WO2016093333A1 - 塩基変異の検出方法及びキット並びに核酸サンプルのｐｃｒ増幅を抑制する方法 - Google Patents

塩基変異の検出方法及びキット並びに核酸サンプルのｐｃｒ増幅を抑制する方法 Download PDF

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俊 坂本
順子 仲村
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Definitions

  • the present invention relates to a method and kit for detecting a base mutation, and a method for suppressing PCR amplification of a nucleic acid sample in a sequence-specific manner.
  • the gene base sequence varies from individual to individual. Among these nucleotide sequence differences, those with a frequency of 1% or more are called “gene polymorphisms”. There are various types of polymorphisms, and examples include base substitution, base insertion or deletion, and differences in the number of repetitions of a specific base sequence. These polymorphisms are called base mutations.
  • Detection of base mutation is performed by a method of analyzing a melting curve of a polymerase chain reaction (PCR) product, a TaqMan (registered trademark) method, a method of sequencing a nucleotide sequence of a PCR product, an Invader (registered trademark) method, or the like. Yes.
  • PCR polymerase chain reaction
  • TaqMan registered trademark
  • Invader registered trademark
  • the vicinity of the target base sequence to be detected is amplified by the PCR method.
  • the PCR method uses a thermostable polymerase and two primers complementary to a target nucleic acid to (1) denature a double-stranded target nucleic acid that serves as a template, and (2) apply a primer to the denatured target nucleic acid. This is a method of amplifying a target nucleic acid exponentially by repeating three steps of annealing and (3) extension reaction from a primer by controlling temperature.
  • a melting curve of the PCR product is prepared using an intercalator reagent.
  • the intercalator reagent When the intercalator reagent is present in the solution, it exists as an aggregate of two or more molecules, so it does not exhibit fluorescence due to the exciton effect, but it is isolated from the aggregated state by intercalating with the target nucleic acid. And emits fluorescence.
  • intercalator reagents include ethidium bromide and cyber green.
  • the temperature of the PCR product is raised and the double-stranded DNA is dissociated (melted) into single-stranded DNA, the fluorescence from the intercalator reagent disappears. Using this, a melting curve is created. Subsequently, the melting curve is analyzed, and base mutations are detected based on slight differences in melting curves due to differences in the base sequence of the PCR product.
  • a TaqMan (registered trademark) probe to which a fluorescent substance and a quenching substance are added is used.
  • the TaqMan (registered trademark) probe is annealed to the target nucleic acid in step (2) of the PCR method described above.
  • the TaqMan® probe is degraded by the 5 ′ ⁇ 3 ′ exonuclease activity of the polymerase. As a result, the fluorescent material released from the quenching material emits fluorescence.
  • a TaqMan (registered trademark) probe complementary to a sequence having a base mutation (mutant type sequence) and the TaqMan (registered trademark) probe are fluorescent substances
  • the PCR reactions are performed in the presence of two TaqMan® probes, TaqMan® probes that are different and complementary to the wild type sequence. Thereafter, a base mutation is detected by comparing the fluorescence intensities of the two colors of fluorescence derived from each decomposed TaqMan (registered trademark) probe.
  • base mutation is detected by directly decoding the base sequence of the PCR product.
  • base mutations are detected using a crystal base that specifically recognizes and cleaves the triple-stranded structure of DNA.
  • the sequencing method and the Invader (registered trademark) method are superior to the detection method based on the melting curve and the TaqMan (registered trademark) method in detecting single nucleotide mutations.
  • the base mutation there is a somatic mutation in which the base sequence is acquired by a disease such as cancer. Detecting the presence or absence of somatic mutation is very useful in selecting a method for treating a disease.
  • nucleic acid sample has a wild type sequence
  • the nucleic acid having the mutant type sequence may be present in a very small copy number.
  • it may be difficult to detect a somatic mutation by a detection method using a melting curve with low detection sensitivity or the TaqMan (registered trademark) method.
  • Patent Document 1 and Non-Patent Document 1 after PCR amplification of a wild type sequence is blocked by artificial nucleic acid PNA (Peptide Nucleic Acid) and a mutant sequence is specifically PCR amplified, a melting curve of the PCR product is obtained.
  • PNA Peptide Nucleic Acid
  • a method has been proposed that detects the presence or absence of a base mutation based on the difference in melting curves between the wild type and the mutant type.
  • Patent Document 1 and Non-Patent Document 1 since the presence or absence of a base mutation is detected by a melting curve, when a nucleic acid having a base mutation exists in a nucleic acid sample in a very small copy number, It may be difficult to detect the mutation. Moreover, in addition to the base mutation to be detected, when a single nucleotide polymorphism (SNP), base insertion, base deletion, or the like is included, the base mutation may be erroneously detected. In addition, when the base mutation to be detected is an insertion or deletion of one base, there is a case where the melting curve does not differ greatly between the wild type and the mutant type, and the identification may be difficult.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • the present invention provides a method and kit for detecting a base mutation capable of detecting a base mutation even when a nucleic acid sample having a base mutation has a very small copy number. Objective. It is another object of the present invention to provide a method and kit for detecting a base mutation that can accurately detect a base mutation even if a base mutation other than the base mutation to be detected is present in the nucleic acid sample. Furthermore, an object of the present invention is to provide a method and kit for detecting a base mutation capable of detecting a base mutation even if the base mutation to be detected is an insertion or deletion of one base. Another object of the present invention is to provide a method for suppressing PCR amplification of a nucleic acid sample in a sequence-specific manner.
  • the present invention is as follows.
  • the method for detecting a base mutation according to the first aspect of the present invention is a method for detecting a base mutation in a target base sequence of a nucleic acid sample, comprising: a primer set capable of amplifying an amplification target region containing the target base sequence by PCR; A blocker nucleic acid fragment having a base sequence complementary to the target base sequence and comprising at least one residue of an artificial nucleic acid; and the target base on the same strand as the target base sequence in the amplification target region
  • the nucleic acid sample was used as a template using a probe that hybridizes to a region closer to the 5 ′ end than the sequence, has a fluorescent substance at one of the 5 ′ end or the 3 ′ end, and has a quencher at the other end.
  • the artificial nucleic acid may be BNA.
  • the melting temperature of the blocker nucleic acid fragment and the melting temperature of the probe may be higher than the melting temperature of the primer set.
  • the target base sequence may be a wild-type base sequence.
  • a PCR reaction when performing the PCR reaction, is further performed using a standard nucleic acid having a wild-type base sequence as a template, and the amount of nucleic acid amplified when the nucleic acid sample is used as a template, When the amount of nucleic acid amplified is larger than that when the standard nucleic acid is used as a template, it may be determined that a base mutation exists in the target base sequence of the nucleic acid sample.
  • the target base sequence may be a base sequence of a KRAS, NRAS, BRAF, EGFR, or PIK3CA gene.
  • the kit according to the second aspect of the present invention is a kit for detecting a base mutation in a target base sequence of a nucleic acid sample, a primer set capable of amplifying a target region for amplification containing the target base sequence by PCR, A blocker nucleic acid fragment having a base sequence complementary to the target base sequence and comprising at least one residue of an artificial nucleic acid; Of the amplification target region, on the same strand as the target base sequence, hybridizes to a region closer to the 5 ′ end than the target base sequence, and has a fluorescent substance at one of the 5 ′ end or the 3 ′ end, And a probe having a quenching substance on the other side.
  • the artificial nucleic acid may be BNA.
  • the melting temperature of the blocker nucleic acid fragment and the melting temperature of the probe may be higher than the melting temperature of the primer set.
  • the target base sequence may be a base sequence of a KRAS, NRAS, BRAF, EGFR, or PIK3CA gene.
  • a method for suppressing PCR amplification of a nucleic acid sample having a target base sequence provides a primer set capable of amplifying the target region of amplification of the nucleic acid sample containing the target base sequence by PCR, A PCR reaction using the nucleic acid sample as a template is performed using a blocker nucleic acid fragment having a base sequence complementary to the target base sequence and containing an artificial nucleic acid of at least one residue.
  • the artificial nucleic acid may be BNA.
  • the melting temperature of the blocker nucleic acid fragment may be higher than the melting temperature of the primer set.
  • a base mutation can be detected even when the nucleic acid sample has a very small copy number of the nucleic acid having the base mutation. . Moreover, according to the method and kit for detecting a base mutation according to the above aspect of the present invention, a base mutation can be accurately detected even if a base mutation other than the base mutation to be detected is present in the nucleic acid sample. Moreover, according to the method and kit for detecting a base mutation according to the above aspect of the present invention, a base mutation can be detected even if the base mutation to be detected is an insertion or deletion of one base. Moreover, according to the said aspect of this invention, the method of suppressing PCR amplification of a nucleic acid sample in a sequence specific can be provided.
  • 6 is a graph showing the results of detecting base mutations in codons 12 to 13 of the KRAS gene. It is a graph which shows the result of having detected the base mutation of the codon 61 of a KRAS gene. It is a graph which shows the result of having detected the base mutation of the codon 146 of a KRAS gene. 6 is a graph showing the results of detecting base mutations in codons 12 to 13 of the KRAS gene. It is a graph which shows the result of having detected the base mutation of the codon 61 of a KRAS gene.
