JP2008136436A - １本鎖ｄｎａ結合蛋白質を用いた核酸の変異検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】二本鎖核酸のミスマッチをより効率よく正確に検出する方法を提供すること。
【解決手段】１本鎖ＤＮＡ結合蛋白質を用いて核酸配列中の変異の有無を判定する方法。前記の核酸配列中の変異の有無を判定する方法であって、１本鎖ＤＮＡ結合蛋白質を用いた核酸増幅反応の生成物により、前記核酸配列中の変異の有無を判定することを特徴とする方法。前記核酸配列中の変異の有無を判定するキット。
【選択図】なし

Description

本発明は、一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質を用いることを特徴とする、二本鎖核酸のミスマッチを検出する方法に関する。本発明の方法によれば、ＤＮＡ塩基配列における一塩基遺伝子多型（ＳＮＰｓ：Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、一塩基置換あるいはＳＮＰともいう）を検出することができる。

ゲノム配列解析に続いて注目されているのは、遺伝子発現プロフィール分析や遺伝子中のＳＮＰｓの分析である。種々条件下で発現している遺伝子、種々個体の遺伝子変異等の解析により遺伝子機能、遺伝子と疾患あるいは医薬品感受性との関連が調べられている。また、これらの遺伝子に関する知識を用いて疾患の診断などが行われつつある。
核酸配列における変異の検出は、医学遺伝学の分野において非常に重要である。遺伝的変異の検出は、遺伝病における分子生物学的根拠の決定、遺伝的なカウンセリングのためのキャリアー及び出生前診断の提供、医薬における個人別化の促進、並びに遺伝学的研究における多型の同定等において重要である。

現在既知のSNPsをタイピングする方法は、原理で分類すると、ポリメラーゼ反応を利用する方法と、ハイブリダイゼーションを利用する方法の２つになる。
ハイブリダイゼーションを利用する方法は、DNAチップを用いる単純ハイブリダイゼーション法（Sequence By Hybridization）（非特許文献１：Drmanac R,et al:Genomics 4:114-128(1989)）やDye-labeled oligonucleotide ligation法（非特許文献２：Chen X, et al.:Genome Res. 8:549-556(1998)）,Invader法（非特許文献３：Lyamichev, et al:Science 260:778-783(1993)）の3つがある。いずれの場合も、各対立遺伝子（アレル）に対応したオリゴヌクレオチドを用意し、どちらのアレルにハイブリダイズしたかを検出するのが原則となる。これらの方法は、ハイブリ操作を必要とするため時間を要したり、あるいは、検出系に蛍光を採用していたりするため装置が高価であるといった問題を有し、簡便に検査を行うことはできない。
ポリメラーゼ反応を利用する方法は、SNaPShot法、Pyrosequence法（非特許文献４：Alderborn, A. et.al:Genome Res.,28:1249-1258(2000)）のようにSNPの近くにプライマー(primer)を設定し、SNP部位でどの塩基が取りこまれたか見る方法と、3’末端付近に各アレルに対応したSNP部位を含むようにプライマーを設計し、ポリメラーゼ反応が起こるか否かで判定を行う方法（ARMS法（Amplification refractory mutation system）、非特許文献５：Newton CR, et al.:Nucl Acids Res.17:2503-2516(1989)、PASA法（PCR-amplification of specific alleles）,非特許文献６：Sarker G et al:Anal Biochem 186:64-68(1990)）とに別れる。
SNaPShot法は、SNP部位の直前までプライマーを作り、ジデオキシヌクレオチドのみで伸長反応を行い、どの塩基が取りこまれたか解析する方法である。
1塩基のみの伸長反応であるため、これを解析するにはシークエンサーを用いなければならず、高価な装置が必要であるという問題を有する。
ARMS法やPASA法は、プライマーの起点とする伸長反応がプライマー3’末端と鋳型のマッチングに強く依存することを利用したものである（非特許文献７：Kwok S. et al.:Nucleic Acids Res 18,999-1005(1990),非特許文献８：Huang M.M. et al.:Nucleic Acids Res. 20,4567-4573(1992)）つまり、あらかじめ各アレルに相補的なプライマーを用意しておき、試料の遺伝子型と一致した場合にのみ伸長反応が起きることを利用し、増幅反応が起きたか否かで遺伝子型を判定する方法である。
しかし、実際には、各アレル特異プライマー間は1塩基の相違しかなく、鋳型の配列次第ではミスマッチプライマーによってもしばしば非特異的な増幅が起きる（非特許文献８：Huang M.M. et al.:Nucleic Acids Res. 20,4567-4573(1992)）。また、増幅が起きるか否かは用いる機器や周囲の環境等の微妙な条件によっても左右されるため、非特異増幅を抑える事は困難である。
特にＰＣＲ法に代表される、温度サイクルの必要な反応系におけるプライマーの1塩基の相違による識別は、塩基対の水素結合が温度に大きく影響を受けることを考慮すると非特異増幅を抑える事はさらにいっそうの困難を生じさせる。

