WO2006051991A1 - 核酸の増幅および検出方法 - Google Patents

核酸の増幅および検出方法 Download PDF

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WO2006051991A1
WO2006051991A1 PCT/JP2005/020964 JP2005020964W WO2006051991A1 WO 2006051991 A1 WO2006051991 A1 WO 2006051991A1 JP 2005020964 W JP2005020964 W JP 2005020964W WO 2006051991 A1 WO2006051991 A1 WO 2006051991A1
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WO
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sequence
nucleic acid
primer
complementary
primer set
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PCT/JP2005/020964
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Yoshihide Hayashizaki
Toshizo Hayashi
Yasumasa Mitani
Original Assignee
Riken
Kabushiki Kaisha Dnaform
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification

Definitions

  • the present invention relates to a method for specifically amplifying a minute amount of a nucleic acid molecule contained in a sample and detecting it.
  • cells having properties specific to the disease are known.
  • cancer cells having various properties are known even in cancer of the same tissue.
  • the effects of therapeutic drugs, cancer progression, prognosis, etc. differ depending on the nature of such cancer cells. Therefore, by specifically detecting each of these disease-related cells having various properties, the disease can be diagnosed, and further, selection of therapeutic drugs, selection of treatment methods, surgery, It provides important information related to the selection of the surgical procedure.
  • a mutant gene having such a mutation can be used as a marker indicating the presence of disease-related cells in the diagnosis of each disease.
  • the base sequence of the gene may be determined and examined for the presence or absence of the mutation.
  • the determination of the base sequence requires a nucleic acid sample containing almost no other type of gene such as the wild type whose purity of the mutant gene is high, so that it takes a lot of time and cost.
  • a method for amplifying only a mutated gene specific to a disease by using a nucleic acid amplification method and detecting the disease by the presence or absence of the amplified product has been developed.
  • PCR method (US Pat. No. 4,683,195; US Pat. No. 4,683,202; and US Pat. No. 4,800,159) is most often used as a nucleic acid amplification method.
  • primers may be used for sequences that are not perfectly complementary, resulting in false amplification reactions, so PCR methods are specific for detecting mutations, especially single nucleotide mutations.
  • the method that has sex is ena.
  • the sample specimen often contains both a wild type gene and a mutant gene, and in addition, a mutant type having other mutations. May contain genes.
  • the amount of mutant genes contained in the sample may be extremely low compared to wild-type genes or other mutant genes!
  • cancer diagnosis it is necessary to detect a very small amount of cancer cells contained in normal tissues, so it is necessary to detect a very small amount of mutant genes from a specimen containing a large amount of wild-type genes. is there.
  • the specificity of the nucleic acid amplification method to be used is particularly important when detecting mutant genes by the nucleic acid amplification method for the purpose of disease diagnosis.
  • a strand displacement amplification method SDA method; Japanese Patent Publication No. 7-114718
  • self-sustained sequence amplification Method 3SR method
  • Q ⁇ replicase method Japanese Patent No. 2710159
  • NASBA method Japanese Patent No. 2650159
  • LAMP method International Publication No. 00 ⁇ 28082 pamphlet
  • I CAN method International Publication No. 02Z16639 pamphlet
  • the rolling circle method and the method described in the pamphlet of International Publication No. 2004Z040019 are known.
  • the present inventors include a primer containing a sequence specific to two or more regions in the target nucleic acid sequence and a sequence specific to one or more regions in the target nucleic acid sequence. By designing these primers so that one or more of the above regions contain nucleotide residues that can be mutated, one of the wild type gene and the mutant gene can be identified. Have been found to be amplified. In addition, the inventors have
  • the amplification product obtained by the nucleic acid amplification reaction is contained in a bowl shape and the nucleic acid amplification reaction is repeated with a reaction solution to which a reagent such as the primer is newly added. It was found that a small amount of mutant gene can be specifically amplified.
  • the present invention is based on these findings.
  • an object of the present invention is to specifically amplify a trace amount of a mutant gene in a sample containing a large amount of wild-type gene or a trace amount of a wild-type gene in a sample containing a large amount of mutant gene. It is to provide a nucleic acid amplification method.
  • the nucleic acid amplification method according to the present invention is a method for specifically amplifying either one of the genes including both the wild-type gene and the mutant gene! / (A) At least one primer containing a sequence homologous or complementary to two or more regions on the gene to be tested and at least one primer containing a sequence homologous or complementary to one or more regions on the same gene A step of preparing a primer set, wherein a nucleotide residue to be mutated is contained in one or more of the regions, and (b) a nucleic acid molecule contained in the sample is caged A step of performing a nucleic acid amplification reaction with the primer set, and (c) a nucleic acid amplification reaction with the primer set using the amplification product obtained by the nucleic acid amplification reaction as a saddle shape. This includes a step of performing a breadth reaction.
  • either one of the wild-type gene and the mutant gene can be specifically amplified, and in particular, the gene to be amplified is extreme in the sample. Even if it exists only in a trace amount, it can be specifically amplified. This makes it possible to detect a very small amount of disease-related cells having a mutant gene from a specimen containing a large amount of normal cells having a wild type gene.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing the action mechanism of a nucleic acid amplification reaction using a first primer.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating the structure of a second primer.
  • FIG. 3a is a diagram schematically showing the action mechanism of a nucleic acid amplification reaction using a first primer and a second primer.
  • FIG. 3b is a diagram schematically showing the action mechanism of a nucleic acid amplification reaction using the first primer and the second primer.
  • FIG. 4 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) contained in the human / 3 globin gene, the mutation site used in Example 1, and the region used for primer design.
  • FIG. 5 is a graph showing the time course of the third nucleic acid amplification reaction in Example 1.
  • the nucleic acid amplification method according to the present invention is a method of specifically amplifying one or both genes from a sample containing both a wild type gene and a mutant gene.
  • the specificity is extremely high, and even if the sequence difference between the wild type gene and the mutant gene is a single base substitution, only one of them can be amplified. Furthermore, even if any type of gene is present in the sample in a very small amount, the gene can be specifically amplified.
  • a primer containing a sequence homologous or complementary to two or more regions on a gene to be amplified wild type gene or mutant gene
  • a primer set comprising at least one primer containing a homologous or complementary sequence in one or more of the regions above. This primer set is designed so that nucleotide residues that can be mutated are included in one or more of the regions.
  • the two kinds of primers included in the primer set can typically be a forward primer and a reverse primer designed for a target nucleic acid sequence to be amplified. Therefore, one primer is in the 5 'end region of the target nucleic acid sequence.
  • the other primer may contain a sequence complementary to the 3 ′ end region of the target nucleic acid sequence.
  • at least one of these primers includes a sequence homologous or complementary to a region different from the 5 ′ end region and the 3 ′ end region of the target nucleic acid sequence.
  • one of the primers hybridizes to the target nucleic acid sequence or its complementary sequence, and after the extension reaction of the primer has occurred, the primer is hybridized to the region on the extended strand to form a loop structure.
  • the at least one primer is designed based on the sequence of two or more regions on the target nucleic acid sequence (the gene to be amplified), and the upper limit of the number of the regions is not particularly limited, but preferably It is designed based on a sequence of 2 to 5 regions, more preferably 2 to 3 regions, and more preferably 2 regions.
  • the other primer is designed based on the sequence of one or more regions on the target nucleic acid sequence (gene to be amplified), and the upper limit of the number of the regions is not particularly limited, but preferably 1 It is designed based on a sequence of ⁇ 5 regions, more preferably 1-3 regions, and even more preferably 1-2 regions.
  • the primer set may further include other primers involved in the nucleic acid amplification reaction in addition to the two kinds of primers.
  • the region on the target nucleic acid sequence (the gene to be amplified) used for the design of the two types of primers included in the primer set includes at least one nucleotide residue capable of mutation. Selected as Multiple regions containing nucleotide residues that are resistant to such mutations can also be used for primer design, especially when there are nucleotide residues that are resistant to multiple mutations in the mutant gene. .
  • the primer set enables amplification of a target nucleic acid by a reaction under isothermal conditions.
  • the nucleic acid amplification reaction can be performed under isothermal conditions. it can. Examples of such isothermal nucleic acid amplification methods include the LAMP method (International Publication No. 00Z28082 pamphlet), the method described in International Publication No.
  • the first primer included in the primer set has a 3 'sequence (Ac) that hybridizes to the sequence (A) at the 3' end portion of the target nucleic acid sequence.
  • the nucleic acid amplification method developed by the present inventors is used as the isothermal nucleic acid amplification method.
  • the primer set is a primer set comprising at least two kinds of primers capable of amplifying the target nucleic acid sequence, and the first primer contained in the primer set is 3 of the target nucleic acid sequence. It contains a sequence (Ac ') complementary to the sequence (A) of the terminal portion at the 3' end portion, and is present 5 'to the target nucleic acid sequence from the sequence (A).
  • a sequence ( ⁇ ′) homologous to the sequence (B) is included on the 5 ′ side of the sequence (Ac), and the second primer included in the primer set is complementary to the target nucleic acid sequence.
  • a folded sequence (D-) comprising a sequence (Cc ') complementary to the sequence (C) at the 3' end portion of the sequence at the 3 'end portion and two nucleic acid sequences that hybridize to each other on the same strand Dc) on the 5 'side of the sequence (Cc').
  • “noblybize” means that a region in a primer hybridizes to a target region under stringent conditions and does not hybridize to a region other than the target region.
  • Stringent conditions can be determined depending on the melting temperature Tm (° C) of the duplex between the region in the primer and its complementary strand, the salt concentration of the hybridization solution, etc. Reference can be made to J. Sambrook, EF Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989). For example, when hybridization is performed at a temperature slightly lower than the melting temperature of the primer region to be used, the region in the primer can be specifically hybridized to the target region.
  • the region in the primer that hybridizes to a target region comprises a sequence complementary to that target region.
  • FIG. 1 schematically shows the mechanism of nucleic acid synthesis by the first primer. First, determine the target nucleic acid sequence in the trapezoidal nucleic acid, and determine the sequence (A) at the 3 'end of the target nucleic acid sequence and the sequence (B) that is 5' to the sequence (A). decide.
  • the first primer comprises the sequence (Ac ′) and further comprises the sequence ( ⁇ ′) on the 5 ′ side.
  • the sequence (Ac ′) is a sequence complementary to the sequence (A), and the sequence ( ⁇ ′) is a sequence homologous to the sequence ( ⁇ ).
  • the first primer may include V or an intervening sequence that does not affect the reaction between the sequence (Ac ′) and the sequence ( ⁇ ′).
  • the sequence (Ac) in the primer is hybridized to the sequence (A) of the target nucleic acid sequence (FIG. 1 (a)).
  • a primer extension reaction occurs in this state, a nucleic acid containing a complementary sequence of the target nucleic acid sequence is synthesized.
  • the sequence ( ⁇ ′) present on the 5 ′ end side of the synthesized nucleic acid hybridizes to the sequence (Be) present in the nucleic acid, and thereby the stem in the 5 ′ end portion of the synthesized nucleic acid— A loop structure is formed.
  • the sequence (A) on the cocoon-type nucleic acid becomes a single strand, and another primer having the same sequence as the first primer hybridizes to this part (FIG. 1 (b)).
  • an extension reaction from the newly hybridized first primer occurs by the strand displacement reaction, and at the same time, the previously synthesized nucleic acid is separated from the vertical nucleic acid (FIG. 1 (c)).
  • the phenomenon that the sequence ( ⁇ ') hybridizes to the sequence (Be) is caused by the presence of a complementary region on the same strand.
  • a double-stranded nucleic acid is released into a single strand, partial dissociation at its end or other relatively unstable partial force begins.
  • the base pair of the terminal portion is in an equilibrium state of dissociation and binding at a relatively high temperature, and the double-stranded nucleic acid is maintained as a whole.
  • a stem-loop structure can be formed as a metastable state.
  • the same other primer binds to the complementary strand part (sequence (A) on the vertical nucleic acid) that is exposed due to the formation of the structure, and the polymerase is immediately activated.
  • sequence (A) on the vertical nucleic acid
  • the design criteria for the first primer in a preferred embodiment of the present invention are as follows. is there. First, in order for a new primer to efficiently anneal to the homologous nucleic acid after the complementary strand of the truncated nucleic acid is synthesized by extension of the primer, a stem loop structure is formed at the 5 'end of the synthesized complementary strand. Therefore, it is necessary to make the part of the sequence (A) on the cage nucleic acid a single strand.
  • Ratio to X (X—Y) ZX is important.
  • the efficiency V the formation of the stem loop structure, that is, the efficiency!
  • the distance between (X + Y) is important.
  • the optimum temperature for the primer extension reaction is at most around 72 ° C, and at such a low temperature, it is difficult for the extended strand to dissociate over a long region. Therefore, in order for the sequence ( ⁇ ′) to hybridize efficiently to the sequence (Be), it is considered preferable that the number of bases between both sequences is small.
  • sequence ( ⁇ ′) in order for the sequence ( ⁇ ′) to hybridize to the sequence (Be) and the portion of the sequence (A) on the cage nucleic acid to be a single strand, the sequence ( ⁇ ′) and the sequence (Be) It is considered preferable that the number of bases between and is larger.
  • the first primer according to a preferred embodiment of the present invention is the case where there is no intervening sequence between the sequence (Ac) and the sequence ( ⁇ ⁇ ') constituting the primer.
  • (X— ⁇ ) ⁇ is 1.00 or more, preferably 0.00 or more, more preferably 0.05 or more, more preferably 0.10 or more, and 1.00 or less, preferably 0.75. In the following, it is designed to be more preferably 0.50 or less, and still more preferably 0.25 or less.
  • ( ⁇ + ⁇ ) is preferably 15 or more, more preferably 20 or more, more preferably 30 or more, and is preferably 50 or less, more preferably 48 or less, and even more preferably 42 or less.
  • ⁇ X— ( ⁇ — ⁇ ' ⁇ is 1.00 or more, preferably 0.00 or more, more preferably 0.05 or more. Furthermore, it is designed to be more preferably 0.10 or more, and 1.00 or less, preferably 0.75 or less, more preferably 0.50 or less, and further preferably 0.25 or less. Further, ( ⁇ + ⁇ + ⁇ ′) is preferably 15 or more, more preferably 20 or more, more preferably 30 or more, and preferably 100 or less, more preferably 75 or less, more preferably 50 or less. Is done.
  • the first primer has a chain length that allows base pairing with the target nucleic acid while maintaining the required specificity under given conditions.
  • the chain length of this primer is preferably 15 to 100 nucleotides, more preferably 20 to 60 nucleotides.
  • the lengths of the sequence (Ac ′) and the sequence ( ⁇ ′) constituting the first primer are each preferably 5 to 50 nucleotides, more preferably 7 to 30 nucleotides. If necessary, insert an intervening sequence that does not affect the reaction between sequence (Ac ') and sequence ( ⁇ ').
  • the second primer is added to the sequence (C) of the 3 'end portion of the complementary sequence of the target nucleic acid sequence (the strand opposite to the strand to which the first primer hybridizes).
  • a folded sequence (D-Dc) comprising a complementary sequence (Cc) at the 3 ′ end portion and containing two nucleic acid sequences that hybridize to each other on the same strand is represented by 5 ′ of the sequence (Cc ′). It is included on the side.
  • the structure of such a second primer is, for example, as shown in FIG. 2, but is not limited to the sequence or the number of nucleotides shown in FIG.
  • the length of the sequence (Cc ′) constituting the second primer is preferably 5 to 50 nucleotides, more preferably 10 to 30 nucleotides.
  • the length of the folded sequence (D-Dc ′) is preferably 2 to: L000 nucleotides, more preferably 2 to 100 nucleotides, still more preferably 4 to 60 nucleotides, and further preferably 6 to 40 nucleotides.
  • the number of nucleotides of base pairs formed by hybridization within the folded sequence is preferably 2 to 500 bp, more preferably 2 to 50 bp, more preferably 2 to 30 bp. This is preferably 3 to 20 bp.
