JP2024506277A - 脱塩基核酸を有する配列変換及びシグナル増幅dna、並びにそれを使用する検出方法 - Google Patents
脱塩基核酸を有する配列変換及びシグナル増幅dna、並びにそれを使用する検出方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2024506277A JP2024506277A JP2023546262A JP2023546262A JP2024506277A JP 2024506277 A JP2024506277 A JP 2024506277A JP 2023546262 A JP2023546262 A JP 2023546262A JP 2023546262 A JP2023546262 A JP 2023546262A JP 2024506277 A JP2024506277 A JP 2024506277A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sequence
- dna
- complementary
- nucleic acid
- signal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 196
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 183
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 183
- 208000035657 Abasia Diseases 0.000 title claims abstract description 138
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 title claims description 163
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims description 79
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims description 79
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title description 18
- 238000001216 nucleic acid method Methods 0.000 title 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 229
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 claims abstract description 168
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 claims abstract description 168
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 121
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 110
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 45
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 38
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 37
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Chemical class Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 19
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 13
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 13
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 10
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 claims description 7
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 claims description 7
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims description 6
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 claims description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 4
- 108010068698 spleen exonuclease Proteins 0.000 claims description 4
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 claims description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 496
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 55
- 102100033072 DNA replication ATP-dependent helicase DNA2 Human genes 0.000 description 54
- 101000927313 Homo sapiens DNA replication ATP-dependent helicase DNA2 Proteins 0.000 description 54
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 30
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 25
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 25
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 22
- 101710147059 Nicking endonuclease Proteins 0.000 description 20
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 18
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 17
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 17
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 16
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 16
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 16
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 16
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 16
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 15
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 14
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 12
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 10
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 9
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 8
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 7
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 7
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 7
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 6
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 5
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- -1 rRNA Proteins 0.000 description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 3
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 3
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 3
- 101100483399 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) CDC34 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N glycine betaine Chemical compound C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 3
- FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M sodium iodide Chemical compound [Na+].[I-] FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000606153 Chlamydia trachomatis Species 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 2
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 238000003380 quartz crystal microbalance Methods 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- JEOQACOXAOEPLX-WCCKRBBISA-N (2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoic acid;1,3-thiazolidine-4-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CSCN1.OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N JEOQACOXAOEPLX-WCCKRBBISA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000796533 Arna Species 0.000 description 1
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 206010018612 Gonorrhoea Diseases 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 1
- 241000713196 Influenza B virus Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 1
- 208000031662 Noncommunicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 108091007412 Piwi-interacting RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000726445 Viroids Species 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N alpha-acetylene Natural products C#C HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000012482 calibration solution Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 229940038705 chlamydia trachomatis Drugs 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 125000002534 ethynyl group Chemical group [H]C#C* 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 description 1
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 208000001786 gonorrhea Diseases 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 1
- 208000037798 influenza B Diseases 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011147 magnesium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000009518 sodium iodide Nutrition 0.000 description 1
- BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M sodium perchlorate Chemical compound [Na+].[O-]Cl(=O)(=O)=O BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910001488 sodium perchlorate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 1
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 1
- 238000006177 thiolation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/682—Signal amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
Abstract
試料中で標的核酸を検出するための方法が開示される。この方法は、試料を、ポリメラーゼ及びエンドヌクレアーゼの存在下で、5’から3’方向に、シグナルDNA生成配列と、エンドヌクレアーゼ認識部位と、少なくとも1つの脱塩基部分を含む相補的配列とを含む、第1のオリゴヌクレオチドと接触させることを含み、この相補的配列が、シグナルDNA生成配列の少なくとも一部に相補的である第1の相補的配列及び標的核酸の3’末端に相補的である第2の相補的配列を含む。第2のシグナルDNA生成配列と、エンドヌクレアーゼ認識部位と、第1のオリゴヌクレオチドの第1のシグナルDNA生成配列に相同でありかつ任意選択的に少なくとも1つの脱塩基部位を有する配列とを含む、第2のオリゴヌクレオチドを含む方法も、開示される。
Description
本出願は、2021年2月1日に提出された米国特許仮出願第63/144,146号に関連しておりその優先権の利益を主張するものであり、前記特許文献は参照によりその全体をここに組み込む。
配列表
本出願は、参照により組み込まれ「12835WOO1_SeqList.txt」と題するテキストファイルとしてコンピュータ可読フォーマットで本出願の提出書類と一緒に提出される配列表を含有する。配列表ファイルは、2022年1月31日に作成され、サイズは7,208バイトである。テキストファイルは、配列表提出の目的で必要とされることがある配列表の任意のハードコピーとしての役割もする。
本出願は、参照により組み込まれ「12835WOO1_SeqList.txt」と題するテキストファイルとしてコンピュータ可読フォーマットで本出願の提出書類と一緒に提出される配列表を含有する。配列表ファイルは、2022年1月31日に作成され、サイズは7,208バイトである。テキストファイルは、配列表提出の目的で必要とされることがある配列表の任意のハードコピーとしての役割もする。
資金提供
該当なし
該当なし
試験試料中の標的核酸の検出は、医学及び生物学を含む種々の分野で重要である。多くの組成物、アッセイプラットホーム及び手順が特定の核酸分子の検出に利用可能である。検出が再現でき正確であるためには、これらの手順は非特異的バックグラウンド増幅がないか又は低いレベルであることを必要とする。しかし、増幅法は、結果の品質、精度、再現性及び全体的信頼性に影響を及ぼす偽陽性シグナルを生じることがある。一部のアッセイでは、これらの「偽」陽性シグナルは、非鋳型DNA(非標的DNA)を含有する対照試料又はさらにはいかなるDNA鋳型も欠く試料を含めて、試料中で検出されることがある。
混合核酸配列の集団から特定の配列を増幅させるために使用される1つの一般的な方法はポリメラーゼ連鎖反応である(PCR)。典型的なPCRは3種の異なる温度で実行されるので、反応は、正確な温度を維持する難しさ及びタイムロスが増幅サイクルの数に比例して増加するという難しさなどの課題と関連することがある。二本鎖鋳型DNAが変性して一本鎖になる(ある程度特定の配列に依存する)には、高い「融解」温度の使用が必要になる場合が多いが、これにより使用できるDNAポリメラーゼの種類は高度に熱安定である種類に限定される。
したがって、PCRで使用される反応条件よりも穏やかな反応条件下で核酸を検出する等温増幅プラットホーム技術が開発された。にも関わらず、これらの等温増幅技術は、標的配列検出を妨害することがある非特異的増幅事象及び高バックグラウンドシグナルにより提起される課題に対処していない。
以下の開示は、PCRで使用される反応条件ほど厳密ではない反応条件下で核酸配列(例えば、DNA又はRNA)を検出するための代わりの方法及び組成物を提供する。本方法及び組成物は、試料中低濃度で存在することがある核酸分子及び/又は長さが短い核酸分子の検出を可能にする配列選択性及び感受性を維持する。本方法及び組成物は、非特異的及び/又は標的非依存性増幅事象から生じる場合がある任意のバックグラウンドシグナルも減らす。態様の中でも、本開示は、低温、等温条件下で試料中の標的核酸の検出限界を改善でき、試料調製及び自動化された検出法を簡略化する又は改善することができる新規の方法、試薬及び核酸分子を提供する。
(発明の要旨)
一態様では、本開示は、試料中で標的核酸を検出するための方法であって、前記試料を、5’から3’方向に、シグナルDNA生成配列(A)と、エンドヌクレアーゼ認識部位(B)と、シグナルDNA生成配列の少なくとも一部に相補的である第1の相補的配列(C)及びその中に組み込まれる少なくとも1つの脱塩基部位(又は「脱塩基基」、「脱塩基部分」又は「脱塩基残基」)を有し標的核酸の3’末端に相補的である第2の相補的配列(D)を含む相補的配列とを含む、カバーされた(すなわち、ヘアピン)オリゴヌクレオチド(配列変換DNA又はSC DNA);ポリメラーゼ;並びにニッキング反応のためのエンドヌクレアーゼと接触させることを含む方法に関する。本態様の実施形態では、本方法は、シグナルDNAの存在又は非存在を判定することも含み、シグナルDNAの存在は試料中の標的核酸の存在を示す。