  • the method for detecting a base mutation in a target base sequence of a nucleic acid sample uses a primer set, a blocker nucleic acid fragment, and a probe to perform a PCR reaction using the nucleic acid sample as a template. Furthermore, the amount of template amplification in the PCR reaction is measured by detecting fluorescence derived from the probe.
  • the primer set can amplify an amplification target region including the target base sequence by PCR.
  • the blocker nucleic acid fragment has a base sequence complementary to the target base sequence and includes an artificial nucleic acid having at least one residue.
  • the probe hybridizes to a region closer to the 5 ′ end than the target base sequence on the same strand as the target base sequence in the target amplification sequence, and has a fluorescent substance at one of the 5 ′ end or the 3 ′ end, The other has a quencher.
  • FIG. 1 is a schematic diagram for explaining a base mutation detection method according to the present embodiment.
  • a base mutation 20 ′ (adenine residue in FIG. 1) in the target base sequence 10 is detected will be described.
  • the residue of the wild-type sequence corresponding to the base mutation 20 ′ is residue 20 (guanine residue in FIG. 1).
  • a region having a target base sequence in a nucleic acid sample (a part having the target base sequence) is referred to as a target base sequence.
  • base means a purine base or pyrimidine base such as adenine, guanine, thymine, and cytosine.
  • the “residue” means a unit corresponding to a nucleotide in the case of DNA. That is, in the present specification, the “base” means a base portion or a portion corresponding to the base portion of residues consisting of “base, sugar, and phosphate” in the case of DNA. In addition, “residue” means a unit consisting of “base, sugar and phosphate” in the case of DNA or a unit corresponding thereto.
  • a PCR reaction is performed in the presence of the primer 40F and the primer 40R, the blocker nucleic acid fragment 50, and the probe 60.
  • the primer 40F and the primer 40R are primer sets that can amplify the amplification target region 30 including the target base sequence 10 by PCR using the nucleic acid sample w (wild type) and the nucleic acid sample m (mutant type) as templates.
  • the blocker nucleic acid fragment 50 has a base sequence complementary to the target base sequence 10.
  • the probe 60 hybridizes to a region 5 ′ of the target base sequence 10 on the same strand as the target base sequence 10 in the amplification target region 30, and a fluorescent substance is added to one of the 5 ′ end or the 3 ′ end. Having a quencher on the other side.
  • the probe 60 has a base sequence complementary to the template.
  • the fluorescent material F is bonded to one end of the probe 60, and the quenching material Q is bonded to the other end.
  • the melting temperature of the blocker nucleic acid fragment 50 and the melting temperature of the probe 60 are preferably higher than the melting temperatures of the primer 40F and the primer 40R. Thereby, in the annealing process in the PCR reaction, the blocker nucleic acid fragment 50 and the probe 60 can be bound to the template before the primer 40F and the primer 40R, and the detection accuracy of the base mutation can be improved.
  • the reaction solution is first heated to about 90 to 99 ° C. to denature the nucleic acid.
  • the temperature of the reaction solution is lowered to about 50 to 60 ° C. and annealed.
  • the blocker nucleic acid fragment 50 and the probe 60 are bound to the template before the primer 40F and the primer 40R.
  • the blocker nucleic acid fragment 50 since the blocker nucleic acid fragment 50 has a wild-type base sequence, it binds to the wild-type template w. However, it does not bind to the mutant template m having the base mutation 20 '.
  • primer 40F and primer 40R bind to the template.
  • the temperature of the reaction solution is adjusted to about 60 to 75 ° C., and primer extension reaction with Taq polymerase is performed.
  • primer extension reaction since the blocker nucleic acid fragment 50 is bound to the wild-type template w, the primer extension reaction is hindered.
  • the blocker nucleic acid fragment 50 is not bound to the mutant template m, a primer extension reaction is performed.
  • the extension of the primer reaches the binding site of the probe 60.
  • the probe is degraded by the 5 ′ ⁇ 3 ′ exonuclease activity of Taq polymerase.
  • the fluorescent substance F is released from the quenching substance Q and emits fluorescence.
  • the PCR reaction When the PCR reaction is advanced by repeating the cycles of denaturation, annealing, and extension, the PCR amplification of the wild type template w is suppressed, and the PCR amplification of the mutant type template m is preferentially performed.
  • the amount of the fluorescent substance F increases in proportion to the PCR amplification amount of the template m.
  • the PCR amplification amount of the template m can be measured. Thereby, the presence of the base mutation 20 'in the target base sequence 10 of the nucleic acid sample can be detected.
  • the suppression of the PCR amplification is efficiently performed by the blocker nucleic acid fragment 50 containing an artificial nucleic acid having at least one residue. Specific artificial nucleic acids will be described later.
  • the position of the artificial nucleic acid may be any of the residues constituting the blocker nucleic acid fragment 50.
  • the blocker nucleic acid fragment 50 suppresses the PCR amplification of the wild-type template w, so that a nucleic acid having a base mutation is present in a very small number of copies in the nucleic acid sample. Even if it exists, a base mutation can be detected.
  • the base mutation in the target base sequence 10 can be accurately detected. Moreover, even if the base mutation in the target base sequence 10 is an insertion or deletion of one base, the base mutation can be detected. Further, within the range of the target base sequence 10, even if a new base mutation exists, the base mutation can be performed without changing the design of the primer 40F, the primer 40R, the blocker nucleic acid fragment 50, and the probe 60. Can be detected.
  • the method according to the present embodiment not only can the genotype of a low-copy-number somatic mutation gene be determined, but it is also possible to deal with a newly discovered mutant form in the future. is there. Therefore, the method according to the present embodiment is also useful for customized medicine such as early detection of oncogenes.
  • the base mutation means a difference in the base sequence of a gene existing between individuals of the same biological species. According to the detection method according to the present embodiment, not only a congenital base mutation such as SNP or microsatellite polymorphism but also one or more bases in the base sequence are substituted, deleted, or inserted. Acquired base mutations such as somatic mutations can also be detected.
  • the nucleic acid sample may be a sample containing genomic DNA derived from a test subject. Alternatively, it may be a sample containing an amplification product obtained by previously amplifying a region containing a target base mutation site by PCR or the like using genomic DNA as a template.
  • the target base sequence 10 may be one or plural.
  • a plurality of amplification target regions 30 including each target base sequence 10 are simultaneously PCR amplified using a plurality of pairs of primer sets using a nucleic acid sample as a template (“multiplex PCR” or “mPCR”).
  • the PCR amplification product may be used as a nucleic acid sample to detect a base mutation in each target base sequence. Thereby, even if a nucleic acid sample is scarce, for example, a sample can be increased and a base mutation can be detected.
  • the target base sequence 10 may be a wild type base sequence.
  • the blocker nucleic acid fragment 50 has a base sequence complementary to the target base sequence 10. Therefore, in this case, PCR amplification of the wild-type template w can be suppressed and PCR amplification of the mutant template m can be performed preferentially. This makes it easy to detect a base mutation even when the abundance of the mutant template m in the nucleic acid sample is small.
  • the target base sequence is not particularly limited, but may be, for example, the base sequence of KRAS, NRAS, BRAF, EGFR, or PIK3CA gene. Mutations in these genes have been reported to be associated with cancer, particularly colon cancer.
  • anti-EGFR antibody is a kind of cancer therapeutic agent, but it is known that the effect of anti-EGFR antibody cannot be obtained in the case of colorectal cancer having mutations in codons 12 and 13 of KRAS gene.
  • colorectal cancer there are patients with BRAF gene mutation in about 10% of the KRAS gene exon 2 which is wild type, and it has been reported that the prognosis is poor.
  • detecting the presence or absence of somatic mutations in the above genes is very useful in selecting a method for treating a disease.
  • Melting temperature is the temperature at which 50% of DNA molecules are denatured to become single-stranded.
  • the melting temperature can be determined based on a change in the absorbance of the nucleic acid.
  • the bases constituting the nucleic acid have strong absorption around a wavelength of 260 nm.
  • the absorbance of the whole nucleic acid is smaller than the sum of the absorbances of the individual bases due to stacking interaction.
  • the individual bases become free and absorb light, so that the absorbance becomes higher than that of the double-stranded nucleic acid.
  • the melting temperature corresponds to the temperature at the inflection point of this curve and can be defined as the temperature at 50% of the total increase in absorbance.
  • the blocker nucleic acid fragment 50 has at least one residue of an artificial nucleic acid.
  • PNA peptide nucleic acids
  • BNA cross-linked nucleic acids
  • GAA glycol nucleic acids
  • TAA threose nucleic acids
  • ENA ENA (2′-O, 4′-C-ethylene-crosslinked)
  • Nucleoside-modified nucleic acids such as enantiomers (for example, ⁇ -L-deoxynucleosides instead of ⁇ -D-deoxynucleosides) are known.
  • the artificial nucleic acid is preferably BNA among these.
  • PNA oligonucleotides have problems such as difficulty in synthesizing a structure having a long chain length due to the specificity of the structure, and remarkably lower solubility in water depending on the base sequence.
  • the BNA oligonucleotide does not have such a problem, and is a more suitable substance for use in the blocker nucleic acid fragment according to this embodiment.