また、近年ハイブリダイゼーションを利用する方法の特異性を向上させる目的で標識したミスマッチ認識蛋白であるMutＳ蛋白を使用することで、ハイブリダイゼーション産物に生じるミスマッチを検出する方式（特許文献１：特開平2003-52396号公報）が提案されている。しかし、ハイブリ操作を必要とするため時間を要したり、あるいは、検出系に蛍光を採用していたりするため装置が高価であるといった問題についての課題は解決されていない。さらに、ＭｕｔＳ蛋白はミスマッチの種類によって結合の強さが異なることが知れれている。特に、ピリミジン・ピリミジンのミスマッチに対する結合は弱い（非特許文献９：M.Gotoh et at al. Genet.Anal 14, 47-50 (1997)）。
よって、ミスマッチ認識蛋白をSNPsタイピングに応用した場合、変異を見落とす危険性が高いという問題点を抱えている。

Drmanac R,et al:Genomics 4:114-128(1989) Chen X, et al.:Genome Res. 8:549-556(1998) Lyamichev, et al:Science 260:778-783(1993) Alderborn, A. et.al:Genome Res.,28:1249-1258(2000) Newton CR, et al.:Nucl Acids Res.17:2503-2516(1989) Sarker G et al:Anal Biochem 186:64-68(1990) Kwok S. et al.:Nucleic Acids Res 18,999-1005(1990) Huang M.M. et al.:Nucleic Acids Res. 20,4567-4573(1992) M.Gotoh et at al. Genet.Anal 14, 47-50 (1997) 特開平2003-52396号公報

本発明は、二本鎖核酸のミスマッチをより効率よく正確に検出する方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、核酸増幅時に一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質を接触させることで、ミスマッチが存在する核酸の増幅を選択的に抑制しうることを見出した。これは、一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質の効果として従来知られていなかった驚くべき事である。本発明はこのような知見に基づいて完成したものである。

すなわち、本発明は下記構成よりなる。
<１>1本鎖ＤＮＡ結合蛋白質を用いて核酸配列中の変異の有無を判定する方法。
<２>上記<１>記載の核酸配列中の変異の有無を判定する方法であって、１本鎖ＤＮＡ結合蛋白質を用いた核酸増幅反応の生成物により、前記核酸配列中の変異の有無を判定することを特徴とする方法。
<３>上記<１>または<２>記載の核酸配列中の変異の有無を判定する方法であって、１本鎖ＤＮＡ結合蛋白質が核酸増幅反応の非特異反応を抑制することにより、増幅反応の有無で上記核酸配列中の変異の有無を判定することを特徴とする方法。
<４>核酸増幅反応が等温で行われることを特徴とする上記<２>または<３>に記載の判定方法。
<５>核酸増幅反応が鎖置換型ポリメラーゼを用いて行われることを特徴とする上記<２>〜<４>のいずれかに記載の判定方法。
<６>１本鎖結合蛋白質が、大腸菌、ショウジョウバエもしくはアフリカツメガエル由来のSSB、T4ファージ遺伝子32、41、44、45、または61蛋白質のいずれかもしくはこれら少なくとも2種以上の混合物である、上記<１>〜<５>のいずれかに記載の方法。
<７>核酸配列中の変異の有無を判定する方法であって、被検物質から核酸の抽出、増幅、検出の一連の動作を密閉した空間内で連続して行うことを特徴とする上記<１>〜<６>のいずれかに記載の方法。
<８>被検物質が、血液、体液、組織、細胞、細菌、及びウイルスから選択されることを特徴とする<１>〜<７>のいずれかに記載の方法。
<９>上記<１>〜<８>のいずれかに記載の核酸配列中の変異の有無を判定するキット。