  • the nucleotide sequence of the folded sequence (D-Dc ′) is not particularly limited as long as it is any sequence, but is preferably a sequence that does not hybridize to the target nucleic acid sequence. If necessary, an intervening sequence that does not affect the reaction may be inserted between the sequence (Cc ′) and the folded sequence (D-Dc ′).
  • the possible mechanism of action for the nucleic acid amplification reaction using these first and second primers will be described with reference to FIG. 3 (FIGS. 3a and 3b).
  • the first primer hybridizes to the sense strand of the target nucleic acid, and the primer extension reaction takes place (Fig. 3 (a)) G.
  • a stem-loop structure is formed on the extension strand (one).
  • a new first primer hybridizes to the sequence (A) on the target nucleic acid sense strand that has become a single strand (Fig. 3 (b)).
  • the extended chain (-) is released.
  • the second primer hybridizes to the sequence (C) on the released extended strand (-) (Fig. 3 (c)), the extension reaction of the primer occurs, and the extended strand (+) is synthesized. (Fig. 3 (d)).
  • a stem-loop structure is formed at the 3 'end of the generated extended strand (+) and the 5' end of the extended strand (one) (Fig. 3 (e)), and the free 3 'end extended strand (+)
  • the extended chain (1) is detached (Fig.
  • the extension reaction from the end of the loop produces a hairpin-type double-stranded nucleic acid in which the extended strand (one) is bound to the 3 'side of the extended strand (+) via the sequence (A) and sequence (Be).
  • the first primer hybridizes to the sequence (A) and sequence (Be) (Fig. 3 (g)), and the extended strand (one) is generated by the extension reaction (Figs. 3 (h) and (0)).
  • the folded sequence present at the 3 ′ end of the hairpin type double-stranded nucleic acid provides a free 3 ′ end (FIG. 3 (h)), and an extension reaction therefrom (FIG.
  • a single-stranded nucleic acid having a folded sequence at both ends and alternately containing extended strands (+) and extended strands (-) is generated via the sequences derived from the first and second primers (Fig. 3 (j
  • the folded sequence present at its 3 'end provides a free 3' end (the complementary strand synthesis origin) (Fig. 3 (k)), so The reaction is repeated to double the chain length per extension reaction (Fig. 3 (1) and (m)).
  • the folded sequence present at the 3 'end provides a free 3' end (the complementary strand synthesis origin) (Fig. 3 (n)).
  • a loop structure is formed, and a single-stranded nucleic acid containing an extended strand (+) and an extended strand (one) alternately through a sequence derived from the primer is generated (Fig. 3 (o)). Even in acid, the formation of a complementary strand is sequentially provided by loop formation at the 3 ′ end, and thus elongation reactions occur one after another.
  • Sequence derived from one primer and second primer is extended strand Because it is contained between (+) and the extended strand (one), each primer can hybridize to cause an extension reaction, which significantly increases the sense strand and antisense strand of the target nucleic acid. Amplified.
  • the primer set may further include a third primer that hybridizes to the target nucleic acid sequence or a complementary sequence thereof in addition to the first primer and the second primer.
  • a third primer is intended not to compete with other primers due to hybridization to the target nucleic acid sequence or its complementary sequence.
  • “do not compete!” Means that the primer does not interfere with the provision of the complementary strand synthesis starting point by hybridizing to the target nucleic acid.
  • the amplification product has the target nucleic acid sequence and its complementary sequence alternately. There is a folded sequence or loop structure at the 3 'end of the amplified product, and extension reactions occur one after another from the complementary strand synthesis starting point provided.
  • the third primer can anneal to the target sequence present in the single-stranded part when such an amplification product is partially in a single-stranded state. As a result, a new complementary strand synthesis origin is provided in the target nucleic acid sequence in the amplification product, and an extension reaction takes place therefrom, so that the nucleic acid amplification reaction is performed more rapidly.
  • the third primer is not necessarily limited to one type, but two or more types of the third primer may be used simultaneously in order to improve the speed and specificity of the nucleic acid amplification reaction. These third primers typically have different sequence powers than the first primer and the second primer, and may hybridize to a partially overlapping region as long as they do not compete with these primers.
  • the chain length of the third primer is preferably 2 to: LOO nucleotides, more preferably 5 to 50 nucleotides, and even more preferably 7 to 30 nucleotides.
  • the third primer mainly has an auxiliary function for proceeding more rapidly with the nucleic acid amplification reaction by the first primer and the second primer. Therefore,
  • the third primer preferably has a Tm that is lower than the Tm of the third and third ends of the first primer and the second primer, respectively.
  • the amount of the third primer added to the amplification reaction solution is preferably smaller than the amount of each of the first primer and the second primer.
  • nucleotide residues that can be mutated are included in the sequence (A), the sequence (B), or the sequence (C).
  • the primer set can be designed as follows.
  • the third primer hybridizes to the nucleic acid sequence in the nucleic acid sample or a complementary sequence thereof, one or more mismatches are formed between the nucleic acid sequence or the complementary sequence due to the presence or absence of the mutation.
  • a third primer can also be designed to occur. This makes it possible to determine the presence or absence of the mutation by confirming the presence or absence of the amplification product, and to determine the amount of the gene having the mutation by quantifying the amplification product. .
  • the primer set is designed such that a nucleotide residue capable of mutation is included in the sequence (A).
  • the first primer anneals to the sequence (A) in the nucleic acid amplification reaction, and thus an amplification product is obtained.
  • the nucleic acid sample if the nucleic acid sequence that is different from the target nucleic acid sequence at the mutation site is in a cage shape, it becomes difficult for the first primer to anneal to the sequence (A) in the nucleic acid amplification reaction. No amplification product is obtained or the amount of amplification product obtained is significantly reduced.
  • Nucleotide residues that can be mutated are preferably included in the 5 ′ end of the sequence (A) (corresponding to 3, the end of the first primer).
  • the primer set is designed such that a nucleotide residue to be mutated is included in the sequence (C).
  • the second primer is annealed to the sequence (C) in the nucleic acid amplification reaction, so that an amplification product is obtained.
  • a nucleic acid sequence that is different from the target nucleic acid sequence at the mutation site in the nucleic acid sample has a saddle shape, it is difficult to anneal the second primer to the sequence (C) in the nucleic acid amplification reaction. Because No amplification product is obtained or the amount of amplification product obtained is significantly reduced.
  • Nucleotide residues that can be mutated are preferably included in the 5 'end of the sequence (C) (corresponding to 3, the end of the second primer).
  • the primer set is designed so that nucleotide residues capable of mutation are included in the sequence (B).
  • the primer is annealed to the sequence (A) and the extension reaction is performed. Since the sequence ( ⁇ ') contained in is hybridized to the sequence (Be) on the extended strand, a stem loop structure is efficiently formed. The formation of this efficient stem loop structure allows the other first primer to anneal in a saddle shape, and the mechanism of action shown in FIG. 1 proceeds efficiently, resulting in an amplification product.
  • a stem-and-loop structure can be formed as a metastable state.
  • this stem loop structure does not exist stably, especially when there are non-complementary nucleotides between the sequence ( ⁇ ') and the sequence (Be) part that form the stem. Or the stem is not formed at all.
  • the hybridization between the vertical sequence (A) and the sequence (Ac ') in the primer is more dominant, and the sequence (A) is not a single strand.
  • the next first primer cannot be annealed. That Therefore, it is extremely difficult to cause the continuous reaction shown in Fig. 1.
  • the nucleic acid amplification reaction using the primer set described above is carried out using the nucleic acid molecules contained in the sample as saddles.
  • the reaction conditions can be appropriately determined by those skilled in the art according to the nucleic acid amplification reaction used.
  • the nucleic acid amplification reaction is preferably performed under isothermal conditions.
  • isothermal refers to maintaining an approximately constant temperature condition such that the enzyme and the primer can substantially function.
  • substantially constant temperature conditions are not only to maintain the set temperature accurately, but also to the extent that the temperature does not deteriorate the substantial function of the enzyme and primer. Means that.
  • the nucleic acid amplification reaction under a certain temperature condition can be carried out by keeping the temperature at which the activity of the enzyme used can be maintained.
  • reaction temperature in order for the primer to anneal to the target nucleic acid, for example, it is preferable to set the reaction temperature to a temperature near the melting temperature (Tm) of the primer or lower. It is preferable to set the stringency level in consideration of the melting temperature (Tm) of the primer. Therefore, this temperature is preferably about 20 ° C to about 75 ° C, more preferably about 35 ° C to about 65 ° C.
  • the polymerase used in the nucleic acid amplification reaction is preferably one having normal temperature, intermediate temperature, or heat resistance, which preferably has strand displacement activity (strand displacement ability). It can be used suitably.
  • this polymerase may be either a natural body or a mutant with artificial mutations. Examples of such a polymerase include DNA polymerase. Further, it is preferred that the DNA polymerase is substantially free of 5 ′ ⁇ 3 ′ exonuclease activity.
  • Such DNA polymerases are thermophilic, such as Bacillus stearothermophilus (hereinafter referred to as “: B. st”) and Bacillus caldotenax (hereinafter referred to as “B. ca”).
  • the DNA polymerase used in the nucleic acid amplification reaction is further divided into Vent DNA polymerase, Vent (Exo-) DNA polymerase, DeepVent DNA polymerase, DeepVent (Exo-) DNA polymerase, ⁇ 29 phage DNA polymerase, MS-2 phage DNA polymerase, Z-Taq DNA polymerase, Pfo DNA polymerase, Pfo turbo DNA polymerase, KOD DNA polymerase, 9 ° Nm DNA polymerase, Therminater DNA polymerase Etc.
  • reagents used in the nucleic acid amplification reaction include, for example, catalysts such as magnesium chloride, magnesium acetate, and magnesium sulfate, substrates such as dNTP mix, tris hydrochloride buffer, tricine buffer, sodium phosphate buffer, A buffer such as potassium phosphate buffer can be used.
  • catalysts such as magnesium chloride, magnesium acetate, and magnesium sulfate
  • substrates such as dNTP mix
  • tris hydrochloride buffer such as dNTP mix
  • tris hydrochloride buffer such as dNTP mix
  • tricine buffer Tris hydrochloride buffer
  • tricine buffer such as sodium phosphate buffer
  • a buffer such as potassium phosphate buffer
  • additives such as dimethyl sulfoxide and betaine ( ⁇ , ⁇ , ⁇ -trimethylglycine), acidic substances and cation complexes described in WO 99/54455 pamphlets may be used. .
  • a melting temperature adjusting agent can be added to the reaction solution in order to increase the amplification efficiency of the nucleic acid.
  • the melting temperature (Tm) of a nucleic acid is generally determined by the specific nucleotide sequence of the double stranded portion in the nucleic acid. By adding a melting temperature adjusting agent to the reaction solution, this melting temperature can be changed. Therefore, under a certain temperature, it is possible to adjust the intensity of double strand formation in the nucleic acid.
  • a general melting temperature adjusting agent has an effect of lowering the melting temperature.
  • a melting temperature adjusting agent By adding such a melting temperature adjusting agent, it is possible to lower the melting temperature of the duplex forming part between two nucleic acids, in other words, to reduce the strength of the duplex formation. Is possible. Therefore, when such a melting temperature adjusting agent is added to the reaction solution in the nucleic acid amplification reaction, it is efficiently used in a GC-rich nucleic acid region that forms a strong double strand or a region that forms a complex secondary structure. The double-stranded portion can be made into a single strand, whereby the next primer becomes hybridized to the target region after the extension reaction by the primer is completed, so that the nucleic acid amplification efficiency can be increased.
  • the concentration of the melting temperature adjusting agent used in the present invention and the concentration thereof in the reaction solution is determined based on other reaction conditions that affect the hybridization conditions such as salt concentration, reaction temperature, and the like. Is selected appropriately. Therefore, the melting temperature adjusting agent is not particularly limited, but is preferably dimethyl sulfoxide (DMSO), betaine, formamide or glycerol, or any combination thereof, more preferably dimethyl sulfoxide (DMSO). ).
  • an enzyme stabilizer can be added to the reaction solution.
  • the enzyme in the reaction solution is stabilized, so that the nucleic acid amplification efficiency can be increased.
  • the enzyme stabilizer used in the present invention is not particularly limited and may be any one known in the art such as glycerol, urine serum albumin, saccharides and the like.
  • a reagent for enhancing the heat resistance of an enzyme such as DNA polymerase or reverse transcriptase can be added to the reaction solution as an enzyme stabilizer.
  • an enzyme stabilizer As a result, the enzyme in the reaction solution is stabilized, so that the nucleic acid synthesis efficiency and amplification efficiency can be increased.
  • Such reagents are well known in the art and may be rugged, but are not particularly limited, but are preferably saccharides, more preferably monosaccharides or oligosaccharides, more preferably It can be trehalose, sorbitol or mannitol, or a mixture of two or more of these.
  • the nucleic acid amplification reaction is performed in the presence of a mismatch recognition protein, which enables more specific amplification of a mutant gene or a wild type gene. .
  • Misuma Tutsi gene diagnostic method to detect mismatches utilizes a binding protein
  • a binding protein have been developed (M. Gotoh et al., Genet . Anal, 14, 47-50, 1997) specific in 0 in a nucleic acid
  • a mismatched control nucleic acid is hybridized with a test nucleic acid suspected of having a mutation, and a mismatch recognition protein is introduced into the mismatched nucleic acid.
  • a mismatch recognition protein is introduced into the mismatched nucleic acid.
  • Mismatch means a set of base pairs selected from adenine (A), guanine (G), cytosine (C), and thymine (T) (uracil (U) in the case of RNA). Is not a normal base pair (A and T combination or G and C combination). Mismatches include not only one mismatch but also multiple consecutive mismatches, mismatches caused by insertion and Z or deletion of one or more bases, and combinations thereof.
  • heteroduplex structure is a substantially complementary duplex structure, but includes a noncomplementary region by having one or more mismatches. This means a chain structure. This heteroduplex structure results in a false amplification product that should not be produced.
  • mismatch binding protein binds to the heteroduplex structure as described above, and the subsequent amplification reaction is hindered. Therefore, by using a mismatch binding protein, it is possible to prevent the generation of an erroneous amplification product.
  • the mismatch binding protein used in the present invention may be any protein known to those skilled in the art as long as it is a protein that recognizes a mismatch in a double-stranded nucleic acid and can bind to the mismatch site. It may be a thing.
  • the mismatch-binding protein used in the present invention has one or more amino acid substitutions, deletions, additions, and / or insertions in the amino acid sequence of the wild-type protein as long as the mismatch in the double-stranded nucleic acid can be recognized. It may be a protein (mutant) that also has an amino acid sequence ability! /. Such mutants can also be created artificially by forces that may occur in nature. Many methods are known for introducing amino acid mutations into proteins.
  • site-directed mutagenesis methods include WP Deng and JA Nickoloff (Anal. Biochem., 200, 81, 1992), KL Makamaye and F. Eckstein (Nucleic Acids Res., 14, 9679 -9698). , 1986), etc., and as a random mutation introduction method, a basic repair system is used.
  • a method using a deficient E. coli strain XLl-Red (Stratagene), a method of chemically modifying bases using sodium nitrite, etc. (J.-J. Diaz et al., BioTechnique, 11, 204-211, 1 991) is known.
  • mismatch binding proteins are known, such as MutM, Mut S and their analogs (Radman, M. et al. Annu. Rev. Genet. 20: 523-538 (1986)). Radaman, M. etal., Sci. Amer., August 1988, pp40-46; Modric h, P., J. Biol. Chem. 264: 6597-6600 (1989); Lahue.RS et al, Science 245: 160-164 (198 8); Jiricny, J. et al '. Nucl. Acids Res. 16: 7843-7853 (1988); Su, SSet al., J. Biol. Chem.
  • the mismatch binding protein used in the present invention is preferably derived from MutS, MutH, MutL, or yeast, and more preferably MutS, MutH, or MutL.