  • BNA has a higher Tm value than other artificial nucleic acids, and is therefore a more suitable material for use as a blocker.
  • the blocker nucleic acid fragment is not present even in a reaction in a high temperature range by nucleic acid amplification reaction (PCR), such as a step of heating the reaction solution to about 90 to 99 ° C. to denature the nucleic acid. Since it is difficult to remove from the binding portion of the template w, the PCR amplification of the template w can be more effectively suppressed.
  • PCR nucleic acid amplification reaction
  • the inventors have found that the blocker nucleic acid fragment 50 having at least one residue of BNA exhibits a markedly improved PCR amplification suppression efficiency.
  • a nucleic acid fragment in which all residues are BNA is used as the blocker nucleic acid fragment 50, there is a possibility that a region that does not match completely, such as a mutant sequence or another region having a similar sequence, may be blocked.
  • BNA is a general term for cross-linked nucleic acids.
  • BNA includes 2 ', 4'-BNA, 3', 4'-, which is a nucleotide having two cyclic structures in which the oxygen atom at the 2 'site of ribose and the carbon atom at the 4' site are bonded via methylene.
  • BNA, 2′-deoxy-3′-N-3 ′, 4′-BNA, 3′-N-2 ′, 4′-BNA; 2nd-position O and 4th-position C of the furanose ring are represented by —NRCH 2 2 ′, 4′-BNA NC having a structure in which — (R is a methyl group) is bridged; 2 ′ having a structure in which O at the 2-position of the furanose ring and C at the 4-position are bridged with —CH 2 OCH 2 — , 4′-BNA COC and the like are known.
  • the BNA included in the blocker nucleic acid fragment 50 may be any of the BNAs described above, but is preferably 2 ', 4'-BNA.
  • the length of the blocker nucleic acid fragment 50 is not particularly limited as long as the melting temperature is higher than that of the primer 40F and the primer 40R.
  • the probe used in the present embodiment is an oligonucleotide having a fluorescent substance at one of the 5 ′ end and the 3 ′ end and a quenching substance at the other end.
  • a TaqMan (registered trademark) probe can also be used as the probe.
  • usable fluorescent materials include FAM, Yakima Yellow (registered trademark), fluorescein, FITC, VIC (registered trademark), and the like.
  • TAMRA etc. are mentioned as a quenching substance which can be used.
  • the primer 40F, the blocker nucleic acid fragment 50, and the probe 60 are bound on the same strand of the template w in this order from the 3 ′ side to the 5 ′ side of the strand.
  • the template w PCR amplification of the template w is suppressed and decomposition of the probe 60 is suppressed.
  • the probe 60 is decomposed by the extension of the primer 40F, and the fluorescent substance F is released quantitatively.
  • the amount of PCR amplification of the template can be measured by measuring the amount of fluorescence of the fluorescent substance F released by the decomposition of the probe 60. It is preferable to measure fluorescence in real time simultaneously with the PCR reaction. When measuring such fluorescence in real time, it can be carried out using various devices used in real-time quantitative PCR.
  • a base mutation In detecting a base mutation, it is preferable to prepare a control nucleic acid sample. Thereby, a base mutation can be detected more accurately.
  • a control for example, a nucleic acid sample (standard nucleic acid) having a wild-type base sequence can be used.
  • the base sequence in the target nucleotide sequence of the nucleic acid sample is used. It can be determined that a mutation exists.
  • the target base sequence is a wild-type base sequence, a primer set, a blocker nucleic acid fragment, and a probe And a PCR reaction using the nucleic acid sample and a standard nucleic acid having a wild-type base sequence as a template.
  • the primer set can amplify an amplification target region including the target base sequence by PCR.
  • the blocker nucleic acid fragment has a base sequence complementary to the target base sequence and includes an artificial nucleic acid having at least one residue.
  • the probe hybridizes to a region 5 ′ of the target base sequence on the same strand as the target base sequence in the amplification target region, has a fluorescent substance at one of the 5 ′ end or the 3 ′ end, and the other Has a quencher. Furthermore, the amount of amplification of the template in the PCR reaction is measured by detecting fluorescence derived from the probe. Furthermore, when the nucleic acid amplification amount when the nucleic acid sample is used as a template is larger than the nucleic acid amplification amount when the standard nucleic acid is used as a template, the base sequence of the nucleic acid sample is It is determined that there is a mutation.
  • a kit for detecting a base mutation in a target base sequence of a nucleic acid sample according to the second embodiment of the present invention includes a primer set, a blocker nucleic acid fragment, and a probe.
  • the primer set can amplify an amplification target region including the target base sequence by PCR.
  • the blocker nucleic acid fragment has a base sequence complementary to the target base sequence and includes an artificial nucleic acid having at least one residue.
  • the probe hybridizes to a region 5 ′ of the target base sequence on the same strand as the target base sequence in the amplification target region, has a fluorescent substance at one of the 5 ′ end or the 3 ′ end, and the other Has a quencher.
  • the kit according to this embodiment can be suitably used for the above-described method for detecting a base mutation.
  • Specific embodiments of the blocker nucleic acid fragment and the probe are the same as those described above.
  • the blocker nucleic acid fragment suppresses PCR amplification of a template that is not a detection target (for example, a nucleic acid having a wild-type base sequence), whereby a detection target template (for example, a base mutation can be detected even when a nucleic acid having a base mutation) has a very small copy number.
  • a detection target for example, a nucleic acid having a wild-type base sequence
  • the base mutation in the target base sequence can be accurately detected.
  • the base mutation in the target base sequence is an insertion or deletion of one base, the base mutation can be detected.
  • it exists in the range of object base sequence even if it is a case where a novel base mutation exists, a base mutation can be detected.
  • the artificial nucleic acid is preferably BNA from the viewpoint of increasing the efficiency of suppressing PCR amplification by the blocker nucleic acid fragment.
  • a suitable BNA has the same configuration as described above.
  • the melting temperature of the blocker nucleic acid fragment and the melting temperature of the probe are preferably higher than the melting temperature of the primer set.
  • the target base sequence may be a base sequence of KRAS, NRAS, BRAF, EGFR, or PIK3CA gene.
  • a kit is useful for diagnosing cancer such as colorectal cancer and selecting a treatment method.
  • the method for suppressing PCR amplification of a nucleic acid sample having a target base sequence uses a primer set that can amplify an amplification target region including the target base sequence of a nucleic acid sample by PCR.
  • the primer set can amplify the amplification target region including the target base sequence of the nucleic acid sample by PCR.
  • a PCR reaction using the nucleic acid sample as a template is performed in the presence of a blocker nucleic acid fragment having a base sequence complementary to the target base sequence and containing an artificial nucleic acid of at least one residue.
  • the method according to this embodiment can specifically suppress PCR amplification of a template having a specific base sequence.
  • the specific mode of the blocker nucleic acid fragment is the same as that described above.
  • the artificial nucleic acid is preferably BNA from the viewpoint of increasing the efficiency of suppressing PCR amplification by a blocker nucleic acid fragment.
  • a suitable BNA has the same configuration as described above.
  • the melting temperature of the blocker nucleic acid fragment is preferably higher than the melting temperature of the primer set.
  • a reaction solution for PCR reaction was prepared so as to have the composition shown in Table 2. Moreover, the reaction liquid which added the blocker nucleic acid fragment and the reaction liquid which does not add were prepared. When no blocker nucleic acid fragment was added, the same volume of water was added. BNA (2 ′, 4′-BNA) was used as an artificial nucleic acid for the blocker nucleic acid fragment.
  • the probe used was FAM as a fluorescent material and TAMRA as a quencher.
  • human genomic DNA was used for the nucleic acid sample. Specific contents of the nucleic acid sample will be described later.
  • each prepared PCR reaction solution was set in a real-time PCR analysis system (trade name “CFX96”, Bio-Rad), held at 50 ° C. for 2 minutes, then held at 95 ° C. for 10 minutes, Enzymes in the TaqMan® Gene Expression Master Mix were activated. Then, after denaturing by holding at 95 ° C. for 15 seconds, it was kept at 60 ° C. for 30 seconds to anneal and extend. This repeated reaction at 95 ° C. for 15 seconds and 60 ° C. for 30 seconds was carried out for 40 cycles.
  • CFX96 real-time PCR analysis system
  • FIG. 2 is a graph showing the results of detecting base mutations in codons 12 to 13 of the KRAS gene.
  • the horizontal axis indicates the number of PCR cycles, and the vertical axis indicates the intensity of fluorescence derived from the probe.
  • human genomic DNA in which the nucleotide sequence of codons 12 to 13 of the KRAS gene is 100% wild type was used.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of detecting the base mutation of codon 61 of the KRAS gene in the same manner as described above.
  • a nucleic acid sample human genomic DNA having a 100% wild-type base sequence of codon 61 of the KRAS gene was used.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of detecting the base mutation of codon 146 of the KRAS gene in the same manner as described above.
  • a nucleic acid sample human genomic DNA having a 100% wild type nucleotide sequence of codon 146 of the KRAS gene was used.
  • Example 2 A reaction solution for PCR reaction was prepared in the same manner as in Experimental Example 1 except that the nucleic acid sample was changed. Specific contents of the nucleic acid sample will be described later. Moreover, the reaction liquid which added the blocker nucleic acid fragment and the reaction liquid which does not add were prepared. When no blocker nucleic acid fragment was added, the same volume of water was added.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of detecting base mutations in codons 12 to 13 of the KRAS gene.