本発明の方法によれば、ＳＮＰｓ等の二本鎖の核酸が有するミスマッチの有無をより効率よく正確に検出することができる。本発明の方法は、遺伝子診断、感染症診断、ゲノム創薬等の用途に適用することができる。

本発明は、一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質を利用して、二本鎖核酸が有するミスマッチ部分の一本鎖を検出する方法に関する。本発明の方法は、二本鎖核酸内に存在するミスマッチ部分（すなわち一本鎖部分）に対する一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質の認識能力、および、一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質がプライマーと核酸のハイブリダイズに結合していると核酸複製反応が阻害される現象を利用する方法であり、核酸増幅反応の成否（増幅量）を指標とする。

本発明の方法は、
（ａ）任意の核酸、該標的核酸を増幅しうるプライマーおよび試薬類、ならびに、一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質を接触させて増幅反応溶液を得る工程、
（ｂ）該プライマーを延伸することにより核酸を増幅する工程、
（ｃ）核酸が増幅したか否かを検出し対照核酸と標的核酸との間のミスマッチの有無を判定する工程、を含む。
（ａ）工程において、１本鎖ＤＮＡ結合蛋白質のＤＮＡとの接触のタイミングは特に限定されるものではないが、後述される二本鎖核酸の生成後に行うことが好ましい。

本発明の方法の原理を、以下に説明する。
まず、ミスマッチを有するかどうか判定する対象である核酸を調製する。核酸は、プライマーなどとして人工合成した配列であっても、天然物由来の配列であってもよい。
例えば、ヒトの血液、体液、組織、細胞、細菌、及びウイルスから抽出されたゲノム
等を好ましく用いることが出来る。

次いで、これらの核酸に、該標的核酸を増幅しうるプライマーおよび試薬類、ならびに、一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質を接触させる。プライマーは、あらかじめ各アレルに相補的になるように設計されている。標的核酸とプライマーがハイブリダイズした場合、遺伝子型が一致した場合のみ、標的核酸とプライマーは完全に二本鎖を形成する。一致しなかった場合、標的核酸とプライマーは、部分的に一本鎖状態になっている。一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質は、これらの一本鎖状態を認識し、その部位に特異的に結合する。

次に、二本鎖核酸の増幅を行う。一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質が合した状態で核酸増幅方法を適用すると、増幅反応は抑制される。一方、一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質が結合していない状態においては、増幅が起きる。

また、次のように、あらかじめ変異を有することが疑われる標的核酸と対照核酸（変異を有しない核酸）とを調製し、これらを互いにハイブリダイズさせたものを用いることもできる。ハイブリダイズの結果、標的核酸が変異を有すれば、対照核酸とのハイブリダイズによりヘテロ二本鎖核酸（ミスマッチを有する二本鎖核酸）が生じる。一方、標的核酸に変異がなければ、ホモ二本鎖核酸（ミスマッチを有しない二本鎖核酸）のみが生じ、ヘテロ二本鎖核酸は生じない。二本鎖核酸に対し、一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質を接触させた場合、一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質はミスマッチを有するヘテロ二本鎖核酸には結合するが、ホモ二本鎖核酸には結合しない。

次に、二本鎖核酸の増幅を行う。一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質がヘテロ二本鎖核酸に結合した状態で核酸増幅方法を適用すると、増幅反応は抑制される。一方、一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質が結合していないホモ二本鎖においては、増幅がおきる。

したがって、いずれの場合においても二本鎖核酸の増幅の有無を調べることにより、試料の二本鎖核酸がミスマッチを有するか否か判定することができる。ＳＮＰｓの検出においては、標的核酸が変異を有するか否かを判定できる。より詳しくは、一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質の非存在下および存在下における二本鎖核酸の増幅量を検証することで、より高精度にミスマッチの有無を判別することができる。

本発明において「ミスマッチ」とは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）（ＲＮＡの場合はウラシル（Ｕ））から選択される一組の塩基対が正常な塩基対（Ａ／ＴまたはＧ／Ｃ）ではないことを指す。本発明において「ミスマッチ」には、1つのミスマッチのみならず、複数の連続したミスマッチ、1または複数の塩基の挿入および／または欠失により生じるミスマッチ、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。