一態様では、本開示は、試料中で標的核酸を検出するための方法であって、前記試料を、5’から3’方向に、シグナルDNA生成配列(A)と、エンドヌクレアーゼ認識部位(B)と、シグナルDNA生成配列の少なくとも一部に相補的である第1の相補的配列(C)及びその中に組み込まれる少なくとも1つの脱塩基部位(又は「脱塩基基」、「脱塩基部分」又は「脱塩基残基」)を有し標的核酸の3’末端に相補的である第2の相補的配列(D)を含む相補的配列とを含む、カバーされた(すなわち、ヘアピン)オリゴヌクレオチド(配列変換DNA又はSC DNA);ポリメラーゼ;並びにニッキング反応のためのエンドヌクレアーゼと接触させることを含む方法に関する。本態様の実施形態では、本方法は、シグナルDNAの存在又は非存在を判定することも含み、シグナルDNAの存在は試料中の標的核酸の存在を示す。
一態様では、本開示は、試料中で標的核酸を検出するための方法であって、標的核酸と1つ以上の脱塩基部位を有する第1のオリゴヌクレオチド(配列変換DNA又はSC DNA)との相互作用がポリメラーゼによる複製をプライミングして、第1のシグナルDNA(S1)を生成し、この第1のシグナルDNA(S1)が今度は1つ以上の脱塩基部分(又は部位)を有する場合がある第2のオリゴヌクレオチド(シグナル増幅DNA又はカスケードシグナル増幅DNA1若しくはcSA DNA1)と相互作用をしてポリメラーゼによる複製をプライミングして、第1のシグナルDNA(S1)と異なる第2のシグナルDNA(S2)を生成し、この第2のシグナルDNAが今度は1つ以上の脱塩基部位を有する場合がある第3のオリゴヌクレオチド(カスケードシグナル増幅DNA2又はcSA DNA2)と相互作用をすることができ、ポリメラーゼによる複製をプライミングして、第3の特有のシグナルDNA(S3)を生成する、方法に関する。第3の特有のシグナルDNA S3は、1つ以上の脱塩基部位を有する場合がある第4のオリゴヌクレオチド(カスケードシグナル増幅DNA3又はcSA DNA3)と相互作用をすることができ、ポリメラーゼによる複製をプライミングして、第4の特有のシグナルDNA(S4)を生成し、この第4のシグナルDNAが今度は、1つ以上の脱塩基部位を有する場合がある第5のオリゴヌクレオチド(カスケードシグナル増幅DNA4又はcSA DNA4)と相互作用をすることができ、ポリメラーゼによる複製をプライミングして、第5の特有のシグナルDNA S5を生成し、この第5のシグナルDNAが今度は、1つ以上の脱塩基部位を有する場合がある第6のオリゴヌクレオチド(カスケードシグナル増幅DNA5又はcSA DNA5)と相互作用をすることができ、ポリメラーゼによる複製をプライミングして、第6の特有のシグナルDNA S6を生成して、など、所望の増幅に到達するまで続く。これらの態様の種々の実施形態では、脱塩基部位は、配列の3’側の半分のほうのヌクレオチド配列に(例えば、標的又はシグナルDNAとハイブリダイズするSC又はcSA DNAの3’末端の近く、又はその内部にあるオリゴヌクレオチド配列の一部内に)位置することが可能である。さらなる実施形態では、脱塩基部位(複数可)は、前記第1のオリゴヌクレオチド(例えば、上で言及される配列(D))の標的核酸の3’末端に相補的である配列の5’末端で第1のヌクレオチドから位置3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15又はその組合せに位置することができる。一部の実施形態は、脱塩基部位(複数可)を、エンドヌクレアーゼ認識部位の3’末端から3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15ヌクレオチドである位置にある、又はこれらの位置の組合せの位置にあるものとして記載しうる。
例えば、本明細書に記載される種々の態様の一部の実施形態では、本開示は、試料中で標的核酸を検出するための方法(並びに組成物、キット及び化学修飾されたオリゴヌクレオチド)であって、前記試料を、5’から3’方向に、第1のシグナルDNA生成配列(A)と、エンドヌクレアーゼ認識部位(B)と、シグナルDNA生成配列(A)の少なくとも一部に相補的である第1の相補的配列(C)及び標的核酸の3’末端に相補的である第2の相補的配列(D)を含む相補的配列とを含む第1のオリゴヌクレオチド(本明細書では配列変換DNA又はSC DNAとして同定されることがある)と接触させることを含み、配列(D)は、その中に組み込まれた少なくとも1つの脱塩基部位(又は「脱塩基基」、「脱塩基部分」又は「脱塩基残基」)を有し、第1のシグナルDNA生成配列(A)の少なくとも一部とシグナルDNA生成配列(A)に相補的な第1の相補的配列は、ハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、方法を提供する。一部のさらなる実施形態では、方法、組成物及びキットは、5’から3’方向に、第2の特有のシグナルDNA生成配列(E)と、エンドヌクレアーゼ認識部位(F)(SC DNA中のエンドヌクレアーゼ認識部位(B)と同じであるか又は異なっていてもよい)と、シグナルDNA生成配列(E)の少なくとも一部に相補的である配列(G)と、第1のSC DNAオリゴヌクレオチドの第1のシグナルDNA生成配列に相同である配列(H)とを含み、配列(H)が任意選択的にその中に組み込まれた1つ又は複数の脱塩基部位(複数可)を有し、第2のシグナルDNA生成配列(E)の少なくとも一部と第2のシグナルDNA生成配列(E)に相補的な配列(G)がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する第2のオリゴヌクレオチド(本明細書ではシグナル増幅DNA又はカスケードシグナル増幅DNA1(SA DNA又はcSA DNA1)と同定してよい)を含む。これらの態様及び実施形態では、方法、組成物及びキットは、ポリメラーゼ及びニッキング反応のためのエンドヌクレアーゼを含むことができる。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼ認識部位(B)及び/又は(F)はヘアピン構造のループに位置することができる。本明細書で考察されるように、任意の数(n)の特有のシグナル増幅DNA又はカスケードシグナル増幅DNA(又は「cSA DNA」)を上の反応に添加することができ、それぞれの特有なcSA DNAが特有のシグナルDNA配列を生成するように組み立ててよい。例えば、一部の実施形態では、nは10、9、8、7、5、4、3、2又は1が可能であり、その場合、10、9、8、7、5、4、3、2又は1のcSA DNAが、標的核酸及び配列変換DNA(SC DNA)を含む反応に添加される。この態様の実施形態では、本方法は、1つ以上のシグナルDNA(複数可)の存在又は非存在を判定し、1つ以上のシグナルDNA(複数可)の存在は、試料中の標的核酸の存在を示すことも含む。
例えば、一部の実施形態では、本開示は、試料中の標的核酸を検出するための方法であって、前記試料を、5’から3’方向に、第1のシグナルDNA生成配列(A)と、エンドヌクレアーゼ認識部位(B)と、シグナルDNA生成配列(A)の少なくとも一部に相補的である第1の相補的配列(C)及びその中に組み込まれた少なくとも1つの脱塩基部位を有し、標的核酸の3’末端に相補的である第2の相補的配列(D)を含む相補的配列とを含む第1のオリゴヌクレオチド(配列転換DNA又はSC DNA)と接触させ、第1のシグナルDNA生成配列(A)の少なくとも一部とシグナルDNA生成配列(A)の一部に相補的である第1の相補的配列(C)がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、前記方法に関する。さらなる実施形態では、本方法は、5’から3’方向に、第2の特有のシグナルDNA生成配列(E)と、エンドヌクレアーゼン認識部位(F)(SC DNA中のエンドヌクレアーゼン認識部位(B)と同じであるか又はそれとは異なってもよい)と、第2の特有のシグナルDNA生成配列(E)の少なくとも一部に相補的である相補的配列(G)及び第1のSC DNAオリゴヌクレオチドの第1のシグナルDNA生成配列(A)と相同である配列(H)を含む配列領域とを含み、配列(H)が任意選択的に、その中に組み込まれた少なくとも1つの脱塩基部位を有し、第2の特有のシグナルDNA生成配列(E)の少なくとも一部とシグナルDNA生成配列(E)に相補的な配列(G)がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、第2のオリゴヌクレオチド(カスケードシグナル増幅DNA1又はcSA DNA1);5’から3’方向に、第3の特有のシグナルDNA生成配列(I)と、エンドヌクレアーゼン認識部位(J)(エンドヌクレアーゼン認識部位(B)及び(F)と同じであるか又はそれとは異なってもよい)と、第3の特有のシグナルDNA生成配列(I)の少なくとも一部に相補的である相補的配列(K)及び第2のオリゴヌクレオチドcSC DNA1の第2のシグナルDNA生成配列(E)と相同である配列(L)を含む配列領域とを含み、シグナル(L)が任意選択的に、その中に組み込まれた少なくとも1つの脱塩基部位を有し、第3の特有のシグナルDNA生成配列(I)の少なくとも一部とシグナルDNA生成配列(I)に相補的な配列(K)がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、第3のオリゴヌクレオチド(カスケードシグナル増幅DNA2又はcSA DNA2)を含む。そのような実施形態では、本方法は、ポリメラーゼ;及びニッキング反応のためのエンドヌクレアーゼをさらに含んでよい。さらなる実施形態では、本方法は、シグナルDNAの存在又は非存在を判定し、シグナルDNAの存在は試料中の標的核酸の存在を示すことも含む。
別の態様では、本開示は、試料中の標的核酸を検出するための方法に関するものであり、標的核酸と第1のオリゴヌクレオチド(少なくとも1つの脱塩基部位を有する配列変換DNA又はSC DNA)の相互作用が第1のシグナルDNA(S1)を生成し、この第1のシグナルDNAが今度は第2のオリゴヌクレオチド(カスケードシグナル増幅DNA1又はcSA DNA1、任意選択的に、少なくとも1つの脱塩基部位を有する)と相互作用してS1と異なる第2のシグナルDNA(S2)を生成し、この第2のシグナルDNAが今度は第3のオリゴヌクレオチド(カスケードシグナル増幅DNA2又はcSA DNA2、任意選択的に、少なくとも1つの脱塩基部位を有する)と相互作用できてシグナルDNA(S1)を生成し、このシグナルDNAは標的核酸がSC DNAと相互作用すると生成されるのと同じシグナルDNAである。この態様では、増幅されたシグナルDNA(S2)は、カスケードシグナル増幅DNA cSA DNA2と相互作用するとシグナルDNA(S1)に変換され、シグナルDNA(S1)のサイクル増幅が可能になる。
さらなる態様では、本開示は、試料中で標的核酸を検出するための方法であって、前記試料を、5’から3’方向に、シグナルDNA生成配列(A)と、エンドヌクレアーゼ認識部位(B)と、シグナルDNA生成配列(A)の少なくとも一部に相補的である第1の相補的配列(C)及びその中に組み込まれた少なくとも1つの脱塩基部位を有し前記標的核酸(T)の3’末端に相補的である第2の相補的配列(D)を含む相補的配列とを含み、第1のシグナルDNA生成配列(A)の少なくとも一部とシグナルDNA生成配列(A)に相補的である第1の相補的配列(C)がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する第1のオリゴヌクレオチド(又は配列変換DNA若しくはSC DNA);5’から3’方向に、第1のオリゴヌクレオチドのシグナルDNA生成配列(A)と相同なシグナルDNA生成配列(E)と、エンドヌクレアーゼ認識部位(F)(第1のオリゴヌクレオチドのエンドヌクレアーゼ認識部位(B)と同じである)と、シグナルDNA生成配列(E)の少なくとも一部に相補的である相補的配列(G)及び第1のオリゴヌクレオチドのシグナルDNA生成配列(A)と相同な配列(H)を含む配列領域とを含み、配列(H)が任意選択的にその中に組み込まれた少なくとも1つの脱塩基部位を有し、第2のシグナルDNA生成配列(E)の少なくとも一部とシグナルDNA生成配列(E)に相補的である配列(G)がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する第2のオリゴヌクレオチド(又はシグナル増幅DNA若しくはSA DNA));ポリメラーゼ;並びにニッキング反応のためのエンドヌクレアーゼと接触させることを含む方法に関する。この態様の実施形態では、本方法は、シグナルDNAの存在又は非存在を判定し、シグナルDNAの存在は試料中の標的核酸の存在を示すことも含む。
ある特定の実施形態では、1つ以上の脱塩基部位(すなわち、部分)は、本明細書に記載される任意のオリゴヌクレオチドの配列に存在することができる。例えば、1つ以上の脱塩基部位は任意のシグナル変換オリゴヌクレオチド(SC DNA)に、並びに/又は本開示に従って調製される及び/若しくは使用される任意のシグナル増幅オリゴヌクレオチド(cSA DNA又はSA DNA)に存在することができる。ある特定の実施形態では、少なくとも1つの脱塩基部位が、任意のSC DNA(例えば、配列(D)内の)の3’末端から及び/又は任意のシグナル増幅DNA(SA又はcSA DNA;例えば、配列(H)及び/又は配列(L)内の)の3’末端から位置1~50、1~45、1~40、1~35、1~30、1~25、1~20、1~15、1~10、又は1~5にある。代わりに、少なくとも1つの脱塩基部位が、任意のSC DNAの3’末端から並びに/又は本開示に従って調製される及び/若しくは使用される任意のcSA DNAの3’末端から位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25又はその組合せにある。一部の実施形態では、少なくとも1つの脱塩基部位が、標的核酸(例えば、配列(D))の3’末端に相補的である任意のSC DNAの配列の5’末端から及び/又はシグナルDNAの3’末端に相補的である任意のSA若しくはcSA DNAの配列の5’末端から位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25又はその組合せにある。さらに代わりに、少なくとも1つの脱塩基部位が、任意のSC DNA及び/又は本発明に従って調製される若しくは使用される任意のcSA DNA内のエンドヌクレアーゼ認識部位の3’末端から位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25又はその組合せにある。
さらに下で考察されるように、例えば、SC DNAに1つ以上の脱塩基部位を含む配列が本明細書で開示される方法を実施される際のバックグラウンドシグナルを減らす(例えば、標的非依存性増幅から生じることがあるシグナルを減らす)のに効果的であることを例証する本開示のある特定の実施形態が説明される。
一部の実施形態では、SC DNAに(標的核酸の3’末端に相補的である配列(D)内に)及び/又は1つ以上のcSA DNA(複数可)(例えば、第2のシグナルDNA生成配列(E)に相同な配列(L))に脱塩基部位を組み込めば、増幅反応での非特異的バックグラウンドシグナルの生成を取り除く又は減らすことができる。他の実施形態では、SC DNA及び/又はcSA DNA配列に脱塩基部位を組み込めば、標的核酸の特異的で正確な測定を可能にする一期間の間非特異的増幅事象の生成/発生を遅らせることができる。したがって、本開示は、いかなる検出可能な非特異的妨害バックグラウンドシグナルであれ生成される前に標的核酸(例えば、試料中の標的配列)の存在を示すシグナル配列(複数可)の測定を可能にする核酸分子(オリゴヌクレオチド)、組成物、キット、及び方法を提供する。
図1A~1Cに模式的に示されるように(すなわち、配列長又はハイブリダイズしているヌクレオチド対の数に関する目盛りまでは示されていない)、SC DNA及びcSA DNAは、シグナルDNA生成配列(A)、(E)又は(I)の少なくとも一部に相補的である配列(C)、(G)又は(K)を含む。配列(C)、(G)又は(K)の少なくとも一部は、シグナルDNA生成配列(A)、(E)又は(I)の相補的領域の少なくとも一部とハイブリダイズして、ヘアピン(又はステムループ)構造を形成する。図1A~1Cの非限定的実施形態で説明されるように、二本鎖ステムは一方の側ではエンドヌクレアーゼ認識部位(B)、(F)又は(J)を含む不対ループ領域と隣接し、もう一方の側では標的核酸(SC DNAの場合では)に相補的な配列又は上流シグナルDNA生成配列と隣接している。一部の実施形態では、SC DNAはcSA DNAとして機能することができる(すなわち、方法が別々の増幅オリゴヌクレオチド配列を含まない場合、SC DNAは標的からのシグナルを変換しかつ増幅する)。
任意のシグナル変換オリゴヌクレオチド(SC DNA)では、及び/又は任意のシグナル増幅オリゴヌクレオチド(cSA DNA又はSA DNA)では、シグナルDNA生成配列とシグナルDNA生成配列の少なくとも一部に相補的である配列は、一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼ認識部位を含むことができるヘアピン構造を形成し、この部位はエンドヌクレアーゼにより切れ目を入れられる配列に相補的な配列を含む。エンドヌクレアーゼにより切れ目を入れられる配列は、エンドヌクレアーゼにより認識される配列の内部、その下流又はその上流に存在してよく、したがって、そのような相補的ハイブリダイゼーションを通じて二本鎖配列を形成しうる。適切には、二本鎖になる場合、エンドヌクレアーゼ認識部位(B)、(F)又は(J)は反応中に存在するエンドヌクレアーゼにより認識されることができ、エンドヌクレアーゼ認識部位(B)、(F)又は(J)(又はエンドヌクレアーゼ認識部位(B)、(F)又は(J)に隣接している配列)は二本鎖DNAの1つの鎖だけで切断されうる(すなわち、切れ目を入れられる)。SC DNAの場合、標的核酸の結合は、DNAポリメラーゼによる複製をプライミングして、エンドヌクレアーゼに対する認識部位として役立つことができる活性のある二本鎖形態のエンドヌクレアーゼ認識部位(B)を生み出す。次に、新たに生み出された二本鎖エンドヌクレアーゼ部位(B)での又は新たに生み出された二本鎖エンドヌクレアーゼ部位(B)に隣接する部位でのエンドヌクレアーゼニッキングは、DNAポリメラーゼによる複製をプライミングして、シグナルDNAを生み出す。cSA DNAでは、上流シグナルDNAの結合がDNAポリメラーゼによる複製をプライミングして、エンドヌクレアーゼに対する認識部位として役立つことができる活性のある二本鎖形態のエンドヌクレアーゼ認識部位(F)又は(J)を生み出す。次に、新たに生み出された二本鎖エンドヌクレアーゼ部位(F)若しくは(J)での、又は新たに生み出された二本鎖エンドヌクレアーゼ部位(F)若しくは(J)に隣接する部位でのエンドヌクレアーゼニッキングは、DNAポリメラーゼによる複製をプライミングして、シグナルDNAを生み出す。図2A~2Cに例証されるように、エンドヌクレアーゼ認識部位(B)、(F)及び(J)は、SC DNAでもcSA DNAでもなく、新たに複製された鎖が切れ目を入れられるように、方向付けられる。すなわち、新たに複製された鎖が生み出されると、エンドヌクレアーゼ認識部位の配向は、新たに複製された鎖のエンドヌクレアーゼ活性(切断)を方向付ける。それ故に、エンドヌクレアーゼ認識部位は、エンドヌクレアーゼにより切れ目を入れられる配列に相補的な配列を含み、SC DNAオリゴヌクレオチド及びcSA DNAオリゴヌクレオチドが反応の間ずっと無傷のままでいる(すなわち、切れ目を入れられないし切断もされない)ことが可能になる。
配列(C)、(G)及び/又は(K)は長さにより制限されることはなく、約5~約100核酸塩基、及び5~100の間のすべての整数が可能である。一部の実施形態では、配列(C)、(G)及び/又は(K)は、約5~約30核酸塩基、及び5~30の間のすべての整数が可能である。配列(C)、(G)及び/又は(K)は、シグナルDNA生成配列(A)、(E)及び/又は(I)と同じ長さである必要もない。一部の実施形態では、(C)、(G)及び/又は(K)は、シグナルDNA生成配列(A)、(E)及び/若しくは(I)と同じ長さであることが可能である、又は(C)、(G)及び/若しくは(K)は、約1~20若しくは約1~10塩基短いことが可能である。SC DNA及びcSA DNAのステム構造は、一般に、約3~約60核酸塩基対長に及ぶ二本鎖DNAの長さを含んでよい。一部の実施形態では、ステムは、約5~約20核酸塩基対長及び5~20の間のすべての整数に及ぶ二本鎖DNAの長さを含む。