  • human genomic DNA in which the nucleotide sequence of codons 12 to 13 of the KRAS gene is 100% wild type (indicated as “wild type” in FIG. 5), or human genomic DNA having the wild type sequence of 90% A mixture of 10% human genomic DNA having a G13D mutation (GGC ⁇ GAC) at codons 12 to 13 of the KRAS gene (shown as “mutant” in FIG. 5) was used.
  • the amount of amplification of the nucleic acid sample containing the mutant template was larger than that of the wild type template. This result indicates that a base mutation exists in codons 12 to 13 of the KRAS gene in the nucleic acid sample. This result also shows that the base mutation can be clearly detected if the mutant template is present in the nucleic acid sample at 10%.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of detecting a base mutation at codon 61 of the KRAS gene.
  • human genomic DNA whose base sequence of codon 61 of the KRAS gene is 100% wild type shown as “wild type” in FIG. 6
  • human genomic DNA having the wild type sequence 90%
  • KRAS A mixture of 10% of human genomic DNA having a Q61H mutation (CAA ⁇ CAC) at gene codon 61 (shown as “mutant” in FIG. 6) was used.
  • the amount of amplification of the nucleic acid sample containing the mutant template was larger than that of the wild type template. This result indicates that there is a base mutation at codon 61 of the KRAS gene in the nucleic acid sample. This result also shows that the base mutation can be clearly detected if the mutant template is present in the nucleic acid sample at 10%.
  • a base mutation can be detected even when a nucleic acid having a base mutation is present in a very small copy number in a nucleic acid sample. Further, even if a base mutation other than the base mutation to be detected exists, the base mutation can be detected accurately. Further, even if the base mutation to be detected is an insertion or deletion of one base, the base mutation can be detected.
  • the present invention can provide a method for suppressing PCR amplification of a nucleic acid sample in a sequence-specific manner.
  • SYMBOLS 10 Target base sequence, 20 ... Residue, 20 '... Base mutation, 30 ... Amplification object region, 40F, 40R ... Primer, 50 ... Blocker nucleic acid fragment, 60 ... Probe, w ... Wild type nucleic acid sample (wild type template) ), M ... mutant nucleic acid sample (mutant template), F ... fluorescent substance, Q ... quenching substance.

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Abstract

　本発明の塩基変異の検出方法は、核酸サンプルの対象塩基配列中の塩基変異の検出方法であって、前記対象塩基配列を含む増幅対象領域をＰＣＲによって増幅可能なプライマーセットと；前記対象塩基配列に相補的な塩基配列を有し、少なくとも１残基の人工核酸を含む、ブロッカー核酸断片と；前記増幅対象領域のうち、前記対象塩基配列と同一鎖上で、前記対象塩基配列よりも５'末端に近い領域にハイブリダイズし、５'末端又は３'末端の一方に蛍光物質を有し、他方に消光物質を有するプローブと、を用いて、前記核酸サンプルを鋳型としたＰＣＲ反応を行い、前記プローブ由来の蛍光を検出することにより、前記ＰＣＲ反応における前記鋳型の増幅量を測定する。

Description

塩基変異の検出方法及びキット並びに核酸サンプルのＰＣＲ増幅を抑制する方法
　本発明は、塩基変異の検出方法及びキット並びに核酸サンプルのＰＣＲ増幅を配列特異的に抑制する方法に関する。
　本願は、２０１４年１２月１１日に日本に出願された特願２０１４－２５０９０１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　遺伝子の塩基配列は個体間で様々である。これらの塩基配列の違いのうち、頻度が１％以上のものは「遺伝子多型」と呼ばれる。多型の種類は様々であり、塩基の置換、塩基の挿入又は欠損、特定の塩基配列の繰り返し回数の違い等が挙げられる。これらの多型を塩基変異という。
　塩基変異の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物の融解曲線を解析する方法や、ＴａｑＭａｎ（登録商標）法、ＰＣＲ産物の塩基配列をシーケンスする方法、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）法等により行われている。
　融解曲線を解析する方法では、まず、ＰＣＲ法により、検出対象となる対象塩基配列の近傍を増幅する。ＰＣＲ法とは、耐熱性ポリメラーゼと、標的核酸と相補性を有する２つのプライマーとを用いて、（１）鋳型となる２本鎖標的核酸の変性、（２）変性した標的核酸へのプライマーのアニーリング、（３）プライマーからの伸長反応、という３つのステップを、温度制御を行うことにより繰り返し、指数関数的に標的核酸を増幅する方法である。
　続いて、インターカレーター試薬を使用してＰＣＲ産物の融解曲線を作成する。インターカレーター試薬は、溶液中に存在する際には、２分子以上の集合体として存在するため、エキシトン効果により蛍光発光を示さないが、標的核酸にインターカレートすることで、集合状態から単離され、蛍光発光する。インターカレーター試薬としては、例えばエチジウムブロマイドやサイバーグリーンが挙げられる。
　より具体的には、ＰＣＲ産物の温度を上昇させて、二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離（融解）させると、インターカレーター試薬からの蛍光が消失する。これを利用して、融解曲線を作成する。続いて融解曲線を解析し、ＰＣＲ産物の塩基配列の相違によって融解曲線がわずかに相違することに基づいて塩基変異を検出する。
　また、ＴａｑＭａｎ（登録商標）法では、蛍光物質及び消光物質を付加したＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの存在下でＰＣＲ反応を行うと、上記のＰＣＲ法のステップ（２）においてＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが標的核酸にアニーリングされる。さらにステップ（３）の伸長反応に伴い、ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によりＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが分解される。その結果、消光物質から遊離した蛍光物質が蛍光を発するようになる。
　ＴａｑＭａｎ（登録商標）法により塩基変異を検出する場合、例えば、塩基変異を有する配列（変異型配列）に相補的なＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、及び、上記ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブとは蛍光物質が異なっており、野生型配列に相補的なＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの、２種類のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの存在下でＰＣＲ反応を行う。その後、分解した各ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブに由来する２色の蛍光の蛍光強度を比較することにより、塩基変異が検出される。