  • Mismatch binding proteins may also bind to single-stranded nucleic acids, and binding of such mismatch-binding proteins to single-stranded nucleic acids is known to be inhibited by single-stranded binding proteins. ing. Therefore, when a mismatch binding protein is used in the nucleic acid amplification reaction, it is preferable to use a single-stranded binding protein in combination. Mismatch-binding proteins can also bind to double-stranded nucleic acids that do not contain mismatches. Such misbinding of mismatch-binding proteins can be activated by using a activating agent to activate the mismatch-binding proteins. It is known that it is inhibited by keeping it. Therefore, when using a mismatch binding protein in a nucleic acid amplification reaction, it is preferable to use a protein that has been activated in advance by an activator.
  • the single-stranded binding protein (SSB) used to inhibit the binding of the mismatch binding protein to the single-stranded nucleic acid can be any SSB known in the art.
  • Preferred SSBs include single-stranded binding proteins from Escherichia coli, Drosophila, and Xenopus, and gene 32 protein from T4 butteriophage, and their equivalents from other species. Can be mentioned.
  • mismatch-binding proteins used in combination include MutS, MutH, MutL, HexA, MSH1-6, Rep3, RNaseA, uracil-DNA glycosidase, T4 endonuclease VII, and resolvase, preferably MutS, MSH2 or MSH6 Or a mixture of two or more of these, more preferably MutS.
  • the activator for activating the mismatch binding protein is not particularly limited since it can be appropriately selected by those skilled in the art, but preferably ATP (adenosine 5'-triphosphate) , ADP (adenosine 5'-diphosphate), ATP- ⁇ 3 (adenosine 5 '0 (3-thio triphosphate)), AMP-PNP (adenosine 5' [ J 8, ⁇ imido] triphosphate), etc. Or one of the nucleotides that can bind to the mismatch binding protein.
  • the activity of the mismatch binding protein can be performed by incubating the mismatch binding protein and the active agent at room temperature for several seconds to several minutes.
  • the nucleic acid amplification reaction using the primer set is performed using the amplification product obtained by the nucleic acid amplification reaction as a template.
  • This nucleic acid amplification reaction can be carried out under the same conditions as described above, using all or part of the reaction solution obtained by the nucleic acid amplification reaction as a sample. More specifically, a reagent such as primer, polymerase, dNTP mix, and buffer solution is added to the reaction solution obtained by the nucleic acid amplification reaction as necessary to prepare a new reaction solution, which is used for nucleic acid amplification. You can react.
  • the nucleic acid amplification reaction using such an amplification product as a cage is repeated two or more times.
  • the presence of the amplification product obtained by the nucleic acid amplification method can be detected by many various methods.
  • One method is the detection of amplification products of a specific size by general gel electrophoresis. In this method, for example, it can be detected by a fluorescent substance such as ethidium bromide or cyber green.
  • detection can be performed by using a labeled probe having a label such as piotin and hybridizing it to the amplification product.
  • Piotin can be detected by binding to fluorescently labeled avidin, avidin bound to an enzyme such as peroxidase, and the like.
  • Yet another method is to use immunochromatography.
  • a chromatographic medium using a label detectable with the naked eye (Immunochromatography method).
  • Amplification disconnection If a fragment and a labeled probe are hybridized, and a further different sequence of the amplified fragment and a hybridization-capable capture probe are immobilized on a chromatographic medium, they can be trapped at the immobilized portion, and detection on the chromatographic medium is possible. Is possible. As a result, simple detection with the naked eye is possible.
  • the amplification efficiency in the nucleic acid amplification reaction is very high, so that the amplification product can also be detected indirectly by using the fact that pyrophosphate is generated as an amplification byproduct.
  • a method for example, there is a method of visually observing the white turbidity of the reaction solution by utilizing the fact that pyrophosphoric acid binds to magnesium in the reaction solution to cause white precipitation of magnesium pyrophosphate.
  • the as another method there is a method utilizing the fact that the concentration of magnesium ion in the reaction solution is remarkably reduced by forming an insoluble salt by strongly binding pyrophosphate with metal ions such as magnesium.
  • a metal indicator whose color tone changes according to the magnesium ion concentration for example, Eriochrome Black T, Hydroxy Naphthol Blue, etc.
  • the color change of the reaction solution is visually observed.
  • the increase in fluorescence accompanying the amplification reaction can be observed visually, so that amplification products can be detected in real time.
  • the presence of the amplification product obtained by the nucleic acid amplification method according to the present invention can also be detected by observing the aggregation of the solid phase carrier resulting from the generation of the amplification product.
  • at least one primer contained in the primer set used for the nucleic acid amplification reaction must not contain a solid phase carrier or a site (group) that can bind to the solid phase carrier. It is supposed to be.
  • the solid phase carrier or the site capable of binding to the solid phase carrier may be introduced at any part of the primer, such as the 3 ′ end, 5 ′ end, or central region, but preferably 5 ′. It is assumed that it was introduced at the end.
  • the substrate used in the nucleic acid amplification reaction may comprise a solid phase carrier or a site capable of binding to the solid phase carrier.
  • the solid phase carrier used in the present invention is a carrier insoluble in the reaction solution used for nucleic acid amplification reaction, or from the liquid phase to the solid phase (gel phase) or from the solid phase (gel phase) before and after amplification.
  • Any phase transition carrier whose properties change to the liquid phase can be used.
  • Preferred solid phase carriers include water-insoluble organic polymer carriers, water-insoluble inorganic polymer carriers, synthetic polymer carriers, phase transition carriers, metal colloids, magnetic particles, and the like.
  • solvent-insoluble organic polymer carriers and solvent-insoluble inorganic polymer carriers, solvent-soluble polymer carriers, gel polymer carriers and the like.
  • water-insoluble organic polymers include silicon-containing materials such as porous silica, porous glass, diatomaceous earth, and celite, and polysaccharides such as nitrocellulose, hydroxyapatite, agarose, dextran, cellulose, and carboxymethylcellulose.
  • examples of the water-insoluble inorganic polymer include aluminum oxide, titanium oxide, ceramic particles, and the like.
  • Synthetic polymers include, for example, polystyrene, poly (meth) atrelate, polybutyl alcohol, polyacrylonitrile or copolymers thereof, styrene-styrene sulfonic acid copolymer, vinyl acetate-acrylic acid ester copolymer, etc. Can be mentioned.
  • the metal colloid include gold colloid.
  • Magnetic particles include magnetic iron oxide beads, monodispersed, superparamagnetic particles with finely pulverized magnetic iron oxide particles on the surface (Japanese Patent Publication No. 4-501959), superparamagnetic acid covered with a polymerizable silane coating. Examples include magnetically responsive particles containing pig iron (Japanese Patent Publication No.
  • a magnetized solid phase carrier can easily separate a solid and a liquid using magnetic force.
  • the shape of the solid phase carrier include particles, membranes, fibers, and filters. Particles are particularly preferred as the shape of the solid support. Its surface may be porous or non-porous, and may be displaced! /.
  • Particularly preferred solid phase carriers include latex in which a synthetic polymer carrier is uniformly dispersed in water, metal colloid particles such as gold colloid, and magnetic particles such as magnet beads.
  • Immobilization of the primer or the substrate to the solid phase carrier can be performed by a method known to those skilled in the art, and may be a method by deviation of physical bonding or chemical bonding! /,.
  • the primer or substrate is immobilized on a solid phase carrier by, for example, a substance capable of labeling an oligonucleotide such as a primer or a probe, and a solid phase carrier obtained by binding a substance capable of binding thereto.
  • a substance capable of labeling an oligonucleotide such as a primer or a probe
  • a solid phase carrier obtained by binding a substance capable of binding thereto.
  • those well known in the art can be used, for example, For example, a combination of a ligand and a receptor capable of binding to it, and a combination of two nucleic acids that hybridize to each other.
  • a primer or a substrate labeled with piotin is bound to a solid phase carrier whose surface is coated with avidin or streptavidin, whereby the primer or the substrate can be immobilized on the solid phase carrier.
  • the antigen include haptens such as FITC, DIG, and DNP.
  • antibodies that can bind to these include antibodies such as anti-FITC antibody, anti-DIG antibody, and anti-DNP antibody. Further, these antibodies may be either monoclonal antibodies or polyclonal antibodies.
  • the combination of piotin and streptavidin is particularly preferred because of its high specificity and good binding efficiency.
  • Labeling substances such as piotin, hapten, and ligand can be used alone or in a combination of two or more if necessary, using known means (Japanese Patent Laid-Open Nos. 59-93099, 59-148798, and Can be introduced at the 5 'end of the primer.
  • the site (or group) capable of binding to the solid phase carrier used in the present invention can be selected according to the above-described method used for immobilization of a primer or a substrate to the solid phase carrier, and therefore, the solid phase carrier can be selected. Any of those that allow physical binding to the carrier or those that allow chemical binding may be used, but specific binding is preferable.
  • the sites capable of binding to the solid phase carrier include, as described above, piotin, avidin, streptavidin, antigen, antibody, ligand, receptor, nucleic acid, protein, and the like, and preferably with piotin or streptavidin. More preferably, it is piotin.
  • the solid phase carrier used in this case may contain a binding partner of the site contained in the primer or the substrate, if necessary.
  • a binding partner is present in a form capable of binding to the above-mentioned site contained in the primer or the substrate, preferably present on the surface of the solid phase carrier, and more preferably solid. It is assumed that it is applied on the surface of the phase carrier.
  • the sample is a specimen derived from the subject, and the amplification target is included in a mutant gene or pathogen having a disease-related mutation.
  • the amplification target is included in a mutant gene or pathogen having a disease-related mutation.
  • a method for detecting a cell associated with a disease from a specimen derived from a subject comprising (a) a mutant gene having a mutation associated with the disease.
  • a primer set comprising at least one primer containing a sequence homologous or complementary to two or more regions and at least one primer containing a sequence homologous or complementary to one or more regions on the same gene
  • a step of preparing a primer set in which nucleotide residues involved in mutation in a mutant gene are contained in one or more of the regions and (b) a nucleic acid molecule contained in the specimen as a saddle type
  • detecting the amplification product In this method, if an amplification product is detected in step (d), it indicates that
  • a cell associated with a disease has a gene mutation associated with the disease, preferably a gene mutation specific for the disease, and is appropriately selected by those skilled in the art depending on the target disease. Gene mutations related to this are known for various diseases, and those skilled in the art can appropriately use combinations of these diseases and gene mutations. Examples of such gene mutations include mutations in the j8 globin gene specific for sickle cell disease, mutations in the p53 gene specific for cancer, and the like.
  • a mutation in the j8 globin gene specific to sickle cell disease known as a genetic disease includes a GAG force at the seventh codon to GTG, and this 13-globin expressed by this single nucleotide mutation The 6th amino acid is replaced with valine by glutamic acid. Therefore, a cell associated with sickle cell disease can be detected by specifically amplifying the mutant 8) globin gene having this mutation.
  • a number of gene mutations specific to cancer cells are known, but most of them are p53 gene mutations.
  • the p53 protein which also expresses this gene power, is one of the transcription factors. It controls cell cycle, apoptosis, and DNA repair, and plays a role in preventing the accumulation of mutations (such as canceration) at the individual level.
  • mutations in the p53 gene are found in more than 50% of cases, of which 80% are point mutations with amino acid substitutions. This mutation rate is much higher than other known oncogenes.
  • the p53 protein is a DNA binding protein, and many of the mutations found in cancer are concentrated in the DNA binding domain.
  • mutations in the p53 gene that are common in colorectal cancer are mutations at 175, 248, and 273, followed by CG, followed by 196, 213, 245, There is a tendency for mutations to concentrate at the 282nd codon.
  • the types of point mutations also have a clear tendency, and there are overwhelmingly many transversions from GC to AT.
  • cancer cells can be detected by specifically amplifying a mutant gene having any one or a combination of two or more of such mutations.
  • a method for specifically detecting a pathogen from a specimen derived from a subject comprising (a) two or more specific genes on a gene contained in the target pathogen to be detected.
  • a primer set comprising at least one primer containing a homologous or complementary sequence in the target region and at least one primer containing a homologous or complementary sequence in one or more specific regions on the same gene
  • a step of preparing (b) the sample A step of performing a nucleic acid amplification reaction with the primer set using the contained nucleic acid molecule as a cage, (C) a step of performing a nucleic acid amplification reaction with the primer set using the amplification product obtained by the nucleic acid amplification reaction as a cage, and (d) a step of detecting the amplification product.
  • this method when an amplification product is detected in step (d), it indicates that the target pathogen strain has been detected.
  • pathogens include pathogenic bacteria, fungi, viruses and the like.
  • the specific region on the gene contained in the target pathogen can be easily selected by comparing the sequence of the gene with the sequence of the nucleic acid contained in the sample.
  • pathogens may have mutant strains having mutant genes that are not limited to wild strains having wild-type genes. As such mutant strains, various strains are known along with differences in gene sequences from wild strains. According to the method of the present invention, it is possible to simultaneously detect all or a part of such wild strains and mutant strains, or it is possible to specifically detect only one of them. For example, when multiple strains of pathogens are detected simultaneously, a region having a sequence that is common to these strains and that is not found in nucleic acids contained in other strains or specimens should be used as the specific region. Can do. In addition, when only a single strain of the pathogen is specifically detected, it has a sequence that is not found in nucleic acids contained in other strains or specimens and is found only in the target pathogen strain. A region can be used as the specific region.
  • nucleotide residues capable of mutation are contained in one or more of the specific regions.
  • Primer sets can be designed to For example, in the case of using the nucleic acid amplification method developed by the present inventors, nucleotide residues that can be mutated are included in the sequence (A), the sequence (B), or the sequence (C). Primer sets can be designed.
  • the third primer hybridizes to a nucleic acid sequence in the nucleic acid sample or a complementary sequence thereof, one or more mismatches between the nucleic acid sequence or a complementary sequence thereof are caused by the presence or absence of the mutation.
  • a third primer can also be designed to occur. This makes it possible to determine the presence or absence of the target pathogen strain by confirming the presence or absence of the amplification product, and by quantifying the amplification product. It is possible to determine the amount of the pathogen strain.
  • Each step of the method for detecting a disease-related cell or pathogen according to the present invention can be performed as described above by the nucleic acid amplification method according to the present invention.
  • the method for detecting a disease-related cell or pathogen if the disease-related cell or pathogen is detected, the subject suffers from an infection caused by the disease or the pathogen strain. Can be determined. Therefore, according to the present invention, a method for diagnosing a disease in a subject is provided, and the method comprises all the steps of the method for detecting a disease-related cell or pathogen according to the present invention.
  • mi Extraction of the above-mentioned atypical gene with sample power that mixes bull and frog eglobin
  • the mutant gene was specifically amplified from a sample containing a wild-type human ⁇ -globin gene and a mutant human ⁇ -globin gene containing a single base substitution, and this was detected.
  • a long-chain synthetic oligonucleotide containing a single-base mutation in a specific region in the human j8 globin gene and a single-base mutation is not included!
  • a strand synthesis oligonucleotide was synthesized.
  • these long-chain synthetic oligonucleotides were amplified by PCR, respectively, and amplification products of wild-type DNA and mutant DNA containing single-base mutation were obtained. After sequencing and confirming the nucleotide residues of the mutated part, these amplified products were used as templates in the following experiments.
  • the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) of the wild-type amplification product is shown in FIG. In Fig. 4, the boxed residue is the residue that is effective for mutation, and this residue is “t” in the mutant amplification product.
  • Fl-W 5'-gatgctccatacaactgtgttcactagcaa-3 '(Self column number 2);
  • R1 5-ggatatatatatatcccttcaccacgttcaccttg- ( ⁇ ⁇ (13 ⁇ 4 ⁇ ⁇ "4).
  • Fl-M 5 -gatgcaccatacaactgtgttcactagcaa- ⁇ '(3 ⁇ 4 row 3 ⁇ 4 ⁇ number 3);
  • R1 5-ggatatatatatatcccttcaccacgttcaccttg- ( ⁇ ⁇ (13 ⁇ 4 ⁇ ⁇ "4).
  • the forward primer F1-M has the same nucleotide sequence as that of the primer F1-W except that it has a T residue that is resistant to mutation at the fifth and sixth positions from the end.
