JPWO2016093333A1 - 塩基変異の検出方法及びキット並びに核酸サンプルのpcr増幅を抑制する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2014年12月11日に日本に出願された特願2014−250901号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
本発明の第一態様に係る塩基変異の検出方法は、核酸サンプルの対象塩基配列中の塩基変異の検出方法であって、前記対象塩基配列を含む増幅対象領域をPCRによって増幅可能なプライマーセットと;前記対象塩基配列に相補的な塩基配列を有し、少なくとも1残基の人工核酸を含む、ブロッカー核酸断片と;前記増幅対象領域のうち、前記対象塩基配列と同一鎖上で、前記対象塩基配列よりも5’末端に近い領域にハイブリダイズし、5’末端又は3’末端の一方に蛍光物質を有し、他方に消光物質を有するプローブと、を用いて、前記核酸サンプルを鋳型としたPCR反応を行い、前記プローブ由来の蛍光を検出することにより、前記PCR反応における前記鋳型の増幅量を測定する。
上記第一態様において、前記人工核酸は、BNAであってもよい。
上記第一態様において、前記ブロッカー核酸断片の融解温度及び前記プローブの融解温度は、前記プライマーセットの融解温度よりも高くてもよい。
上記第一態様において、前記対象塩基配列が、野生型の塩基配列であってもよい。
上記第一態様において、前記PCR反応を行う際に、更に、野生型の塩基配列を有する標準核酸を鋳型としたPCR反応を行い、前記核酸サンプルを鋳型に用いた場合の核酸の増幅量が、前記標準核酸を鋳型に用いた場合の核酸の増幅量と比較して多かった場合に、前記核酸サンプルの対象塩基配列に塩基変異が存在すると判定してもよい。
上記第一態様において、前記対象塩基配列が、KRAS、NRAS、BRAF、EGFR、又はPIK3CA遺伝子の塩基配列であってもよい。
本発明の第二態様に係るキットは、核酸サンプルの対象塩基配列中の塩基変異を検出するためのキットであって、前記対象塩基配列を含む増幅対象領域をPCRによって増幅可能なプライマーセットと、前記対象塩基配列に相補的な塩基配列を有し、少なくとも1残基の人工核酸を含む、ブロッカー核酸断片と、
前記増幅対象領域のうち、前記対象塩基配列と同一鎖上で、前記対象塩基配列よりも5’末端に近い領域にハイブリダイズし、5’末端又は3’末端の一方に蛍光物質を有し、他方に消光物質を有するプローブと、を含む。
上記第二態様において、前記人工核酸は、BNAであってもよい。
上記第二態様において、前記ブロッカー核酸断片の融解温度及び前記プローブの融解温度は、前記プライマーセットの融解温度よりも高くてもよい。
上記第二態様において、前記対象塩基配列が、KRAS、NRAS、BRAF、EGFR、又はPIK3CA遺伝子の塩基配列であってもよい。
本発明の第三態様に係る、対象塩基配列を有する核酸サンプルのPCR増幅を抑制する方法は、前記核酸サンプルの前記対象塩基配列を含む増幅対象領域をPCRによって増幅可能なプライマーセットを用意し、前記核酸サンプルを鋳型としたPCR反応を、前記対象塩基配列に相補的な塩基配列を有し、少なくとも1残基の人工核酸を含む、ブロッカー核酸断片を用いて行う。
上記第三態様において、前記人工核酸は、BNAであってもよい。
上記第三態様において、前記ブロッカー核酸断片の融解温度は、前記プライマーセットの融解温度よりも高くてもよい。
本発明の第1実施形態に係る核酸サンプルの対象塩基配列中の塩基変異の検出方法は、プライマーセットと、ブロッカー核酸断片と、プローブとを用いて、核酸サンプルを鋳型としたPCR反応を行う。さらに、プローブ由来の蛍光を検出することにより、PCR反応における鋳型の増幅量を測定する。プライマーセットは、対象塩基配列を含む増幅対象領域をPCRによって増幅可能である。ブロッカー核酸断片は、対象塩基配列に相補的な塩基配列を有し、少なくとも1残基の人工核酸を含む。プローブは、増幅対象領域のうち、対象塩基配列と同一鎖上で、対象塩基配列よりも5’末端に近い領域にハイブリダイズし、5’末端又は3’末端の一方に蛍光物質を有し、他方に消光物質を有する。
