后使用第二挂锁探针进行基因分型，并进行二次RCA反应，从而产生第二RCA产物(sRCA产物)。图1示意性地说明了该方法的步骤，并且如图所示，可以通过流式细胞术、显微术或者甚至普通手机摄像头对它们进行数字记录。

从图4中可以看出，我们观察到了一个明显的趋势，即间隙-填充环随着间隙-填充-连接循环的增加而累积，表明循环方案按预期进行。

实例5

拥挤剂的作用

将拥挤剂PEG添加到循环间隙-填充-连接反应中，并在sRCA后对4个循环期间形成的产物进行计数。浓度为20％的PEG提供了最佳产量(图5)。

实例6

基因组DNA中突变体的检测

如图1所示，我们在基因组DNA样品上应用间隙-填充-连接方案与第二RCA的组合，其中KRAS突变基因组DNA被连续稀释到野生型基因组DNA中(图6)。图6显示了不同图像通道中的WT和突变产物，并且可以彼此区分。

我们进一步列举了产生图6中所示的连续稀释实验的sRCA(第二RCA)产物编号，并且该数字绘制在图7中。间隙-填充-连接方案能够检测KRAS G12D突变，甚至在1：10 000的稀释度下也能够检测。

实例7

间隙大小和靶突变体位置的研究

我们还研究了间隙大小和靶突变体位置对间隙-填充-连接保真度的影响，如图8所示。序列GGAGCTGGTGGCGTAGGC(SEQ ID NO.5)表示包含探针结合位点和靶序列的靶分子中的序列。如图8中每个显微图像的顶部所示，该序列被注释以说明间隙-填充-连接探针结合区(侧翼序列)、间隙-填充-连接区域(以矩形显示)和基因分型目靶碱基(以三角形表示)。

图8中的左侧组说明了使用6nt间隙并且基因分型靶碱基是间隙中的第二碱基时的结果，未揭示出非特异性产物。在右侧组中，也有6nt的间隙，但待填充的基因分型靶位置位于最后一个碱基处，观察到一些非特异性产物。在中间的图像中，探针在与其靶标杂交时有一个单核苷酸间隙，诊断核苷酸变体位于该间隙中。这些条件导致相当数量的错误产物。然而，可以优化条件以减少或最小化这种情况，例如包括使用不同的聚合酶来用于间隙填充延伸步骤。因此，间隙大小以及间隙内靶碱基的位置影响间隙-填充-连接机制的保真度。可以在给定情况下优化参数。这些数据是使用Stoffel片段生成的，Stoffel片段是Taq聚合酶缺少校对结构域的变体。

实例8

RNA的原位检测

我们还应用间隙-填充-连接/sRCA方案对细胞中的RNA分子进行原位基因分型，并且我们成功地在RNA水平上检测到不同细胞系的正确基因型。

间隙-填充挂锁探针和靶标的序列显示在下表1中。靶分子中的侧翼序列以下划线显示，间隙填充连接区域以粗体显示，并且基因分型靶碱基以双下划线显示。

在A549细胞系样品中(图9)，我们仅检测到突变信号(如KRAS G12S/G12S突变通道中可见；WT通道中无信号)，这与细胞系是KRAS G12S等位基因纯合子的事实一致。在没有逆转录酶的情况下，没有生成间隙-填充-连接探针的靶标，并且因此既没有检测到绿色信号也没有检测到红色信号。在HaCAT细胞中(图10)，只有野生型信号(如KRAS WT通道中可见)按预期检测到，因为该细胞系是野生型KRAS等位基因的纯合子。同样，在没有逆转录酶的情况下，没有生成间隙-填充-连接探针的靶标，因此既没有检测到绿色信号也没有检测到红色信号。当我们在共培养的A549和HaCAT细胞系上应用间隙-填充-连接sRCA与RNA检测的组合时，细胞表现出一种或另一种颜色的产物，而没有看到细胞含有两种不同颜色的sRCA产物(参见图11，其显示了不同通道中的细胞系)。