  • the reverse primer R1 has a structure in which the sequence at the 3, terminal side (19mer: underlined portion) anneals in a cage shape, and the sequence at the 5 'end (16mer: other than the underlined portion) folds within that region. Designed to take
  • a nucleic acid amplification reaction using a wild-type DNA detection primer pair or a mutant DNA detection primer pair for each of the saddle types. I did it. Specifically, a reaction solution (25 ⁇ L) having the following composition: Tris-HCl (20 mM, pH 8.8), KCl (lOmM), (NH) SO (10 mM),
  • FIG. 5 shows the change over time in the amount of amplification in the third nucleic acid amplification reaction.
  • Table 1 shows the increase in nucleic acids. It summarizes the results of the width.
  • the results of the amplification reaction are + + +, + +, +, and then in order from the one with the highest increase rate of the amplified products (the one with the fastest rise of the curve in the graph), and there is no amplification at all. What did not exist was taken as one.
  • the sample numbers shown in Fig. 5 correspond to the sample numbers in Table 1! / Speak.
  • Table 1 Amount of amplified product from the third nucleic acid amplification reaction
  • Figure 5 and Table 1 confirm that the wild-type DNA detection primer pair specifically detects only wild-type DNA, and the mutant DNA detection primer pair specifically detects only mutant-type DNA. It was. It was also shown that mutant DNA can be detected even in samples where mutant DNA is only 1/5000 of wild-type DNA.

Abstract

　多量の野生型遺伝子を含むサンプル中の微量の変異型遺伝子を特異的に増幅しうる核酸増幅法が開示される。この方法は、野生型遺伝子と変異型遺伝子の両方を含むサンプルからいずれか一方の遺伝子を特異的に増幅する方法であって、（ａ）増幅しようとする前記遺伝子上の２以上の領域に相同または相補的な配列を含む少なくとも１種のプライマーおよび同遺伝子上の１以上の領域に相同または相補的な配列を含む少なくとも１種のプライマーを含んでなるプライマーセットであって、変異にかかるヌクレオチド残基が前記領域のうちの１以上の領域に含まれる、プライマーセットを用意する工程、（ｂ）前記サンプルに含まれる核酸分子を鋳型として、前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行なう工程、ならびに（ｃ）前記核酸増幅反応によって得られる増幅産物を鋳型として、前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行なう工程を含む。

Description

明 細 書
核酸の増幅および検出方法
関連出願の参照
[0001] 本特許出願は、先に出願された米国仮出願第 60Z627, 180号（出願日：2004 年 11月 15日）および日本国特許出願である特願 2005— 75664号（出願日： 2005 年 3月 16日）に基づく優先権の主張を伴うものである。これら先の特許出願における 全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
発明の背景
[0002] 発明の分野
本発明は、サンプル中に含まれる微量な核酸分子を特異的に増幅し、これを検出 する方法に関する。
[0003] 背景 術
様々な疾患において、その疾患に特異的な性質を有する細胞が知られている。例 えば、癌細胞としては、同じ組織の癌においても様々な性質のものが知られている。 さらに、このような癌細胞の性質によって、治療用薬剤の効果、癌の進行、予後など が異なることが知られている。よって、様々な性質を有するこれら疾患関連細胞のそ れぞれを特異的に検出することにより、その疾患を診断することができ、さらには、治 療用薬剤の選択、治療法の選択、手術の際の術式の選択などに関連する重要な情 報が提供される。
[0004] 近年、癌などの疾病の分子生物学的な研究が進んでおり、癌細胞などの疾患関連 細胞のそれぞれに特異的な遺伝子変異が数多く見出されている。このような変異を 有する変異型遺伝子は、それぞれの疾患の診断において、疾患関連細胞の存在を 示すマーカーとして用いることができる。
[0005] 変異型遺伝子を検出するためには、その遺伝子の塩基配列を決定して変異の有 無を調べればよい。しかしながら、塩基配列決定には前記変異型遺伝子の純度が高 ぐ野生型などの他の型の遺伝子をほとんど含まない核酸試料が必要とされるため、 多大な時間とコストがかかる。 [0006] 最近、核酸増幅法を利用して疾患に特異的な変異型遺伝子のみを増幅し、増幅産 物の有無によって疾患を検出する方法が開発の対象となっている。
[0007] 一般に、核酸増幅法としては PCR法 (米国特許第 4683195号明細書;米国特許 第 4683202号明細書;および米国特許第 4800159号明細書)が最もよく利用され る。しかし、通常の PCR法では、プライマーが完全に相補的でない配列にァユーリン グして誤った増幅反応が起こることがあるため、 PCR法は、変異の検出、特に一塩基 変異の検出に必要な特異性を有する方法とは 、えな 、。
[0008] また、疾患の診断における変異型遺伝子の検出では、サンプルとなる検体が野生 型遺伝子と変異型遺伝子の両方を含んでいることが多ぐさらには、他の変異を有す る変異型遺伝子を含んでいることもある。さらに、サンプル中に含まれる変異型遺伝 子の量が、野生型遺伝子または他の変異型遺伝子に比べて極端に少な!/ヽこともある 。例えば、癌の診断では、正常組織中に含まれる微量の癌細胞を検出することが必 要とされるため、大量の野生型遺伝子を含む検体から極微量の変異型遺伝子を検 出する必要がある。
[0009] 従って、疾患の診断を目的として核酸増幅法による変異型遺伝子の検出を行なう 場合には、利用する核酸増幅法の特異性が特に重要となる。
[0010] 一方で、核酸増幅方法としては、 PCR法以外にも様々な方法が開発されており、例 えば、鎖置換増幅法 (SDA法;特公平 7— 114718号公報)、自己維持配列増幅法（ 3SR法）、 Q βレプリカーゼ法（日本国特許第 2710159号公報）、 NASBA法（日本 国特許第 2650159号公報）、 LAMP法（国際公開第 00Ζ28082号パンフレット）、 I CAN法（国際公開第 02Z16639号パンフレット）、ローリングサークル法、国際公開 第 2004Z040019号パンフレットに記載の方法などが知られている。
[0011] さらに、核酸増幅法を利用した遺伝子変異の検出法として、上記の LAMP法を用 いた変異検出法 (特開 2003— 159100号公報）、国際公開第 01/34838号パンフ レットに記載の方法などが知られている。
発明の概要
[0012] 本発明者らは、核酸増幅反応において、標的核酸配列中の 2以上の領域に特異 的な配列を含むプライマーと、標的核酸配列中の 1以上の領域に特異的な配列を含 むプライマーとを使用し、前記領域の 1以上の領域に変異に力かるヌクレオチド残基 が含まれるようにこれらプライマーを設計しておくことにより、野生型遺伝子と変異型 遺伝子のいずれか一方を特異的に増幅できることを見出した。さらに、本発明者らは
、前記核酸増幅反応によって得られる増幅産物を铸型として含み、新たに前記プライ マー等の試薬を加えた反応液による核酸増幅反応を繰り返すことにより、多量の野 生型遺伝子を含むサンプル中の極微量の変異型遺伝子を特異的に増幅できること を見出した。本発明はこれら知見に基づくものである。
[0013] 従って、本発明の目的は、多量の野生型遺伝子を含むサンプル中の微量の変異 型遺伝子、または多量の変異型遺伝子を含むサンプル中の微量の野生型遺伝子を 特異的に増幅しうる核酸増幅法を提供することにある。
[0014] そして、本発明による核酸増幅法は、野生型遺伝子と変異型遺伝子の両方を含む サンプルから!/、ずれか一方の遺伝子を特異的に増幅する方法であって、 (a)増幅し ようとする前記遺伝子上の 2以上の領域に相同または相補的な配列を含む少なくとも 1種のプライマーおよび同遺伝子上の 1以上の領域に相同または相補的な配列を含 む少なくとも 1種のプライマーを含んでなるプライマーセットであって、変異にかかるヌ クレオチド残基が前記領域のうちの 1以上の領域に含まれる、プライマーセットを用意 する工程、（b)前記サンプルに含まれる核酸分子を铸型として、前記プライマーセット による核酸増幅反応を行なう工程、ならびに（c)前記核酸増幅反応によって得られる 増幅産物を铸型として、前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行なう工程を含 んでなるものである。
[0015] 本発明によれば、野生型遺伝子と変異型遺伝子の両方を含むサンプルから、その いずれか一方を特異的に増幅することができ、特に、その増幅対象となる遺伝子が サンプル中に極微量にしか存在しな ヽ場合でも、これを特異的に増幅することができ る。これにより、野生型遺伝子を有する多量の正常細胞を含む検体から、変異型遺 伝子を有する極微量の疾患関連細胞を検出することが可能となる。
図面の簡単な説明
[0016] [図 1]図 1は、第一のプライマーを用いた核酸増幅反応の作用機序を模式的に示した 図である。 [図 2]図 2は、第二のプライマーの構造を例示した図である。
[図 3a]図 3aは、第一のプライマーおよび第二のプライマーを用いた核酸増幅反応の 作用機序を模式的に示した図である。
[図 3b]図 3bは、第一のプライマーおよび第二のプライマーを用いた核酸増幅反応の 作用機序を模式的に示した図である。
[図 4]図 4は、ヒト /3グロビン遺伝子に含まれるヌクレオチド配列（配列番号 1)、ならび に実施例 1にお 、て用いられた変異の部位およびプライマーの設計に用いられた領 域を示す図である。
[図 5]図 5は、実施例 1における 3回目の核酸増幅反応の経時変化を示すグラフであ る。
発明の具体的説明
[0017] 本発明による核酸増幅法は、野生型遺伝子と変異型遺伝子の両方を含むサンプ ルから 1、ずれか一方の遺伝子を特異的に増幅する方法である。その特異性は極め て高度であり、野生型遺伝子と変異型遺伝子との配列の相違点が一塩基置換であつ ても、これらのいずれか一方のみを増幅することができる。さらに、いずれかの型の遺 伝子がサンプル中に極微量にしか存在しな 、場合であっても、その遺伝子を特異的 に増幅することができる。これらの効果は、プライマーのミスプライミングによる誤った 増幅産物の生成を防止するためのプライマーの構造、および核酸増幅反応の繰り返 しによつて達成される。
[0018] 本発明による核酸増幅法では、増幅しょうとする遺伝子 (野生型遺伝子または変異 型遺伝子）上の 2以上の領域に相同または相補的な配列を含む少なくとも 1種のブラ イマ一および同遺伝子上の 1以上の領域に相同または相補的な配列を含む少なくと も 1種のプライマーを含んでなるプライマーセットが用意される。このプライマーセット は、変異に力かるヌクレオチド残基が前記領域のうちの 1以上の領域に含まれるよう に設計される。
[0019] 前記プライマーセットに含まれる前記 2種のプライマーは、典型的には、増幅しょう とする標的核酸配列について設計されたフォワードプライマーおよびリバースプライ マーとすることができる。よって、一方のプライマーは標的核酸配列の 5'末端領域に 相同な配列を含むものとし、他方のプライマーは標的核酸配列の 3'末端領域に相補 的な配列を含むものとすることができる。さらに、これらプライマーの少なくとも一方は 、標的核酸配列の 5 '末端領域および 3 '末端領域とは異なる領域に相同または相補 的な配列を含むものとされる。このような配列は、例えば、一方のプライマーが標的核 酸配列またはその相補配列にハイブリダィズし、同プライマーの伸長反応が起こった 後に、その伸長鎖上の領域にノ、イブリダィズしてループ構造を形成するように、同プ ライマーの 5'末端側に組み込むことができる。このように、少なくとも 1種のプライマー は、標的核酸配列 (増幅しょうとする遺伝子)上の 2以上の領域の配列に基づいて設 計され、その領域の数の上限は特に限定されないが、好ましくは 2〜5領域、より好ま しくは 2〜3領域、さらに好ましくは 2領域の配列に基づいて設計される。また、他の 1 種のプライマーは、標的核酸配列（増幅しょうとする遺伝子）上の 1以上の領域の配 列に基づいて設計され、その領域の数の上限は特に限定されないが、好ましくは 1〜 5領域、より好ましくは 1〜3領域、さらに好ましくは 1〜2領域の配列に基づいて設計 される。さらに、前記プライマーセットは、前記 2種のプライマーに加え、核酸増幅反 応に関与する他のプライマーをさらに含むものとしてもよい。
[0020] 前記プライマーセットに含まれる前記 2種のプライマーの設計に用いられる標的核 酸配列 (増幅しょうとする遺伝子)上の領域は、そのうちの少なくとも 1つが変異にか 力るヌクレオチド残基を含むように選択される。このような変異に力かるヌクレオチド残 基を含む複数の領域をプライマーの設計に用いることもでき、特に、変異型遺伝子中 に複数の変異に力かるヌクレオチド残基が存在する場合には有利である。
[0021] 前記プライマーセットの他の設計基準は、利用する核酸増幅反応の作用機序に従 つて決定される。このような核酸増幅反応としては、当業者に公知のいかなる方法で あってもよいが、好ましくは等温下での反応によって標的核酸の増幅を可能とするも のとされる。よって、本発明の好ましい実施態様によれば、前記プライマーセットは等 温下での反応によって標的核酸の増幅を可能とするものとされ、その場合には、核酸 増幅反応は等温下で行なうことができる。このような等温核酸増幅法としては、例えば 、 LAMP法（国際公開第 00Z28082号パンフレット）、国際公開第 2004Z040019 号パンフレットに記載の方法等が挙げられる。 [0022] 本発明の好ましい実施態様によれば、前記プライマーセットに含まれる第一のブラ イマ一は、標的核酸配列の 3 '末端部分の配列 (A)にハイブリダィズする配列 (Ac )を 3 '末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列 (A)よりも 5 '側 に存在する配列（B)の相補配列（Be)にハイブリダィズする配列（Β')を前記配列 (Ac )の 5，側に含んでなるものとされる。
[0023] 本発明の特に好ましい実施態様によれば、等温核酸増幅法として、本発明者ら〖こ よって開発された核酸増幅法が用いられる。この実施態様では、前記プライマーセッ トは、標的核酸配列を増幅しうる少なくとも 2種のプライマーを含んでなるプライマー セットであって、前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列 の 3 '末端部分の配列 (A)に相補的な配列 (Ac')を 3 '末端部分に含んでなり、かつ前 記標的核酸配列にお 、て前記配列 (A)よりも 5 '側に存在する配列（B)に相同な配 列（Β')を前記配列 (Ac )の 5 '側に含んでなるものであり、前記プライマーセットに含 まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の 3 '末端部分の配列 (C )に相補的な配列（Cc')を 3 '末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダィズする 2つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（D-Dc )を前記配列（Cc')の 5 '側に 含んでなるものとされる。