　また、シーケンス法では、ＰＣＲ産物の塩基配列を直接解読することにより、塩基変異が検出される。
　また、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）法では、ＤＮＡの三重鎖構造を特異的に認識して切断するクリベースを利用して、塩基変異が検出される。
　これらの塩基配列の検出方法のうち、シーケンス法やＩｎｖａｄｅｒ（登録商標）法は、融解曲線による検出方法やＴａｑＭａｎ（登録商標）法よりも、１塩基変異の検出能力に優れている。
　ところで、塩基変異の中には、癌等の疾患により後天的に塩基配列が変異する体細胞変異が存在する。体細胞変異の有無を検出することは、疾患の治療方法の選択を行うにあたり、非常に有用である。
　体細胞変異には、未知の変異配列が多く存在する。そのため、シーケンス法やＩｎｖａｄｅｒ（登録商標）法によってこれらの塩基変異を検出するためには、新たな塩基変異が発見される度に、使用するプライマーやプローブの配列を見直さなければならないという問題がある。
　また、体細胞変異の場合、核酸サンプル中の大部分は野生型配列を有しており、変異型配列を有する核酸は、ごくわずかなコピー数しか存在しない場合がある。このような場合、検出感度が低い融解曲線による検出方法やＴａｑＭａｎ（登録商標）法では体細胞変異を検出することが困難な場合がある。
　したがって、体細胞変異の検出に適した塩基変異の検出方法が求められている。体細胞変異の検出においては、体細胞変異の塩基配列を詳細に解明する必要はなく、塩基変異の有無のみを検出できればよい場合がある。
　例えば、特許文献１及び非特許文献１では、人工核酸ＰＮＡ（Peptide Nucleic Acid）により野生型配列のＰＣＲ増幅をブロックして、変異型配列を特異的にＰＣＲ増幅した後、ＰＣＲ産物の融解曲線を作成し、野生型と変異型との融解曲線の相違に基づいて、塩基変異の有無を検出する方法が提案されている。
日本国特表２０１４－５０１５３３号公報
Bjornar Gilje, et al., Journal of Molecular Diagnostics, 10, 325-331, 2008
　しかしながら、特許文献１や非特許文献１では、融解曲線により塩基変異の有無を検出しているため、核酸サンプル中に、塩基変異を有する核酸がごくわずかなコピー数しか存在しない場合には、塩基変異を検出することが困難な場合がある。また、検出対象の塩基変異以外に、一塩基多型（ＳＮＰ）や、塩基の挿入、塩基の欠失等を含む場合には、塩基変異を誤検出してしまう場合がある。また、検出対象の塩基変異が１塩基の挿入や欠失である場合は、野生型と変異型とで融解曲線に大きな違いが生じず、識別が困難になる場合がある。
　そこで、本発明は、核酸サンプル中に、塩基変異を有する核酸がごくわずかなコピー数しか存在しない場合であっても塩基変異を検出することができる塩基変異の検出方法及びキットを提供することを目的とする。また本発明は、核酸サンプル中に、検出対象の塩基変異以外の塩基変異が存在しても正確に塩基変異を検出することができる塩基変異の検出方法及びキットを提供することを目的とする。さらに本発明は、検出対象の塩基変異が１塩基の挿入や欠失であっても塩基変異の検出が可能な塩基変異の検出方法及びキットを提供することを目的とする。本発明はまた、核酸サンプルのＰＣＲ増幅を配列特異的に抑制する方法を提供することを目的とする。
　本発明は以下の通りである。
　本発明の第一態様に係る塩基変異の検出方法は、核酸サンプルの対象塩基配列中の塩基変異の検出方法であって、前記対象塩基配列を含む増幅対象領域をＰＣＲによって増幅可能なプライマーセットと；前記対象塩基配列に相補的な塩基配列を有し、少なくとも１残基の人工核酸を含む、ブロッカー核酸断片と；前記増幅対象領域のうち、前記対象塩基配列と同一鎖上で、前記対象塩基配列よりも５’末端に近い領域にハイブリダイズし、５’末端又は３’末端の一方に蛍光物質を有し、他方に消光物質を有するプローブと、を用いて、前記核酸サンプルを鋳型としたＰＣＲ反応を行い、前記プローブ由来の蛍光を検出することにより、前記ＰＣＲ反応における前記鋳型の増幅量を測定する。
　上記第一態様において、前記人工核酸は、ＢＮＡであってもよい。
　上記第一態様において、前記ブロッカー核酸断片の融解温度及び前記プローブの融解温度は、前記プライマーセットの融解温度よりも高くてもよい。
　上記第一態様において、前記対象塩基配列が、野生型の塩基配列であってもよい。
　上記第一態様において、前記ＰＣＲ反応を行う際に、更に、野生型の塩基配列を有する標準核酸を鋳型としたＰＣＲ反応を行い、前記核酸サンプルを鋳型に用いた場合の核酸の増幅量が、前記標準核酸を鋳型に用いた場合の核酸の増幅量と比較して多かった場合に、前記核酸サンプルの対象塩基配列に塩基変異が存在すると判定してもよい。
　上記第一態様において、前記対象塩基配列が、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、又はＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の塩基配列であってもよい。
　本発明の第二態様に係るキットは、核酸サンプルの対象塩基配列中の塩基変異を検出するためのキットであって、前記対象塩基配列を含む増幅対象領域をＰＣＲによって増幅可能なプライマーセットと、前記対象塩基配列に相補的な塩基配列を有し、少なくとも１残基の人工核酸を含む、ブロッカー核酸断片と、
　前記増幅対象領域のうち、前記対象塩基配列と同一鎖上で、前記対象塩基配列よりも５’末端に近い領域にハイブリダイズし、５’末端又は３’末端の一方に蛍光物質を有し、他方に消光物質を有するプローブと、を含む。
　上記第二態様において、前記人工核酸は、ＢＮＡであってもよい。
　上記第二態様において、前記ブロッカー核酸断片の融解温度及び前記プローブの融解温度は、前記プライマーセットの融解温度よりも高くてもよい。
　上記第二態様において、前記対象塩基配列が、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、又はＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の塩基配列であってもよい。
　本発明の第三態様に係る、対象塩基配列を有する核酸サンプルのＰＣＲ増幅を抑制する方法は、前記核酸サンプルの前記対象塩基配列を含む増幅対象領域をＰＣＲによって増幅可能なプライマーセットを用意し、前記核酸サンプルを鋳型としたＰＣＲ反応を、前記対象塩基配列に相補的な塩基配列を有し、少なくとも１残基の人工核酸を含む、ブロッカー核酸断片を用いて行う。
　上記第三態様において、前記人工核酸は、ＢＮＡであってもよい。
　上記第三態様において、前記ブロッカー核酸断片の融解温度は、前記プライマーセットの融解温度よりも高くてもよい。
　本発明の上記態様に係る塩基変異の検出方法及びキットによれば、核酸サンプル中に、塩基変異を有する核酸がごくわずかなコピー数しか存在しない場合であっても塩基変異を検出することができる。また、本発明の上記態様に係る塩基変異の検出方法及びキットによれば、核酸サンプル中に、検出対象の塩基変異以外の塩基変異が存在しても正確に塩基変異を検出することができる。また、本発明の上記態様に係る塩基変異の検出方法及びキットによれば、検出対象の塩基変異が１塩基の挿入や欠失であっても塩基変異を検出することができる。また、本発明の上記態様によれば、核酸サンプルのＰＣＲ増幅を配列特異的に抑制する方法を提供することができる。
本発明の第１実施形態に係る塩基変異の検出方法を説明する模式図である。 ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２～１３の塩基変異を検出した結果を示すグラフである。 ＫＲＡＳ遺伝子のコドン６１の塩基変異を検出した結果を示すグラフである。 ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１４６の塩基変異を検出した結果を示すグラフである。 ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２～１３の塩基変異を検出した結果を示すグラフである。 ＫＲＡＳ遺伝子のコドン６１の塩基変異を検出した結果を示すグラフである。
［塩基変異の検出方法］
　本発明の第１実施形態に係る核酸サンプルの対象塩基配列中の塩基変異の検出方法は、プライマーセットと、ブロッカー核酸断片と、プローブとを用いて、核酸サンプルを鋳型としたＰＣＲ反応を行う。さらに、プローブ由来の蛍光を検出することにより、ＰＣＲ反応における鋳型の増幅量を測定する。プライマーセットは、対象塩基配列を含む増幅対象領域をＰＣＲによって増幅可能である。ブロッカー核酸断片は、対象塩基配列に相補的な塩基配列を有し、少なくとも１残基の人工核酸を含む。プローブは、増幅対象領域のうち、対象塩基配列と同一鎖上で、対象塩基配列よりも５’末端に近い領域にハイブリダイズし、５’末端又は３’末端の一方に蛍光物質を有し、他方に消光物質を有する。
　まず、本実施形態の塩基変異の検出方法の概要を説明する。図１は、本実施形態に係る塩基変異の検出方法を説明する模式図である。図１に示すように、ここでは、対象塩基配列１０中の塩基変異２０’（図１ではアデニン残基）を検出する場合を説明する。塩基変異２０’に対応する野生型配列の残基は、残基２０（図１ではグアニン残基）である。なお、本明細書においては、核酸サンプル中の対象塩基配列を有する領域（対象塩基配列を有する部位）を、対象塩基配列と呼ぶ。また、本明細書において、「塩基」とは、アデニン、グアニン、チミン、シトシン等のプリン塩基又はピリミジン塩基を意味する。