ステムはバルジ又はミスマッチも含むことができ、配列(C)、(G)及び/又は(K)は、配列(A)、(E)及び/又は(I)に100%相補的である必要はない。一部の実施形態では、配列(C)、(G)及び/又は(K)は、配列(C)、(G)及び/又は(K)のすべてに又は一部に100%相補的でよい。例えば、配列(C)は配列(A)に約50%、60%、70%、80%、又は90%よりも多く相補的であることが可能であり、配列(G)は配列(E)に約50%、60%、70%、80%、又は90%よりも多く相補的であることが可能であり配列(K)は配列(I)に約50%、60%、70%、80%、又は90%よりも多く相補的であることが可能である。いかなる塩基対合ミスマッチにもかかわらず、2つの配列は一般に適切な条件下で互いに選択的にハイブリダイズする能力を有する。一部の実施形態では、配列(A)と配列(C)の間、配列(E)と配列(G)の間、及び配列(I)と配列(K)の間の相補性の量は約80%~100%であり、これは、例えば、本明細書で開示される条件などの厳密な又は高度に厳密な条件下でのハイブリダイゼーションを可能にすることができる。
一部の実施形態では、例えば、SC DNAの配列(A)及び(C)のステム-ループ構造部分並びに配列(E)及び(G)又は配列(I)及び(K)のステム-ループ構造部分の二本鎖ステムは、20%~70%の任意のパーセンテージを含む、約20%~約70%に及ぶGC含量を有することができる。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼ認識部位(B)、(F)又は(J)の少なくとも一部は、ステムループ構造の一本鎖ループに位置している。一部の実施形態では、全エンドヌクレアーゼ認識部位(B)、(F)又は(J)は、ループ領域を含む配列に位置している。一般に、ステムループ構造中のループは、約3~約30ヌクレオチド塩基及び中間の任意の数が可能である。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼ認識部位(B)は、4~約10ヌクレオチド塩基長及び4と10の間のすべての整数である。
本開示は、標的核酸(例えば、試料中の標的配列)の存在を示すシグナルDNAの測定を可能にする核酸分子(例えば、本明細書に開示されるSC及びcSA DNA)、組成物、キット及び方法も提供する。例えば、一部の実施形態では、試料中の約1nM~約1fMの標的核酸の存在から生じるシグナルは、約10~約120、約5~約120、又は約3~約120分内で検出可能である。
この態様の実施形態では、ポリメラーゼは鎖置換活性を有することがある。さらなる実施形態では、ポリメラーゼは、3’から5’エキソヌクレアーゼ欠損、5’から3’エキソヌクレアーゼ欠損、又は3’から5’エキソヌクレアーゼ欠損と5’から3’エキソヌクレアーゼ欠損の両方でもよい。一部の実施形態では、ポリメラーゼはDNAポリメラーゼを含む。
一実施形態では、エンドヌクレアーゼは、オリゴヌクレオチドに切れ目を入れる反応において使用できるニッキングエンドヌクレアーゼ又は制限エンドヌクレアーゼを含んでよい。(B)SC DNAの、(E)第1のcSA DNA1の、(H)第2のcSA DNA2のエンドヌクレアーゼ認識部位及び/又は任意のそれに続くcSA DNAに位置する任意の他のエンドヌクレアーゼ部位は、同一であるか、異なっているか、又は同じ及び異なる(例えば、2つは同一であり3番目は異なる)エンドヌクレアーゼ部位(複数可)の組合せが可能である。
本明細書で開示される方法は、典型的なDNA増幅条件(例えば、標準的PCRに関連する典型的な温度、反応物濃度、時間サイクル、等)下で実施してよいが、一部の実施形態では、本方法は、等温条件下で又は実質的に一定温度下で実施してもよい。さらなる実施形態では、方法は標準的PCR法で使用される温度よりも低い温度で実施してよい。一例として、方法の一部の実施形態は、下に記載される標的核酸(T)及びSC DNAの配列(D)の、又はシグナルDNA及びcSA DNAの相補的配列の計算された最適ハイブリダイゼーション若しくはアニーリング温度、又は実験的に決定されたハイブリダイゼーション若しくはアニーリング温度での又はそれよりも下の温度で実施してよい。方法の一部の実施形態は、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチド中のヘアピン構造の融解温度での又はそれよりも下の温度で実施してよい。一実施形態では、本方法は、SC DNAの配列(D)に結合している標的核酸(T)、又はcSA DNAの適切な配列に結合しているシグナルDNAの融解温度よりも下の温度で実施してよい。さらに他の実施形態では、本方法は、ポリメラーゼ及び/又はエンドヌクレアーゼ活性を可能にする温度で実施してよい。さらなる実施形態では、本方法は、試料中の標的核酸の検出のために反応混合物中に存在するポリメラーゼ及び/又はエンドヌクレアーゼについての最適反応温度である又は約最適反応温度である温度で実施してよい。
別の態様では、本開示は、5’から3’方向に、第1のシグナルDNA生成配列(A)と、エンドヌクレアーゼ認識部位(B)と、第1のシグナルDNA生成配列(A)の少なくとも一部に相補的である第1の相補的配列(C)及びその中に組み込まれた少なくとも1つの脱塩基部位を有し標的核酸の3’末端に相補的である第2の相補的配列(D)を含む相補的配列とを含み、第1のシグナルDNA生成配列(A)の少なくとも一部とシグナルDNA生成配列(A)に相補的である配列(C)がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、本明細書では「配列変換DNA」(又は「SC DNA」)と呼ばれる場合もある化学修飾されたオリゴヌクレオチドに関する。
別の態様では、本開示は、5’から3’方向に、特有のシグナルDNA生成配列(例えば、対になったSC DNAのシグナルDNA生成配列(A)とは異なる)と、エンドヌクレアーゼ認識部位と、1つの配列領域が特有のシグナルDNA生成配列の少なくとも一部に相補的であり、第2の配列領域が任意選択的に、その中に組み込まれた少なくとも1つの脱塩基部位を有し、配列変換DNA(SC DNA)のシグナルDNA生成配列に又は異なるcSA DNAのシグナルDNA生成配列に相同である配列を有する2つの配列領域とを含む配列を含み、特有のシグナルDNA生成配列の少なくとも一部と特有のシグナルDNA生成配列に相補的な配列がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、本明細書では「シグナル増幅DNA」、「カスケードシグナル増幅DNA」(例えば、「SA DNA」又は「cSA DNA」)と呼ばれる場合があるオリゴヌクレオチドに関する。
図に関して、例えば、別の態様では、本開示は、5’から3’方向に、第2の特有なシグナルDNA生成配列(E)と、エンドヌクレアーゼ認識部位(F)と、シグナルDNA生成配列(E)の少なくとも一部に相補的な配列(G)と、配列変換DNA(SC DNA)のシグナルDNA生成配列(A)に相同な配列(H)とを含み、配列(H)が任意選択的に、その中に組み込まれた少なくとも1つの脱塩基部位を有し、第2のシグナルDNA生成配列(E)の少なくとも一部とシグナルDNA生成配列(E)に相補的である配列(G)がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、本明細書では「第1のカスケードシグナル増幅DNA1」(又は「cSA DNA1」)と呼ばれる場合もある、オリゴヌクレオチドに関する。
さらなる態様では、本開示は、5’から3’方向に、第3の特有なシグナルDNA生成配列(I)と、エンドヌクレアーゼ認識部位(J)と、シグナルDNA生成配列(I)の少なくとも一部に相補的な配列(K)と、第1のカスケードシグナル増幅DNA1」(cSA DNA1)のシグナルDNA生成配列(E)に相同な配列(L)とを含み、配列(L)が任意選択的に、その中に組み込まれた少なくとも1つの脱塩基部位を有し、第3のシグナルDNA生成配列(I)の少なくとも一部とシグナルDNA生成配列(I)に相補的である配列(K)がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、本明細書では「第2のカスケードシグナル増幅DNA2」(又は「cSA DNA2」)と呼ばれる場合もある、もう1つのオリゴヌクレオチドに関する。
標的核酸配列は、目的の任意のヌクレオチド配列でよく、一部の実施形態では、感染病原体又はマイクロRNAから生じる配列を含みうる。他の実施形態では、標的核酸は、疾患又は障害に関連することがある遺伝子由来の配列を含みうる。
一部の実施形態では、本開示に従って調製される及び/又は使用されるオリゴヌクレオチド中のエンドヌクレアーゼ認識部位(例えば、SC DNAエンドヌクレアーゼ認識部位(B)並びにcSA DNAエンドヌクレアーゼ認識部位(E)及び(H))は、エンドヌクレアーゼにより切れ目を入れられる配列に相補的な配列を含む。他の実施形態では、エンドヌクレアーゼにより切れ目を入れられる配列は、エンドヌクレアーゼにより特異的に認識される配列に隣接している(下流又は上流で)。
さらなる態様では、本開示は、試料中の標的核酸を検出するための組成物であって、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドのうちの1つ以上を含む前記組成物に関する。この態様の一部の例となる実施形態は、5’から3’方向に、第1の特有のシグナルDNA生成配列(A)と、エンドヌクレアーゼ認識部位(B)と、シグナルDNA生成配列(A)の少なくとも一部に相補的である第1の相補的配列(C)及びその中に組み込まれた少なくとも1つの脱塩基部位を有し標的核酸の3’末端に相補的である第2の相補的配列(D)を含む相補的配列とを含み、第1のシグナルDNA生成配列(A)の少なくとも一部とシグナルDNA生成配列(A)に相補的である配列(C)がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、第1のオリゴヌクレオチド(配列変換DNA又はSC DNA);5’から3’方向に、第2の特有のシグナルDNA生成配列(E)と、エンドヌクレアーゼ認識部位(F)と、シグナルDNA生成配列(E)の少なくとも一部に相補的である配列(G)を含む相補的配列と、第1のSC DNAオリゴヌクレオチドの第1のシグナルDNA生成配列(A)に相同である配列(H)とを含み、配列(H)が任意選択的にその中に組み込まれた少なくとも1つの脱塩基部位を有し、第2のシグナルDNA生成配列(E)の少なくとも一部とシグナルDNA生成配列(E)に相補的な配列(G)がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、第2のオリゴヌクレオチド(カスケードシグナル増幅DNA1又はcSA DNA1);5’から3’方向に、第3の特有のシグナルDNA生成配列(I)と、エンドヌクレアーゼ認識部位(J)と、シグナルDNA生成配列(I)の少なくとも一部に相補的である配列(K)及び第2のオリゴヌクレオチドcSC DNA1の第2のシグナルDNA生成配列(E)に相同な配列(L)を含む配列領域とを含み、配列(L)が任意選択的に少なくとも1つの脱塩基部位を有し、シグナル(L)が任意選択的にその中に組み込まれた少なくとも1つの脱塩基部位を有し、第3のシグナルDNA生成配列(I)の少なくとも一部とシグナルDNA生成配列(I)に相補的な配列(K)がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、第3のオリゴヌクレオチド(カスケードシグナル増幅DNA2又はcSA DNA2);ポリメラーゼ、並びにニッキング反応のためのエンドヌクレアーゼを含む組成物を提供する。この態様の実施形態では、組成物は、シグナルDNAの存在又は非存在を判定し、シグナルDNAの存在が試料中の標的核酸の存在を示すための方法において使用される。
組成物は、ポリメラーゼ及び/又はエンドヌクレアーゼ認識部位が二本鎖になっている場合はエンドヌクレアーゼも含むことができ、エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ認識部位(SC DNAのエンドヌクレアーゼ認識部位、及び存在する任意のcSA DNAの任意のエンドヌクレアーゼ認識部位(例えば、第1のcSA DNA1のエンドヌクレアーゼ認識部位(F)及び第2のcSA DNA2のエンドヌクレアーゼ認識部位(J))において、又はエンドヌクレアーゼ認識部位に隣接して、切れ目を入れることができる。それぞれの覆われた構造(すなわち、ヘアピン構造)では、新たに複製された鎖が生成される場合、エンドヌクレアーゼ認識部位の配向は、新たに複製された鎖のエンドヌクレアーゼ活性(すなわち、ニッキング/切断)を方向付ける。それゆえに、エンドヌクレアーゼ認識部位は、エンドヌクレアーゼにより切れ目を入れられる配列に相補的な配列を含み、これにより、SC DNA又はcSA DNAが反応の間ずっと無傷のままでいることが可能になる。組成物は、反応バッファーなどの他の試薬、デオキシリボヌクレオチド及び、例えば、新たに合成されたDNAの蛍光検出用のフルオロフォア修飾プローブDNA(例えば、分子ビーコンプローブ)などのレポーター分子も含むことができる。
さらに別の態様では、本開示は、試料中の標的核酸を検出するためのキットであって、5’から3’方向に、第1のシグナルDNA生成配列(A)と、エンドヌクレアーゼ認識部位(B)と、シグナルDNA生成配列(A)の少なくとも一部に相補的である第1の相補的配列(C)及びその中に組み込まれた少なくとも1つの脱塩基部位を有し標的核酸の3’末端に相補的である第2の相補的配列(D)を含む相補的配列とを含み、第1のシグナルDNA生成配列(A)の少なくとも一部とシグナルDNA生成配列(A)に相補的である配列(C)がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、第1のオリゴヌクレオチド(配列変換DNA又はSC DNA);5’から3’方向に、第2の特有のシグナルDNA生成配列(E)と、エンドヌクレアーゼ認識部位(F)と、シグナルDNA生成配列(E)の少なくとも一部に相補的である配列(G)及び第1のSC DNAオリゴヌクレオチドの第1のシグナルDNA生成配列(A)に相同である配列(H)を含む配列領域とを含み、配列(H)が任意選択的にその中に組み込まれた少なくとも1つの脱塩基部位を有し、第2のシグナルDNA生成配列(E)の少なくとも一部とシグナルDNA生成配列(E)に相補的な配列(G)がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、第2のオリゴヌクレオチド(カスケードシグナル増幅DNA1又はcSA DNA1);5’から3’方向に、第3の特有のシグナルDNA生成配列(I)と、エンドヌクレアーゼ認識部位(J)と、シグナルDNA生成配列(I)の少なくとも一部に相補的である配列(K)及び第2のオリゴヌクレオチドcSC DNA1の第2のシグナルDNA生成配列(E)に相同である配列(L)を含む配列領域とを含み、配列(L)が任意選択的に少なくとも1つの脱塩基部位を有し、シグナル(L)が任意選択的にその中に組み込まれた少なくとも1つの脱塩基部位を有し、第3のシグナルDNA生成配列(I)の少なくとも一部とシグナルDNA生成配列(I)に相補的な配列(K)がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、第3のオリゴヌクレオチド(カスケードシグナル増幅DNA2又はcSA DNA2)を含む前記キットに関する。一部の実施形態では、キットは、ポリメラーゼ及び/又はエンドヌクレアーゼ認識部位若しくはエンドヌクレアーゼ認識部位に隣接する部位に切れ目を入れることができるエンドヌクレアーゼをさらに含むことができる。キットは、反応バッファーなどの試薬、デオキシリボヌクレオチド及び、例えば、シグナルDNAなどの新たに合成されたDNAの蛍光検出用のフルオロフォア修飾プローブDNA(例えば、分子ビーコンプローブ)などのレポーター分子も含むことができる。キットは、本明細書で開示される方法のうちのいずれか1つを実行するのに使用するための説明書も含むことができる。
本明細書で開示される方法、オリゴヌクレオチド、組成物及びキットは、総合システムプラットホームと組み合わせて使用してよい。例えば、本発明の方法、オリゴヌクレオチド、組成物及びキットは、例えば、Abbott Laboratories(Abbott Park、IL)により、例えば、ARCHITECT(登録商標)又はAbbott Alinity devicesのシリーズとして市販されている組合せ方式で使用しうる。本明細書で開示される方法、オリゴヌクレオチド、組成物及びキットは、例えば、m2000sp試料調製システム(Abbott Diagnostics、Abbott Park、IL)などの試料調製システムプラットホームと一緒に使用しうる。同様に、本明細書で開示される方法、オリゴヌクレオチド、組成物及びキットは、例えば、Abbott’s i-STAT point-of-care system(例えば、i-STAT and i-STAT Alinity、Abbott Diagnostics、Abbott Park、IL)などのポイントオブケアシステムプラットホームと一緒に使用してよく、任意選択的に、他のプラットホーム(例えば、Universal Biosensors(Rowville、Australia)(例えば、US 2006/0134713参照)、Axis-Shield PoC AS(Oslo、Norway)及びClinical Lab Products(Los Angeles、USA))上で用いてもよい。さらに、本発明の方法、オリゴヌクレオチド、組成物及びキットは、例えば、ハンドヘルド蛍光検出器、マイクロpHメーター、マイクロ流体デバイス、マイクロアレイ、酵素検出システム、免疫クロマトグラフィー試験片、及びラテラルフローデバイスなどのいかなる数の他のデバイス、アッセイプラットホーム、及び計測手段と一緒に使用することも可能である。
本明細書で開示される方法、オリゴヌクレオチド、組成物及びキットは、非感染性及び感染性疾患の診断を含む分子診断の分野で使用しうる。例えば、本発明の方法、オリゴヌクレオチド、組成物及びキットを使用すれば、がん及び他の遺伝性疾患を検出できる。同様に、本発明の方法、オリゴヌクレオチド、組成物及びキットを使用すれば、例えば、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、クラミジア・トラコマチス、淋病、インフルエンザAウイルス、インフルエンザBウイルス、又は呼吸器多核体ウイルスなどの感染性疾患から生じる標的核酸検出できる。
本開示により提供される追加の態様、実施形態及び利点は、以下に続く説明に照らせば明らかになる。
一般的な意味で、本開示は、試験試料中の標的核酸を検出するのに驚くほど効果的である核酸構築物に関する。本明細書で開示される構築物は、標的核酸の存在下で生み出されるシグナルDNAの生成を可能にする核酸配列を含む。本明細書で開示される方法及び核酸構築物は、低温度及び等温条件下で有利に実施しうる標的核酸の選択的及び感度のよい検出を提供する。
この態様の実施形態では、本開示は、試料中の標的核酸を検出するのに有用である新規の配列変換(SC)及びカスケードシグナル増幅(cSA)オリゴヌクレオチド構築物、並びにその組合せを提供する。図1Aの図解的実施形態により描かれるように、試料中の標的核酸の検出用の配列変換DNA(SC DNA)オリゴヌクレオチドは、5’から3’方向に、第1のシグナルDNA生成配列(A)と、ニッキング反応で使用できるエンドヌクレアーゼ認識部位(B)と、少なくとも1つの脱塩基部分を含む相補的配列を含み、相補的配列はシグナルDNA生成配列(A)の少なくとも一部に相補的である第1の相補的配列(C)及びその中に組み込まれた少なくとも1つの脱塩基部位を有し標的核酸に相補的である第2の相補的配列(D)とを含み、第1のシグナルDNA生成配列(A)の少なくとも一部とシグナルDNA生成配列(A)に相補的である配列(C)がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する。この態様の一部の実施形態では、相補的配列(すなわち、(C)及び(D)を含む)は複数の脱塩基部分を含む。一部のさらなる実施形態では、第2の相補的配列(D)は、標的核酸の3’末端に相補的であり、複数の脱塩基部位(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10脱塩基部位)を含む。一部の実施形態では、化学修飾SC DNAオリゴヌクレオチドは3’末端修飾をさらに含む。