[0024] 本発明において「ノヽイブリダィズする」とは、プライマー中の領域がストリンジェントな 条件下で標的領域にハイブリダィズし、標的領域以外の領域にはハイブリダィズしな いことを意味する。ストリンジェントな条件は、プライマー中の領域とその相補鎖との二 重鎖の融解温度 Tm (°C)およびハイブリダィゼーシヨン溶液の塩濃度などに依存して 決定することができ、例えば、 J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Clon ing 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)等を参照することができる。例 えば、使用するプライマー領域の融解温度よりわずかに低 、温度下でハイブリダィゼ ーシヨンを行なうと、プライマー中の領域を標的領域に特異的にハイブリダィズさせる ことができる。このようなプライマーは、市販のプライマー構築ソフト、例えば、 Primer 3 (Whitehead Institute for Biomedical Research社製）などを用いて設計することがで きる。本発明の好ましい実施態様によれば、ある標的領域にノ、イブリダィズするプライ マー中の領域は、その標的領域に相補的な配列を含んでなるものである。 [0025] 前記第一のプライマーによる核酸合成の作用機序を図 1に模式的に示す。まず、 铸型となる核酸中の標的核酸配列を決定し、その標的核酸配列の 3'末端部分の配 列 (A)、および配列 (A)よりも 5 '側に存在する配列 (B)を決定する。第一のプライマ 一は、配列 (Ac')を含んでなり、さらにその 5'側に配列（Β')を含んでなる。配列 (Ac') は配列 (A)に相補的な配列であり、配列（Β')は配列（Β)に相同な配列である。ここで 、第一のプライマーは、前記配列 (Ac')と前記配列 (Β')の間に、反応に影響を与えな V、介在配列を含んで 、てもよ 、。このようなプライマーを铸型核酸にアニーリングさせ ると、プライマー中の配列 (Ac )が標的核酸配列の配列 (A)にハイブリダィズした状 態となる（図 l(a))。この状態でプライマー伸長反応が起こると、標的核酸配列の相補 配列を含む核酸が合成される。そして、合成された核酸の 5'末端側に存在する配列 (Β')が、同核酸中に存在する配列（Be)にハイブリダィズし、これにより、合成された 核酸の 5'末端部分においてステム—ループ構造が形成される。その結果、铸型核 酸上の配列 (A)がー本鎖となり、この部分に先の第一のプライマーと同一の配列を有 する他のプライマーがハイブリダィズする（図 l(b))。その後、鎖置換反応により、新た にハイブリダィズした第一のプライマーからの伸長反応が起こると同時に、先に合成 された核酸が铸型核酸から分離される（図 l(c))。
[0026] 上記の作用機序にお!、て、配列（Β')が配列（Be)にハイブリダィズする現象は、同 一鎖上に相補領域が存在することにより起こる。一般に、二本鎖核酸が一本鎖に解 離するときは、その末端あるいはそれ以外の比較的不安定な部分力 部分的な解離 が始まる。上記第一のプライマーによる伸長反応で生成した二本鎖核酸は、比較的 高温では末端部分の塩基対は解離と結合の平衡状態にあり、全体としては二本鎖を 保っている。そのような状態で末端の解離した部分に相補的な配列が同一鎖上に存 在すると、準安定な状態としてステム—ループ構造を形成することができる。このステ ムループ構造は安定的には存在しないが、その構造の形成により剥き出しとなった 相補鎖部分 (铸型核酸上の配列 (A) )に同一の他のプライマーが結合し、すぐさまポ リメラーゼが伸長反応を行うことにより、先に合成された鎖が置換されて遊離すると同 時に、新たな二本鎖核酸を生成することができる。
[0027] 本発明の好ましい実施態様における第一のプライマーの設計基準は次のとおりで ある。まず、プライマーの伸長により铸型核酸の相補鎖が合成された後に新たなブラ イマ一が効率よく同铸型核酸にアニーリングするためには、合成された相補鎖の 5 ' 末端におけるステム ループ構造形成により、铸型核酸上の前記配列 (A)の部分を 一本鎖とする必要がある。そのためには、配列 (Ac')の塩基数 Xと標的核酸配列中に おける前記配列 (A)と前記配列 (B)に挟まれた領域の塩基数 Yとの差 (X— Y)の、 X に対する割合 (X—Y) ZXが重要となる。ただし、铸型核酸上において配列 (Α)よりも 5'側に存在する、プライマーのハイブリダィズとは関係無い部分まで一本鎖とする必 要はない。また、新たなプライマーが効率よく铸型核酸にアニーリングするためには、 上述のステム—ループ構造形成を効率よく行なうことも必要となる。そして、効率の良 V、ステム ループ構造形成、すなわち、効率の良!、配列（Β')と配列（Be)とのハイブ リダィゼーシヨンには、前記配列（Β')と前記配列（Be)との間の距離 (X+Y)が重要と なる。一般に、プライマー伸長反応のための最適温度は最高でも 72°C付近であり、 そのような低い温度では、伸長鎖が長い領域にわたって解離することは困難である。 従って、配列（Β')が配列（Be)に効率よくハイブリダィズするためには、両配列の間の 塩基数は少ないほうが好ましいと考えられる。一方で、配列（Β')が配列（Be)にハイブ リダィズして铸型核酸上の前記配列 (A)の部分を一本鎖とするためには、配列（Β')と 配列（Be)との間の塩基数は多い方が好ましいと考えられる。
[0028] 以上のような観点から、本発明の好ましい実施態様による前記第一のプライマーは 、プライマーを構成する配列 (Ac )と配列 (Β')の間に介在配列が存在しない場合に おいて、（X— Υ) ΖΧが一 1. 00以上、好ましくは 0. 00以上、さらに好ましくは 0. 05 以上、さらに好ましくは 0. 10以上となり、また、 1. 00以下、好ましくは 0. 75以下、さ らに好ましくは 0. 50以下、さらに好ましくは 0. 25以下となるように設計される。さらに 、（Χ+Υ)は、好ましくは 15以上、さらに好ましくは 20以上、さらに好ましくは 30以上 とされ、また、好ましくは 50以下、さらに好ましくは 48以下、さらに好ましくは 42以下と される。
[0029] また、プライマーを構成する配列 (Ac )と配列 (Β')の間に介在配列 (塩基数は Y' ) が存在する場合には、本発明の好ましい実施態様による前記第一のプライマーは、 { X— (Υ— Υ' ΜΖΧが一 1. 00以上、好ましくは 0. 00以上、さらに好ましくは 0. 05以 上、さらに好ましくは 0. 10以上となり、また、 1. 00以下、好ましくは 0. 75以下、さら に好ましくは 0. 50以下、さらに好ましくは 0. 25以下となるように設計される。さらに、 (Χ+Υ+Υ' )は、好ましくは 15以上、さらに好ましくは 20以上、さらに好ましくは 30 以上とされ、また、好ましくは 100以下、さらに好ましくは 75以下、さらに好ましくは 50 以下とされる。
[0030] 前記第一のプライマーは、与えられた条件下で必要な特異性を維持しながら標的 核酸との塩基対結合を行うことができる程度の鎖長を有するものである。このプライマ 一の鎖長は、好ましくは 15〜100ヌクレオチド、より好ましくは 20〜60ヌクレオチドと する。また、前記第一のプライマーを構成する配列 (Ac')と配列 (Β')の長さは、それ ぞれ、好ましくは 5〜50ヌクレオチド、より好ましくは 7〜30ヌクレオチドである。また、 必要に応じて、配列 (Ac')と配列 (Β')の間に、反応に影響を与えない介在配列を挿 人してちょい。
[0031] 前記第二のプライマーは、上述のように、前記標的核酸配列の相補配列 (第一の プライマーがハイブリダィズする鎖に対して反対側の鎖)の 3'末端部分の配列 (C)に 相補的な配列（Cc )を 3'末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダィズする 2つ の核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（D-Dc )を前記配列（Cc')の 5'側に含ん でなるものである。このような第二のプライマーの構造は、例えば、図 2に示すようなも のであるが、図 2に示される配列やヌクレオチド数に限定されるものではない。第二の プライマーを構成する配列（Cc')の長さは、好ましくは 5〜50ヌクレオチド、より好まし くは 10〜30ヌクレオチドである。また、前記折返し配列（D-Dc')の長さは、好ましくは 2〜： L000ヌクレオチド、より好ましくは 2〜100ヌクレオチド、さらに好ましくは 4〜60ヌ クレオチド、さらに好ましくは 6〜40ヌクレオチドであり、折返し配列の内部におけるハ イブリダィゼーシヨンによって形成される塩基対のヌクレオチド数は、好ましくは 2〜5 00bp、より好ましく ίま 2〜50bp、さら【こ好ましく ίま 2〜30bp、さら【こ好ましく ίま 3〜20b pである。折返し配列（D-Dc')のヌクレオチド配列はいかなる配列であってもよぐ特 に限定されるものではないが、好ましくは標的核酸配列にハイブリダィズしない配列と される。また、必要に応じて、配列（Cc')と折返し配列（D-Dc')の間に、反応に影響を 与えな ヽ介在配列を挿入してもよ ヽ。 これら第一のプライマーおよび第二のプライマーによる核酸増幅反応について考え られる作用機序を、図 3 (図 3aおよび図 3b)を用いて説明する。まず、第一のプライマ 一が標的核酸のセンス鎖にハイブリダィズし、該プライマーの伸長反応が起きる（図 3 (a)) G次いで、伸長鎖（一）上においてステム—ループ構造が形成され、これにより一 本鎖となった標的核酸センス鎖上の配列 (A)に新たな第一のプライマーがハイブリダ ィズし (図 3(b))、該プライマーの伸長反応が起きて、先に合成された伸長鎖（―）が 脱離する。次に、脱離した伸長鎖（-)上の配列 (C)に第二のプライマーがハイブリダ ィズし (図 3(c))、該プライマーの伸長反応が起き、伸長鎖（+ )が合成される（図 3(d)) 。生成した伸長鎖（ + )の 3 '末端と伸長鎖（一）の 5 '末端ではステム ループ構造が 形成され (図 3(e))、遊離型の 3 '末端である伸長鎖（+ )のループ先端力も伸長反応 が起こると同時に、前記伸長鎖（一）が脱離する（図 3(1))。ループ先端からの前記伸 長反応により、伸長鎖（+ )の 3 '側に配列 (A)および配列 (Be)を介して伸長鎖（一） が結合したヘアピン型の二本鎖核酸が生成し、その配列 (A)および配列（Be)に第一 のプライマーがハイブリダィズし（図 3(g))、その伸長反応により伸長鎖（一）が生成す る（図 3(h)および (0)。また、前記ヘアピン型二本鎖核酸の 3 '末端に存在する折返し 配列によって遊離型の 3 '末端が提供され (図 3(h))、そこからの伸長反応により（図 3( 0)、両端に折返し配列を有し、第一および第二のプライマーに由来する配列を介し て伸長鎖（+ )と伸長鎖（-)とを交互に含む一本鎖核酸が生成する（図 3(j))。この一 本鎖核酸では、その 3 '末端に存在する折返し配列により遊離型の 3 '末端 (相補鎖 合成起点）が提供されるため（図 3(k))、同様の伸長反応が繰り返され、 1回の伸長反 応あたり 2倍の鎖長となる（図 3(1)および (m))。また、図 3(0において脱離した第一のプ ライマー力もの伸長鎖（一）では、その 3 '末端に存在する折返し配列により遊離型の 3 '末端 (相補鎖合成起点）が提供されるため（図 3(n))、そこからの伸長反応により、 両端にステム ループ構造が形成され、プライマーに由来する配列を介して伸長鎖 (+ )と伸長鎖（一）とを交互に含む一本鎖核酸が生成する（図 3(o))。この一本鎖核 酸においても、 3 '末端におけるループ形成によって相補鎖合成起点が順次提供さ れるため、そこからの伸長反応が次々に起こる。このようにして自動的に延長される一 本鎖核酸には、第一のプライマーおよび第二のプライマーに由来する配列が伸長鎖 (+ )と伸長鎖（一）との間に含まれているため、各プライマーがハイブリダィズして伸 長反応を起こすことが可能であり、これにより標的核酸のセンス鎖およびアンチセンス 鎖が顕著に増幅される。
[0033] 前記プライマーセットは、前記第一のプライマーおよび前記第二のプライマーにカロ えて、前記標的核酸配列またはその相補配列にノ、イブリダィズする第三のプライマ 一をさらに含んでいてもよぐこのような第三のプライマーは、標的核酸配列またはそ の相補配列へのハイブリダィゼーシヨンにっ 、て他のプライマーと競合しな 、ものとさ れる。
[0034] 本発明にお 、て「競合しな!、」とは、そのプライマーが標的核酸にハイブリダィズす ることによって他のプライマーによる相補鎖合成起点の付与が妨げられないことを意 味する。
[0035] 第一のプライマーおよび第二のプライマーにより標的核酸が増幅された場合には、 上述のように、増幅産物は標的核酸配列とその相補配列とを交互に有するものとなる 。その増幅産物の 3 '末端には折返し配列またはループ構造が存在し、これにより提 供される相補鎖合成起点から次々に伸長反応が起こっている。第三のプライマーは 、このような増幅産物が部分的に一本鎖の状態になった時に、その一本鎖部分に存 在する標的配列にアニーリングすることができる。これにより、増幅産物中の標的核 酸配列内に新たな相補鎖合成起点が提供され、そこからの伸長反応が起こるため、 核酸増幅反応がより迅速に行われるようになる。
[0036] 第三のプライマーは必ずしも 1種類に限定されるわけではなぐ核酸増幅反応の迅 速性および特異性を向上させるためには 2種類以上の第三のプライマーを同時に用 いてもよい。これら第三のプライマーは、典型的には第一のプライマーおよび第二の プライマーとは異なる配列力 なる力 これらのプライマーと競合しない限りにおいて 、部分的に重なる領域にハイブリダィズするものとしてもよい。第三のプライマーの鎖 長は、好ましくは 2〜： LOOヌクレオチド、より好ましくは 5〜50ヌクレオチド、さらに好ま しくは 7〜30ヌクレオチドとされる。
[0037] 第三のプライマーは、第一のプライマーおよび第二のプライマーによる核酸増幅反 応をより迅速に進めるための補助的な働きをその主目的とするものである。従って、 第三のプライマーは、第一のプライマーおよび第二のプライマーの各 3，末端の Tmよ りも低い Tmを有するものとすることが好ましい。また、第三のプライマーの増幅反応 液への添加量は、第一のプライマーおよび第二のプライマーのそれぞれの添加量よ りも少ない方が好ましい。
[0038] 前記プライマーセットを利用して遺伝子変異の有無を判定するためには、変異にか 力るヌクレオチド残基が前記配列 (A)、前記配列（B)または前記配列（C)に含まれる ようにプライマーセットを設計することができる。また、上記第三のプライマーが前記 核酸試料中の核酸配列またはその相補配列にハイブリダィズしたときに、前記変異 の存在または不存在によって前記核酸配列またはその相補配列との間で 1以上のミ スマッチを生じるように、第三のプライマーを設計することもできる。これにより、増幅 産物の有無を確認することによって前記変異の有無を判定することが可能となり、ま た、増幅産物を定量することにより前記変異を有する遺伝子の量を決定することが可 能となる。
[0039] 本発明の一つの実施態様によれば、前記プライマーセットは、変異に力かるヌクレ ォチド残基が前記配列 (A)に含まれるように設計される。この実施態様では、核酸試 料中の標的核酸配列が铸型となる場合には、核酸増幅反応において第一のプライ マーが配列 (A)にアニーリングするため、増幅産物が得られる。核酸試料中の、変異 部位にぉ 、て標的核酸配列とは異なる核酸配列が铸型となる場合には、核酸増幅 反応において第一のプライマーが配列 (A)にアニーリングすることが困難となるため 、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。変異に 力かるヌクレオチド残基は、好ましくは前記配列 (A)の 5 '末端 (第一のプライマーに おける 3，末端に対応する）に含まれるものとされる。
[0040] 本発明の他の実施態様によれば、前記プライマーセットは、変異にかかるヌクレオ チド残基が前記配列 (C)に含まれるように設計される。この実施態様では、核酸試料 中の標的核酸配列が铸型となる場合には、核酸増幅反応において第二のプライマ 一が配列 (C)にアニーリングするため、増幅産物が得られる。核酸試料中の、変異部 位にお 、て標的核酸配列とは異なる核酸配列が铸型となる場合には、核酸増幅反 応において第二のプライマーが配列（C)にアニーリングすることが困難となるため、 増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。変異に 力かるヌクレオチド残基は、好ましくは前記配列 (C)の 5 '末端 (第二のプライマーに おける 3，末端に対応する）に含まれるものとされる。