本発明において「変異」とは、対照核酸と比較した場合における標的核酸中の異なる塩基（二本鎖核酸の場合には塩基対、ただし、一方が存在しない場合も含む。）を指し、塩基の置換、塩基の欠失、塩基の挿入を含むことを意味する。

本発明において「核酸」は、特に制限されず、ＤＮＡおよびＲＮＡあるいはその他の人工核酸（所謂ＰＮＡ等）いずれも用いることができ、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ等の天然試料であっても、合成ポリヌクレオチドであってもよい。また二本鎖核酸、並びに直鎖状核酸および環状核酸を含む。１本鎖核酸のＳＮＰｓについても、対照核酸とハイブリダイズさせることで検証できる。

本発明において「対照核酸」とは、変異を有しない核酸を指す。また、「標的核酸」とは、対照核酸とは異なる塩基（変異）を有することが疑われる核酸を指す。標的核酸は、変異を有しなければ対照核酸と同一の核酸であり、変異を有すれば、該変異部位のみ対照核酸と異なる核酸である。例えば、遺伝子病が疑われる患者の遺伝子における変異を検出する場合において変異を有することが疑われる患者の遺伝子は標的核酸であり、この遺伝子に対応する健常者の遺伝子は対照核酸である。

本発明の方法に用いられる標的核酸としては、特に制限はなく、変異を有するか否かを検出したい所望の核酸を用いることができる。また、対照核酸は、標的核酸に対応する核酸であって、仮に標的核酸が変異を有しなければ、標的核酸と同一の核酸を用いる。この同一とは、両者がハイブリダイズする領域において同一の意味であり、長さに相違があってもよいが、可能であれば長さも揃えることが望ましい。標的核酸および対照核酸は、１本鎖であっても二本鎖であってもよい。

本発明の方法は、核酸配列の変異、例えば、単一のミスマッチ塩基対、複数の連続したミスマッチ、1塩基対複数塩基のミスマッチ、さらには二本鎖核酸の少なくとも片側の鎖における１または複数の塩基の欠失および/または挿入によって生じるミスマッチの検出に好適に適用することができる。

本発明の方法に用いられる一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質は、ＤＮＡの複製過程にて作用する蛋白質である。
複製に際してＤＮＡの二重らせんは複製起点から一過的にほどかれ、その露出された一本鎖のそれぞれを鋳型にして新しいポリヌクレオチド鎖が合成される。このとき一本鎖になったＤＮＡが二本鎖に戻らないよう、一本鎖部分に結合するのが一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質である。

このような一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質（ＳＳＢ）は、当分野で既知の任意のSSBである。好ましくは、一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質（大腸菌、ショウジョウバエ、アフリカツメガエル由来である。）、Ｔ４バクテリオファージ由来の ３２、４１、４４、４５、または６１gene蛋白質および真核生物におけるRPAタンパク質である。また、他の種由来のその相当物も好ましく用いることが出来る。

また、一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質は、上記機能を有する限り、天然型の蛋白質のアミノ酸配列中、１つ若しくは複数のアミノ酸を置換、欠失、および／または挿入したアミノ酸配列からなる蛋白質（変異体）であってもよい。このような変異体は、自然界において生じることもあるが、公知の方法を適宜利用して人為的に調製することも可能である。

一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質は、天然の蛋白質として、または組換え蛋白質として、陰イオン交換カラム、陽イオン交換カラム、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー、硫酸アンモニウム分画等の公知の方法を適宜組み合わせて調製することが可能である。また、組換え蛋白質で発現量が多い場合には、陽イオン交換カラムおよびゲル濾過カラムを用いたクロマトグラフィーのみにより容易に調製することも可能である。一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質は市販品も利用することができる。一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質の使用量は、通常、試料の核酸１μｇに対して１〜５０μｇ、好ましくは３〜２０μｇである。