図1Bの図解的実施形態により描かれるように、試料中の標的核酸の検出用の第1のカスケードシグナル増幅DNA(cSA DNA1)は、5’から3’方向に、第2の特有のシグナルDNA生成配列(E)と、エンドヌクレアーゼ認識部位(F)(エンドヌクレアーゼ認識部位(B)と同じである又は異なることが可能である)と、シグナルDNA生成配列(E)の少なくとも一部に相補的である配列(G)及び第1のSC DNAの第1のシグナルDNA生成配列(A)に相同である配列(H)を含む配列領域とを含み、配列(H)が任意選択的にその中に組み込まれた少なくとも1つの脱塩基部位を有し、第2のシグナルDNA生成配列(E)の少なくとも一部とシグナルDNA生成配列(E)に相補的な配列(G)がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する。この態様の一部の実施形態では、配列(H)は、第1のSC DNAの第1のシグナルDNA生成配列(A)に相同であり、複数の脱塩基部位(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10脱塩基部位)を含む。一部の実施形態では、化学修飾オリゴヌクレオチドは3’末端修飾をさらに含む。
図1Cの図解的実施形態により描かれるように、試料中の標的核酸の検出用の第2のカスケードシグナル増幅DNA2(cSA DNA2)は、5’から3’方向に、第3の特有なシグナルDNA生成配列(I)と;エンドヌクレアーゼ認識部位(J)(エンドヌクレアーゼ認識部位(B)及び(F)と同じである又は異なることが可能である)と;シグナルDNA生成配列(I)の少なくとも一部に相補的である配列(K)及び第1のcSA DNA1の第2のシグナルDNA生成配列(E)に相同である配列(L)を含む配列領域とを含み、配列(L)が任意選択的にその中に組み込まれた少なくとも1つの脱塩基部位を有し、第3のシグナルDNA生成配列(I)の少なくとも一部とシグナルDNA生成配列(I)に相補的な配列(K)がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する。この態様の一部の実施形態では、配列(L)は、第1のcSA DNA1の第2のシグナルDNA生成配列(E)に相同であり、複数の脱塩基部位(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、若しくは10又はそれよりも多い脱塩基部位)を含む。一部の実施形態では、化学修飾オリゴヌクレオチドは3’末端修飾をさらに含む。
本開示の実施形態では、SC DNAの配列(D)はその中に組み込まれた少なくとも1つの脱塩基部位を有し標的核酸に相補的であり、SC DNAの又は異なるcSA DNAのシグナルDNA生成配列に実質的に相同であるcSA DNAの配列は、任意選択的に、その中に組み込まれた少なくとも1つの脱塩基部位を有する。他の実施形態では、SC DNAの配列(D)だけがその中に組み込まれた1つ以上の脱塩基部位を含む。脱塩基部位は以下の一般構造を有する:
例えば、SC DNAの配列(D)中に及び/又は任意選択的に、SC DNAのシグナルDNA生成配列に実質的に相同であるcSA DNAの又は本明細書に記載される異なるcSA DNAの配列中に脱塩基部位を組み込むことにより、非特異的バックグラウンドシグナル増幅は完全に取り除かれるか、減らされるか、又は非特異的バックグラウンドシグナルからのいかなる実質的な妨害もなしで、標的核酸の存在から生じるシグナル配列を検出するのに十分である期間遅延される。例えば、ある特定の実施形態では、本発明の方法、オリゴヌクレオチド、組成物、及びキットを使用する場合、非特異的バックグラウンドシグナル増幅は99~10%減少、99~20%減少、99~30%減少、99~50%減少、又は99~70%減少する。ある特定の実施形態では、SC DNAの配列(D)中に、及びSC DNAのシグナルDNA生成配列に実質的に相同であるSA DNAの配列の一部中に1つ以上の脱塩基部位を組み込めば、非特異的バックグラウンドシグナル増幅を平均で少なくとも約10%、20%、30%、40%、若しくは50%若しくはそれよりも多く、又は平均で約10%、約20%、若しくは約30%減少させることができる。
本明細書の図に示されるように、本明細書で開示されるSC及びcSA DNAは、シグナル生成配列(例えば、SC DNAのシグナルDNA生成配列(A);cSA DNA1のシグナル生成配列(E);及びcSA DNA2のシグナルDNA生成配列(I))を含む。これらのシグナル生成配列は、いかなる所望の核酸配列でも含むことができ、いかなる特定の配列にも限定されない。下でさらに詳細に考察されるように、これらのシグナル生成配列は、シグナルDNA(例えば、S1、S2及びS3)の生成にむけて鋳型の少なくとも一部を提供する。これらのシグナル生成配列は長さにより限定されない。一部の実施形態では、本開示のSC DNA及び/又はcSA DNA(複数可)中のシグナル生成配列は、約5~約100核酸塩基であり、5から100までのすべての整数である。一部の実施形態では、SC DNA及び/又はcSA DNA(複数可)中のシグナル生成配列は、約5~約30核酸塩基であり、5から30までのすべての整数である。一部の実施形態では、SC DNA及び/又はcSA DNA(複数可)中のシグナル生成配列は、約10~約30核酸塩基であり、10から30までのすべての整数である。さらにさらなる実施形態では、SC DNA及び/又はcSA DNA(複数可)中のシグナル生成配列は、約15~約30核酸塩基であり、15から30までのすべての整数(例えば、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、又は約30塩基)である。
さらなる態様では、シグナルDNA生成配列(A);その中に組み込まれた少なくとも1つの脱塩基部位を有し標的核酸の3’末端に相補的である配列(D);シグナルDNA生成配列(E);及びシグナルDNA生成配列(A)に実質的に相同である配列(H)の長さは変動してもよいが、典型的には、これらの配列のそれぞれはその他とおおよそ同じ長さである。一部の実施形態では、これらの配列の1つ又は組合せの長さは、約5~約100ヌクレオチドの範囲にあってよいが、さらに典型的には、約5~約30、約10~約30、又は約15~約30ヌクレオチド長である。エンドヌクレアーゼ認識部位は、本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼにより認識される、結合を受ける、及び切れ目を入れられることが可能な配列を含む。そのような配列は当技術分野では一般に公知である。エンドヌクレアーゼ認識部位は、エンドヌクレアーゼ結合部位の5’側又は3’側(又は5’と3’の両方)に追加のヌクレオチドを含むことができるが、典型的には10ヌクレオチド長以下である。
本明細書に記載されるある特定の実施形態では、標的核酸の3’末端に相補的なSC DNAの配列(D)における、及び任意選択的に、SC DNAの又は異なるcSA DNAのシグナルDNA生成配列に実質的に相同である任意のcSA DNA(例えば、SC DNAのシグナルDNA生成配列(A)に実質的に相同であるSA DNAの配列(H))の配列における脱塩基部位、又は複数の脱塩基部位の位置は、配列の3’末端に関して特定され、変動することがある。一部の実施形態では、配列中の脱塩基部位又は複数の脱塩基部位の位置は、標的核酸に相補的である配列の5’末端、シグナル配列に相補的な配列の5’末端、又はエンドヌクレアーゼ認識部位の3’末端に関して特定されうる。したがって、一部の実施形態では、脱塩基部位(単数又は複数)は、標的核酸の3’末端に相補的な配列の5’末端から位置3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15又はその組合せに(又は、代わりに、エンドヌクレアーゼ認識部位の3’末端の位置と比べてその同じ位置に)位置している。一部の実施形態では、脱塩基部位は、前記標的核酸の3’末端に相補的な前記配列の5’末端から7位に位置している。一部の実施形態では、2つの脱塩基部位は、前記標的核酸の3’末端に相補的な前記配列の5’末端から7及び8位に位置している。一部の実施形態では、3つの脱塩基部位は、前記標的核酸の3’末端に相補的な前記配列の5’末端から7、8及び9位に位置している。さらなる実施形態では、4つの脱塩基部位は、前記標的核酸の3’末端に相補的な前記配列の5’末端から7、8、9及び10位に位置している。
一部の別の実施形態では、脱塩基部位又は複数の脱塩基部位は、オリゴヌクレオチド配列の3’末端から位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30に位置している。単一の脱塩基部位を含む一部の実施形態では、脱塩基部位は、オリゴヌクレオチド配列の3’末端から位置1、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30のいずれかに位置している。
標的核酸の3’末端に相補的なSC DNAの配列(D)及び/又はSC DNAの又は異なるcSA DNAのシグナルDNA生成配列に実質的に相同である任意のcSA DNAの配列が2つの脱塩基部位を含む実施形態では、脱塩基部位は、それぞれの配列の3’末端から位置1~30から選択される2つの位置のいずれの組合せでも位置してよい。
標的核酸の3’末端に相補的なSC DNAの配列(D)及び/又はSC DNAの又は異なるcSA DNAのシグナルDNA生成配列に実質的に相同である任意のcSA DNAの配列が2つの脱塩基部位を含む実施形態では、脱塩基部位は、それぞれの配列の3’末端から位置1~30から選択される2つの位置のいずれの組合せでも位置してよい。
標的核酸の3’末端に相補的なSC DNAの配列(D)及び/又はSC DNAの又は異なるcSA DNAのシグナルDNA生成配列に実質的に相同である任意のcSA DNAの配列が3つの脱塩基部位を含む実施形態では、脱塩基部位は、それぞれの配列の3’末端から位置1~30から選択される3つの位置のいずれの組合せでも位置してよい。
標的核酸の3’末端に相補的なSC DNAの配列(D)及び/又はSC DNAの又は異なるcSA DNAのシグナルDNA生成配列に実質的に相同である任意のcSA DNAの配列が4つの脱塩基部位を含む実施形態では、脱塩基部位は、それぞれの配列の3’末端から位置1~30から選択される4つの位置のいずれの組合せでも位置してよい。
SC DNA及びcSA DNAは、エンドヌクレアーゼ認識部位(例えば、SC DNAエンドヌクレアーゼ部位(B)並びにcSA DNA1エンドヌクレアーゼ部位(F)及びcSA DNA2エンドヌクレアーゼ部位(J))を含み、これらの部位は同じでも異なっていてもよい。一本鎖形態(例えば、図1A、1B及び1Cの構造)では、エンドヌクレアーゼ認識部位(例えば、エンドヌクレアーゼ認識部位(B)、(F)及び(J))はエンドヌクレアーゼにより切れ目を入れられる配列に相補的な配列を含む。エンドヌクレアーゼにより切れ目を入れられる配列は、エンドヌクレアーゼにより認識される配列内に、それから下流に、又は上流に存在してもよい。適切には、二本鎖の場合、エンドヌクレアーゼ認識部位(例えば、エンドヌクレアーゼ認識部位(B)、(F)及び(J))は、反応中に存在する1つ以上のエンドヌクレアーゼにより認識されることが可能であり、エンドヌクレアーゼ認識部位(又はエンドヌクレアーゼ認識部位に隣接する配列)は二本鎖DNAの一本鎖だけが切断され(すなわち、切れ目を入れられ)うる。
下でさらに詳細に説明されるように、SC DNAの相補的配列(D)に標的核酸が結合すると、DNAポリメラーゼを介して複製をプライミングして、エンドヌクレアーゼ認識部位(B)の、活性のある二本鎖形態を生み出し、これはその後エンドヌクレアーゼに対する認識部位として働くことができる(図2A)。次に、エンドヌクレアーゼが、新たに生み出された二本鎖エンドヌクレアーゼ部位(B)で、又は新たに生み出された二本鎖エンドヌクレアーゼ部位(B)に隣接する部位で切れ目を入れると、DNAポリメラーゼを介して複製をプライミングして、第1のシグナルDNA(S1)を生成する(例えば、図2A参照)。図2Aで図解されているように、エンドヌクレアーゼ認識部位(B)は、SC DNAではなく新たに複製された鎖が切れ目を入れられるように配向される。すなわち、新たに複製された鎖が生成されると、(B)中のエンドヌクレアーゼ認識部位の配向が、新たに複製された鎖のエンドヌクレアーゼ活性(切断)を方向付ける。したがって、エンドヌクレアーゼ認識部位は、エンドヌクレアーゼにより切れ目を入れられる配列に相補的な配列を含み、SCオリゴヌクレオチドが反応の間ずっと無傷のままでいる(すなわち、SC DNAは切れ目も入れられないし切断もされない)ことが可能になる。
下でさらに詳細に説明されるように、cSA DNA1の配列(H)にSC DNAのシグナル生成配列(A)から生成される第1のシグナルDNA(S1)が結合すると、DNAポリメラーゼを介して複製をプライミングして、cSA DNA1のエンドヌクレアーゼ認識部位(F)の、活性のある二本鎖形態を生み出し、これはエンドヌクレアーゼに対する認識部位として働くことができる(図2B)。次に、エンドヌクレアーゼが、cSA DNA1の新たに生み出された二本鎖エンドヌクレアーゼ部位(F)で、又は新たに生み出された二本鎖エンドヌクレアーゼ部位(F)に隣接する部位で切れ目を入れると、DNAポリメラーゼを介して複製をプライミングして、SC DNAから生成された第1のシグナルDNA(S1)とは異なる第2のシグナルDNA(S2)を生成する(図2B)。図2Bで図解されているように、エンドヌクレアーゼ認識部位(F)は、cSA DNA1ではなく新たに複製された鎖が切れ目を入れられるように配向される。すなわち、新たに複製された鎖が生成されると、(F)中のエンドヌクレアーゼ認識部位の配向が、新たに複製された鎖のエンドヌクレアーゼ活性(切断)を方向付ける。したがって、エンドヌクレアーゼ認識部位は、エンドヌクレアーゼにより切れ目を入れられる配列に相補的な配列を含み、cSA DNA1オリゴヌクレオチドが反応の間ずっと無傷のままでいる(すなわち、cSA DNA1は切れ目も入れられないし切断もされない)ことが可能になる。
下でさらに詳細に説明されるように、cSA DNA1の配列(H)にSC DNAのシグナル生成配列(A)から生成される第1のシグナルDNA(S1)が結合すると、DNAポリメラーゼを介して複製をプライミングして、cSA DNA1のエンドヌクレアーゼ認識部位(F)の、活性のある二本鎖形態を生み出し、これはエンドヌクレアーゼに対する認識部位として働くことができる(図2B)。次に、エンドヌクレアーゼが、cSA DNA1の新たに生み出された二本鎖エンドヌクレアーゼ部位(F)で、又は新たに生み出された二本鎖エンドヌクレアーゼ部位(F)に隣接する部位で切れ目を入れると、DNAポリメラーゼを介して複製をプライミングして、SC DNAから生成された第1のシグナルDNA(S1)とは異なる第2のシグナルDNA(S2)を生成する(図2B)。図2Bで図解されているように、エンドヌクレアーゼ認識部位(F)は、cSA DNA1ではなく新たに複製された鎖が切れ目を入れられるように配向される。すなわち、新たに複製された鎖が生成されると、(F)中のエンドヌクレアーゼ認識部位の配向が、新たに複製された鎖のエンドヌクレアーゼ活性(切断)を方向付ける。したがって、エンドヌクレアーゼ認識部位は、エンドヌクレアーゼにより切れ目を入れられる配列に相補的な配列を含み、cSA DNA1オリゴヌクレオチドが反応の間ずっと無傷のままでいる(すなわち、cSA DNA1は切れ目も入れられないし切断もされない)ことが可能になる。
下でさらに詳細に説明されるように、cSA DNA2の配列(L)に第1のcSA DNA1のシグナル生成配列(E)から生成される第2のシグナルDNA(S2)が結合すると、DNAポリメラーゼを介して複製をプライミングして、cSA DNA2のエンドヌクレアーゼ認識部位(J)の、活性のある二本鎖形態を生み出し、これはエンドヌクレアーゼに対する認識部位として働くことができる(図2C)。次に、エンドヌクレアーゼが、cSA DNA2の新たに生み出された二本鎖エンドヌクレアーゼ部位(J)で、又は新たに生み出された二本鎖エンドヌクレアーゼ部位(J)に隣接する部位で切れ目を入れると、DNAポリメラーゼを介して複製をプライミングして、SC DNAから生成された第1のシグナルDNA(S1)(図2A)とは、及びcSA DNA1から生成される第2のシグナルDNA(S2)(図2B)とは異なる第3のシグナルDNA(S3)を生成する。図2Cで図解されているように、エンドヌクレアーゼ認識部位(J)は、cSA DNA2ではなく新たに複製された鎖が切れ目を入れられるように配向される。すなわち、新たに複製された鎖が生成されると、(J)中のエンドヌクレアーゼ認識部位の配向が、新たに複製された鎖のエンドヌクレアーゼ活性(切断)を方向付ける。したがって、エンドヌクレアーゼ認識部位は、エンドヌクレアーゼにより切れ目を入れられる配列に相補的な配列を含み、cSA DNA2オリゴヌクレオチドが反応の間ずっと無傷のままでいる(すなわち、cSA DNA2は切れ目も入れられないし切断もされない)ことが可能になる。
標的DNAに相補的であり少なくとも1つの脱塩基部位を有するSC DNAの配列(D)は長さにより制限されず、約5~約100核酸塩基であり、5から100までのすべての整数が可能である。一部の実施形態では、SC DNAの配列(D)は、約5~約30核酸塩基であり、5から30までのすべての整数である。一部の実施形態では、SC DNA中の配列(D)は、約10~約30核酸塩基であり、10から30までのすべての整数である。さらにさらなる実施形態では、SC DNAの配列(D)は、約15~約30核酸塩基であり、15から30までのすべての整数である。
相補的配列は、水素結合相互作用を形成して二本鎖核酸構造(例えば、核酸塩基対)を形成することができる。例えば、第1の配列に相補的な配列は、第1の配列とワトソンクリック塩基対を形成できる配列を含む。本明細書で使用される場合、用語「相補的な」は、配列がその相補鎖の全長にわたり相補的である必要はなく、別の配列の一部に相補的な配列を包含する。したがって、一部の実施形態では、相補的配列は、配列の全長にわたって又はその一部にわたって(例えば、配列の長さの約5%、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、又は約95%よりも多く)相補的である配列を包含する。例えば、2つの配列は、約2~約100の連続する(切れ目のない)ヌクレオチド、又は2から100までの任意の整数に及ぶ長さにわたって互いに相補的であることが可能である。一部の実施形態では、2つの配列は、約15~約30の連続する(切れ目のない)ヌクレオチド、又は15から30までの任意の整数に及ぶ長さにわたって互いに相補的であることが可能である。本明細書で使用される場合、相補的配列は、いくつかの配列ミスマッチを有する配列を包含することができる。例えば、相補的配列は、配列の長さの少なくとも約70%~100%、好ましくは、約95%よりも多く相補的である配列を含むことができる。ある程度のミスマッチにもかかわらず、相補的配列は、一般に、例えば、本明細書に記載されている又は当業者であれば一般に知っている条件などの厳密な及び高度に厳密な条件などの適切な条件下で互いに選択的にハイブリダイズする能力を有する。
SC及びcSA DNAが公知の方法により合成してよい。例えば、SC及びcSA DNAは、ホスホラミダイト法、リン酸トリエステル法、H-ホスホネート法又はチオホスホン酸エステル法を使用する合成することができる。一部の実施形態では、SC及び/又はcSA DNAは、例えば、イオン交換HPLCを使用して精製することができる。