　また、「残基」とは、ＤＮＡの場合のヌクレオチドに相当する単位を意味する。すなわち、本明細書において、「塩基」とは、ＤＮＡの場合の「塩基、糖、及びリン酸」からなる残基のうちの塩基部分又はこれに相当する部分を意味する。また、「残基」とは、ＤＮＡの場合の「塩基、糖、及びリン酸」からなる単位又はこれに相当する単位を意味する。
　まず、プライマー４０Ｆ及びプライマー４０Ｒと、ブロッカー核酸断片５０と、プローブ６０と、の存在下でＰＣＲ反応を行う。プライマー４０Ｆ及びプライマー４０Ｒは、核酸サンプルｗ（野生型）及び核酸サンプルｍ（変異型）を鋳型として、対象塩基配列１０を含む増幅対象領域３０をＰＣＲによって増幅可能なプライマーセットである。ブロッカー核酸断片５０は、対象塩基配列１０に相補的な塩基配列を有する。プローブ６０は、増幅対象領域３０のうち、対象塩基配列１０と同一鎖上で、対象塩基配列１０よりも５’側の領域にハイブリダイズし、５’末端又は３’末端の一方に蛍光物質を有し、他方に消光物質を有する。
　ブロッカー核酸断片５０を構成する残基のうち、少なくとも１残基は人工核酸である。
　また、プローブ６０は、鋳型に相補的な塩基配列を有しており、プローブ６０の一方の末端には蛍光物質Ｆが結合しており、他方の末端には消光物質Ｑが結合している。
　また、ブロッカー核酸断片５０の融解温度及びプローブ６０の融解温度は、プライマー４０Ｆ及びプライマー４０Ｒの融解温度よりも高いことが好ましい。これにより、ＰＣＲ反応におけるアニーリングの過程で、プライマー４０Ｆ及びプライマー４０Ｒよりも先にブロッカー核酸断片５０及びプローブ６０を鋳型に結合させることができ、塩基変異の検出精度を向上させることができる。
　ＰＣＲ反応では、まず反応溶液を９０～９９℃程度に加熱して、核酸を変性させる。次に、反応溶液の温度を５０～６０℃程度に下げ、アニーリングさせる。ここで、ブロッカー核酸断片５０及びプローブ６０の融解温度がプライマー４０Ｆ及びプライマー４０Ｒの融解温度より高い場合、ブロッカー核酸断片５０及びプローブ６０が、プライマー４０Ｆ及びプライマー４０Ｒよりも先に鋳型に結合する。このとき、ブロッカー核酸断片５０は、野生型の塩基配列を有しているため、野生型の鋳型ｗに結合する。しかしながら、塩基変異２０’を有する変異型の鋳型ｍには結合しない。その後、プライマー４０Ｆ及びプライマー４０Ｒが鋳型に結合する。
　次に、反応溶液の温度を６０～７５℃程度に調整し、Ｔａｑポリメラーゼによるプライマーの伸長反応を行う。ここで、野生型の鋳型ｗにはブロッカー核酸断片５０が結合しているため、プライマーの伸長反応が妨害される。一方、変異型の鋳型ｍにはブロッカー核酸断片５０が結合していないため、プライマーの伸長反応が行われる。
　やがて、プライマーの伸長はプローブ６０の結合部位に到達する。ここで、Ｔａｑポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によりプローブが分解される。その結果、蛍光物質Ｆが消光物質Ｑから遊離し、蛍光を発するようになる。
　変性、アニーリング、及び伸長のサイクルを繰り返してＰＣＲ反応を進めると、野生型の鋳型ｗのＰＣＲ増幅は抑制され、変異型の鋳型ｍのＰＣＲ増幅が優先的に行われる。また、蛍光物質Ｆの存在量は、鋳型ｍのＰＣＲ増幅量に比例して増大する。
　したがって、蛍光物質Ｆの蛍光の量を測定することにより、鋳型ｍのＰＣＲ増幅量を測定することができる。これにより、核酸サンプルの対象塩基配列１０中の塩基変異２０’の存在を検出することができる。上記のＰＣＲ増幅の抑制は、ブロッカー核酸断片５０が少なくとも１残基の人工核酸を含むことにより効率的に行われる。具体的な人工核酸については後述する。人工核酸の位置は、ブロッカー核酸断片５０を構成する残基のいずれであってもよい。
　本実施形態の方法によれば、ブロッカー核酸断片５０によって、野生型の鋳型ｗのＰＣＲ増幅を抑制することにより、核酸サンプル中に、塩基変異を有する核酸がごくわずかなコピー数しか存在しない場合であっても塩基変異を検出することができる。
　また、増幅対象領域３０のうち、対象塩基配列１０以外の領域に塩基変異が存在する場合であっても、対象塩基配列１０中の塩基変異を正確に検出することができる。また、対象塩基配列１０中の塩基変異が１塩基の挿入や欠失であっても塩基変異を検出することができる。また、対象塩基配列１０の範囲内であれば、新規の塩基変異が存在する場合であっても、プライマー４０Ｆ、プライマー４０Ｒ、ブロッカー核酸断片５０、及びプローブ６０の設計を変更することなく、塩基変異を検出することができる。
　また、ブロッカー核酸断片５０（対象塩基配列１０）を変更することにより、新規の塩基配列の探索を容易に行うことも可能である。
　このように、本実施形態に係る方法によれば、低コピー数の体細胞変異遺伝子の遺伝子型が判定可能であるのみならず、今後新たに発見される変異形態にも対応することが可能である。したがって、本実施形態に係る方法は、癌遺伝子の早期発見等のオーダーメイド医療にも有用である。
　続いて、本実施形態に係る塩基変異の検出方法について、より詳細に説明する。
（塩基変異）
　本明細書において、塩基変異とは、同一生物種の個体間において存在する遺伝子の塩基配列の相違を意味する。本実施形態に係る検出方法によれば、ＳＮＰやマイクロサテライト多型等の先天的な塩基変異だけでなく、塩基配列中の１又は複数の塩基が置換・欠失・挿入されることにより生じた、体細胞変異等の後天的な塩基変異も検出することができる。
（核酸サンプル）
　本実施形態において、核酸サンプルは、被験対象由来のゲノムＤＮＡを含有する試料であってもよい。あるいは、ゲノムＤＮＡを鋳型として、目的の塩基変異部位を含む領域を予めＰＣＲ等で増幅して得られた増幅産物を含有する試料であってもよい。
　本実施形態において、対象塩基配列１０は１個であってもよく、複数であってもよい。
　対象塩基配列１０が複数存在する場合、核酸サンプルを鋳型として、各対象塩基配列１０を含む複数の増幅対象領域３０を複数対のプライマーセットを用いて同時にＰＣＲ増幅し（「多重ＰＣＲ」又は「ｍＰＣＲ」とも呼ばれる。）、このＰＣＲ増幅産物を核酸サンプルに用いて各対象塩基配列中の塩基変異を検出してもよい。これにより、例えば核酸サンプルが希少な場合であっても、サンプルを増やして塩基変異を検出することができる。
（対象塩基配列）
　対象塩基配列１０は、野生型の塩基配列であってもよい。ブロッカー核酸断片５０は、対象塩基配列１０に相補的な塩基配列を有する。そのため、この場合、野生型の鋳型ｗのＰＣＲ増幅を抑制し、変異型の鋳型ｍのＰＣＲ増幅を優先的に行うことができる。これにより、核酸サンプル中の変異型の鋳型ｍの存在量が少ない場合であっても、塩基変異を検出することが容易になる。
　対象塩基配列は特に限定されないが、例えば、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、又はＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の塩基配列であってもよい。これらの遺伝子における変異は、癌、特に大腸癌と関連することが報告されている。
　また、例えば、抗ＥＧＦＲ抗体は癌の治療薬の一種であるが、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２、１３に変異がある大腸癌の場合、抗ＥＧＦＲ抗体の効果が得られないことが知られている。また、例えば大腸癌では、ＫＲＡＳ遺伝子のエクソン２が野生型であるものの１０％程度にＢＲＡＦ遺伝子の変異がある患者が存在し、予後が不良であることが報告されている。このように、上記の遺伝子における体細胞変異の有無を検出することは、疾患の治療方法の選択を行うにあたり、非常に有用である。
（融解温度）
　融解温度（Ｍｅｌｔｉｎｇ　Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、Ｔｍ）とは、ＤＮＡ分子の５０％が変性して一本鎖となる温度である。融解温度は、核酸の吸光度の変化に基づいて求めることができる。核酸を構成する塩基は、波長２６０ｎｍ付近に強い吸収を持っているが、二本鎖核酸では、スタッキング相互作用により、核酸全体の吸光度が個々の塩基の吸光度の総和より小さい。ところが、二本鎖核酸溶液が加熱され、水素結合が切断されると、個々の塩基が自由になって光を吸収するため、二本鎖核酸よりも吸光度が大きくなる。したがって、核酸の温度を変化させながら吸光度を測定し、横軸に温度、縦軸に吸光度をプロットするとシグモイド曲線が得られる。融解温度は、この曲線の変極点の温度に相当し、吸光度の全上昇分の５０％における温度として定義することができる。
（ブロッカー核酸断片）
　ブロッカー核酸断片５０は、人工核酸を少なくとも１残基有する。
　現在、人工核酸として、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、架橋化核酸（ＢＮＡ、Ｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ＥＮＡ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン－架橋化核酸）、鏡像体ヌクレオシド（例えば、β－Ｄ－デオキシヌクレオシドに代わるβ－Ｌ－デオキシヌクレオシド）等のヌクレオシド修飾された核酸等が知られている。
　本実施形態において、人工核酸は、これらの中でもＢＮＡであることが好ましい。
　例えば、ＰＮＡオリゴヌクレオチドはその構造の特異性から鎖長の長い構造の合成が困難なことや、塩基配列によっては水に対して著しく溶解性が低下するなどの問題がある。一方で、ＢＮＡオリゴヌクレオチドではそのような問題がなく、本実施形態に係るブロッカー核酸断片に使用するのに、より適した物質である。
　また、ＢＮＡは他の人工核酸に比べてＴｍ値が高いため、ブロッカーとして用いるのにより適した物質である。Ｔｍ値が高い場合、例えば、反応溶液を９０～９９℃程度に加熱して核酸を変性させる工程のように、核酸増幅反応（ＰＣＲ）による高温度域での反応のときでも、ブロッカー核酸断片が鋳型ｗの結合部から外れにくいため、鋳型ｗのＰＣＲ増幅の抑制をより効果的に行うことができる。