二本鎖核酸を増幅しうるプライマーおよび試薬としては、ＬＡＭＰ増幅反応(Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA；Bio Industry,第18巻、2号（2001）)やＲＣＡ法（Rolling Circle Amplification:Proc.Natl.Acad.Sci,vol.92,4641-4645(1995)）、ＩＣＡＮ法（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）、SDA法（Strand Displacement Amplification:特開平5-130870号）、NASBA法(Nucleic acid Sequence-based Amplification method;Nature,350,91〜(1991)) 、TMA(Transcription mediated amplification method;J.Clin Microbiol.第31巻、3270〜（1993）)等の等温増幅反応や一般的なＰＣＲ増幅反応等のポリメラーゼ増幅反応、ＬＣＲ等（特開平5-2934号公報）のリガーゼ増幅反応など、公知の核酸増幅法に用いるものが利用できる。
具体的には、各方法に適したように設計されたプライマーの核酸と、ポリメラーゼ及び／あるいはリガーゼ（好ましくはＴａｑポリメラーゼ等の耐熱酵素）、核酸基質（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ（ｄＵＴＰ）／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰのｄＮＴＰ）、それらに適した緩衝液（たとえばＴｒｉｓ−ＳＯ₄など）と安定化剤（たとえばＭｇＣｌ₂）や副反応の阻害剤（たとえばＲＮＡｓｅ）などであり、従来の核酸増幅と同様の種類、量および方法で用いることができる。市販の核酸増幅キット等を用いることもできる。

プライマーは、検出する対象のミスマッチの近傍またはミスマッチを含むように設計することが好ましく、用いられる増幅法に応じて複数本用いることができる。また、用いられるプライマーの任意のプライマーが対象のミスマッチの近傍またはミスマッチを含むように設計可能である。
対象のミスマッチの近傍またはミスマッチを含むように設計されたプライマーは、好ましくはミスマッチがプライマーに含まれるように、さらに好ましくはポリメラーゼ反応開始の末端近傍（３’末端から１〜２０塩基以内）、さらに好ましくは３’末端から１〜１０塩基以内、さらに好ましくは、３’末端から１〜５塩基以内にミスマッチが含まれるようにプライマーを設計する。

本発明の方法における二本鎖核酸と一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質との接触は、該蛋白質が該二本鎖核酸中のミスマッチ領域に結合しうる条件（例えば、適当なｐＨ、溶媒、イオン環境、温度）で行なわれる。反応温度や塩濃度、イオンの種類、バッファーのｐＨ等の詳細な条件は適宜調整することができる。

核酸が増幅したか否かを検出する手段としては、エチジウムブロマイドやインターカレーター蛍光色素等の各種染色、ＵＶ吸収、ラジオアイソトープ、ピロリン酸の検出、標識プローブによる検出等を用いた通常の方法を用いることができる。適当な濃度や感度などの条件を設定して有無を判別することも簡便なため好適であり、また濃度を求めることも正確さを期す上で好ましい。
核酸の間のミスマッチの有無を判定するにあたり、ミスマッチを含むことが判っている系（ネガティブコントロール）やミスマッチを含まないことが判っている系（ポジティブコントロール）と、試料の核酸における系を対比して判定することがより好ましい。

本発明において、標的核酸と対照核酸をハイブリダイズさせると、二本鎖核酸は標的核酸に変異がある場合には、ヘテロ二本鎖核酸とホモ二本鎖核酸の混合物となり、標的核酸に変異がない場合には、ホモ二本鎖核酸のみとなる。

二本鎖核酸の変性方法としては、例えば、溶液のｐＨを酸性またはアルカリ性にする方法と、溶液を高温にする方法が挙げられる。ｐＨを変化させる方法としては、例えば ０．１Ｍ ＮａＯＨ、０．１Ｍ ＨＣｌ溶液に置換する方法が挙げられる。また、温度を上げる方法は、核酸の融解温度（Ｔｍ）以上にすればよいが、通常、９５℃程度が用いられる。

二本の一本鎖核酸のハイブリダイズは、溶液のｐＨを中性に戻すこと、または温度を徐々に下げ Ｔｍ以下にすることにより容易に行うことができる。ハイブリダイズにより二本鎖核酸を形成させる過程で一本鎖核酸が残っていると予想される場合には、例えばカラムで１本鎖核酸を除去することが好ましい。

本発明の方法は、遺伝子病患者の罹病が疑われる患者において特定の遺伝子が変異を有するか否かを調べるため、患者由来の遺伝子と健常者の遺伝子が同一の塩基配列を有するか否かを調べることに利用することができる。本発明の方法においては、標的遺伝子のいかなる位置に変異が存在しても検出することが可能であり、検査対象となる遺伝子の変異部位や変異の種類が既知である必要はない点でも優れている。さらには、プライマーやプローブとして人工的に合成された配列に本発明の方法を適用することで、その配列の精度をより向上させることができる。
本発明の核酸配列中の変異の有無を判定するキットは、上記本発明の変異検出法に用いる材料（緩衝液、対象核酸、プライマー、核酸染色剤、１本鎖ＤＮＡ結合蛋白質、水等）を１以上の容器に該材料を適宜選定して収容した形態であれば、特に限定されない。