SC及びcSA DNAは、当技術分野で一般に知られているなどの化学修飾(脱塩基基の組込みに加えて)を含んでよい。一部の実施形態では、例えば、SC及びcSA DNAは、化学修飾ヌクレオチド(例えば、2’-O-メチル誘導体、ホスホロチオエート、等)、3’末端修飾、5’末端修飾又はその任意の組合せを含むことができる。一部の実施形態では、SC及びcSA DNAの3’末端は、伸長反応がSC又はcSA DNAの3’末端(例えば、標的配列又は別の非標的配列に結合すると、ポリメラーゼ伸長のためのプライマーとしての働きをする可能性がある)から起こらないように修飾しうる。図2Aに図解されるように、DNA複製を開始するのは、SC DNAではなく、標的核酸(T)の3’末端である。SC又はcSA DNAの3’末端から開始されるいかなる複製も検出誤り(例えば、偽陽性)を生じることがある。さらに、例えば、SC DNAと非標的配列の間の結合、SC DNAと標的配列の間の不正確な位置での結合、SCとcSA DNAの間の結合、又は非鋳型新規若しくは最初からの合成などの事象から生じるSC DNAの非修飾3’末端からの非特異的伸長反応も検出誤りを生じることがある。したがって、一実施形態では、SC及びcSA DNAは、上で考察された伸長反応などのいずれかの望ましくない伸長反応の発生を減らす又は取り除くことができる3’末端修飾を含む。3’末端修飾の非限定的例は、TAMRA、DABCYL及びFAMを含む。修飾の他の非限定的例は、例えば、ビオチン化、フルオロクロム化、リン酸化、チオール化、アミノ化、反転ヌクレオチド、又は脱塩基基を含む。
SC及びcSA DNAは、当技術分野で一般に知られているなどの化学修飾(脱塩基基の組込みに加えて)を含んでよい。一部の実施形態では、例えば、SC及びcSA DNAは、化学修飾ヌクレオチド(例えば、2’-O-メチル誘導体、ホスホロチオエート、等)、3’末端修飾、5’末端修飾又はその任意の組合せを含むことができる。一部の実施形態では、SC及びcSA DNAの3’末端は、伸長反応がSC又はcSA DNAの3’末端(例えば、標的配列又は別の非標的配列に結合すると、ポリメラーゼ伸長のためのプライマーとしての働きをする可能性がある)から起こらないように修飾しうる。図2Aに図解されるように、DNA複製を開始するのは、SC DNAではなく、標的核酸(T)の3’末端である。SC又はcSA DNAの3’末端から開始されるいかなる複製も検出誤り(例えば、偽陽性)を生じることがある。さらに、例えば、SC DNAと非標的配列の間の結合、SC DNAと標的配列の間の不正確な位置での結合、SCとcSA DNAの間の結合、又は非鋳型新規若しくは最初からの合成などの事象から生じるSC DNAの非修飾3’末端からの非特異的伸長反応も検出誤りを生じることがある。したがって、一実施形態では、SC及びcSA DNAは、上で考察された伸長反応などのいずれかの望ましくない伸長反応の発生を減らす又は取り除くことができる3’末端修飾を含む。3’末端修飾の非限定的例は、TAMRA、DABCYL及びFAMを含む。修飾の他の非限定的例は、例えば、ビオチン化、フルオロクロム化、リン酸化、チオール化、アミノ化、反転ヌクレオチド、又は脱塩基基を含む。
別の態様では、本発明は、試料中の標的核酸(T)を検出するための方法を包含する。本方法は、一般に前記試料を、5’から3’方向に、第1のシグナルDNA生成配列(A)と、エンドヌクレアーゼ認識部位(B)と、少なくとも1つの脱塩基部分、シグナルDNA生成配列(A)の少なくとも一部に相補的である第1の相補的配列(C)及びその中に組み込まれた少なくとも1つの脱塩基部位を有し標的核酸の3’末端に相補的である第2の相補的配列(D)を含む相補的配列とを含み、第1のシグナルDNA生成配列(A)の少なくとも一部とシグナルDNA生成配列(A)に相補的である配列(C)がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、第1のオリゴヌクレオチド(配列変換DNA又はSC DNA);5’から3’方向に、第2の特有のシグナルDNA生成配列(E)と、エンドヌクレアーゼ認識部位(F)と、シグナルDNA生成配列(E)の少なくとも一部に相補的である配列(G)及び第1のSC DNAオリゴヌクレオチドの第1のシグナルDNA生成配列(A)に相同である配列(H)を含む配列領域とを含み、配列(H)が任意選択的にその中に組み込まれた少なくとも1つの脱塩基部位を有し、第2のシグナルDNA生成配列(E)の少なくとも一部とシグナルDNA生成配列(E)に相補的な配列(G)がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、第2のオリゴヌクレオチド(カスケードシグナル増幅DNA1又はcSA DNA1);5’から3’方向に、第3の特有のシグナルDNA生成配列(I)と、エンドヌクレアーゼ認識部位(J)と、シグナルDNA生成配列(I)の少なくとも一部に相補的である配列(K)及び第2のオリゴヌクレオチドcSC DNA1の第2のシグナルDNA生成配列(E)に相同である配列(L)を含む配列領域とを含み、配列(L)が任意選択的にその中に組み込まれた少なくとも1つの脱塩基部位を有し、第3のシグナルDNA生成配列(I)の少なくとも一部とシグナルDNA生成配列(I)に相補的な配列(K)がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、第3のオリゴヌクレオチド(カスケードシグナル増幅DNA2又はcSA DNA2);ポリメラーゼ、並びにニッキング反応のための少なくとも1つのエンドヌクレアーゼと接触させることを含む。この態様の実施形態では、本方法は、シグナルDNAの存在又は非存在を判定し、シグナルDNAの存在が試料中の標的核酸の存在を示すことも含む。
本方法は、試料をエンドヌクレアーゼと接触させることを含む。エンドヌクレアーゼは、SC DNA内のエンドヌクレアーゼ認識部位(B)に相補的な配列、第1のcSA DNA1内のエンドヌクレアーゼ認識部位(F)に相補的な配列、及び第2のcSA DNA2内のエンドヌクレアーゼ認識部位(J)に相補的な配列に切れ目を入れることができる又は切れ目を入れるのに使用することができるニッキングエンドヌクレアーゼ又は制限エンドヌクレアーゼでもよい。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、二本鎖DNAニッキング反応を触媒できる又は触媒するのに使用できるニッキングエンドヌクレアーゼ又は制限エンドヌクレアーゼを含む。ニッキングエンドヌクレアーゼを提供する実施形態では、二本鎖DNAの1つの鎖のリン酸ジエステル結合を切断して、切断部位の5’側にリン酸基を3’側にヒドロキシル基を生成してよい。ニッキングエンドヌクレアーゼの非限定的例は、Nb.BbvCI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nb.BsrDI、Nb.Btsl、Nt.BspQI、Nt.BstNBI、Nb.BsmI、Nt.CviPII及びNt.BsmAIを含む。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは制限エンドヌクレアーゼでよい。これらの実施形態では、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を、制限エンドヌクレアーゼが二本鎖DNAの1つの鎖だけでリン酸ジエステル結合を切断し、二本鎖に切れ目を生み出すように修飾してよい。方法又は戦略を使用して、例えば、制限酵素により切断されない二本鎖核酸のうちの少なくとも1つの鎖での化学修飾を含むなどの、制限エンドヌクレアーゼの活性を改変してよい。そのような修飾の1つの非限定的例は、1つの鎖のリン酸ジエステル結合の酸素原子を硫黄原子で置き換えることを含む。
制限エンドヌクレアーゼを提供する実施形態では、二本鎖DNAの1つの鎖のリン酸ジエステル結合を切断して、切断部位の5’側にリン酸基を3’側にヒドロキシル基を生成してよい。制限エンドヌクレアーゼの非限定的例は、Hinc II、Hind II、Ava I、Fnu4HI、Tth111I及びNciIを含む。
本方法は、試料をポリメラーゼと接触させることを含む。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼでよい。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、5’-3’エキソヌクレアーゼ活性を欠く、3’-5’エキソヌクレアーゼ活性を欠く、5’-3’と3’-5’エキソヌクレアーゼ活性の両方を欠くポリメラーゼでよい。ポリメラーゼは、起源が真核生物、原核生物、又はウイルスでもよく、遺伝子改変することもできる。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、環境(例えば、室内)温度を含む、低いほうの温度で機能するポリメラーゼの間から選択される。DNAポリメラーゼの非限定的例は、クレノウ断片、大腸菌由来のDNAポリメラーゼI、バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)由来の5’-3’エキソヌクレアーゼ欠損Bst DNAポリメラーゼ、及びバチルス・カルドテナックス(Bacillus caldotenax)由来の5’-3’エキソヌクレアーゼ欠損Bca DNAポリメラーゼを含む。
本明細書で開示される方法の1つの非限定的実施形態は、図2A、2B及び2Cに図解されている。手短に言えば、図2Aに図解されるように、試料を、DNAポリメラーゼ及びエンドヌクレアーゼ認識部位(B)の二本鎖形態(すなわち、相補的配列)又はエンドヌクレアーゼ認識部位(B)の二本鎖形態(すなわち、相補的配列)に隣接する部位に切れ目を入れることができるエンドヌクレアーゼの存在下でSC DNAと接触させる。標的核酸(T)が試料中に存在する場合、標的核酸(T)の3’末端配列はSC DNAの配列(D)(標的に相補的であり少なくとも1つの脱塩基部位を有する)にハイブリダイズして、複製(反応混合物中に存在するDNAポリメラーゼによる)をプライミングする又は開始し、それにより二本鎖エンドヌクレアーゼ認識部位(B)を含む二本鎖伸長配列(X)を生成する。新たに生成された二本鎖エンドヌクレアーゼ認識部位(B)の認識(反応混合物中に存在するエンドヌクレアーゼによる)、及びそれに続く新たに生成された鎖のニッキング(反応混合物中に存在するエンドヌクレアーゼによる)により、第1のオリゴヌクレオチドシグナルDNA1(S1)及び伸長配列(X’)が生成される。ニックでの配列(X’)の3’-OHは鎖置換複製のその後のラウンドに対する開始部位としての働きをするので、オリゴヌクレオチド(S1)は、反応混合物においてシグナルDNA1(S1)を複製し増幅し続けるDNAポリメラーゼによりSC DNAから置換される。
図2Bでさらに図解されるように、標的(T)核酸とSC DNAの相互作用により生成される第1のシグナルDNA(S1)は、第1のカスケードシグナル増幅DNA1(又はcSA DNA1)の存在により第2のシグナルDNA2(S2)に変換することができる。手短に言えば、反応中に存在する第1のシグナルDNA1(S1)は、第1のcSA DNA1の配列(H)(シグナルDNA S1に相補的であり、任意選択的に少なくとも1つの脱塩基部位を有する)にハイブリダイズして、複製(反応混合物中に存在するDNAポリメラーゼによる)をプライミングする又は開始し、それにより二本鎖エンドヌクレアーゼ認識部位(F)を含む二本鎖伸長配列(Y)を生成する。新たに生成された二本鎖エンドヌクレアーゼ認識部位(F)の認識(反応混合物中に存在するエンドヌクレアーゼによる)、及びそれに続く新たに生成された鎖のニッキング(反応混合物中に存在するエンドヌクレアーゼによる)により、異なるオリゴヌクレオチドシグナル配列(S2)及び伸長配列(Y’)が生成される。ニックでの配列(Y’)の3’-OHは鎖置換複製のその後のラウンドに対する開始部位としての働きをするので、オリゴヌクレオチド(S2)は、反応混合物において第2の特有のシグナルDNA2(S2)を複製し増幅し続けるDNAポリメラーゼによりcSA DNA1から置換される。
図2Cでさらに図解されるように、第1のシグナルDNA(S1)と第1のカスケードSA DNA(cSA DNA1)の相互作用により生成される第2のシグナルDNA(S2)は、第2のカスケードシグナル増幅DNA2(又はcSA DNA2)の存在により第3のシグナルDNA3(S3)に変換することができる。手短に言えば、反応中に存在する第2のシグナルDNA2(S2)は、第2のcSA DNA2の配列(L)(シグナルDNA S2に相補的であり、任意選択的に少なくとも1つの脱塩基部位を有する)にハイブリダイズして、複製(反応混合物中に存在するDNAポリメラーゼによる)をプライミングする又は開始し、それにより二本鎖エンドヌクレアーゼ認識部位(J)を含む二本鎖伸長配列(U)を生成する。新たに生成された二本鎖エンドヌクレアーゼ認識部位(J)の認識(反応混合物中に存在するエンドヌクレアーゼによる)、及びそれに続く新たに生成された鎖のニッキング(反応混合物中に存在するエンドヌクレアーゼによる)により、異なるオリゴヌクレオチドシグナル配列(S3)及び伸長配列(U’)が生成される。ニックでの配列(U’)の3’-OHは鎖置換複製のその後のラウンドに対する開始部位としての働きをするので、オリゴヌクレオチド(S3)は、反応混合物において第3の特有のシグナルDNA3(S3)を複製し増幅し続けるDNAポリメラーゼによりcSA DNA2から置換される。
一部の実施形態では、シグナルDNA(S2)/標的DNA比は、約100~約1000、約100~約800、約100~約600、約100~約400、又は約100~約200である。他の実施形態では、シグナルDNA(S3)/標的DNA比は、約1000~約10000、約1000~約8000、約1000~約6000、約1000~約4000、又は約1000~約2000である。
本発明に従った方法は、等温又は実質的に一定の温度条件下で実施してもよい。実質的に一定の温度条件下で方法を実施することに関する実施形態では、温度のある程度の変動は許される。例えば、一部の実施形態では、実質的に一定の温度は、所望の又は特定された標的温度範囲(例えば、約+/-2℃又は約+/-5℃)内で変動してよい。一部の実施形態では、実質的に一定の温度は、熱サイクルを含まない温度を含んでよい。一部の実施形態では、本方法は、例えば、(1)SC DNAの配列(D)への標的核酸(T)のおおよその計算された/予測された又は実験的に決定された最適ハイブリダイゼーション若しくはアニーリング温度の若しくはそれよりも下の温度;(2)SC DNAに結合している標的核酸(T)の融解温度の若しくはそれよりも下の温度(典型的には、ハイブリダイゼーション又はアニーリング温度は融解温度よりもわずかに下である);(3)cSA DNAに結合しているシグナルDNA(S)の融解温度の若しくはそれよりも下の温度;又は(4)反応混合物中に存在するポリメラーゼ及び/若しくはエンドヌクレアーゼについてのおおよその計算された/予測された若しくは実験的に決定された最適反応温度の若しくはそれよりも下の温度などの等温又は実質的に一定の温度で実施することができる。
本方法は、約20℃~約70℃に及ぶ反応温度を含んでよく、約20℃~約42℃の範囲内に収まるもっと低い温度も含む。一部の実施形態では、反応温度範囲は、35℃~40℃(例えば、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、又は40℃)である。他の実施形態では、反応温度は65℃よりも下であり、約55℃、約50℃、約45℃、約40℃、又は約30℃より下のもっと低い温度も含む。さらに他の実施形態では、反応温度は、約20℃、約21℃、約22℃、約23℃、約24℃、約25℃、約26℃、約27℃、約28℃、約29℃、約30℃、約31℃、約32℃、約33℃、約34℃、約35℃、約36℃、約37℃、約38℃、約39℃、約40℃、約41℃、約42℃、約43℃、約44℃、約45℃、約46℃、約47℃、約48℃、約49℃、約50℃、約51℃、約52℃、約53℃、約54℃、約55℃、約56℃、約57℃、約58℃、約59℃、約60℃、約61℃、約62℃、約63℃、約64℃、約65℃、約66℃、約67℃、約68℃、約69℃、又は約70℃でもよい。
本方法は、標的核酸の存在下で検出可能量のシグナル配列の増幅を可能にするのに十分である時間実施してよい。一部の実施形態では、反応時間は約5分~16時間、又は約3分~16時間に及んでよい。さらに他の実施形態では、反応時間は、約5~120分、又は約15~60分に及んでよい。
種々のシグナルDNA(S1)、(S2)及び(S3)は標的核酸(T)の存在下だけで生成されるために、本発明に従った方法は、いずれか1つのシグナルDNAの存在又は非存在を検出することにより試料中の標的核酸(T)の存在又は非存在を検出する。シグナルDNA(S1)、(S2)及び(S3)は異なっており、配列によって制限されず、検出を受け入れられるいかなる配列も可能である。シグナルDNA(S1)、(S2)及び(S3)は長さによっても制限されない。好ましくは、シグナルDNA(S1)、(S2)及び(S3)は、約5~約100塩基、5から100の間のいかなる整数でも可能である。一部の実施形態では、シグナルDNA(S1)、(S2)及び(S3)は、約5~約30核酸塩基、5から30の間のすべての整数が可能である。一部の実施形態では、シグナルDNA(S1)、(S2)及び(S3)は、約10~約30塩基長、10から30の間のすべての整数が可能である。さらに一部の実施形態では、シグナルDNA(S1)、(S2)及び(S3)は、約15~約30塩基長、15から30の間のすべての整数が可能である。
本開示に従った方法は、約4~約10、又は約7~約9のpH範囲を含むバッファー条件下で実施してよい。バッファーは、約10mM~約500mM、又は約50mM~150mMの塩濃度を含んでよい。一部の実施形態では、本方法は、標的核酸の存在下で検出可能な量のシグナル配列の増幅を可能にするSC及び/又はcSA DNAの量を使用して実施してよい。一部の実施形態では、SC及び/又はcSA DNA濃度は、約100pM~約100μM、約1nM~約150nM、約5nM~約50nM、又は約5nM~約25nMに及んでよい。
さらなる実施形態では、本明細書で開示されるいかなる方法、オリゴヌクレオチド、組成物、及び/又はキットも、本明細書で開示される方法に従って標的核酸の存在又は非存在について試験されている生体試料からの核酸の非特異的増幅の予防又は減少のためにカオトロピック剤と組み合わせて使用してよい。本明細書で開示されるオリゴヌクレオチド、組成物、及びキットのうちの1つ以上と組み合わせて使用できるカオトロピック剤は、限定せずに、尿素、ホルムアミド、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、過塩素酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、又はその組合せを含む。
いずれか1つのシグナルDNA(S1)、(S2)及び/又は(S3)の存在は、当技術分野で公知のいかなる方法によっても検出できる。例えば、ゲル電気泳動及び臭化エチジウムでの染色を使用することができる。その上、いずれか1つのシグナルDNA(S1)、(S2)及び/又は(S3)の存在は、蛍光偏光、免疫アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動、酵素標識(例えば、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ)、蛍光標識(例えば、フルオレセイン又はローダミン)、化学発光、生物発光、表面プラズモン共鳴(SPR)、又はフルオロフォア修飾プローブDNA(例えば、TaqManプローブ)を使用して検出できる。増幅産物も、例えば、ビオチンで標識された標識ヌクレオチドを使用することにより検出できる。そのような場合、増幅産物中のビオチンは、例えば、蛍光標識アビジン又は酵素標識アビジンを使用して検出できる。増幅産物は、当業者に公知であるレドックス干渉物質を使用することにより電極を用いて検出することもできる。増幅産物は、表面プラズモン共鳴(SPR)、水晶振動子マイクロバランス(QCM)、又は電気化学的方法(ナノポアセンサーを用いる方法を含む)を使用して検出することもできる。
本発明に従った方法は、試料中で標的核酸(T)の存在又は非存在を検出する。本発明に従った方法を使用すれば、試験試料中の標的核酸の濃度を定量的に測定することもできる。例えば、本開示に従った方法は、異なる既知の濃度の範囲の標的核酸の存在下で実施することができ、検量線を当技術分野で一般的に実行されているように準備し使用することができる。
図2Aの標的核酸(T)は、いかなる核酸配列でも含むことができ、DNA、RNA、化学修飾された核酸、非天然核酸、核酸類似体、又はその任意のハイブリッド若しくは組合せを含むことができる。したがって、一部の実施形態では、DNAはcDNA、ゲノムDNA及び合成DNAを含んでよく、RNAは全RNA、mRNA、rRNA、siRNA、hnRNA、piRNA、aRNA、miRNA及び合成RNAを含んでよい。一部の実施形態は特定の標的核酸配列に関するが、補助核酸配列を含むいかなる核酸配列も、検出される標的核酸配列であることが可能である。本開示は、核酸が短鎖核酸である場合でも、標的核酸の検出に選択性及び感度のよさを提供する。したがって、SC DNAの配列(D)と標的核酸(T)の間の相補性の程度は、配列間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする(例えば、配列変換DNAの配列(D)と標的配列(T)配列の相補的ヌクレオチドの数は所与のセットの反応条件下での非特異的ハイブリダイゼーションを回避する)。