また、「残基」とは、DNAの場合のヌクレオチドに相当する単位を意味する。すなわち、本明細書において、「塩基」とは、DNAの場合の「塩基、糖、及びリン酸」からなる残基のうちの塩基部分又はこれに相当する部分を意味する。また、「残基」とは、DNAの場合の「塩基、糖、及びリン酸」からなる単位又はこれに相当する単位を意味する。
また、プローブ60は、鋳型に相補的な塩基配列を有しており、プローブ60の一方の末端には蛍光物質Fが結合しており、他方の末端には消光物質Qが結合している。
本明細書において、塩基変異とは、同一生物種の個体間において存在する遺伝子の塩基配列の相違を意味する。本実施形態に係る検出方法によれば、SNPやマイクロサテライト多型等の先天的な塩基変異だけでなく、塩基配列中の1又は複数の塩基が置換・欠失・挿入されることにより生じた、体細胞変異等の後天的な塩基変異も検出することができる。
本実施形態において、核酸サンプルは、被験対象由来のゲノムDNAを含有する試料であってもよい。あるいは、ゲノムDNAを鋳型として、目的の塩基変異部位を含む領域を予めPCR等で増幅して得られた増幅産物を含有する試料であってもよい。
対象塩基配列10が複数存在する場合、核酸サンプルを鋳型として、各対象塩基配列10を含む複数の増幅対象領域30を複数対のプライマーセットを用いて同時にPCR増幅し(「多重PCR」又は「mPCR」とも呼ばれる。)、このPCR増幅産物を核酸サンプルに用いて各対象塩基配列中の塩基変異を検出してもよい。これにより、例えば核酸サンプルが希少な場合であっても、サンプルを増やして塩基変異を検出することができる。
対象塩基配列10は、野生型の塩基配列であってもよい。ブロッカー核酸断片50は、対象塩基配列10に相補的な塩基配列を有する。そのため、この場合、野生型の鋳型wのPCR増幅を抑制し、変異型の鋳型mのPCR増幅を優先的に行うことができる。これにより、核酸サンプル中の変異型の鋳型mの存在量が少ない場合であっても、塩基変異を検出することが容易になる。
融解温度(Melting Temperature、Tm)とは、DNA分子の50%が変性して一本鎖となる温度である。融解温度は、核酸の吸光度の変化に基づいて求めることができる。核酸を構成する塩基は、波長260nm付近に強い吸収を持っているが、二本鎖核酸では、スタッキング相互作用により、核酸全体の吸光度が個々の塩基の吸光度の総和より小さい。ところが、二本鎖核酸溶液が加熱され、水素結合が切断されると、個々の塩基が自由になって光を吸収するため、二本鎖核酸よりも吸光度が大きくなる。したがって、核酸の温度を変化させながら吸光度を測定し、横軸に温度、縦軸に吸光度をプロットするとシグモイド曲線が得られる。融解温度は、この曲線の変極点の温度に相当し、吸光度の全上昇分の50%における温度として定義することができる。
ブロッカー核酸断片50は、人工核酸を少なくとも1残基有する。
例えば、PNAオリゴヌクレオチドはその構造の特異性から鎖長の長い構造の合成が困難なことや、塩基配列によっては水に対して著しく溶解性が低下するなどの問題がある。一方で、BNAオリゴヌクレオチドではそのような問題がなく、本実施形態に係るブロッカー核酸断片に使用するのに、より適した物質である。
また、BNAは他の人工核酸に比べてTm値が高いため、ブロッカーとして用いるのにより適した物質である。Tm値が高い場合、例えば、反応溶液を90〜99℃程度に加熱して核酸を変性させる工程のように、核酸増幅反応(PCR)による高温度域での反応のときでも、ブロッカー核酸断片が鋳型wの結合部から外れにくいため、鋳型wのPCR増幅の抑制をより効果的に行うことができる。
発明者らは、BNAを少なくとも1残基有するブロッカー核酸断片50が、格段に向上したPCR増幅の抑制効率を示すことを見出した。全ての残基がBNAである核酸断片をブロッカー核酸断片50として使用した場合、変異型の配列や配列が似ている他の領域などの完全にはマッチしない領域をブロックしてしまうおそれがある。