以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるもので
はない。

＜実施例１＞
１塩基変異の検出と１本鎖ＤＮＡ結合蛋白質の効果
（１）ターゲット核酸断片を含む核酸試料液の調製
ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）１００ｎｇを９８℃で３ｍｉｎ．加熱を行い、１本鎖にしたのち、β−アクチン遺伝子中の配列の増幅を以下の条件で行った。

＜プライマー＞
プライマーは、βアクチン遺伝子を標的に設計を行った。各プライマーの位置関係図は、図１に示す。フォワードプライマー（配列番号１）（Ｆｏｒｗａｒｄ）は、鋳型と相補的な矢印ａで示される３’末端領域と５’末端領域にそのプライマーの伸長鎖上の、３’末端塩基Ｔから１０塩基下流にある鋳型領域ｂとハイブリダイズされるように設計され、上記ａの５’末端部と、領域ｂと相補である領域ｂｃと同一な配列の３’末端部の連結にＴを４塩基介在させた。リバースプライマー（配列番号２）(Ｒｅｖｅｒｓｅ)は、鋳型と相補的な矢印ｃで示される３’末端領域と５’末端領域にそのプライマーの伸長鎖上の、３’末端塩基ａから６塩基下流にある鋳型領域ｄとハイブリダイズされるように設計され、上記ｃの５’末端部と、領域ｄと相補である領域ｄｃと同一な配列の３’末端部の連結にＴを４塩基介在させた。
また、フォワードプライマー、リバースプライマーのそれぞれ外側にアウタープライマー［ＯＦ（配列番号３）、ＯＲ（配列番号４）］を設計した。さらに、１塩基変異のモデル系を作成するために、変異検出用のプライマーを新たに作成し、鋳型とマッチする配列を有するプライマー（配列番号５、配列ｂｃと同じ）（野生型）とその３’末端ＣをＴに置換した人工的に変異を有しているプライマー（配列番号６）（変異型）を作成した。
以下に各種プライマーのＤＮＡ配列を示す。

プライマー１(Ｆｏｒｗａｒｄ)：
５’− CTCTGGGCCTCGTCGCTTTTGGGCATGGGTCAGAAGGATT−３’（配列番号１）
プライマー２(Ｒｅｖｅｒｓｅ):
５’−TACCCCATCGAGCACGGTTTTCATGTCGTCCCAGTTGGTGA−３’（配列番号２）
アウタープライマー３（ＯＦ）
５’−GGGCTTCTTGTCCTTTCCTTC−３’ （配列番号３）
アウタープライマー４（ＯＲ）
５’− CCACACGCAGCTCATTGTAG−３’ （配列番号４）
変異検出用プライマー５（野生型）：
５’−CTCTGGGCCTCGTCGC−３’ （配列番号５）
変異検出用プライマー６（変異型）：
５’−CTCTGGGCCTCGTCGT−３’ （配列番号６）

(２)核酸増幅反応
以下に示す反応液の組成で、６０℃、１時間反応させることで増幅反応を実施した。水準１は、一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質を添加していない水準であり、水準２から４は、一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質の濃度を変えて添加している水準である。合成酵素は、市販のBst. Polymerase（NEB社製）、１本鎖ＤＮＡ結合蛋白質（SSB）は、Single Stranded DNA Binding Protein（Promega社製）を用いた。核酸染色にはSYBR Green I（タカラバイオ社製）を用いた。

1本鎖ＤＮＡ結合蛋白質の添加量は以下に示すとおりである。
水準１:０
水準２:０．１８μg
水準３:０．５４μg
水準４:１．０８μg

（３）増幅産物の検出
前記（２）における増幅反応を、リアルタイム蛍光検出装置（Ｍｘ３０００ｐ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて蛍光検出を行った。各水準、野生型（wild）、変異型（mutant）ともにn=2で実験を行った。結果を図２に示す。太線が野生型プライマー、点線が変異型プライマーを用いた場合である。