一実施形態では、標的核酸配列は、例えば、ゲノムDNA、発現されたmRNA、病原体(微生物、ウイルス)由来の核酸配列、又は治療核酸を含むいかなる数の供給源由来である、又はそれから導かれることが可能である。したがって、本明細書で開示されるSC及びcSA DNA並びに方法を、疾患(例えば、遺伝源及び感染源から生じる)の診断及び予後、汚染菌の同定(例えば、食物媒介病及び器材汚染)、個別化医療(例えば、治療法のモニタリング及び/又は予後)及び同類のもののために使用しうる。例えば、分子診断検査を、以下の感染性疾患:B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎(HCV)、HCV(遺伝子型1~6)、ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)、クラミジア・トラコマチス、淋菌、インフルエンザA型、インフルエンザB型、呼吸器多核体ウイルス(RSV)及びパルボウイルスに関して実施してよい。
一部の実施形態では、標的核酸はマイクロRNA(miRNA)を含むことができる。マイクロRNAは、約22ヌクレオチドの低分子非コードRNA分子を含む。マイクロRNAは、遺伝子発現の転写及び翻訳後調節において機能することが知られている。マイクロRNAは、メッセンジャーRNA(mRNA)の相補的領域と塩基対合することにより機能し、翻訳抑制又は標的分解を介して遺伝子サイレンシングを生じることが知られている。
標的核酸を含むことがあるいかなるタイプに試料でも、本明細書で開示される方法で使用してよい。したがって、標的核酸を含有する又は含有すると疑われる試料は特に限定されず、例えば、全血、血清、バフィーコート、尿、排泄物、脳脊髄液、精液、唾液、組織(例えば、がん組織又はリンパ節)、細胞培養物(例えば、哺乳動物細胞培養物又は細菌培養物)などの生きた対象由来の生体試料;ウイロイド、ウイルス、細菌、真菌、酵母、植物及び動物などの核酸を含有する試料;ウイルス又は細菌などの微生物を含有する又はこれに感染している可能性がある試料(例えば、食物及び生物学的製剤);並びに土壌、産業プロセス及び製造設備、及び廃水などの生物物質を含有することがある試料、及び種々の水源(例えば、飲料水)に由来する試料を含む。さらに、本明細書で開示される方法において使用される核酸含有組成物を調製するため試料はいかなる公知の方法により加工してもよい。そのような調製物の例は、細胞破砕物(例えば、細胞ライセート及び抽出物)、試料分画、試料中の核酸及びmRNA濃縮試料などの特定の核酸分子群を含むことができる。本発明の標的核酸を検出するための方法において使用される試料は、上で言及される生物由来物質及び天然の産物に由来する試料に限定されず、合成オリゴヌクレオチドを含有する試料でもよい。
本発明に従った方法は、Abbott m2000sp試料調製システムと組み合わせて実施することができる。m2000spは磁気粒子技術を使用して核酸を捕獲し、粒子を洗浄して非結合試料成分を取り除く。結合した核酸は溶出され96ディープウェルプレートに移される。Abbott m2000spは、96ディープウェルプレートに移された洗浄核酸と、本技術に従った方法を実施するのに必要ないかなる試薬を組み合わせることもできる。例えば、SC及びcSA DNA、ポリメラーゼ、分子ビーコン、並びに他の試薬(例えば、dNTP)を必要に応じて、又は希望通りに添加することができる。
本発明に従った方法は、ポイントオブケアプラットホームと結びつけることもできる。例えば、成長するDNA鎖中へのデオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)の組み込みは、共有結合の形成及びピロリン酸の放出及び反応のpHに影響を及ぼす正電荷水素イオンを必要とする。したがって、本発明の方法に従ったシグナルDNAの合成は、例えば、ポイントオブケアマイクロpHメーターを使用してpHの変化を追跡することにより検出できる。例えば、Abbott’s i-STATポイントオブケアシステムは、マイクロ組立てセンサー、キャリブレーション溶液、流体系、及びpHの分析用の廃棄物室を含有する使い捨てカートリッジと一緒に供給することができる。
本発明に従った方法は、ポイントオブケアプラットホームと結びつけることもできる。例えば、成長するDNA鎖中へのデオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)の組み込みは、共有結合の形成及びピロリン酸の放出及び反応のpHに影響を及ぼす正電荷水素イオンを必要とする。したがって、本発明の方法に従ったシグナルDNAの合成は、例えば、ポイントオブケアマイクロpHメーターを使用してpHの変化を追跡することにより検出できる。例えば、Abbott’s i-STATポイントオブケアシステムは、マイクロ組立てセンサー、キャリブレーション溶液、流体系、及びpHの分析用の廃棄物室を含有する使い捨てカートリッジと一緒に供給することができる。
本明細書で開示される方法は、追加の試薬を含むことができる。核酸増幅反応で使用できる他の試薬の一部の非限定的例は、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム及び硫酸マグネシウムなどの金属塩;dNTP混合物などの基質;並びにトリス-HClバッファー、トリシンバッファー、リン酸ナトリウムバッファー及びリン酸カリウムバッファーなどのバッファー溶液を含む。同様に、洗浄剤、オキシダント及び還元剤も本明細書で開示される方法の実行において使用できる。さらに、ジメチルスルホキシド及びベタイン(N,N,N-トリメチルグリシン);国際公開第99/54455号に記載される酸性物質;並びに陽イオン複合体などの試薬を使用可能である。
本明細書で提供される方法及び核酸構造物は、標的核酸の存在下でシグナルDNAの指数関数的増幅を提供するために他の方法と組み合わせて使用しうる。例えば、本開示に従った方法及び組成物は、「カバード配列変換DNA及び検出方法」と題した米国特許出願第14/597,981号に記載されるカバード配列変換DNAと組み合わせて使用してよく、前記特許文献は参照により本明細書に組み込む。本開示に従った方法及び組成物は、「ロックド核酸を有する配列変換及びシグナル増幅DNA並びにそれを使用する検出方法」と題した米国特許出願第14/882,124号に記載される化学修飾された配列変換及びシグナル増幅DNAと組み合わせて使用してもよく、前記特許文献は参照により本明細書に組み込む。本開示に従った方法及び組成物は、「ポリDNAスペーサー配列を有する配列変換及びシグナル増幅DNA並びにそれを使用する検出方法」と題した米国特許出願第14/882,109号に記載されるポリDNAスペーサー配列変換及びシグナル増幅DNAと組み合わせて使用してもよく、前記特許文献は参照により本明細書に組み込む。本開示に従った方法及び組成物は、「配列変換及びシグナル増幅DNAカスケード反応並びにそれを使用する検出方法」と題した米国特許出願第14/998,162号に記載される方法及び組成物と組み合わせて使用してもよく、前記特許文献は参照により本明細書に組み込む。
用語「約(about)」とは一般に、当業者であれば、列挙された値に等しい(すなわち、同じ機能又は結果を有する)と見なすと考えられる数の範囲のことである。用語「約」は、本明細書で使用される場合、参照値よりもおおよそ10~20%大きい又は小さい値を含む範囲を指すことが意図されている。ある特定の状況では、当業者であれば、参照値の性質のせいで、用語「約」は、その値から10~20%よりも多い又は少ない偏差を意味することができる。
次の実施例は、上記の態様及び実施形態を例証することが意図されている。上記開示も下記実施例も、添付の特許請求の範囲を限定するものと見なされるべきではない。当業者であれば、本開示が、本開示の種々の態様を記載し例証するために使用される特定の用語法により限定されないことを理解する。
[実施例1]
一組の反応は、配列5’-TCTTGCGTAT CTTCTCCACC TCAGCGCAAG ATCAACATCA GTCTGATAAG CTA-idT-idT-3’(配列番号1)を有するSC DNA1又は5’末端から位置38及び39にdSpacer脱塩基人工核酸(「α」)を有する配列5’-TCTTGCGTAT CTTCTCCACC TCAGCGCAAG ATCAACAααA GTCTGATAAG CTA-idT-idT-3’(配列番号2)を有するSC DNA2を使用して本開示に従って実施した。SC DNAは反応中に1.4nMで存在していた。10の異なる正常血清試料(すなわち、標的核酸を欠く10の血清試料)を非特異的バックグラウンドシグナル増幅の存在について試験した。
一組の反応は、配列5’-TCTTGCGTAT CTTCTCCACC TCAGCGCAAG ATCAACATCA GTCTGATAAG CTA-idT-idT-3’(配列番号1)を有するSC DNA1又は5’末端から位置38及び39にdSpacer脱塩基人工核酸(「α」)を有する配列5’-TCTTGCGTAT CTTCTCCACC TCAGCGCAAG ATCAACAααA GTCTGATAAG CTA-idT-idT-3’(配列番号2)を有するSC DNA2を使用して本開示に従って実施した。SC DNAは反応中に1.4nMで存在していた。10の異なる正常血清試料(すなわち、標的核酸を欠く10の血清試料)を非特異的バックグラウンドシグナル増幅の存在について試験した。
別の一組の反応を上で詳細に述べた同じSC DNA1及びSC DNA2を使用して本開示に従って実施した。SC DNAは反応中に1.4nMで存在していた。反応は、0、100、又は1000fMのモデルRNA標的核酸(すなわち、マイクロRNA-21に相当する配列を有するRNA)の存在下で実施した。
反応は、50mMの酢酸カリウム、20mMの酢酸トリス、7.5mMの酢酸マグネシウム、0.1mg/mLのBSA、1mMのDTT(pH7.9)を有するCutSmartバッファー、0.02U/μLで存在するDNAポリメラーゼBstラージ断片(L.F.)、及び0.025U/μLで存在するニッキングエンドヌクレアーゼNb.BbvClを含有する120μLの反応溶液中37℃で実施した。総増幅時間は25分間であった。生成されたシグナルDNAは、ARCHITECTを使用する化学発光測定により検出した。
実施例1のそれぞれの反応組の結果は、それぞれ図3A(血清)及び3B(添加された標的miRNA)に示されている。
[実施例2]
別の組の反応は、以下のSC DNA:配列5’-TCTTGCGTAT CTTCTCCACC TCAGCGCAAG ATCAACATCA GTCTGATAAG CTA-idT-idT-3’(配列番号1)を有するSC DNA1、5’末端から位置38及び39にdSpacer脱塩基人工核酸(「α」)を有する配列5’-TCTTGCGTAT CTTCTCCACC TCAGCGCAAG ATCAACAααA GTCTGATAAG CTA-idT-idT-3’(配列番号2)を有するSC DNA2、又は5’末端から位置38及び39にエチニルdSpacer脱塩基人工核酸(「β」)を有する配列5’-TCTTGCGTAT CTTCTCCACC TCAGCGCAAG ATCAACAββA GTCTGATAAG CTA-idT-idT-3’(配列番号3)を有するSC DNA3を使用して本開示に従って実施した。SC DNAは反応中に1.4nMで存在していた。10の異なる正常血清試料(商業的供給源から購入した)を非特異的バックグラウンドシグナル増幅の存在について試験した(すなわち、標的核酸を欠く10の血清試料)。
別の組の反応は、以下のSC DNA:配列5’-TCTTGCGTAT CTTCTCCACC TCAGCGCAAG ATCAACATCA GTCTGATAAG CTA-idT-idT-3’(配列番号1)を有するSC DNA1、5’末端から位置38及び39にdSpacer脱塩基人工核酸(「α」)を有する配列5’-TCTTGCGTAT CTTCTCCACC TCAGCGCAAG ATCAACAααA GTCTGATAAG CTA-idT-idT-3’(配列番号2)を有するSC DNA2、又は5’末端から位置38及び39にエチニルdSpacer脱塩基人工核酸(「β」)を有する配列5’-TCTTGCGTAT CTTCTCCACC TCAGCGCAAG ATCAACAββA GTCTGATAAG CTA-idT-idT-3’(配列番号3)を有するSC DNA3を使用して本開示に従って実施した。SC DNAは反応中に1.4nMで存在していた。10の異なる正常血清試料(商業的供給源から購入した)を非特異的バックグラウンドシグナル増幅の存在について試験した(すなわち、標的核酸を欠く10の血清試料)。
反応は、50mMの酢酸カリウム、20mMの酢酸トリス、7.5mMの酢酸マグネシウム、0.1mg/mLのBSA、1mMのDTT(pH7.9)を有するCutSmartバッファー、0.02U/μLで存在するDNAポリメラーゼBstL.F.、及び0.025U/μLで存在するニッキングエンドヌクレアーゼNb.BbvClを含有する120μLの反応溶液中37℃で実施した。総増幅時間は25分間であった。生成されたシグナルDNAは、ARCHITECTを使用する化学発光測定により検出した。
実施例2の結果は図4に図解されている。
[実施例3]
別の組の反応は、SC DNA1(配列番号1)、SC DNA2(配列番号2)又はSC DNA3(配列番号3)を使用して本開示に従って実施した。SC DNAは反応中に1.4nMで存在していた。反応は、0、10、100、又は1000fMのモデルDNA標的核酸(すなわち、マイクロRNA-21に相当する配列を有するDNA)の存在下で実施した。
別の組の反応は、SC DNA1(配列番号1)、SC DNA2(配列番号2)又はSC DNA3(配列番号3)を使用して本開示に従って実施した。SC DNAは反応中に1.4nMで存在していた。反応は、0、10、100、又は1000fMのモデルDNA標的核酸(すなわち、マイクロRNA-21に相当する配列を有するDNA)の存在下で実施した。
反応は、50mMの酢酸カリウム、20mMの酢酸トリス、7.5mMの酢酸マグネシウム、0.1mg/mLのBSA、1mMのDTT(pH7.9)を有するCutSmartバッファー、0.02U/μLで存在するDNAポリメラーゼBstL.F.、及び0.025U/μLで存在するニッキングエンドヌクレアーゼNb.BbvClを含有する120μLの反応溶液中37℃で実施した。総増幅時間は25分間であった。生成されたシグナルDNAは、ARCHITECTを使用する化学発光測定により検出した。
実施例3の結果は図5に図解されている。
[実施例4]
別の組の反応は、SC DNA1(配列番号1)、SC DNA2(配列番号2)又はSC DNA3(配列番号3)を使用して本開示に従って実施した。SC DNAは反応中に1.4nMで存在していた。反応は、0、10、100、又は1000fMのマイクロRNA-21標的核酸(すなわち、RNA標的核酸)の存在下で実施した。
反応は、50mMの酢酸カリウム、20mMの酢酸トリス、7.5mMの酢酸マグネシウム、0.1mg/mLのBSA、1mMのDTT(pH7.9)を有するCutSmartバッファー、0.02U/μLで存在するDNAポリメラーゼBstL.F.、及び0.025U/μLで存在するニッキングエンドヌクレアーゼNb.BbvClを含有する120μLの反応溶液中37℃で実施した。総増幅時間は25分間であった。生成されたシグナルDNAは、ARCHITECTを使用する化学発光測定により検出した。
別の組の反応は、SC DNA1(配列番号1)、SC DNA2(配列番号2)又はSC DNA3(配列番号3)を使用して本開示に従って実施した。SC DNAは反応中に1.4nMで存在していた。反応は、0、10、100、又は1000fMのマイクロRNA-21標的核酸(すなわち、RNA標的核酸)の存在下で実施した。
反応は、50mMの酢酸カリウム、20mMの酢酸トリス、7.5mMの酢酸マグネシウム、0.1mg/mLのBSA、1mMのDTT(pH7.9)を有するCutSmartバッファー、0.02U/μLで存在するDNAポリメラーゼBstL.F.、及び0.025U/μLで存在するニッキングエンドヌクレアーゼNb.BbvClを含有する120μLの反応溶液中37℃で実施した。総増幅時間は25分間であった。生成されたシグナルDNAは、ARCHITECTを使用する化学発光測定により検出した。
実施例4の結果は図6に図解されている。
[実施例5]
別の組の反応は、SC DNA1(配列番号1);SC DNA2(配列番号2);5’末端から38位にdSpacer脱塩基人工核酸(「α」)を有する配列5’-TCTTGCGTAT CTTCTCCACC TCAGCGCAAG ATCAACαCA GTCTGATAAG CTA-idT-idT-3’(配列番号4)を有するSC DNA4;5’末端から位置38、39及び40にdSpacer脱塩基人工核酸(「α」)を有する配列5’-TCTTGCGTAT CTTCTCCACC TCAGCGCAAG ATCAACAααα GTCTGATAAG CTA-idT-idT-3’(配列番号5)を有するSC DNA5;又は5’末端から位置38、39、40及び41にdSpacer脱塩基人工核酸(「α」)を有する5’-TCTTGCGTAT CTTCTCCACC TCAGCGCAAG ATCAACAααα αTCTGATAAG CTA-idT-idT-3’(配列番号6)を有するSC DNA6を使用して本開示に従って実施した。SC DNAは反応中に1.4nMで存在していた。10の異なる正常血清試料(すなわち、標的核酸を欠く10の血清試料)を非特異的バックグラウンドシグナル増幅の存在について試験した。
別の組の反応は、SC DNA1(配列番号1);SC DNA2(配列番号2);5’末端から38位にdSpacer脱塩基人工核酸(「α」)を有する配列5’-TCTTGCGTAT CTTCTCCACC TCAGCGCAAG ATCAACαCA GTCTGATAAG CTA-idT-idT-3’(配列番号4)を有するSC DNA4;5’末端から位置38、39及び40にdSpacer脱塩基人工核酸(「α」)を有する配列5’-TCTTGCGTAT CTTCTCCACC TCAGCGCAAG ATCAACAααα GTCTGATAAG CTA-idT-idT-3’(配列番号5)を有するSC DNA5;又は5’末端から位置38、39、40及び41にdSpacer脱塩基人工核酸(「α」)を有する5’-TCTTGCGTAT CTTCTCCACC TCAGCGCAAG ATCAACAααα αTCTGATAAG CTA-idT-idT-3’(配列番号6)を有するSC DNA6を使用して本開示に従って実施した。SC DNAは反応中に1.4nMで存在していた。10の異なる正常血清試料(すなわち、標的核酸を欠く10の血清試料)を非特異的バックグラウンドシグナル増幅の存在について試験した。
反応は、50mMの酢酸カリウム、20mMの酢酸トリス、7.5mMの酢酸マグネシウム、0.1mg/mLのBSA、1mMのDTT(pH7.9)を有するCutSmartバッファー、0.02U/μLで存在するDNAポリメラーゼBstL.F.、及び0.025U/μLで存在するニッキングエンドヌクレアーゼNb.BbvClを含有する120μLの反応溶液中37℃で実施した。総増幅時間は25分間であった。生成されたシグナルDNAは、ARCHITECTを使用する化学発光測定により検出した。
実施例5の結果は図7に図解されている。
[実施例6]
別の組の反応は、SC DNA1(配列番号1);SC DNA2(配列番号2)、SC DNA4(配列番号4)、SC DNA5(配列番号5)及びSC DNA6(配列番号6)を使用して本開示に従って実施した。SC DNAは反応中に1.4nMで存在していた。反応は、0、10、100、又は1000fMのモデルDNA標的核酸(すなわち、マイクロRNA-21に相当する配列を有するDNA)の存在下で実施した。