　発明者らは、ＢＮＡを少なくとも１残基有するブロッカー核酸断片５０が、格段に向上したＰＣＲ増幅の抑制効率を示すことを見出した。全ての残基がＢＮＡである核酸断片をブロッカー核酸断片５０として使用した場合、変異型の配列や配列が似ている他の領域などの完全にはマッチしない領域をブロックしてしまうおそれがある。
　ＢＮＡとは、架橋化核酸の総称である。ＢＮＡとしては、リボースの２’部位の酸素原子と４’部位の炭素原子とがメチレンを介して結合した２つの環状構造を持つヌクレオチドである２’，４’－ＢＮＡ、３’，４’－ＢＮＡ、２’－デオキシ－３’－Ｎ－３’，４’－ＢＮＡ、３’－Ｎ－２’，４’－ＢＮＡ；フラノース環の２位のＯと４位のＣとを－ＮＲＣＨ２－（Ｒはメチル基）で架橋した構造を有する２’，４’－ＢＮＡＮＣ；フラノース環の２位のＯと４位のＣとを－ＣＨ２ＯＣＨ２－で架橋した構造を有する２’，４’－ＢＮＡＣＯＣ等が知られている。
　ブロッカー核酸断片５０に含ませるＢＮＡとしては、上記のいずれのＢＮＡであってもよいが、２’，４’－ＢＮＡであることが好ましい。また、ブロッカー核酸断片５０の長さは、プライマー４０Ｆ及びプライマー４０Ｒよりも融解温度が高ければ特に制限されない。
（プローブ）
　本実施形態で用いるプローブは、５’末端又は３’末端の一方に蛍光物質を有し、他方に消光物質を有するオリゴヌクレオチドである。プローブとしては、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いることもできる。使用可能な蛍光物質としては、ＦＡＭ、Ｙａｋｉｍａ　Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標）、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ＶＩＣ（登録商標）等が挙げられる。また、使用可能な消光物質としては、ＴＡＭＲＡ等が挙げられる。
　本実施形態では、ＰＣＲ反応のアニーリング工程において、プライマー４０Ｆ、ブロッカー核酸断片５０、及びプローブ６０が、鋳型ｗの同一鎖上に、当該鎖の３’側から５’側に向かってこの順で結合する必要がある。これにより、鋳型ｗにおいては、鋳型ｗのＰＣＲ増幅が抑制されるとともにプローブ６０の分解が抑制される。また、鋳型ｍにおいては、ブロッカー核酸断片５０が結合しないため、プライマー４０Ｆの伸長により、プローブ６０が分解され、蛍光物質Ｆが定量的に遊離される。
（鋳型の増幅量を測定する工程）
　本実施形態では、プローブ６０の分解によって遊離した蛍光物質Ｆの蛍光の量を測定することにより、鋳型のＰＣＲ増幅量を測定することができる。蛍光の測定はＰＣＲ反応と同時にリアルタイムに測定することが好ましい。このような蛍光をリアルタイムに測定する場合は、リアルタイム定量ＰＣＲで使用される各種装置を用いて実施することができる。
　塩基変異を検出するにあたっては、対照の核酸サンプルをもうけることが好ましい。これにより、塩基変異をより正確に検出することができる。対照としては、例えば、野生型の塩基配列を有する核酸サンプル（標準核酸）を用いることができる。この場合、核酸サンプルを鋳型に用いた場合の鋳型のＰＣＲ増幅量が、標準核酸を鋳型に用いた場合の鋳型のＰＣＲ増幅量と比較して多かった場合に、核酸サンプルの対象塩基配列に塩基変異が存在すると判定することができる。
　すなわち、本発明の第１実施形態に係る核酸サンプルの対象塩基配列中の塩基変異の検出方法において、前記対象塩基配列が、野生型の塩基配列であり、プライマーセットと、ブロッカー核酸断片と、プローブと、を用いて、前記核酸サンプル及び野生型の塩基配列を有する標準核酸を鋳型としたＰＣＲ反応を行う。プライマーセットは、対象塩基配列を含む増幅対象領域をＰＣＲによって増幅可能である。ブロッカー核酸断片は、対象塩基配列に相補的な塩基配列を有し、少なくとも１残基の人工核酸を含む。プローブは、増幅対象領域のうち、対象塩基配列と同一鎖上で、対象塩基配列よりも５’側の領域にハイブリダイズし、５’末端又は３’末端の一方に蛍光物質を有し、他方に消光物質を有する。さらに、前記プローブ由来の蛍光を検出することにより、前記ＰＣＲ反応における前記鋳型の増幅量を測定する。さらに、前記核酸サンプルを鋳型に用いた場合の核酸の増幅量が、前記標準核酸を鋳型に用いた場合の核酸の増幅量と比較して多かった場合に、前記核酸サンプルの対象塩基配列に塩基変異が存在すると判定する。
［塩基変異を検出するためのキット］
　本発明の第２実施形態に係る核酸サンプルの対象塩基配列中の塩基変異を検出するためのキットは、プライマーセットと、ブロッカー核酸断片と、プローブとを含む。プライマーセットは、対象塩基配列を含む増幅対象領域をＰＣＲによって増幅可能である。ブロッカー核酸断片は、対象塩基配列に相補的な塩基配列を有し、少なくとも１残基の人工核酸を含む。プローブは、増幅対象領域のうち、対象塩基配列と同一鎖上で、対象塩基配列よりも５’側の領域にハイブリダイズし、５’末端又は３’末端の一方に蛍光物質を有し、他方に消光物質を有する。
　本実施形態に係るキットは、上述した塩基変異の検出方法に好適に用いることができる。ブロッカー核酸断片及びプローブの具体的な態様は、上述した態様と同様である。
　本実施形態に係るキットによれば、ブロッカー核酸断片によって、検出対象でない鋳型（例えば、野生型の塩基配列を有する核酸）のＰＣＲ増幅を抑制することにより、核酸サンプル中に、検出対象の鋳型（例えば、塩基変異を有する核酸）がごくわずかなコピー数しか存在しない場合であっても塩基変異を検出することができる。
　また、増幅対象領域のうち、対象塩基配列以外の領域に塩基変異が存在する場合であっても、対象塩基配列中の塩基変異を正確に検出することができる。また、対象塩基配列中の塩基変異が１塩基の挿入や欠失であっても塩基変異を検出することができる。また、対象塩基配列の範囲内であれば、新規の塩基変異が存在する場合であっても塩基変異を検出することができる。
　本実施形態に係るキットにおいて、上記の人工核酸は、ブロッカー核酸断片によるＰＣＲ増幅の抑制効率が高まる観点から、ＢＮＡであることが好ましい。好適なＢＮＡは、上述した構成と同様である。また、ブロッカー核酸断片の融解温度及びプローブの融解温度は、プライマーセットの融解温度よりも高いことが好ましい。これにより、ＰＣＲ反応におけるアニーリングの過程で、プライマーよりも先にブロッカー核酸断片及びプローブを鋳型に結合させることができ、塩基変異の検出精度を向上させることができる。
　本実施形態に係るキットは、対象塩基配列が、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ又はＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の塩基配列であってもよい。このようなキットは、大腸癌等の癌の診断や治療方法の選択に有用である。
［核酸サンプルのＰＣＲ増幅を抑制する方法］
　本発明の第３実施形態に係る前記対象塩基配列を有する核酸サンプルのＰＣＲ増幅を抑制する方法は、核酸サンプルの対象塩基配列を含む増幅対象領域をＰＣＲによって増幅可能なプライマーセットを用いる。プライマーセットは、核酸サンプルの対象塩基配列を含む増幅対象領域をＰＣＲによって増幅可能である。さらに、前記核酸サンプルを鋳型としたＰＣＲ反応を、前記対象塩基配列に相補的な塩基配列を有し、少なくとも１残基の人工核酸を含む、ブロッカー核酸断片の存在下で行う。
　本実施形態に係る方法によれば、特定の塩基配列を有する鋳型のＰＣＲ増幅を特異的に抑制することができる。ブロッカー核酸断片の具体的な態様は、上述した態様と同様である。
　本実施形態に係る方法において、上記の人工核酸は、ブロッカー核酸断片によるＰＣＲ増幅の抑制効率が高まる観点から、ＢＮＡであることが好ましい。好適なＢＮＡは、上述した構成と同様である。また、ブロッカー核酸断片の融解温度は、プライマーセットの融解温度よりも高いことが望ましい。これにより、ＰＣＲ反応におけるアニーリングの過程で、プライマーよりも先にブロッカー核酸断片を鋳型に結合させることができ、ブロッカー核酸断片によるＰＣＲ増幅の抑制効率を更に向上させることができる。
　以下、実験例により本発明を説明するが、本発明は以下の実験例に限定されない。
［実験例１］
　癌遺伝子であるＫＲＡＳのコドン１２～１３、コドン６１及びコドン１４６の塩基変異を検出した。
　表１に記載の試薬を用いて、表２の組成となるようにＰＣＲ反応の反応液を調製した。
　また、ブロッカー核酸断片を添加した反応液と添加しない反応液とを調製した。
　ブロッカー核酸断片を添加しない場合には、同容量の水を添加した。ブロッカー核酸断片の人工核酸にはＢＮＡ（２’，４’－ＢＮＡ）を用いた。
　また、ブロッカー核酸断片の全残基をＢＮＡで作製すると、その高い結合力から、野生型の鋳型だけでなく、変異型の鋳型のＰＣＲ増幅を抑制してしまう可能性がある。そのため、ブロッカー核酸断片にはランダムに通常のヌクレオチド残基を含有させた。表１に示すブロッカー核酸断片の塩基配列のうち、太文字にし、下線を付した残基はＢＮＡを示し、通常の文字は通常のヌクレオチド残基であることを示す。
　また、プローブには、蛍光物質としてＦＡＭ、消光物質としてＴＡＭＲＡを使用した。
　また、核酸サンプルには、ヒトゲノムＤＮＡを用いた。核酸サンプルの具体的な内容は後述する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　続いて、調製したＰＣＲ反応の各反応液を、リアルタイムＰＣＲ解析システム（商品名「ＣＦＸ９６」、バイオラッド社）にセットし、５０℃で２分間保持した後、９５℃で１０分間保持して、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ジーンエクスプレッションマスターミックス内の酵素を活性化させた。その後、９５℃で１５秒間保持して変性させた後、６０℃で３０秒間保持して、アニーリング及び伸長させた。この９５℃１５秒、６０℃３０秒の繰り返し反応を４０サイクル実施した。