实例9

新鲜冷冻组织样品中的RNA的原位检测

还应用上述实例中描述的间隙-填充-连接/sRCA方案以对来自两个不同患者的新鲜冷冻淋巴瘤组织样品中的RNA分子进行基因分型。一名被鉴定为H1185-13的患者携带杂合的DNMT3AI661T和E773G突变，并且另一名被鉴定为A23066-10的患者携带不包含所述突变的纯合野生型DNMT3A基因，其基因型已通过下一代测序证实。通过间隙-填充-连接/sRCA方案成功以RNA水平检测到不同组织样品的正确基因型。

结果分别示于图12(40X放大倍数)。

在DNMT3A I661T+E733G+组织样品(图12A)中，检测到来自DNMT3A-MUT(I66T+E733G)探针和DNMT3A野生型探针的信号，这与组织样品源自携带杂合的DNMT3A I661TE733G突变的患者的事实一致。相反，未从DNMT3A I661T-E733G-组织样品(图12B)中检测到来自突变探针的信号，该样品仅包含该基因的野生型拷贝。

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SEQUENCE LISTING

<110> 稀有生物科学公司

<120> 检测靶核酸序列的方法

<130> P23113452WP

<150> GB 2019074.0

<151> 2020-12-03

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 间隙-填充探针-5'臂（5'靶结合区）

<400> 1

gtaggcaaga gtgccttgac gatacagcta 30

<210> 2

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 间隙-填充探针-非靶互补区（骨架区域）

<400> 2

tgtatctgac ttagcttcca tcttcataga gcgatatcct acggtagtgt atc 53

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 间隙-填充探针-3'臂（3'靶结合区）

<400> 3

gtggtagttg gagct 15

<210> 4

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶序列

<400> 4

cctgctgaaa atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctggtggcg taggcaagag 60

tgccttgacg atacagctaa ttca 84

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶分子中包含探针结合位点和靶序列的序列

<400> 5

ggagctggtg gcgtaggc 18

Claims

1.一种用于检测样品中靶分子中的靶核酸序列的方法，所述方法包括：

(i)使所述靶分子与第一挂锁探针接触，所述第一挂锁探针包含位于或靠近其相应的5'和3'末端的靶结合区，所述靶结合区能够与靶核酸分子中位于所述靶核酸序列侧翼的互补结合位点杂交，并允许所述探针的靶结合区与所述靶核酸分子杂交；

(ii)任选地在所述5'和/或3'末端裂解任何未杂交的核苷酸后，使用聚合酶延伸所述挂锁探针的杂交的3'末端以创建所述靶核酸序列的互补拷贝，并使延伸的3'末端与杂交的5'末端连接以环化所述挂锁探针；

(iii)使用环化的挂锁探针作为第一RCA模板进行第一RCA反应以生成第一RCA产物(RCP)，所述第一RCA产物包含所述靶核酸序列的拷贝的多个重复序列；

(iv)使所述第一RCP与包含对所述靶核酸序列具有特异性的靶结合区的第二挂锁探针接触并允许所述探针与所述多个重复序列中的靶序列杂交；

(v)连接杂交的第二挂锁探针以环化所述杂交的挂锁探针；

(vi)使用环化的第二挂锁探针作为第二RCA模板进行第二RCA反应以生成含有所述第二挂锁探针的多个重复序列互补拷贝的第二RCP；

(vii)检测所述第二RCP以检测所述第二挂锁探针，从而检测所述靶核酸序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(i)中，所述挂锁探针的3'靶结合区比5'靶结合区短至少6个碱基，并且使所述挂锁探针与dNTP、聚合酶和连接酶一起与所述靶核酸分子接触，并且其中所述dNTP以不超过10μM的浓度提供并且所述聚合酶以不超过0.025U/u的浓度提供。

3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(i)包括：

(a)使所述靶核酸分子与所述第一挂锁探针接触并允许所述探针的所述靶结合区与所述靶核酸分子杂交；以及

(b)在所述探针已与所述靶核酸分子杂交后，使杂交的挂锁探针/靶核酸反应混合物与聚合酶接触。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述方法用于检测样品中靶核酸分子中的变异靶核酸序列，并且步骤(iv)至(vi)包括：