反応は、50mMの酢酸カリウム、20mMの酢酸トリス、7.5mMの酢酸マグネシウム、0.1mg/mLのBSA、1mMのDTT(pH7.9)を有するCutSmartバッファー、0.02U/μLで存在するDNAポリメラーゼBstL.F.、及び0.025U/μLで存在するニッキングエンドヌクレアーゼNb.BbvClを含有する120μLの反応溶液中37℃で実施した。総増幅時間は25分間であった。生成されたシグナルDNAは、ARCHITECTを使用する化学発光測定により検出した。
別の組の反応は、SC DNA1(配列番号1);SC DNA2(配列番号2)、SC DNA4(配列番号4)、SC DNA5(配列番号5)及びSC DNA6(配列番号6)を使用して本開示に従って実施した。SC DNAは反応中に1.4nMで存在していた。反応は、0、10、100、又は1000fMのモデルDNA標的核酸(すなわち、マイクロRNA-21に相当する配列を有するDNA)の存在下で実施した。
反応は、50mMの酢酸カリウム、20mMの酢酸トリス、7.5mMの酢酸マグネシウム、0.1mg/mLのBSA、1mMのDTT(pH7.9)を有するCutSmartバッファー、0.02U/μLで存在するDNAポリメラーゼBstL.F.、及び0.025U/μLで存在するニッキングエンドヌクレアーゼNb.BbvClを含有する120μLの反応溶液中37℃で実施した。総増幅時間は25分間であった。生成されたシグナルDNAは、ARCHITECTを使用する化学発光測定により検出した。
実施例6の結果は図8に図解されている。
[実施例7]
別の組の反応は、SC DNA1(配列番号1)、SC DNA2(配列番号2)、SC DNA4(配列番号4)、SC DNA5(配列番号5)及びSC DNA6(配列番号6)を使用して本開示に従って実施した。SC DNAは反応中に1.4nMで存在していた。反応は、0、10、100、又は1000fMのマイクロRNA-21標的核酸(すなわち、RNA標的配列)の存在下で実施した。
別の組の反応は、SC DNA1(配列番号1)、SC DNA2(配列番号2)、SC DNA4(配列番号4)、SC DNA5(配列番号5)及びSC DNA6(配列番号6)を使用して本開示に従って実施した。SC DNAは反応中に1.4nMで存在していた。反応は、0、10、100、又は1000fMのマイクロRNA-21標的核酸(すなわち、RNA標的配列)の存在下で実施した。
反応は、50mMの酢酸カリウム、20mMの酢酸トリス、7.5mMの酢酸マグネシウム、0.1mg/mLのBSA、1mMのDTT(pH7.9)を有するCutSmartバッファー、0.02U/μLで存在するDNAポリメラーゼBstL.F.、及び0.025U/μLで存在するニッキングエンドヌクレアーゼNb.BbvClを含有する120μLの反応溶液中37℃で実施した。総増幅時間は25分間であった。生成されたシグナルDNAは、ARCHITECTを使用する化学発光測定により検出した。
実施例7の結果は図9に図解されている。
[実施例8]
別の組の反応は、SC DNA1(配列番号1)、SC DNA2(配列番号2)、5’末端から位置40及び41にdSpacer脱塩基人工核酸(「α」)を有する配列5’-TCTTGCGTAT CTTCTCCACC TCAGCGCAAG ATCAACATCα αTCTGATAAG CTA-idT-idT-3’(配列番号7)を有するSC DNA7、5’末端から位置39及び40にdSpacer脱塩基人工核酸(「α」)を有する配列5’-TCTTGCGTAT CTTCTCCACC TCAGCGCAAG ATCAACATαα GTCTGATAAG CTA-idT-idT-3’(配列番号8)を有するSC DNA8、5’末端から位置37及び38にdSpacer脱塩基人工核酸(「α」)を有する配列5’-TCTTGCGTAT CTTCTCCACC TCAGCGCAAG ATCAACααCA GTCTGATAAG CTA-idT-idT-3’(配列番号9)を有するSC DNA9、5’末端から位置36及び37にdSpacer脱塩基人工核酸(「α」)を有する配列5’-TCTTGCGTAT CTTCTCCACC TCAGCGCAAG ATCAAααTCA GTCTGATAAG CTA-idT-idT-3’(配列番号10)を有するSC DNA10、並びに5’末端から位置35及び36にdSpacer脱塩基人工核酸(「α」)を有する配列5’-TCTTGCGTAT CTTCTCCACC TCAGCGCAAG ATCAααATCA GTCTGATAAG CTA-idT-idT-3’(配列番号11)を有するSC DNA11を使用して本開示に従って実施した。SC DNAは反応中に1.4nMで存在していた。10の異なる正常血清試料(すなわち、標的核酸を欠く10の血清試料)を非特異的バックグラウンドシグナル増幅の存在について試験した。
別の組の反応は、SC DNA1(配列番号1)、SC DNA2(配列番号2)、5’末端から位置40及び41にdSpacer脱塩基人工核酸(「α」)を有する配列5’-TCTTGCGTAT CTTCTCCACC TCAGCGCAAG ATCAACATCα αTCTGATAAG CTA-idT-idT-3’(配列番号7)を有するSC DNA7、5’末端から位置39及び40にdSpacer脱塩基人工核酸(「α」)を有する配列5’-TCTTGCGTAT CTTCTCCACC TCAGCGCAAG ATCAACATαα GTCTGATAAG CTA-idT-idT-3’(配列番号8)を有するSC DNA8、5’末端から位置37及び38にdSpacer脱塩基人工核酸(「α」)を有する配列5’-TCTTGCGTAT CTTCTCCACC TCAGCGCAAG ATCAACααCA GTCTGATAAG CTA-idT-idT-3’(配列番号9)を有するSC DNA9、5’末端から位置36及び37にdSpacer脱塩基人工核酸(「α」)を有する配列5’-TCTTGCGTAT CTTCTCCACC TCAGCGCAAG ATCAAααTCA GTCTGATAAG CTA-idT-idT-3’(配列番号10)を有するSC DNA10、並びに5’末端から位置35及び36にdSpacer脱塩基人工核酸(「α」)を有する配列5’-TCTTGCGTAT CTTCTCCACC TCAGCGCAAG ATCAααATCA GTCTGATAAG CTA-idT-idT-3’(配列番号11)を有するSC DNA11を使用して本開示に従って実施した。SC DNAは反応中に1.4nMで存在していた。10の異なる正常血清試料(すなわち、標的核酸を欠く10の血清試料)を非特異的バックグラウンドシグナル増幅の存在について試験した。
反応は、50mMの酢酸カリウム、20mMの酢酸トリス、7.5mMの酢酸マグネシウム、0.1mg/mLのBSA、1mMのDTT(pH7.9)を有するCutSmartバッファー、0.02U/μLで存在するDNAポリメラーゼBstL.F.、及び0.025U/μLで存在するニッキングエンドヌクレアーゼNb.BbvClを含有する120μLの反応溶液中37℃で実施した。総増幅時間は25分間であった。生成されたシグナルDNAは、ARCHITECTを使用する化学発光測定により検出した。
実施例8の結果は図10に図解されている。
[実施例9]
別の組の反応は、SC DNA1(配列番号1)、SC DNA2(配列番号2)、SC DNA7(配列番号7)、SC DNA8(配列番号8)、SC DNA9(配列番号9)、SC DNA10(配列番号10)及びSC DNA11(配列番号11)を使用して本開示に従って実施した。SC DNAは反応中に1.4nMで存在していた。反応は、0、10、100、又は1000fMのモデルDNA標的核酸(すなわち、マイクロRNA-21に相当する配列を有するDNA)の存在下で実施した。
別の組の反応は、SC DNA1(配列番号1)、SC DNA2(配列番号2)、SC DNA7(配列番号7)、SC DNA8(配列番号8)、SC DNA9(配列番号9)、SC DNA10(配列番号10)及びSC DNA11(配列番号11)を使用して本開示に従って実施した。SC DNAは反応中に1.4nMで存在していた。反応は、0、10、100、又は1000fMのモデルDNA標的核酸(すなわち、マイクロRNA-21に相当する配列を有するDNA)の存在下で実施した。
反応は、50mMの酢酸カリウム、20mMの酢酸トリス、7.5mMの酢酸マグネシウム、0.1mg/mLのBSA、1mMのDTT(pH7.9)を有するCutSmartバッファー、0.02U/μLで存在するDNAポリメラーゼBstL.F.、及び0.025U/μLで存在するニッキングエンドヌクレアーゼNb.BbvClを含有する120μLの反応溶液中37℃で実施した。総増幅時間は25分間であった。生成されたシグナルDNAは、ARCHITECTを使用する化学発光測定により検出した。
実施例9の結果は図11に図解されている。
[実施例10]
別の組の反応は、SC DNA1(配列番号1)、SC DNA2(配列番号2)、SC DNA7(配列番号7)、SC DNA8(配列番号8)、SC DNA9(配列番号9)、SC DNA10(配列番号10)及びSC DNA11(配列番号11)を使用して本開示に従って実施した。SC DNAは反応中に1.4nMで存在していた。反応は、0、10、100、又は1000fMのマイクロRNA-21標的核酸(すなわち、RNA標的核酸)の存在下で実施した。
別の組の反応は、SC DNA1(配列番号1)、SC DNA2(配列番号2)、SC DNA7(配列番号7)、SC DNA8(配列番号8)、SC DNA9(配列番号9)、SC DNA10(配列番号10)及びSC DNA11(配列番号11)を使用して本開示に従って実施した。SC DNAは反応中に1.4nMで存在していた。反応は、0、10、100、又は1000fMのマイクロRNA-21標的核酸(すなわち、RNA標的核酸)の存在下で実施した。
反応は、50mMの酢酸カリウム、20mMの酢酸トリス、7.5mMの酢酸マグネシウム、0.1mg/mLのBSA、1mMのDTT(pH7.9)を有するCutSmartバッファー、0.02U/μLで存在するDNAポリメラーゼBstL.F.、及び0.025U/μLで存在するニッキングエンドヌクレアーゼNb.BbvClを含有する120μLの反応溶液中37℃で実施した。総増幅時間は25分間であった。生成されたシグナルDNAは、ARCHITECTを使用する化学発光測定により検出した。
実施例10の結果は図12に図解されている。
[実施例11]
別の組の反応は、SC DNA1(配列番号1)、SC DNA2(配列番号2)並びに5’末端から位置38及び39にdSpacer脱塩基人工核酸(「α」)を有する配列5’-AGCAGCAACA TAGCAGAACC TCAGCGCTGC TTCTTGCααA TCTTCTCCA-idT-idT-3’(配列番号12)を有するSA DNA1を使用して本開示に従って実施した。SC DNAは反応中に1.4nMで存在しており、SA DNA1は反応中に1.4nMで存在していた。10の異なる正常血清試料(すなわち、標的核酸を欠く10の血清試料)を非特異的バックグラウンドシグナル増幅の存在について試験した。
別の組の反応は、SC DNA1(配列番号1)、SC DNA2(配列番号2)並びに5’末端から位置38及び39にdSpacer脱塩基人工核酸(「α」)を有する配列5’-AGCAGCAACA TAGCAGAACC TCAGCGCTGC TTCTTGCααA TCTTCTCCA-idT-idT-3’(配列番号12)を有するSA DNA1を使用して本開示に従って実施した。SC DNAは反応中に1.4nMで存在しており、SA DNA1は反応中に1.4nMで存在していた。10の異なる正常血清試料(すなわち、標的核酸を欠く10の血清試料)を非特異的バックグラウンドシグナル増幅の存在について試験した。
反応は、50mMの酢酸カリウム、20mMの酢酸トリス、7.5mMの酢酸マグネシウム、0.1mg/mLのBSA、1mMのDTT(pH7.9)を有するCutSmartバッファー、0.02U/μLで存在するDNAポリメラーゼBstL.F.、及び0.025U/μLで存在するニッキングエンドヌクレアーゼNb.BbvClを含有する120μLの反応溶液中37℃で実施した。総増幅時間は25分間であった。生成されたシグナルDNAは、ARCHITECTを使用する化学発光測定により検出した。
実施例11の結果は図13に図解されている。
[実施例12]
別の組の反応は、SC DNA1(配列番号1)、SC DNA2(配列番号2)及びSA DNA1(配列番号12)を使用して本開示に従って実施した。SC DNAは反応中に0.14nMで存在しており、SA DNA1は反応中に1.4nMで存在していた。反応は、0、100、又は1000fMのモデルDNA標的核酸(すなわち、マイクロRNA-21に相当する配列を有するDNA)の存在下で実施した。
別の組の反応は、SC DNA1(配列番号1)、SC DNA2(配列番号2)及びSA DNA1(配列番号12)を使用して本開示に従って実施した。SC DNAは反応中に0.14nMで存在しており、SA DNA1は反応中に1.4nMで存在していた。反応は、0、100、又は1000fMのモデルDNA標的核酸(すなわち、マイクロRNA-21に相当する配列を有するDNA)の存在下で実施した。
反応は、50mMの酢酸カリウム、20mMの酢酸トリス、7.5mMの酢酸マグネシウム、0.1mg/mLのBSA、1mMのDTT(pH7.9)を有するCutSmartバッファー、0.02U/μLで存在するDNAポリメラーゼBstL.F.、及び0.025U/μLで存在するニッキングエンドヌクレアーゼNb.BbvClを含有する120μLの反応溶液中37℃で実施した。総増幅時間は25分間であった。生成されたシグナルDNAは、ARCHITECTを使用する化学発光測定により検出した。
実施例12の結果は図14に図解されている。
[実施例13]
別の組の反応は、SC DNA1(配列番号1)、SC DNA2(配列番号2)及びSA DNA1(配列番号12)を使用して本開示に従って実施した。SC DNAは反応中に0.14nMで存在しており、SA DNA1は反応中に1.4nMで存在していた。反応は、0、100、又は1000fMのマイクロRNA-21標的核酸(すなわち、RNA標的核酸)の存在下で実施した。
別の組の反応は、SC DNA1(配列番号1)、SC DNA2(配列番号2)及びSA DNA1(配列番号12)を使用して本開示に従って実施した。SC DNAは反応中に0.14nMで存在しており、SA DNA1は反応中に1.4nMで存在していた。反応は、0、100、又は1000fMのマイクロRNA-21標的核酸(すなわち、RNA標的核酸)の存在下で実施した。
反応は、50mMの酢酸カリウム、20mMの酢酸トリス、7.5mMの酢酸マグネシウム、0.1mg/mLのBSA、1mMのDTT(pH7.9)を有するCutSmartバッファー、0.02U/μLで存在するDNAポリメラーゼBstL.F.、及び0.025U/μLで存在するニッキングエンドヌクレアーゼNb.BbvClを含有する120μLの反応溶液中37℃で実施した。総増幅時間は25分間であった。生成されたシグナルDNAは、ARCHITECTを使用する化学発光測定により検出した。
実施例13の結果は図15に図解されている。
[実施例14]
非特異的バックグラウンドシグナル増幅に対するその中に組み込まれた脱塩基部位を有するSC DNA及び/又はSA DNAの効果を比較するために本開示に従って一連の反応を実施した。反応は58の正常な血清試料(すなわち、標的核酸を欠く)で実施した。それぞれの血清試料は以下の2つの反応条件を使用して分析した。
非特異的バックグラウンドシグナル増幅に対するその中に組み込まれた脱塩基部位を有するSC DNA及び/又はSA DNAの効果を比較するために本開示に従って一連の反応を実施した。反応は58の正常な血清試料(すなわち、標的核酸を欠く)で実施した。それぞれの血清試料は以下の2つの反応条件を使用して分析した。
反応条件Aは、配列5’-AGCAGCAACA TAGCAGAACC TCAGCTTCTG CTATGTTGCT GCTTCAACAT AAGTCTGATA AGCTA-idT-idT-3’(配列番号15)を有するSC DNA13及び配列5’-TCTTGCGTAT CTTCTCCACC TCAGCATACG CAAGAAGCAG CAACATAGCA GAA-idT-idT-3’(配列番号16)を有するSA DNA3を使用した。SC及びSA DNAは反応中にそれぞれ0.42nM及び1.4nM存在していた。
反応条件Bは、位置50及び51にdSpacer脱塩基人工核酸(「α」)を有する配列5’-AGCAGCAACA TAGCAGAACC TCAGCTTCTG CTATGTTGCT GCTTCAACAα αAGTCTGATA AGCTA-idT-idT-3’(配列番号13)を有するSC DNA12及び位置41及び42にdSpacer脱塩基人工核酸(「α」)を有する配列5’-TCTTGCGTAT CTTCTCCACC TCAGCATACG CAAGAAGCAG ααACATAGCA GAA-idT-idT-3’(配列番号14)を有するSA DNA2を使用した。SC及びSA DNAは反応中にそれぞれ0.42nM及び1.4nM存在していた。
反応は、50mMの酢酸カリウム、20mMの酢酸トリス、7.5mMの酢酸マグネシウム、0.1mg/mLのBSA、1mMのDTT(pH7.9)を有するCutSmartバッファー、0.02U/μLで存在するDNAポリメラーゼBstL.F.、及び0.025U/μLで存在するニッキングエンドヌクレアーゼNb.BbvClを含有する120μLの反応溶液中37℃で実施した。総増幅時間は25分間であった。生成されたシグナルDNAは、ARCHITECTを使用する化学発光測定により検出した。
実施例14の結果は図16~18に示されている(灰色線は個々の生物学的複写物を表し、黒色線はすべての生物学的複写物の平均を表す)。図16は、非特異的バックグラウンドシグナルに対するSC DNA及びSA DNAの効果を図解しており、それぞれがその中に組み込まれた脱塩基部位を有する。これらのデータは、それぞれが脱塩基部位を含むSC DNA及びSA DNA(反応条件B)が、SC DNA及びSA DNAが脱塩基部位を欠く(反応条件A)反応と比べて非特異的バックグラウンドシグナルを減少できることを実証している。
反応は、50mMの酢酸カリウム、20mMの酢酸トリス、7.5mMの酢酸マグネシウム、0.1mg/mLのBSA、1mMのDTT(pH7.9)を有するCutSmartバッファー、0.02U/μLで存在するDNAポリメラーゼBstL.F.、及び0.025U/μLで存在するニッキングエンドヌクレアーゼNb.BbvClを含有する120μLの反応溶液中37℃で実施した。総増幅時間は25分間であった。生成されたシグナルDNAは、ARCHITECTを使用する化学発光測定により検出した。
実施例14の結果は図16~18に示されている(灰色線は個々の生物学的複写物を表し、黒色線はすべての生物学的複写物の平均を表す)。図16は、非特異的バックグラウンドシグナルに対するSC DNA及びSA DNAの効果を図解しており、それぞれがその中に組み込まれた脱塩基部位を有する。これらのデータは、それぞれが脱塩基部位を含むSC DNA及びSA DNA(反応条件B)が、SC DNA及びSA DNAが脱塩基部位を欠く(反応条件A)反応と比べて非特異的バックグラウンドシグナルを減少できることを実証している。
図17は、中間域偽陽性値(測定されたARCHITECT値は2000相対発光量よりも少なかった)を報告する20の正常な血清からの非特異的バックグラウンドシグナルに対するSC DNA及びSA DNAの効果を図解しており、それぞれがその中に組み込まれた脱塩基部位を有する。図18は、高域偽陽性値(測定されたARCHITECT値は2000相対発光量よりも大きかった)を報告する38の正常な血清からの非特異的バックグラウンドシグナルに対するSC DNA及びSA DNAの効果を図解しており、それぞれがその中に組み込まれた脱塩基部位を有する。これらのデータは、それぞれがその中に組み込まれた脱塩基部位を有するSC DNA及びSA DNAが、高域偽陽性値を報告する正常な血清と比べて中間域偽陽性値を報告する正常な血清の非特異的バックグラウンドシグナル減少に対する効果が大きいことを実証している。
[実施例15]