水準１〜４ともに２０分前後に野生のプライマーから増幅が起きていることがわかる。また、一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質(SSB)を添加している水準２〜４については、変異プライマーからの増幅は、一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質の添加量に応じて遅れていることがわかる。特に水準４に関しては、６０分後も起きていない。一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質により非特異的な増幅が抑えられていることがわかる。ここで、Ｍｘ３０００ｐの解析ソフトを用いて、上記のグラフにおいて蛍光量が２５０に到達したときの時間を算出した。結果を下表に示す。単位は分で、ｎ＝２の平均である。

上表から確かに、ＳＳＢの添加量に応じて変異型の増幅が抑えられていることがわかる。

＜実施例２＞
ヒトＡＤＲＢ２遺伝子中のＳＮＰｓ（Ａｒｇ１６Ｇｌｙ）の検出
（１）ターゲット核酸断片を含む核酸試料液の調製
合意済みの健常人２人分からあらかじめ採血を行い、QuickGene DNA whole blood kit（Fujifilm社製）を用いてゲノムを抽出した。これらの配列を解析した結果、健常人Ａは野生型のホモ、健常人Ｂは変異型のホモと判明した。
これら２人分のゲノムをそれぞれ１００ｎｇ、９８℃で３ｍｉｎ．加熱を行い１本鎖にしたのち、ＡＤＲＢ２遺伝子中のＳＮＰｓの判定を以下の条件で行った。

＜プライマー＞
プライマーは、ＡＤＲＢ２遺伝子を標的にＬＡＭＰ法が行えるように設計を行った。図１と同様な考え方で、フォワードプライマー、リバースプライマーともに、鋳型と相補的な３’末端領域と５’末端領域にそのプライマーの伸長鎖上の領域とハイブリダイズされるように設計されている５’末端領域からなる。各プライマーの位置関係図は、図３に示す。なお、変異検出用プライマー（野生型）の矢印枠外の配列は配列ｅと同じであり、変異検出用プライマー（変異型）は野生型の５’端ＴがＣに置換されている。なお、Reversプライマーの矢印枠外の配列は配列ｆと同じである。
以下に各種プライマーのＤＮＡ配列を示す。

変異検出用プライマー７（野生型）：
５’−TATTGGGTGCCGCCATGGGGCAACCCGGGA−３’ （配列番号７）
変異検出用プライマー８(変異型):
５’−CATTGGGTGCCGCCATGGGGCAACCCGGGA−３’ （配列番号８）
プライマー９(Reverse):
５’−CATGCGCCGGACCACCCACACCTCGTCCCT−３’ （配列番号９）
ループプライマー１０
５’−CAAGAAGGCGCTGCCG−３’ （配列番号１０）

(２)核酸増幅反応
以下に示す反応液の組成で、検体Ａ、検体Ｂの２人分のゲノムについて、６０℃、１時間反応させることで増幅反応を実施した。水準は、各検体２水準で、一つは一本鎖DNA結合蛋白質（Promega社製、０．１８μｇ）を含む水準、もう一つは含まない水準である。

（３）遺伝子多型の判定
前記（２）における増幅反応を、リアルタイム蛍光検出装置（Ｍｘ３０００ｐ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて蛍光検出を行った。各水準、野生型（wild）と変異型（mutant）プライマーを用いて増幅を行い、増幅の有無で遺伝子型を判定した。
結果を図４に示す。太線が野生型プライマー、点線が変異型プライマーを用いた場合である。

検体A、検体Bともに既知のタイプ（検体A：野生型、検体B：変異型）と一致した。いずれの検体においても、水準２（SSBを添加していない水準）と比べて、水準１の方が非特異的な増幅が抑制されていて遺伝子多型が明確にタイピングできる。

＜実施例３＞
変異認識蛋白質（ＭｕｔＳ）との比較
（１）ターゲット核酸断片を含む核酸試料液の調製
実施例２で用いた検体Ａ（ＡＤＲＢ２のＳＮＰｓ（Ａｒｇ１６Ｇｌｙ）が野生型）のゲノムを１００ｎｇ用いて、９８℃で３ｍｉｎ．加熱を行い１本鎖にしたのち、非特異増幅を抑制する蛋白質としてＳＳＢとＭｕｔＳを用いて、ＡＤＲＢ２遺伝子中のＳＮＰｓ判定を以下の条件で行った。