[0041] 本発明の好ましい実施態様によれば、前記プライマーセットは、変異に力かるヌクレ ォチド残基が前記配列 (B)に含まれるように設計される。この実施態様では、核酸試 料中の標的核酸配列が铸型となる場合には、核酸増幅反応において、第一のプライ マーが配列 (A)にアニーリングして伸長反応が行なわれた後に該プライマーに含ま れる配列（Β')が伸長鎖上の配列（Be)にハイブリダィズするため、ステム ループ構 造が効率的に形成される。この効率的なステム ループ構造の形成により、他の第 一のプライマーが铸型にアニーリングすることが可能となり、図 1に示される作用機序 が効率的に進行するため、増幅産物が得られる。一方で、核酸試料中の、変異部位 にお 、て標的核酸配列とは異なる核酸配列が铸型となる場合には、核酸増幅反応 における上記ステム—ループ構造の形成が困難となるため、図 1に示される作用機 序が妨げられ、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減 少する。
[0042] 上述の配列（B)における変異の検出について、さらに詳細に説明する。図 1に示す 作用機序において、配列（Β')が配列（Be)にハイブリダィズする現象は、同一鎖上に 相補領域が存在することにより起こる。一般に、二本鎖核酸が一本鎖に解離するとき は、その末端あるいはそれ以外の比較的不安定な部分力 部分的な解離が始まる。 第一のプライマーによる伸長反応によって生成した二本鎖核酸は、比較的高温では 末端部分の塩基対は解離と結合の平衡状態にあり、全体としては二本鎖を保ってい る。そのような状態で末端の解離した部分に相補的な配列が同一鎖上に存在すると 、準安定な状態としてステム一ループ構造を形成することができる。しかし、このステ ムーループ構造は安定的には存在せず、特に、そのステムを形成する配列（Β')と配 列（Be)部分との間に相補的でないヌクレオチドが存在する場合には、非常に不安定 となり、あるいは、ステムが全く形成されない。この場合には、铸型上の配列 (A)とブラ イマ一中の配列（Ac')とのハイブリダィゼーシヨンの方が優位となり、配列（A)の部分 がー本鎖とならないため、次の第一のプライマーがアニーリングできなくなる。そのた め、図 1に示される連続した反応を起こすことが極めて困難となる。
[0043] 本発明による核酸増幅法では、前記サンプルに含まれる核酸分子を铸型として、前 記プライマーセットによる核酸増幅反応が行なわれる。その反応条件は、利用する核 酸増幅反応に従って、当業者であれば適宜決定することができる。
[0044] 前記プライマーセットが等温下での反応によって標的核酸の増幅を可能とするもの とされる場合には、核酸増幅反応は等温下で行なうことが好ましい。ここで、「等温」と は、酵素およびプライマーが実質的に機能しうるような、ほぼ一定の温度条件下に保 つことをいう。さらに、「ほぼ一定の温度条件」とは、設定された温度を正確に保持す ることのみならず、酵素およびプライマーの実質的な機能を損なわな!/、程度の温度 変化であれば許容されることを意味する。一定の温度条件下での核酸増幅反応は、 使用する酵素の活性を維持できる温度に保つことにより実施することができる。また、 この核酸増幅反応において、プライマーが標的核酸にアニーリングするためには、例 えば、反応温度を、そのプライマーの融解温度 (Tm)付近の温度、もしくはそれ以下 に設定することが好ましぐさらには、プライマーの融解温度 (Tm)を考慮し、ストリン ジエンシーのレベルを設定することが好ましい。従って、この温度は、好ましくは、約 2 0°C〜約 75°Cであり、さらに好ましくは、約 35°C〜約 65°Cとする。
[0045] 核酸増幅反応に用いられるポリメラーゼは、鎖置換 (strand displacement)活性 (鎖 置換能）を有するものであることが好ましぐ常温性、中温性、もしくは耐熱性のいず れのものも好適に使用できる。また、このポリメラーゼは、天然体もしくは人工的に変 異をカ卩えた変異体のいずれであってもよい。このようなポリメラーゼとしては、 DNAポ リメラーゼが挙げられる。さらに、この DNAポリメラーゼは、実質的に 5 '→3 'ェキソヌ クレアーゼ活性を有しな 、ものであることが好まし 、。このような DNAポリメラーゼとし ては、バチルス'ステア口サーモフィルス（Bacillus stearothermophilus,以下「： B. st」と いう）、バチルス'カルドテナックス（Bacillus caldotenax、以下「B. ca」という）等の好熱 性バチルス属細菌由来 DNAポリメラーゼの 5 '→3，ェキソヌクレアーゼ活性を欠失し た変異体、大腸菌 . coli)由来 DNAポリメラーゼ Iのタレノウフラグメント等が挙げら れる。核酸増幅反応において使用する DNAポリメラーゼとしては、さらに、 Vent DNA ポリメラーゼ、 Vent (Exo-) DNAポリメラーゼ、 DeepVent DNAポリメラーゼ、 DeepVent (Exo-) DNAポリメラーゼ、 Φ 29ファージ DNAポリメラーゼ、 MS— 2ファージ DNAポ リメラーゼ、 Z-Taq DNAポリメラーゼ、 Pfo DNAポリメラーゼ、 Pfo turbo DNAポリメラー ゼ、 KOD DNAポリメラーゼ、 9° Nm DNAポリメラーゼ、 Therminater DNAポリメラーゼ 等が挙げられる。
[0046] 核酸増幅反応に用いられるその他の試薬としては、例えば、塩化マグネシウム、酢 酸マグネシウム、硫酸マグネシウム等の触媒、 dNTPミックス等の基質、トリス塩酸バッ ファー、トライシンバッファー、リン酸ナトリウムバッファー、リン酸カリウムバッファ一等 の緩衝液を使用することができる。さらに、ジメチルスルホキシド (dimethyl sulfoxide) やべタイン（Ν,Ν,Ν- trimethylglycine)等の添加物、国際公開第 99/54455号パンフ レットに記載の酸性物質、陽イオン錯体等を使用してもよい。
[0047] 核酸増幅反応において、核酸の増幅効率を高めるために、融解温度調整剤を反 応溶液中に添加することができる。核酸の融解温度 (Tm)は、一般的に、核酸中の二 本鎖形成部分の具体的なヌクレオチド配列によって決定される。反応溶液中に融解 温度調整剤を添加することにより、この融解温度を変化させることができ、従って、一 定の温度下では、核酸における二本鎖形成の強度を調整することが可能となる。一 般的な融解温度調整剤は、融解温度を下げる効果を有する。このような融解温度調 整剤を添加することにより、 2本の核酸の間の二本鎖形成部分の融解温度を下げるこ とができ、換言すれば、その二本鎖形成の強度を下げることが可能となる。従って、 前記核酸増幅反応においてこのような融解温度調整剤を反応溶液中に添加すると、 強固な二本鎖を形成する GCの豊富な核酸領域や複雑な二次構造を形成する領域 において効率的に二本鎖部分を一本鎖とすることが可能となり、これにより、プライマ 一による伸長反応が終わった後に次のプライマーが目的領域にハイブリダィズしゃ すくなるため、核酸の増幅効率を上げることができる。本発明において用いられる融 解温度調整剤およびその反応溶液中での濃度は、ハイブリダィゼーシヨン条件に影 響を与える他の反応条件、例えば塩濃度、反応温度等を考慮して、当業者により適 切に選択される。従って、融解温度調整剤は特に制限されるものではないが、好まし くはジメチルスルホキシド（DMSO)、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、ま たはこれらの任意の組み合わせとされ、より好ましくはジメチルスルホキシド（DMSO )とされる。
[0048] さらに、核酸増幅反応において、酵素安定化剤を反応溶液中に添加することもでき る。これにより、反応液中の酵素が安定ィ匕されるため、核酸の増幅効率を高めること が可能となる。本発明において用いられる酵素安定化剤は、グリセロール、ゥシ血清 アルブミン、糖類などの、当技術分野において知られているいかなるものであってもよ ぐ特に制限されない。
[0049] さらに、核酸増幅反応において、 DNAポリメラーゼ、逆転写酵素などの酵素の耐熱 性を増強するための試薬を、酵素安定化剤として反応溶液中に添加することもできる 。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の合成効率および増幅効 率を高めることが可能となる。このような試薬は当技術分野にぉ 、て知られて 、る!/ヽ 力なるものであってもよぐ特に制限されないが、好ましくは糖類、より好ましくは単糖 またはオリゴ糖、さらに好ましくはトレハロース、ソルビトールもしくはマン-トール、ま たはこれらの 2種以上の混合物とされる。
[0050] 本発明の好ましい実施態様によれば、核酸増幅反応はミスマッチ認識タンパク質の 存在下で行なわれ、これにより、より正確な変異型遺伝子または野生型遺伝子の特 異的な増幅が可能となる。
[0051] 細菌や酵母等には、 DNAの 2本鎖において部分的に対合できない（ミスマッチ)塩 基対が生じたときに、これを修復するための機構があることが既に知られている。この 修復は「ミスマッチ結合タンパク質」（「ミスマッチ認識タンパク質」とも称される）と呼ば れるタンパク質によって行なわれるものであり、 MutSタンパク質（特表平 9 50469 9号公報）、 MutMタンパク質（特開 2000— 300265号公報）、 GFP (Green Fluores cence Protein)に結合した MutSタンパク質（国際公開第 99/06591号パンフレット )などの様々なミスマッチ結合タンパクの使用が報告されている。さらに、近年、ミスマ ツチ結合タンパク質を利用してミスマッチを検出する遺伝子診断法が開発されている (M. Gotoh et al.， Genet. Anal, 14, 47-50, 1997) 0核酸中における特定のヌクレオ チドにおける多型および突然変異の検出法としては、例えば、変異のない対照核酸 と、変異が存在することが疑われる被検核酸とをハイブリダィズさせ、そこにミスマッチ 認識タンパク質を導入することによりミスマッチを検出する方法が知られている。 [0052] 本発明にお！/、て「ミスマッチ」とは、アデニン (A)、グァニン（G)、シトシン（C)、およ びチミン (T) (RNAの場合はゥラシル (U) )から選択される一組の塩基対が正常な塩 基対 (Aと Tの組み合わせ、または Gと Cの組み合わせ)ではないことを意味する。ミス マッチには、 1つのミスマッチのみならず、複数の連続したミスマッチ、 1または複数の 塩基の挿入および Zまたは欠失により生じるミスマッチ、ならびにそれらの組み合わ せが含まれる。
[0053] 変異型遺伝子または野生型遺伝子の特異的増幅のための核酸増幅反応にお!、て も、これらのミスマッチ結合タンパク質を利用することにより、その特異性 (正確さ）を向 上させることができる。核酸増幅反応においては、相互に相補的でない 2つのヌクレ ォチド配列の間で少量のへテロ二本鎖構造が生ずることがある。本発明にお 、て「へ テロ二本鎖構造」とは、実質的には相補的な二本鎖構造であるが、 1または複数のミ スマッチを有することにより非相補的な領域を含む二本鎖構造を意味する。このよう なへテロ二本鎖構造により、本来的には生成しないはずの誤った増幅産物がもたら される。そこで、核酸増幅反応に用いられる反応液中にミスマッチ結合タンパク質を 添加しておけば、上記のようなヘテロ二本鎖構造にこのミスマッチ結合タンパク質が 結合し、その後の増幅反応が妨げられる。従って、ミスマッチ結合タンパク質を利用 することにより、誤った増幅産物の生成を防ぐことが可能となる。
[0054] 本発明に用いられるミスマッチ結合タンパク質は、二本鎖核酸におけるミスマッチを 認識し、そのミスマッチの部位に結合することが可能なタンパク質であればよぐ例え ば、当業者に公知のいずれのものであってもよい。また、本発明に用いられるミスマツ チ結合タンパク質は、二本鎖核酸中のミスマッチを認識しうる限り、野生型タンパク質 のアミノ酸配列において 1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または 挿入されたアミノ酸配列力もなるタンパク質 (変異体)であってもよ!/、。このような変異 体は、自然界において生じることもある力 人為的に作製することも可能である。タン ノ ク質にアミノ酸変異を導入する方法としては、多くの方法が知られている。例えば、 部位特異的変異導入法としては、 W.P. Dengと J.A. Nickoloffの方法（Anal. Biochem. , 200, 81, 1992)、 K.L. Makamayeと F. Ecksteinの方法（Nucleic Acids Res., 14, 9679 -9698, 1986)などが知られており、ランダム変異導入法としては、基本的な修復系を 欠損した大腸菌 XLl-Red株 (Stratagene社)を用いる方法、亜硝酸ナトリウム等を用 いて化学的に塩基を修飾する方法 (J.-J. Diaz et al.， BioTechnique, 11, 204-211, 1 991)などが知られている。このようなミスマッチ結合タンパク質としては、 MutM、 Mut Sおよびそれらの類似体など、多くのものが知られている（Radman,M.et al.Annu.Rev .Genet.20:523-538(1986);Radaman,M.etal.,Sci.Amer.,August 1988,pp40-46;Modric h,P.,J.Biol.Chem.264:6597-6600(1989) ; Lahue.R.S. et al, Science 245:160-164(198 8);Jiricny,J.et al'.Nucl. Acids Res.16:7843- 7853(1988);Su,S.S.et al.,J.Biol.Chem.263; 6829-6835(1988);Lahue,R.S.et al.'Mutat.Res.198:37- 43(1988);Dohet,C.et al.Mol.G en.Gent.206: 181-184(1987); Jones.M.et al.'Gentics 115:605—610(1987) ; Salmonella typhimuriumの Muts (Lu,A.L.,Genetics 118:593- 600(1988);HaberL.T. et al.J.Bact eriol.l70:197-202(1988);Pang,P.P.et al.J.Bacteriol.163: 1007- 1015(1985))；および P riebe S.D.et al.,J.Bacterilo.l70:190- 196(1988))。本発明に用いられるミスマッチ結合 タンパク質は、好ましくは MutS、 MutH、 MutL、または酵母に由来するものとされ、 より好ましくは MutS、 MutH、または MutLとされる。
[0055] ミスマッチ結合タンパク質は、一本鎖核酸にも結合することがあり、このようなミスマツ チ結合タンパク質の一本鎖核酸への結合は、一本鎖結合タンパク質により阻害され ることが知られている。従って、核酸増幅反応においてミスマッチ結合タンパク質を用 いる場合には、一本鎖結合タンパク質を併用することが好ましい。また、ミスマッチ結 合タンパク質は、ミスマッチを含まない二本鎖核酸にも結合することがあり、このような ミスマッチ結合タンパク質の誤った結合は、あら力じめ活性剤を用いてミスマッチ結合 タンパク質を活性ィ匕しておくことにより阻害されることが知られている。従って、核酸増 幅反応においてミスマッチ結合タンパク質を用いる場合には、活性剤によりあらかじ め活性ィ匕されたものを用いることが好まし 、。
[0056] 一本鎖核酸にミスマッチ結合タンパク質が結合するのを阻害するために使用する 一本鎖結合タンパク質 (SSB)は、当技術分野において公知の任意の SSBとすること ができる。好ましい SSBとしては、ェシエリキア'コリ、ショウジヨウバエ、およびアフリカ ッメガエルに由来する一本鎖結合タンパク質、および T4バタテリオファージ由来の遺 伝子 32タンパク質、ならびに他の種に由来するこれらの相当物が挙げられる。この場 合に使用されるミスマッチ結合タンパク質としては、 MutS、 MutH、 MutL、 HexA、 MSH1〜6、 Rep3、 RNaseA、ゥラシルー DNAグリコシダーゼ、 T4エンドヌクレア一 ゼ VII、レゾルバーゼなどが挙げられ、好ましくは MutS、 MSH2もしくは MSH6、ま たはこれらの 2種以上の混合物とされ、より好ましくは MutSとされる。
[0057] ミスマッチ結合タンパク質を活性ィ匕するための活性剤は、当業者であれば適宜選 択することができるため、特に限定されないが、好ましくは、 ATP (アデノシン 5'—三リ ン酸)、 ADP (アデノシン 5'—二リン酸)、 ATP- γ 3(ァデノシン5' 0 (3—チォ 三リン酸))、 AMP— PNP(ァデノシン5' [ J8 , γ イミド]三リン酸)などの化合物とさ れ、あるいは、ミスマッチ結合タンパク質に結合できるヌクレオチドの一つとされる。ミ スマッチ結合タンパク質の活性ィ匕は、ミスマッチ結合タンパク質と活性剤とを、室温で 数秒間から数分間インキュベートすることにより行うことができる。