特異的及び非特異的増幅に対するSC DNAのシグナルDNA生成配列の少なくとも一部に相補的な配列の長さを変える効果を調べるために一組の反応を本開示に従って実施した。反応は、配列5’-TCTTGCGTAT CTTCTCCACC TCAGCGCAAG ATCAACATCA GTCTGATAAG CTA-idT-idT-3’(配列番号1)を有するSC DNA1、5’末端から位置38及び39にdSpacer脱塩基人工核酸(「α」)を有する配列5’-TCTTGCGTAT CTTCTCCACC TCAGCGCAAG ATCAACAααA GTCTGATAAG CTA-idT-idT-3’(配列番号2)を有するSC DNA2、5’末端から位置42及び43にdSpacer脱塩基人工核酸(「α」)を有する配列5’-TCTTGCGTAT CTTCTCCACC TCAGCATACG CAAGATCAAC AααAGTCTGATA AGCTA-idT-idT-3’(配列番号17)を有するSC DNA14、5’末端から位置46及び47にdSpacer脱塩基人工核酸(「α」)を有する配列5’-TCTTGCGTAT CTTCTCCACC TCAGCGAAGA TACGCAAGAT CAACAααAGT CTGATA AGCTA-idT-idT-3’(配列番号18)を有するSC DNA15及び5’末端から位置50及び51にdSpacer脱塩基人工核酸(「α」)を有する配列5’-TCTTGCGTAT CTTCTCCACC TCAGCTGGAG AAGATACGCA AGATCAACAα αAGTCTGATA AGCTA-idT-idT-3’(配列番号19)を有するSA DNA16を使用して実施した。SC DNAは反応中に1.4nMで存在していた。10の異なる正常血清試料(すなわち、標的核酸を欠く10の血清試料)を非特異的バックグラウンドシグナル増幅の存在について試験した。
特異的及び非特異的増幅に対するSC DNAのシグナルDNA生成配列の少なくとも一部に相補的な配列の長さを変える効果を調べるために一組の反応を本開示に従って実施した。反応は、配列5’-TCTTGCGTAT CTTCTCCACC TCAGCGCAAG ATCAACATCA GTCTGATAAG CTA-idT-idT-3’(配列番号1)を有するSC DNA1、5’末端から位置38及び39にdSpacer脱塩基人工核酸(「α」)を有する配列5’-TCTTGCGTAT CTTCTCCACC TCAGCGCAAG ATCAACAααA GTCTGATAAG CTA-idT-idT-3’(配列番号2)を有するSC DNA2、5’末端から位置42及び43にdSpacer脱塩基人工核酸(「α」)を有する配列5’-TCTTGCGTAT CTTCTCCACC TCAGCATACG CAAGATCAAC AααAGTCTGATA AGCTA-idT-idT-3’(配列番号17)を有するSC DNA14、5’末端から位置46及び47にdSpacer脱塩基人工核酸(「α」)を有する配列5’-TCTTGCGTAT CTTCTCCACC TCAGCGAAGA TACGCAAGAT CAACAααAGT CTGATA AGCTA-idT-idT-3’(配列番号18)を有するSC DNA15及び5’末端から位置50及び51にdSpacer脱塩基人工核酸(「α」)を有する配列5’-TCTTGCGTAT CTTCTCCACC TCAGCTGGAG AAGATACGCA AGATCAACAα αAGTCTGATA AGCTA-idT-idT-3’(配列番号19)を有するSA DNA16を使用して実施した。SC DNAは反応中に1.4nMで存在していた。10の異なる正常血清試料(すなわち、標的核酸を欠く10の血清試料)を非特異的バックグラウンドシグナル増幅の存在について試験した。
別の組の反応を、上で詳細に述べたSC DNA1(配列番号1)、SC DNA2(配列番号2)、又はSC DNA14(配列番号17)、SC DNA15(配列番号18)、若しくはSC DNA16(配列番号19)を使用して本開示に従って実施した。SC DNAは反応中に1.4nMで存在していた。反応は、配列5’-tagcttatca gactgatgtt ga-3’(配列番号20)(すなわち、マイクロRNA-21に相当する配列を有するDNA)を有する0、10、100、又は1000fMのモデルDNA標的核酸の存在下で実施した。
別の組の反応を、上で詳細に述べたSC DNA1(配列番号1)、SC DNA2(配列番号2)、又はSC DNA14(配列番号17)、SC DNA15(配列番号18)、若しくはSC DNA16(配列番号19)を使用して本開示に従って実施した。SC DNAは反応中に1.4nMで存在していた。反応は、配列5’-uagcuuauca gacugauguu ga-3’(配列番号21)(すなわち、マイクロRNA-21に相当する配列を有するRNA)を有する0、10、100、又は1000fMのモデルRNA標的核酸の存在下で実施した。
反応は、50mMの酢酸カリウム、20mMの酢酸トリス、7.5mMの酢酸マグネシウム、0.1mg/mLのBSA、1mMのDTT(pH7.9)を有するCutSmartバッファー、0.02U/μLで存在するDNAポリメラーゼBstラージ断片(L.F.)、及び0.025U/μLで存在するニッキングエンドヌクレアーゼNb.BbvClを含有する120μLの反応溶液中37℃で実施した。総増幅時間は25分間であった。生成されたシグナルDNAは、ARCHITECTを使用する化学発光測定により検出した。
実施例15のそれぞれの反応の組の結果は、それぞれ図19A(血清)、19B(添加された標的DNA)及び19C(添加された標的RNA)に示されている。
下記の表1及び2は、本明細書で開示される配列の配列番号を開示する。
本出願はある特定の態様及び実施形態に関連して説明されたが、本明細書で提供される開示には変更を加えうること、均等物を本開示の範囲から逸脱することなく置き換えうることは当業者であれば理解する。したがって、本出願は開示されている特定の態様及び実施形態に限定されるべきではなく、添付の特許請求の範囲内に収まるすべての態様及び実施形態を含むと理解され認識されるべきである。
Claims (34)
- 試料中で標的核酸を検出するための方法であって、試料を、
5’から3’方向に、シグナルDNA生成配列と、エンドヌクレアーゼ認識部位と、少なくとも1つの脱塩基部分を含む相補的配列とを含む、第1のオリゴヌクレオチドであって、前記相補的配列が前記シグナルDNA生成配列の少なくとも一部に相補的である第1の相補的配列及び前記標的核酸の3’末端に相補的である第2の相補的配列を含む、第1のオリゴヌクレオチド、
ポリメラーゼ、並びに
ニッキング反応のためのエンドヌクレアーゼ
と接触させることを含み、
前記少なくとも1つの脱塩基部分が前記第2の相補的配列の5’末端と3’末端の間に位置し、前記第2の相補的配列の5’末端から3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15ヌクレオチドであるヌクレオチド位置から選択され、
前記シグナルDNA生成配列の少なくとも一部と前記シグナルDNA生成配列の一部に相補的な前記第1の相補的配列がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する方法。 - 前記第1のオリゴヌクレオチドが複数の脱塩基部分を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第1のオリゴヌクレオチドが、前記標的核酸の3’末端に相補的な前記第2の相補的配列の5’末端から7ヌクレオチドである位置にある脱塩基部分を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第1のオリゴヌクレオチドが、前記標的核酸の3’末端に相補的な前記第2の相補的配列の5’末端から7及び8ヌクレオチドである位置にある2つの脱塩基部分を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記第1のオリゴヌクレオチドが、前記標的核酸の3’末端に相補的な前記第2の相補的配列の5’末端から7、8及び9ヌクレオチドである位置にある3つの脱塩基部分を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記第1のオリゴヌクレオチドが、前記標的核酸の3’末端に相補的な前記第2の相補的配列の5’末端から7、8、9及び10ヌクレオチドである位置にある4つの脱塩基部分を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記方法が実質的に一定の温度で実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記方法が、約20℃~約42℃の温度で実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリメラーゼが鎖置換活性を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリメラーゼが、3’から5’エキソヌクレアーゼ欠損、5’から3’エキソヌクレアーゼ欠損、又は両方である、請求項1に記載の方法。
- 前記標的核酸がマイクロRNAである、請求項1に記載の方法。
- 前記標的核酸が感染病原体由来である、請求項1に記載の方法。
- 前記方法が、1つ以上の脱塩基改変をオリゴヌクレオチド配列中に組み込んでいるオリゴヌクレオチドを含まない対照反応と比べて、バックグラウンドシグナル増幅の99%~10%の減少を提供する、請求項1~12のいずれかに記載の方法。
- 前記方法が、非特異的バックグラウンドシグナル増幅を約30%減少させる、請求項13に記載の方法。
- 前記第1のオリゴヌクレオチドが3’末端修飾を含む、請求項1~14のいずれかに記載の方法。
- 試料中で標的核酸を検出するための組成物であって、
5’から3’方向に、シグナルDNA生成配列と、エンドヌクレアーゼ認識部位と、少なくとも1つの脱塩基部分を含む相補的配列とを含む、第1のオリゴヌクレオチドであって、前記相補的配列が前記シグナルDNA生成配列の少なくとも一部に相補的である第1の相補的配列及び前記標的核酸の3’末端に相補的である第2の相補的配列を含み、前記シグナルDNA生成配列の少なくとも一部と前記シグナルDNA生成配列の一部に相補的な前記第1の相補的配列がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、第1のオリゴヌクレオチド
を含む、組成物。 - 前記少なくとも1つの脱塩基部分が、前記第2の相補的配列の5’末端と3’末端の間に位置し、前記第2の相補的配列の5’末端から3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15ヌクレオチドであるヌクレオチド位置から選択される、請求項16に記載の組成物。
- 前記第1のオリゴヌクレオチドが複数の脱塩基部分を含む、請求項16に記載の組成物。
- 前記第1のオリゴヌクレオチドが、前記標的核酸の3’末端に相補的な前記第2の相補的配列の5’末端から7ヌクレオチドである位置にある脱塩基部分を含む、請求項16に記載の組成物。
- 前記第1のオリゴヌクレオチドが、前記標的核酸の3’末端に相補的な前記第2の相補的配列の5’末端から7及び8ヌクレオチドである位置にある2つの脱塩基部分を含む、請求項16に記載の組成物。
- 前記第1のオリゴヌクレオチドが、前記標的核酸の3’末端に相補的な前記第2の相補的配列の5’末端から7、8及び9ヌクレオチドである位置にある3つの脱塩基部分を含む、請求項16に記載の組成物。
- 前記第1のオリゴヌクレオチドが、前記標的核酸の3’末端に相補的な前記第2の相補的配列の5’末端から7、8、9及び10ヌクレオチドである位置にある4つの脱塩基部分を含む、請求項16に記載の組成物。
- ポリメラーゼ及びニッキング反応のためのエンドヌクレアーゼをさらに含む、請求項16に記載の組成物。
- 前記ポリメラーゼが鎖置換活性を有する、請求項23に記載の組成物。
- 前記ポリメラーゼが、3’から5’エキソヌクレアーゼ欠損、5’から3’エキソヌクレアーゼ欠損、又は両方である、請求項23に記載の組成物。
- 前記第1のオリゴヌクレオチドが3’末端修飾を含む、請求項16~25のいずれかに記載の組成物。
- 試料中で標的核酸を検出するためのキットであって、
5’から3’方向に、シグナルDNA生成配列と、エンドヌクレアーゼ認識部位と、少なくとも1つの脱塩基部分を含む相補的配列とを含む、第1のオリゴヌクレオチドであって、前記相補的配列が前記シグナルDNA生成配列の少なくとも一部に相補的である第1の相補的配列及び前記標的核酸の3’末端に相補的である第2の相補的配列を含み、前記少なくとも1つの脱塩基部分が前記第2の相補的配列の5’末端と3’末端の間に位置し、前記第2の相補的配列の5’末端から3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15ヌクレオチドであるヌクレオチド位置から選択され、前記シグナルDNA生成配列の少なくとも一部と前記シグナルDNA生成配列の一部に相補的な前記第1の相補的配列がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、第1のオリゴヌクレオチド
を、含むキット。 - 5’から3’方向に、シグナルDNA生成配列と、エンドヌクレアーゼ認識部位と、少なくとも1つの脱塩基部分を含む相補的配列とを含む、化学修飾されたオリゴヌクレオチドであって、前記相補的配列が前記シグナルDNA生成配列の少なくとも一部に相補的である第1の相補的配列及び前記標的核酸の3’末端に相補的である第2の相補的配列を含み、前記少なくとも1つの脱塩基部分が第2の相補的配列の5’末端と3’末端の間に位置し、前記第2の相補的配列の5’末端から3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15ヌクレオチドであるヌクレオチド位置から選択され、前記シグナルDNA生成配列の少なくとも一部と前記シグナルDNA生成配列の一部に相補的な前記第1の相補的配列がハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する、化学修飾されたオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが複数の脱塩基部位を含む、請求項28に記載の化学修飾されたオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが、前記標的核酸の3’末端に相補的な前記第2の相補的配列の5’末端から7ヌクレオチドである位置にある脱塩基部分を含む、請求項28に記載の化学修飾されたオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが、前記標的核酸の3’末端に相補的な前記第2の相補的配列の5’末端から7及び8ヌクレオチドである位置にある2つの脱塩基部分を含む、請求項29に記載の化学修飾されたオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが、前記標的核酸の3’末端に相補的な前記第2の相補的配列の5’末端から7、8及び9ヌクレオチドである位置にある3つの脱塩基部分を含む、請求項29に記載の化学修飾されたオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが、前記標的核酸の3’末端に相補的な前記第2の相補的配列の5’末端から7、8、9及び10ヌクレオチドである位置にある4つの脱塩基部分を含む、請求項29に記載の化学修飾されたオリゴヌクレオチド。
- 3’末端修飾をさらに含む、請求項28~33のいずれかに記載の化学修飾されたオリゴヌクレオチド。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US202163144146P | 2021-02-01 | 2021-02-01 | |
US63/144,146 | 2021-02-01 | ||
PCT/US2022/014590 WO2022165353A1 (en) | 2021-02-01 | 2022-01-31 | Sequence conversion and signal amplifier dna having abasic nucleic acids, and detection methods using same |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2024506277A true JP2024506277A (ja) | 2024-02-13 |
Family
ID=82653918
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2023546262A Pending JP2024506277A (ja) | 2021-02-01 | 2022-01-31 | 脱塩基核酸を有する配列変換及びシグナル増幅dna、並びにそれを使用する検出方法 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20240117414A1 (ja) |
JP (1) | JP2024506277A (ja) |
WO (1) | WO2022165353A1 (ja) |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2002317973A1 (en) * | 2001-07-20 | 2003-03-03 | Cancer Research Technology Limited | Methods and polynukleotides for assaying the activity of a dna modifying enzyme |
EP1472335A4 (en) * | 2001-11-08 | 2005-12-28 | Univ Johns Hopkins | METHOD AND SYSTEMS FOR NUCLEIC ACID SEQUENCING |
US7252940B2 (en) * | 2002-08-21 | 2007-08-07 | Epoch Biosciences, Inc. | Abasic site endonuclease assay |
WO2016103234A1 (en) * | 2014-12-24 | 2016-06-30 | Abbott Japan Co., Ltd. | Detection method based on signal amplifier dna cascade reactions with target extension |
-
2022
- 2022-01-31 JP JP2023546262A patent/JP2024506277A/ja active Pending
- 2022-01-31 WO PCT/US2022/014590 patent/WO2022165353A1/en active Application Filing
-
2023
- 2023-07-31 US US18/362,013 patent/US20240117414A1/en active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2022165353A1 (en) | 2022-08-04 |
US20240117414A1 (en) | 2024-04-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11492658B2 (en) | Sequence conversion and signal amplifier DNA cascade reactions and detection methods using same | |
CA2936157C (en) | Covered sequence conversion dna and detection methods | |
US10208333B2 (en) | Sequence conversion and signal amplifier DNA having locked nucleic acids and detection methods using same | |
JP6126381B2 (ja) | 標的核酸の検出方法及びキット | |
US20100092972A1 (en) | Assay for gene expression | |
EP3388532B1 (en) | Integrated capture and amplification of target nucleic acid for sequencing | |
JP2024506277A (ja) | 脱塩基核酸を有する配列変換及びシグナル増幅dna、並びにそれを使用する検出方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230817 |