　図２は、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２～１３の塩基変異を検出した結果を示すグラフである。横軸はＰＣＲのサイクル数を示し、縦軸は、プローブに由来する蛍光の強度を示す。核酸サンプルとしては、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２～１３の塩基配列が１００％野生型であるヒトゲノムＤＮＡを使用した。
　ブロッカー核酸断片の存在下（図２で（＋）と表記）及び非存在下（図２で（－）と表記）における、リアルタイムＰＣＲの反応曲線の結果から、ブロッカー核酸断片の存在下では、鋳型のＰＣＲ増幅が抑制されたことが示された。この結果は、核酸サンプル中のＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２～１３には塩基変異が存在しないことを示す。
　図３は、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン６１の塩基変異を上記と同様にして検出した結果を示すグラフである。核酸サンプルとしては、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン６１の塩基配列が１００％野生型であるヒトゲノムＤＮＡを使用した。
　ブロッカー核酸断片の存在下（図３で（＋）と表記）及び非存在下（図３で（－）と表記）における、リアルタイムＰＣＲの反応曲線の結果から、ブロッカー核酸断片の存在下では、鋳型のＰＣＲ増幅が抑制されたことが示された。この結果は、核酸サンプル中のＫＲＡＳ遺伝子のコドン６１には塩基変異が存在しないことを示す。
　図４は、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１４６の塩基変異を上記と同様にして検出した結果を示すグラフである。核酸サンプルとしては、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１４６の塩基配列が１００％野生型であるヒトゲノムＤＮＡを使用した。
　ブロッカー核酸断片の存在下（図４で（＋）と表記）及び非存在下（図４で（－）と表記）における、リアルタイムＰＣＲの反応曲線の結果から、ブロッカー核酸断片の存在下では、鋳型のＰＣＲ増幅が抑制されたことが示された。この結果は、核酸サンプル中のＫＲＡＳ遺伝子のコドン１４６には塩基変異が存在しないことを示す。
［実験例２］
　核酸サンプルを変更した以外は実験例１と同様にして、ＰＣＲ反応の反応液を調製した。核酸サンプルの具体的な内容は後述する。また、ブロッカー核酸断片を添加した反応液と添加しない反応液を調製した。ブロッカー核酸断片を添加しない場合には、同容量の水を添加した。
　図５は、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２～１３の塩基変異を検出した結果を示すグラフである。核酸サンプルとしては、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２～１３の塩基配列が１００％野生型であるヒトゲノムＤＮＡ（図５中、「野生型」と示す。）、又は、上記野生型配列を有するヒトゲノムＤＮＡ９０％と、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２～１３にＧ１３Ｄ変異（ＧＧＣ→ＧＡＣ）を有するヒトゲノムＤＮＡ（図５中、「変異型」と示す。）１０％と、の混合物を使用した。
　ブロッカー核酸断片の存在下（図５で（＋）と表記）及び非存在下（図５で（－）と表記）における、リアルタイムＰＣＲの反応曲線の結果から、ブロッカー核酸断片の存在下では、野生型の鋳型のＰＣＲ増幅が抑制され、変異型の鋳型のＰＣＲ増幅が選択的に行われたことが示された。
　また、ブロッカー核酸断片の存在下では、変異型の鋳型を含む核酸サンプルの増幅量が、野生型の鋳型の増幅量と比較して多かった。この結果は、核酸サンプル中のＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２～１３に塩基変異が存在することを示す。また、この結果は、変異型の鋳型が核酸サンプル中に１０％存在すれば、塩基変異を明確に検出可能であることを示す。
　図６は、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン６１の塩基変異を検出した結果を示すグラフである。
　核酸サンプルとしては、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン６１の塩基配列が１００％野生型であるヒトゲノムＤＮＡ（図６中、「野生型」と示す。）、又は、上記野生型配列を有するヒトゲノムＤＮＡ９０％と、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン６１にＱ６１Ｈ変異（ＣＡＡ→ＣＡＣ）を有するヒトゲノムＤＮＡ（図６中、「変異型」と示す。）１０％と、の混合物を使用した。
　ブロッカー核酸断片の存在下（図６で（＋）と表記）及び非存在下（図６で（－）と表記）における、リアルタイムＰＣＲの反応曲線の結果から、ブロッカー核酸断片の存在下では、野生型の鋳型のＰＣＲ増幅が抑制され、変異型の鋳型のＰＣＲ増幅が選択的に行われたことが示された。
　また、ブロッカー核酸断片の存在下では、変異型の鋳型を含む核酸サンプルの増幅量が、野生型の鋳型の増幅量と比較して多かった。この結果は、核酸サンプル中のＫＲＡＳ遺伝子のコドン６１に塩基変異が存在することを示す。また、この結果は、変異型の鋳型が核酸サンプル中に１０％存在すれば、塩基変異を明確に検出可能であることを示す。
　本発明に係る塩基変異の検出方法及びキットによれば、核酸サンプル中に、塩基変異を有する核酸がごくわずかなコピー数しか存在しない場合であっても塩基変異を検出することができる。また、検出対象の塩基変異以外の塩基変異が存在しても正確に塩基変異を検出することができる。また、検出対象の塩基変異が１塩基の挿入や欠失であっても塩基変異を検出することができる。また、本発明により、核酸サンプルのＰＣＲ増幅を配列特異的に抑制する方法を提供することができる。
　１０…対象塩基配列、２０…残基、２０’…塩基変異、３０…増幅対象領域、４０Ｆ，４０Ｒ…プライマー、５０…ブロッカー核酸断片、６０…プローブ、ｗ…野生型核酸サンプル（野生型の鋳型）、ｍ…変異型核酸サンプル（変異型の鋳型）、Ｆ…蛍光物質、Ｑ…消光物質。

Claims (13)

  1. 　核酸サンプルの対象塩基配列中の塩基変異の検出方法であって、
    　前記対象塩基配列を含む増幅対象領域をＰＣＲによって増幅可能なプライマーセットと；前記対象塩基配列に相補的な塩基配列を有し、少なくとも１残基の人工核酸を含む、ブロッカー核酸断片と；前記増幅対象領域のうち、前記対象塩基配列と同一鎖上で、前記対象塩基配列よりも５’末端に近い領域にハイブリダイズし、５’末端又は３’末端の一方に蛍光物質を有し、他方に消光物質を有するプローブと、を用いて、前記核酸サンプルを鋳型としたＰＣＲ反応を行い、
    　前記プローブ由来の蛍光を検出することにより、前記ＰＣＲ反応における前記鋳型の増幅量を測定する塩基変異の検出方法。
  2. 　前記人工核酸は、ＢＮＡである、請求項１に記載の検出方法。
  3. 　前記ブロッカー核酸断片の融解温度及び前記プローブの融解温度は、前記プライマーセットの融解温度よりも高い、請求項１又は２に記載の検出方法。
  4. 　前記対象塩基配列が、野生型の塩基配列である、請求項１～３のいずれか一項に記載の検出方法。
  5. 　前記ＰＣＲ反応を行う際に、更に、野生型の塩基配列を有する標準核酸を鋳型としたＰＣＲ反応を行い、
    　前記核酸サンプルを鋳型に用いた場合の核酸の増幅量が、前記標準核酸を鋳型に用いた場合の核酸の増幅量と比較して多かった場合に、前記核酸サンプルの対象塩基配列に塩基変異が存在すると判定する請求項４に記載の検出方法。
  6. 　前記対象塩基配列が、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、又はＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の塩基配列である、請求項１～５のいずれか一項に記載の検出方法。
  7. 　核酸サンプルの対象塩基配列中の塩基変異を検出するためのキットであって、
    　前記対象塩基配列を含む増幅対象領域をＰＣＲによって増幅可能なプライマーセットと、
    　前記対象塩基配列に相補的な塩基配列を有し、少なくとも１残基の人工核酸を含む、ブロッカー核酸断片と、
    　前記増幅対象領域のうち、前記対象塩基配列と同一鎖上で、前記対象塩基配列よりも５’末端に近い領域にハイブリダイズし、５’末端又は３’末端の一方に蛍光物質を有し、他方に消光物質を有するプローブと、を含む、キット。
  8. 　前記人工核酸は、ＢＮＡである、請求項７に記載のキット。
  9. 　前記ブロッカー核酸断片の融解温度及び前記プローブの融解温度は、前記プライマーセットの融解温度よりも高い、請求項７又は８に記載のキット。
  10. 　前記対象塩基配列が、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、又はＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の塩基配列である、請求項７～９のいずれか一項に記載のキット。
  11. 　対象塩基配列を有する核酸サンプルのＰＣＲ増幅を抑制する方法であって、
    　前記核酸サンプルの前記対象塩基配列を含む増幅対象領域をＰＣＲによって増幅可能なプライマーセットを用意し、
    　前記核酸サンプルを鋳型としたＰＣＲ反応を、前記対象塩基配列に相補的な塩基配列を有し、少なくとも１残基の人工核酸を含む、ブロッカー核酸断片を用いて行う、対象塩基配列を有する核酸サンプルのＰＣＲ増幅を抑制する方法。
  12. 　前記人工核酸は、ＢＮＡである、請求項１１に記載の方法。
  13. 　前記ブロッカー核酸断片の融解温度は、前記プライマーセットの融解温度よりも高い、請求項１２に記載の方法。
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