[0058] 本発明による核酸増幅法では、前記核酸増幅反応によって得られる増幅産物を铸 型として、前記プライマーセットによる核酸増幅反応が行なわれる。この核酸増幅反 応は、上記の核酸増幅反応によって得られる反応液の全部または一部をサンプルと して、上記と同様の条件下で実施することができる。より具体的には、核酸増幅反応 によって得られる反応液に、必要に応じてプライマー、ポリメラーゼ、 dNTPミックス、 緩衝液等の試薬を添加して新たな反応液を調製し、これを用いて核酸増幅反応を行 なうことができる。本発明の好ましい実施態様によれば、このような増幅産物を铸型と する核酸増幅反応は 2回以上繰り返される。
[0059] 核酸増幅法によって得られた増幅産物の存在は、多くのあらゆる方法により検出す ることができる。一つの方法は、一般的なゲル電気泳動による特定のサイズの増幅産 物の検出である。この方法では、例えば、ェチジゥムブロマイドやサイバーグリーン等 の蛍光物質により検出できる。他の方法としては、ピオチンのような標識を有する標 識プローブを用い、これを増幅産物にハイブリダィズさせることにより検出することもで きる。ピオチンは、蛍光標識されたアビジン、ペルォキシダーゼのような酵素に結合し たアビジン等との結合により検出可能である。さらに別の方法としては、免疫クロマト グラフを用いる方法がある。この方法では、肉眼で検出可能な標識を利用したクロマ トグラフ媒体を用いることが考案されて 、る (ィムノクロマトグラフィー法)。上記増幅断 片と標識プローブとをハイブリダィズさせ、該増幅断片のさらに異なる配列とハイプリ ダイズ可能な捕捉用プローブをクロマト媒体に固定しておけば、その固定した部分で トラップすることができ、クロマト媒体での検出が可能となる。その結果、肉眼的にシン プルな検出が可能となる。さらに、本発明者らによる核酸増幅法では、核酸増幅反応 における増幅効率が非常に高いため、増幅の副産物としてピロリン酸が生じることを 利用して、増幅産物を間接的に検出することもできる。このような方法としては、例え ば、ピロリン酸が反応溶液中のマグネシウムと結合することによりピロリン酸マグネシゥ ムの白色沈澱が生じることを利用して、反応溶液の白濁を目視で観察する方法があ る。また、他の方法としては、ピロリン酸がマグネシウムなどの金属イオンと強く結合し て不溶性塩を形成することにより、反応溶液中のマグネシウムイオン濃度が著しく減 少することを利用する方法がある。この方法では、マグネシウムイオン濃度に応じて 色調が変化する金属指示薬（例えば、 Eriochrome Black T、 Hydroxy Naphthol Blue 等）を反応溶液に添加しておくことにより、反応溶液の色の変化を目視で観察するこ とにより、増幅の有無を検出することが可能となる。さらに、 Calceinなどを利用すること により、増幅反応に伴う蛍光の増大を目視で観察することができるため、リアルタイム での増幅産物の検出が可能となる。
[0060] 本発明による核酸増幅法によって得られた増幅産物の存在は、増幅産物の生成に 起因する固相担体の凝集を観察することによって検出することもできる。このような検 出を行なう場合には、核酸増幅反応に用いられるプライマーセットに含まれる少なくと も 1種のプライマーを、固相担体または固相担体と結合可能な部位 (基)を含んでな るものとされる。固相担体または固相担体と結合可能な部位は、プライマーの 3 '末端 部、 5 '末端部、中央領域など、いかなる部分に導入されたものであってもよいが、好 ましくは 5 '末端部に導入されたものとされる。あるいは、核酸増幅反応において用い られる基質を、固相担体または固相担体と結合可能な部位を含んでなるものとしても よい。
[0061] 本発明に用いられる固相担体としては、核酸増幅反応に用いられる反応溶液に不 溶性の担体、または増幅の前後において液相から固相（ゲル相)もしくは固相（ゲル 相）から液相に性状が変化する相転移性担体であれば、いずれも使用することが可 能である。好ましい固相担体としては、水不溶性有機高分子担体、水不溶性無機高 分子担体、合成高分子担体、相転移性担体、金属コロイド、磁性粒子等が挙げられ 、さらには、溶媒不溶性有機高分子担体、溶媒不溶性無機高分子担体、溶媒可溶 性高分子担体、ゲル高分子担体等が挙げられる。さらに、水不溶性有機高分子とし ては、例えば、多孔質シリカ、多孔質ガラス、珪藻土、セライトなどの珪素含有物質、 ニトロセルロース、ヒドロキシアパタイト、ァガロース、デキストラン、セルロース、カルボ キシメチルセルロースなどの多糖類の架橋体、メチル化アルブミン、ゼラチン、コラー ゲン、カゼインなどのタンパク質の架橋体、ゲル状粒子、染料ゾル等が挙げられる。 水不溶性無機高分子としては、例えば、酸ィ匕アルミニウム、酸化チタン、セラミック粒 子等が挙げられる。合成高分子としては、例えば、ポリスチレン、ポリ（メタ）アタリレー ト、ポリビュルアルコール、ポリアクリロニトリルまたはこれらの共重合体、スチレン—ス チレンスルホン酸共重合体、酢酸ビニルーアクリル酸エステル共重合体等が挙げら れる。金属コロイドとしては、金コロイド等が挙げられる。磁性粒子としては、磁性酸化 鉄のビーズ、磁性酸化鉄の微粉砕粒子を表面に有する単分散、超常磁性粒子 (特 表平 4— 501959号公報）、重合性シラン被膜によって覆われた超常磁性酸ィ匕鉄を 有する磁気応答粒子 (特公平 7— 6986号公報）、有機ポリマー中に封入された微粉 末状の磁化可能な粒子等が挙げられる。磁性化された固相担体は、固体と液体との 分離を磁力を利用して簡単に行うことができる。固相担体の形状としては、粒子、膜、 繊維状、フィルタ一等が挙げられる。固相担体の形状としては粒子が特に好ましぐ その表面は多孔質または非多孔質の 、ずれであってもよ!/、。特に好ましい固相担体 としては、合成高分子担体が水などに均一に分散されたラテックス、金コロイドなどの 金属コロイド粒子、マグネットビーズなどの磁性粒子等が挙げられる。
プライマーまたは基質の固相担体への固定ィ匕は当業者に公知の方法によって行な うことができ、物理的な結合または化学的な結合の 、ずれによる方法であってもよ！/、 。プライマーまたは基質の固相担体への固定ィ匕は、例えば、一般的にプライマーや プローブなどのオリゴヌクレオチドを標識ィ匕しうる物質と、これに結合可能な物質を結 合させた固相担体とを組み合わせて行なうことができる。このような目的で用いられる 物質の組み合わせは、当技術分野において周知のものを用いることができ、例えば、 る抗体との組み合わせ、リガンドとこれに結合しうるレセプターとの組み合わせ、相互 にハイブリダィズする 2つの核酸の組み合わせ等が挙げられる。具体的には、例えば 、ピオチンで標識したプライマーまたは基質を、アビジンもしくはストレプトアビジンで 表面をコートした固相担体に結合させることにより、プライマーまたは基質を固相担体 に固定ィ匕することができる。前記抗原としては、例えば、 FITC、 DIG, DNP等のハプ テンが挙げられ、これらと結合しうる抗体としては、抗 FITC抗体、抗 DIG抗体、抗 D NP抗体等の抗体が挙げられる。また、これらの抗体は、モノクローナル抗体またはポ リクローナル抗体のいずれであってもよい。特に、ピオチンとストレプトアビジンとの結 合は特異性が高ぐ結合効率も良好であるため、これらの組み合わせは特に好まし い。ピオチン、ハプテン、リガンド等の標識物質は、いずれも単独で、あるいは必要で あれば複数の組み合わせで、公知の手段 (特開昭 59— 93099号公報、特開昭 59 — 148798号公報、および特開昭 59— 204200号公報を参照のこと）により、プライ マーの 5'末端部に導入することができる。
本発明に用いられる固相担体と結合可能な部位 (または基）は、プライマーまたは 基質の固相担体への固定ィ匕のために用いられる上述の方法に従って選択すること ができ、従って、固相担体との物理的な結合を可能とするものまたは化学的な結合を 可能とするもののいずれであってもよいが、好ましくは特異的結合を可能とするものと される。このような固相担体と結合可能な部位としては、上述のような、ピオチン、アビ ジン、ストレプトアビジン、抗原、抗体、リガンド、レセプター、核酸、タンパク質などが 挙げられ、好ましくはピオチンまたはストレプトアビジンとされ、より好ましくはピオチン とされる。このような部位を含むプライマーまたは基質を用いることにより、核酸増幅 反応を行なった後に、増幅産物に上記固相担体を結合させることが可能となる。この 場合において用いられる固相担体は、必要に応じて、プライマーまたは基質に含ま れる前記部位の結合相手を含むものとすることができる。このような結合相手は、ブラ イマ一または基質に含まれる前記部位との結合が可能な形で存在するものであり、 好ましくは固相担体の表面上に存在するものとされ、より好ましくは固相担体の表面 上に塗布されたものとされる。 [0064] 本発明による核酸増幅法は高い特異性と検出感度を有するため、サンプルを被験 者に由来する検体とし、増幅の対象を疾患に関連する変異を有する変異型遺伝子ま たは病原体に含まれる遺伝子とすることによって、前記検体中に含まれる微量の疾 患関連細胞または病原体を検出することが可能となる。
[0065] 従って、本発明によれば、被験者に由来する検体から疾患に関連する細胞を検出 する方法が提供され、該方法は、（a)前記疾患に関連する変異を有する変異型遺伝 子上の 2以上の領域に相同または相補的な配列を含む少なくとも 1種のプライマーお よび同遺伝子上の 1以上の領域に相同または相補的な配列を含む少なくとも 1種の プライマーを含んでなるプライマーセットであって、変異型遺伝子中の変異にかかる ヌクレオチド残基が前記領域のうちの 1以上の領域に含まれる、プライマーセットを用 意する工程、（b)前記検体に含まれる核酸分子を铸型として、前記プライマーセット による核酸増幅反応を行なう工程、（c)前記核酸増幅反応によって得られる増幅産 物を铸型として、前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行なう工程、ならびに (d )増幅産物を検出する工程を含んでなる。この方法では、工程 (d)において増幅産物 が検出された場合に、前記疾患に関連する細胞が検出されたことが示される。
[0066] 疾患に関連する細胞は、その疾患に関連する遺伝子変異、好ましくはその疾患に 特異的な遺伝子変異を有するものであり、目的とする疾患に応じて当業者により適宜 選択される。様々な疾患についてこれに関連する遺伝子変異が知られており、当業 者であればこれらの疾患と遺伝子変異との組み合わせを適宜利用することが可能で ある。このような遺伝子変異としては、例えば、鎌状赤血球症に特異的な j8グロビン 遺伝子における変異、癌に特異的な p53遺伝子における変異などが挙げられる。
[0067] 遺伝病として知られる鎌状赤血球症に特異的な j8グロビン遺伝子の変異としては、 第 7コドンにおける GAG力 GTGへの変異が挙げられ、この一塩基変異により、発現 される 13—グロビンの 6番目のアミノ酸がグルタミン酸力らバリンへ置換される。よって 、この変異を有する変異型 )8グロビン遺伝子を特異的に増幅することにより、鎌状赤 血球症に関連する細胞を検出することができる。
[0068] 癌細胞に特異的な遺伝子変異は数多く知られているが、中でも最も多いのが p53 遺伝子の変異である。この遺伝子力も発現する p53タンパク質は転写因子の一つで あり、細胞周期、アポトーシス、および DNA修復の制御を行ない、個体レベルでの変 異の蓄積 (癌化など)を防ぐ役割を果たしている。ヒトの癌では、その 50%以上の症 例において p53遺伝子の変異が見られ、その中の 80%がアミノ酸置換を伴う点突然 変異である。この変異率は他に知られている癌遺伝子と比較してかなり高くなつてい る。 p53タンパク質は DNA結合タンパク質であり、癌で見られる変異の多くは DNA 結合ドメインに集中している。さらに、 p53遺伝子の中でも際だって変異の集中する ホットスポット »報告 れて ヽる (Lopez M et al., Use of cytological specimens for p53 gene alteration detection in oral squamous cell carcinoma risk patients. Clin. Oncol . (R Coll Radiol). 2004 Aug; 16(5): 366— 70 ; Soussi T et al., Reassessment of the TP5 3 mutation database in human disease by data mining with a library of TP53 missens e mutations, Hum. Mutat. 25(1): 6-17, 2004； Sudhir bnvastava, et al., Biomarkers fo r Early Detection of Colon Cancer, Clinical Cancer Research vol. 7, 1118, 2001； Tni erry Soussi, et al., Significance of TP53 Mutation in Human Cancer: A Critical Anal ysis of Mutations at CpG Dinucleotides, Human. Mutation Vol.21, 192, 2003)。また 、臓器によって変異の頻度や変異のおこりやすい位置は異なる。ヒトの癌の中で、 p5 3遺伝子の変異の頻度が高いものは、肺癌、大腸癌、脾臓癌などであり、これらの癌 の 70%近くに変異が見られる。例えば、大腸癌に多く見られる p53遺伝子中の変異 は、第 175コドン、第 248コドン、および第 273コドンに見られる CGでの変異であり、 次いで第 196コドン、第 213コドン、第 245コドン、第 282コドンなどに変異が集中す る傾向がある。点突然変異の種類にも明確な傾向があり、圧倒的に GCから ATへの トランスバージョンが多い。本発明による疾患関連細胞の検出法においては、このよう な変異のいずれか 1つまたは 2以上の組み合わせを有する変異型遺伝子を特異的 に増幅することにより、癌細胞を検出することができる。
さらに、本発明によれば、被験者に由来する検体から病原体を特異的に検出する 方法が提供され、該方法は、（a)検出しょうとする目的の病原体に含まれる遺伝子上 の 2以上の特異的領域に相同または相補的な配列を含む少なくとも 1種のプライマー 、および同遺伝子上の 1以上の特異的領域に相同または相補的な配列を含む少なく とも 1種のプライマーを含んでなるプライマーセットを用意する工程、 (b)前記検体に 含まれる核酸分子を铸型として、前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行なう 工程、（C)前記核酸増幅反応によって得られる増幅産物を铸型として、前記プライマ 一セットによる核酸増幅反応を行なう工程、ならびに (d)増幅産物を検出する工程を 含んでなる。この方法では、工程 (d)において増幅産物が検出された場合に、目的 の病原体株が検出されたことが示される。
[0070] 病原体としては、病原性を有する細菌、真菌、ウィルスなどを挙げることができる。
目的の病原体に含まれる遺伝子上の特異的領域は、該遺伝子の配列と検体中に含 まれる核酸の配列とを比較することにより容易に選択することができる。また、病原体 には、野生型遺伝子を有する野生株だけでなぐ変異型遺伝子を有する変異株が存 在することがある。このような変異株としては、野生株との間における遺伝子配列の相 違点とともに様々なものが知られている。本発明による方法によれば、このような野生 株および変異株の全部または一部を同時に検出することができ、あるいはそれらの 1 種のみを特異的に検出することもできる。例えば、病原体の複数の株を同時に検出 する場合には、これらの株に共通し、かつ他の株または検体中に含まれる核酸には 見られない配列を有する領域を上記特異的領域として用いることができる。また、病 原体の単一の株のみを特異的に検出する場合には、他の株または検体中に含まれ る核酸には見られず、かつ目的の病原体株のみに見られる配列を有する領域を上記 特異的領域として用いることができる。
[0071] 特に、病原体の野生株および変異株のうちの 1種のみを特異的に検出するために は、変異に力かるヌクレオチド残基が前記特異的領域のうちの 1以上の領域に含まれ るようにプライマーセットを設計することができる。例えば、本発明者らによって開発さ れた核酸増幅法を用いる場合には、変異に力かるヌクレオチド残基が前記配列 (A) 、前記配列（B)または前記配列（C)に含まれるようにプライマーセットを設計すること ができる。また、上記第三のプライマーが前記核酸試料中の核酸配列またはその相 補配列にハイブリダィズしたときに、前記変異の存在または不存在によって前記核酸 配列またはその相補配列との間で 1以上のミスマッチを生じるように、第三のプライマ 一を設計することもできる。これにより、増幅産物の有無を確認することによって目的 の病原体株の有無を判定することが可能となり、また、増幅産物を定量することにより 該病原体株の量を決定することが可能となる。
[0072] 本発明による疾患関連細胞または病原体の検出法の各工程は、本発明による核酸 増幅法にっ 、て上述したように実施することができる。