(iv)使所述第一RCP与两个或更多个第二挂锁探针接触，所述第二挂锁探针各自包含对所述靶核酸序列的不同变体具有特异性的靶结合区，并允许所述探针与所述多个重复序列中的其相应的变异靶序列(在存在时的)杂交；

(v)使已杂交的所述第二挂锁探针连接以环化杂交的挂锁探针；

(vi)使用环化的挂锁探针作为第二RCA模板进行第二RCA反应以生成含有所述第二挂锁探针的多个重复序列互补拷贝的第二RCP；

(vii)检测所述第二RCP以鉴定所述第二挂锁探针，从而鉴定所述变异靶核酸序列。

5.根据权利要求2或权利要求4所述的方法，其中循环重复步骤(i)和(ii)以生成所述第一RCA模板。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述靶核酸分子是基因组DNA。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述靶核酸分子是RNA，并且所述方法包括在步骤(i)中与所述挂锁探针接触之前生成靶RNA的cDNA拷贝。

8.根据权利要求4至7中任一项所述的方法，其中所述变异靶核酸序列是：可能存在于靶核酸分子中给定位置处的突变靶核酸序列或野生型序列，或在靶核酸分子中靶位置处的等位基因变体，或可能存在于靶核酸分子中的多态性。

9.根据权利要求1至6或8中任一项所述的方法，其中所述靶核酸分子是无细胞DNA分子。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述样品是液体活检样品。

11.根据权利要求9或权利要求10所述的方法，其中所述样品是血浆。

12.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中在细胞或组织样品中原位检测所述变异核酸序列。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述样品是临床样品或由临床样品制备。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中在步骤(i)之前或之中，将拥挤剂添加到所述靶核酸分子中。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中在步骤(i)中，将所述靶核酸分子与所述挂锁探针和其他试剂在50℃至65℃的退火温度下一起孵育以用于所述探针的初始杂交，所述退火温度优选53℃至60℃，更优选55℃至60℃。

16.根据权利要求15所述的方法，其中在初始退火步骤之后，降低温度以延伸所述探针的杂交的3'末端。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中在步骤(i)中，所述聚合酶是Taq聚合酶的Stoffel片段，并且所述dNTP以不超过1μM，优选不超过0.5μM，并且更高优选不超过0.3μM或0.25μM的浓度提供。

18.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中在步骤(i)中，所述聚合酶是Phusion聚合酶，并且所述dNTP以不超过10μM，优选不超过3μM，并且更优选不超过1μM的浓度提供。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述第一挂锁探针的所述靶结合区与所述靶核酸分子杂交，其间具有至少4个核苷酸，优选至少6个核苷酸的间隙。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中待检测的所述变异靶核酸序列包含单变异碱基，并且所述变异碱基不位于与所述第一挂锁探针的杂交的末端之间的间隙的第一或最后一个碱基对应的位置。

21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述第二挂锁探针各自包含对所述挂锁探针具有特异性的检测序列，并且所述第二RCP由与所述检测序列的所述第二RCP中的互补拷贝杂交的检测探针检测。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述检测探针标记有可检测标记，优选荧光标记。

23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中通过显微术或通过流式细胞术检测所述第二RCP。

24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中直至步骤(vi)，所述方法是在溶液或悬浮液中进行的均相方法。

25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述方法在固体支持物上进行。

26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述第二RCP通过成像检测。

27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述方法以多重方式进行，其中在步骤(i)中，使所述样品与多个不同的第一挂锁探针接触，所述第一挂锁探针各自对不同的靶核酸分子或不同的靶核酸序列具有特异性。

28.一种用于检测靶核酸分子中的靶核酸序列的试剂盒，所述试剂盒包含：

(i)第一挂锁探针，其包含位于或靠近其相应的5'和3'末端的靶结合区，所述靶结合区能够与所述靶核酸分子中位于所述靶核酸序列侧翼的互补结合位点杂交，并允许所述探针的所述靶结合区与所述靶核酸分子杂交；

(ii)第二挂锁探针，其包含对所述靶核酸序列具有特异性的靶结合区。