＜プライマー＞
プライマーは、実施例２と共通のプライマーを用いた。すなわち、以下の通りである。

変異検出用プライマー７（野生型）：
５’−TATTGGGTGCCGCCATGGGGCAACCCGGGA−３’ （配列番号７）
変異検出用プライマー８(変異型):
５’−CATTGGGTGCCGCCATGGGGCAACCCGGGA−３’ （配列番号８）
プライマー９(Reverse):
５’−CATGCGCCGGACCACCCACACCTCGTCCCT−３’ （配列番号９）
ループプライマー１０
５’−CAAGAAGGCGCTGCCG−３’ （配列番号１０）

(２)核酸増幅反応
以下に示す反応液の組成で、６０℃、１時間反応させることで増幅反応を実施した。水準１は、一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質を添加していない水準であり、水準２はＭｕｔＳ蛋白質（ニッポンジーン社製）、水準３は一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質（Promega社製）を添加した。合成酵素は、市販のBst. Polymerase（NEB社製）を用いた。

1本鎖ＤＮＡ結合蛋白質の添加量は０．１８μｇ、ＭｕｔＳの添加量は１．０μｇである。

（３）遺伝子多型の判定
前記（２）における増幅反応を、リアルタイム蛍光検出装置（Ｍｘ３０００ｐ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて蛍光検出を行った。各水準、野生型（wild）と変異型（mutant）プライマーを用いて増幅を行い、増幅の有無で遺伝子型を判定した。結果を図５に示す。太線が野生型プライマー、点線が変異型プライマーを用いた場合である。

MutS（水準２）、SSB（水準３）ともに水準１と比べて非特異増幅（mutant側の増幅）が抑制されていることがわかる。但し、添加量は、MutSは1.0μgの添加に対して、SSBは0.18μg添加量である。SSBは、変異認識蛋白であるMutSの1/5以下の添加量で同等以上の非特異増幅を抑制する効果が見られる。ここで、Ｍｘ３０００ｐの解析ソフトを用いて、上記のグラフにおいて蛍光量が２５０に到達したときの時間を算出した。結果を下表に示す。単位は分である。

確かに、ＳＳＢにはＭｕｔＳ同等以上の抑制能があることがわかる。

実施例１における各プライマーの位置関係を説明する図である。なお、βアクチン遺伝子は２本鎖であり、上段の２本鎖、下段の２本鎖は各々上段の右端、下段の左端と連結されている。上段及び下段の上側の左端は３’端、上段及び下段の下側の左端は５’端である。また、ＤＮＡ配列の塩基間のブランクは便宜的なものであり、実際は連続している。 実施例１の結果を示す図である。 実施例２における各プライマーの位置関係を説明する図である。なお、2本鎖遺伝子の配置は図１と同様である。 実施例２の結果を示す図である。 実施例３の結果を示す図である。

Claims (9)

1. １本鎖ＤＮＡ結合蛋白質を用いて核酸配列中の変異の有無を判定する方法。
2. 請求項１記載の核酸配列中の変異の有無を判定する方法であって、１本鎖ＤＮＡ結合蛋白質を用いた核酸増幅反応の生成物により、前記核酸配列中の変異の有無を判定することを特徴とする方法。
3. 請求項１または２記載の核酸配列中の変異の有無を判定する方法であって、１本鎖ＤＮＡ結合蛋白質が核酸増幅反応の非特異反応を抑制することにより、増幅反応の有無で上記核酸配列中の変異の有無を判定することを特徴とする方法。
4. 核酸増幅反応が等温で行われることを特徴とする請求項２または３に記載の判定方法。
5. 核酸増幅反応が鎖置換型ポリメラーゼを用いて行われることを特徴とする請求項２〜４のいずれかに記載の判定方法。
6. １本鎖ＤＮＡ結合蛋白質が、大腸菌、ショウジョウバエもしくはアフリカツメガエル由来のSSB、T4ファージ遺伝子32、41、44、45、または61蛋白質のいずれかもしくはこれら少なくとも2種以上の混合物である、請求項1〜５のいずれかに記載の方法。
7. 核酸配列中の変異の有無を判定する方法であって、被検物質から核酸の抽出、増幅、検出の一連の動作を密閉した空間内で連続して行うことを特徴とする請求項1〜６のいずれかに記載の方法。
8. 被検物質が、血液、体液、組織、細胞、細菌、及びウイルスから選択されることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
9. 請求項１〜８のいずれかに記載の核酸配列中の変異の有無を判定するキット。

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