[0073] 本発明による疾患関連細胞または病原体の検出法にお!、て前記疾患関連細胞ま たは病原体が検出された場合には、被験者がその疾患またはその病原体株による感 染症に罹患しているものと判断することができる。従って、本発明によれば、被験者に おける疾患を診断する方法が提供され、該方法は、本発明による疾患関連細胞また は病原体の検出法の全工程を含んでなる。
実施例
[0074] 以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例 に限定されるものではない。
[0075] mi：野牛型および 虽型の eグロビン遣伝早が混 #するサンプル力 の前記 栾異型遺伝子の枪出
本実施例では、野生型ヒト βグロビン遺伝子と一塩基置換を含む変異型ヒト βグロ ビン遺伝子とを含むサンプルから、前記変異型遺伝子を特異的に増幅し、これを検 出した。
[0076] 一塩基変異のモデルを作製するため、ヒト j8グロビン遺伝子中の特定の領域にお V、て一塩基変異を含むような長鎖合成オリゴヌクレオチドと、一塩基変異を含まな!ヽ 長鎖合成オリゴヌクレオチドとを合成した。さらに、これら長鎖合成オリゴヌクレオチド を PCR法でそれぞれ増幅し、一塩基変異を含まな 、野生型 DNAと一塩基変異を含 む変異型 DNAの増幅産物を得た。配列決定して変異部分のヌクレオチド残基を確 認した後、これら増幅産物をテンプレートとして以下の実験に使用した。
[0077] 野生型の増幅産物のヌクレオチド配列（配列番号 1)を図 4に示す。図 4において、 囲み枠を付した残基が変異に力かる残基であり、この残基は変異型の増幅産物では 「t」である。
[0078] プライマーとしては、下記の配列を有する野生型 DNA検出用プライマーペアおよ び変異型 DNA検出用プライマーペアを用いた。これらのプライマーの設計に用いら れたテンプレート上の領域は、図 4に下線部分として示されて 、る。 [0079] 野生型 DNA検出プライマー：
Fl-W: 5'-gatgctccatacaactgtgttcactagcaa-3' (酉己列番号 2)；
R1： 5 - ggatatatatatatcccttcaccacgttcaccttg- (酉歹 (1¾·^"4)。
[0080] 変異型 DNA検出プライマー：
Fl-M : 5 -gatgcaccatacaactgtgttcactagcaa-^' (¾列 ¾■号 3)；
R1： 5 - ggatatatatatatcccttcaccacgttcaccttg- (酉歹 (1¾·^"4)。
[0081] フォワードプライマー F1-Wは、その 3'末端側にある配列（20mer:下線部）が铸型 にアニーリングし、 5'末端側にある配列（lOmer:下線部以外）が、そのプライマーに よる伸長鎖上の、該プライマーの 3'末端残基の 16塩基下流力 始まる領域にハイブ リダィズするように設計されている。フォワードプライマー F1- Mは、 5，末端から 6番目 に変異に力かる T残基を有することを除 、て、プライマー F1-Wと同一のヌクレオチド 配列を有するものである。リバースプライマー R1は、その 3，末端側にある配列（19me r：下線部）が铸型にアニーリングし、 5'末端側にある配列（16mer：下線部以外）が その領域内で折り畳まれる構造をとるように設計されて 、る。
[0082] 上記の野生型 DNA、変異型 DNA、またはその混合物を铸型とし、それぞれの铸 型について、野生型 DNA検出用プライマーペアまたは変異型 DNA検出用プライマ 一ペアを用いた核酸増幅反応を行なった。具体的には、次の組成を有する反応液（ 25 μ L)： Tris-HCl (20mM, pH8. 8)、 KCl (lOmM)、（NH ) SO (10mM)、
4 2 4
MgSO (8mM)、DMSO (3%)、Triton X—100 (l%)、dNTP (l. 4mM) , Mut
4
S (1 g)、それぞれ 2000nMの上記のプライマー対、上記の铸型（10_19molZtub e (約 60000分子））、サイバーグリーン（0. 01 1 !111)、ぉょび161；の：65 DNAポ リメラーゼ（NEW ENGLAND BioLabs)を含有；を調製し、これを 60°Cで 20分間ィ ンキュペートした。その後、反応液から 1 μ 1をとり、これを铸型溶液として用いて上記 と同様の組成を有する反応液 25 μ 1に調製し (希釈工程）、再度 60°Cで 20分間イン キュペートした。その後、さらにもう一度同様の希釈工程およびインキュベート工程を 行った。铸型は二本鎖のまま反応させた。これらの反応は、リアルタイム PCR装置 (ス トラタジーン社製)を用いて行った。
[0083] 3回目の核酸増幅反応における増幅量の経時変化を図 5に示す。表 1は、核酸増 幅を行った結果をまとめたものである。この表において、増幅反応の結果は、増幅産 物の増加速度が速いもの（グラフにおいて曲線の立ち上がりが速いもの）から順に、 + + + , + + , + ,および士とし、全く増幅が見られなかったものを一とした。なお、 図 5に記載されて ヽるサンプル番号は、表 1に記載のサンプル番号に対応して！/ヽる。
[表 1] 表 1 ： 3回目の核酸増幅反応による增幅産物の量
Figure imgf000030_0001
図 5および表 1によれば、野生型 DNA検出用プライマーペアは野生型 DNAのみ を特異的に検出し、変異型 DNA検出用プライマーペアは変異型 DNAのみを特異 的に検出することが確認された。また、変異型 DNAが野生型 DNAの 5000分の 1し か存在しないサンプルについても、変異型 DNAを検出できることが示された。

Claims

請求の範囲
[1] 野生型遺伝子と変異型遺伝子の両方を含むサンプルから!/、ずれか一方の遺伝子 を特異的に増幅する方法であって、
(a)増幅しょうとする前記遺伝子上の 2以上の領域に相同または相補的な配列を含 む少なくとも 1種のプライマーおよび同遺伝子上の 1以上の領域に相同または相補的 な配列を含む少なくとも 1種のプライマーを含んでなるプライマーセットであって、変 異に力かるヌクレオチド残基が前記領域のうちの 1以上の領域に含まれる、プライマ 一セットを用意する工程、
(b)前記サンプルに含まれる核酸分子を铸型として、前記プライマーセットによる核酸 増幅反応を行なう工程、ならびに
(c)前記核酸増幅反応によって得られる増幅産物を铸型として、前記プライマーセッ トによる核酸増幅反応を行なう工程
を含んでなる、方法。
[2] 工程 (c)が 2回以上繰り返される、請求項 1に記載の方法。
[3] 前記プライマーセットが等温下での反応によって標的核酸の増幅を可能とするもの であり、前記核酸増幅反応が等温下で行なわれる、請求項 1に記載の方法。
[4] 前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の 3'末端部分 の配列 (A)に相補的な配列 (Ac')を 3'末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配 列にお!/、て前記配列 (A)よりも 5 '側に存在する配列（B)に相同な配列（Β')を前記配 列 (Ac )の 5'側に含んでなるものである、請求項 1に記載の方法。
[5] 前記プライマーセットが、標的核酸配列を増幅しうる少なくとも 2種のプライマーを含 んでなるプライマーセットであって、
前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の 3'末端部分 の配列 (A)に相補的な配列 (Ac')を 3'末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配 列にお!/、て前記配列 (A)よりも 5 '側に存在する配列（B)に相同な配列（Β')を前記配 列（Ac )の 5，側に含んでなるものであり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーカ、前記標的核酸配列の相補配 列の 3'末端部分の配列 (C)に相補的な配列 (Cc')を 3'末端部分に含んでなり、 つ相互にハイブリダィズする 2つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（D-Dc') を前記配列（Cc )の 5'側に含んでなるものである、請求項 1に記載の方法。
[6] 前記プライマーセットが、配列 (A)、配列 (B)または配列 (C)に前記変異に力かるヌ クレオチド残基を含むように設計されたものである、請求項 5に記載の方法。
[7] 前記プライマーセットが、配列（B)に前記変異に力かるヌクレオチド残基を含むよう に設計されたものである、請求項 5に記載の方法。
[8] 前記プライマーセットが、前記標的核酸配列またはその相補配列にハイブリダィズ する第三のプライマーであって、標的核酸配列またはその相補配列へのハイブリダィ ゼーシヨンについて他のプライマーと競合しない第三のプライマーをさらに含んでな るものである、請求項 5に記載の方法。
[9] 第三のプライマーが、前記核酸試料中の核酸配列またはその相補配列にハイプリ ダイズしたときに、前記変異の存在または不存在によって前記核酸配列またはその 相補配列との間で 1以上のミスマッチを生じるように設計されたものである、請求項 8 に記載の方法。
[10] 核酸増幅反応において鎖置換能を有するポリメラーゼが使用される、請求項 1に記 載の方法。
[11] 核酸増幅反応が、ミスマッチ結合タンパク質の存在下で行われる、請求項 1に記載 の方法。
[12] ミスマッチ結合タンパク質が、 MutS、 MSH2もしくは MSH6、またはこれらの 2種 以上の混合物である、請求項 11に記載の方法。
[13] 被験者に由来する検体力 疾患に関連する細胞を検出する方法であって、
(a)前記疾患に関連する変異を有する変異型遺伝子上の 2以上の領域に相同また は相補的な配列を含む少なくとも 1種のプライマーおよび同遺伝子上の 1以上の領 域に相同または相補的な配列を含む少なくとも 1種のプライマーを含んでなるプライ マーセットであって、変異型遺伝子中の変異に力かるヌクレオチド残基が前記領域の うちの 1以上の領域に含まれる、プライマーセットを用意する工程、
(b)前記検体に含まれる核酸分子を铸型として、前記プライマーセットによる核酸増 幅反応を行なう工程、 (c)前記核酸増幅反応によって得られる増幅産物を铸型として、前記プライマーセッ トによる核酸増幅反応を行なう工程、ならびに
(d)増幅産物を検出する工程
を含んでなり、工程 (d)において増幅産物が検出された場合に、前記疾患に関連す る細胞が検出されたことが示される、方法。
[14] 工程 (c)が 2回以上繰り返される、請求項 13に記載の方法。
[15] 前記プライマーセットが等温下での反応によって標的核酸の増幅を可能とするもの であり、前記核酸増幅反応が等温下で行なわれる、請求項 13に記載の方法。
[16] 前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の 3'末端部分 の配列 (A)にノ、イブリダィズする配列 (Ac')を 3'末端部分に含んでなり、かつ前記標 的核酸配列にぉ 、て前記配列 (A)よりも 5'側に存在する配列（B)の相補配列（Be) にハイブリダィズする配列（Β')を前記配列 (Ac )の 5'側に含んでなるものである、請 求項 13に記載の方法。
[17] 前記プライマーセットが、標的核酸配列を増幅しうる少なくとも 2種のプライマーを含 んでなるプライマーセットであって、
前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の 3'末端部分 の配列 (A)にノ、イブリダィズする配列 (Ac')を 3'末端部分に含んでなり、かつ前記標 的核酸配列にぉ 、て前記配列 (A)よりも 5'側に存在する配列（B)の相補配列（Be) にハイブリダィズする配列（Β')を前記配列 (Ac )の 5'側に含んでなるものであり、 前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーカ、前記標的核酸配列の相補配 列の 3 '末端部分の配列 (C)にハイブリダィズする配列 (Cc')を 3，末端部分に含んで なり、かつ相互にノ、イブリダィズする 2つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（ D-Dc )を前記配列（Cc )の 5'側に含んでなるものである、請求項 13に記載の方法。
[18] 前記プライマーセットが、配列 (A)、配列（B)または配列（C)に前記変異に力かるヌ クレオチド残基を含むように設計されたものである、請求項 17に記載の方法。
[19] 前記プライマーセットが、配列（B)に前記変異に力かるヌクレオチド残基を含むよう に設計されたものである、請求項 17に記載の方法。
[20] 前記プライマーセットが、前記標的核酸配列またはその相補配列にハイブリダィズ する第三のプライマーであって、標的核酸配列またはその相補配列へのハイブリダィ ゼーシヨンについて他のプライマーと競合しない第三のプライマーをさらに含んでな るものである、請求項 17に記載の方法。
[21] 第三のプライマーが、前記核酸試料中の核酸配列またはその相補配列にハイプリ ダイズしたときに、前記変異の存在または不存在によって前記核酸配列またはその 相補配列との間で 1以上のミスマッチを生じるように設計されたものである、請求項 20 に記載の方法。
[22] 核酸増幅反応において鎖置換能を有するポリメラーゼが使用される、請求項 13に 記載の方法。
[23] 核酸増幅反応が、ミスマッチ結合タンパク質の存在下で行われる、請求項 13に記 載の方法。
[24] ミスマッチ結合タンパク質が、 MutS、 MSH2もしくは MSH6、またはこれらの 2種 以上の混合物である、請求項 23に記載の方法。
[25] 被験者に由来する検体から病原体を特異的に検出する方法であって、
(a)検出しょうとする目的の病原体に含まれる遺伝子上の 2以上の特異的領域に相 同または相補的な配列を含む少なくとも 1種のプライマー、および同遺伝子上の 1以 上の特異的領域に相同または相補的な配列を含む少なくとも 1種のプライマーを含 んでなるプライマーセットを用意する工程、
(b)前記検体に含まれる核酸分子を铸型として、前記プライマーセットによる核酸増 幅反応を行なう工程、
(c)前記核酸増幅反応によって得られる増幅産物を铸型として、前記プライマーセッ トによる核酸増幅反応を行なう工程、ならびに
(d)増幅産物を検出する工程
を含んでなり、工程 (d)において増幅産物が検出された場合に、目的の病原体が検 出されたことが示される、方法。
[26] 工程 (c)が 2回以上繰り返される、請求項 25に記載の方法。
[27] 前記プライマーセットが等温下での反応によって標的核酸の増幅を可能とするもの であり、前記核酸増幅反応が等温下で行なわれる、請求項 25に記載の方法。
[28] 前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の 3'末端部分 の配列 (A)にノ、イブリダィズする配列 (Ac')を 3'末端部分に含んでなり、かつ前記標 的核酸配列にぉ 、て前記配列 (A)よりも 5'側に存在する配列（B)の相補配列（Be) にハイブリダィズする配列（Β')を前記配列 (Ac )の 5'側に含んでなるものである、請 求項 25に記載の方法。
[29] 前記プライマーセットが、標的核酸配列を増幅しうる少なくとも 2種のプライマーを含 んでなるプライマーセットであって、
前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の 3'末端部分 の配列 (A)にノ、イブリダィズする配列 (Ac')を 3'末端部分に含んでなり、かつ前記標 的核酸配列にぉ 、て前記配列 (A)よりも 5'側に存在する配列（B)の相補配列（Be) にハイブリダィズする配列（Β')を前記配列 (Ac )の 5'側に含んでなるものであり、 前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーカ、前記標的核酸配列の相補配 列の 3 '末端部分の配列 (C)にハイブリダィズする配列 (Cc')を 3，末端部分に含んで なり、かつ相互にノ、イブリダィズする 2つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（ D-Dc )を前記配列（Cc )の 5'側に含んでなるものである、請求項 25に記載の方法。
[30] 前記プライマーセットが、前記標的核酸配列またはその相補配列にハイブリダィズ する第三のプライマーであって、標的核酸配列またはその相補配列へのハイブリダィ ゼーシヨンについて他のプライマーと競合しない第三のプライマーをさらに含んでな るものである、請求項 29に記載の方法。
[31] 核酸増幅反応において鎖置換能を有するポリメラーゼが使用される、請求項 25に 記載の方法。
[32] 核酸増幅反応が、ミスマッチ結合タンパク質の存在下で行われる、請求項 25に記 載の方法。
[33] ミスマッチ結合タンパク質が、 MutS、 MSH2もしくは MSH6、またはこれらの 2種 以上の混合物である、請求項 32に記載の方法。
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