本実施形態で用いるプローブは、5’末端又は3’末端の一方に蛍光物質を有し、他方に消光物質を有するオリゴヌクレオチドである。プローブとしては、TaqMan(登録商標)プローブを用いることもできる。使用可能な蛍光物質としては、FAM、Yakima Yellow(登録商標)、フルオレセイン、FITC、VIC(登録商標)等が挙げられる。また、使用可能な消光物質としては、TAMRA等が挙げられる。
本実施形態では、プローブ60の分解によって遊離した蛍光物質Fの蛍光の量を測定することにより、鋳型のPCR増幅量を測定することができる。蛍光の測定はPCR反応と同時にリアルタイムに測定することが好ましい。このような蛍光をリアルタイムに測定する場合は、リアルタイム定量PCRで使用される各種装置を用いて実施することができる。
本発明の第2実施形態に係る核酸サンプルの対象塩基配列中の塩基変異を検出するためのキットは、プライマーセットと、ブロッカー核酸断片と、プローブとを含む。プライマーセットは、対象塩基配列を含む増幅対象領域をPCRによって増幅可能である。ブロッカー核酸断片は、対象塩基配列に相補的な塩基配列を有し、少なくとも1残基の人工核酸を含む。プローブは、増幅対象領域のうち、対象塩基配列と同一鎖上で、対象塩基配列よりも5’側の領域にハイブリダイズし、5’末端又は3’末端の一方に蛍光物質を有し、他方に消光物質を有する。
本発明の第3実施形態に係る前記対象塩基配列を有する核酸サンプルのPCR増幅を抑制する方法は、核酸サンプルの対象塩基配列を含む増幅対象領域をPCRによって増幅可能なプライマーセットを用いる。プライマーセットは、核酸サンプルの対象塩基配列を含む増幅対象領域をPCRによって増幅可能である。さらに、前記核酸サンプルを鋳型としたPCR反応を、前記対象塩基配列に相補的な塩基配列を有し、少なくとも1残基の人工核酸を含む、ブロッカー核酸断片の存在下で行う。
癌遺伝子であるKRASのコドン12〜13、コドン61及びコドン146の塩基変異を検出した。
また、ブロッカー核酸断片を添加した反応液と添加しない反応液とを調製した。
ブロッカー核酸断片を添加しない場合には、同容量の水を添加した。ブロッカー核酸断片の人工核酸にはBNA(2’,4’−BNA)を用いた。
また、核酸サンプルには、ヒトゲノムDNAを用いた。核酸サンプルの具体的な内容は後述する。
核酸サンプルを変更した以外は実験例1と同様にして、PCR反応の反応液を調製した。核酸サンプルの具体的な内容は後述する。また、ブロッカー核酸断片を添加した反応液と添加しない反応液を調製した。ブロッカー核酸断片を添加しない場合には、同容量の水を添加した。
核酸サンプルとしては、KRAS遺伝子のコドン61の塩基配列が100%野生型であるヒトゲノムDNA(図6中、「野生型」と示す。)、又は、上記野生型配列を有するヒトゲノムDNA90%と、KRAS遺伝子のコドン61にQ61H変異(CAA→CAC)を有するヒトゲノムDNA(図6中、「変異型」と示す。)10%と、の混合物を使用した。
Claims (13)
- 核酸サンプルの対象塩基配列中の塩基変異の検出方法であって、
前記対象塩基配列を含む増幅対象領域をPCRによって増幅可能なプライマーセットと;前記対象塩基配列に相補的な塩基配列を有し、少なくとも1残基の人工核酸を含む、ブロッカー核酸断片と;前記増幅対象領域のうち、前記対象塩基配列と同一鎖上で、前記対象塩基配列よりも5’末端に近い領域にハイブリダイズし、5’末端又は3’末端の一方に蛍光物質を有し、他方に消光物質を有するプローブと、を用いて、前記核酸サンプルを鋳型としたPCR反応を行い、
前記プローブ由来の蛍光を検出することにより、前記PCR反応における前記鋳型の増幅量を測定する塩基変異の検出方法。 - 前記人工核酸は、BNAである、請求項1に記載の検出方法。
- 前記ブロッカー核酸断片の融解温度及び前記プローブの融解温度は、前記プライマーセットの融解温度よりも高い、請求項1又は2に記載の検出方法。
- 前記対象塩基配列が、野生型の塩基配列である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の検出方法。
- 前記PCR反応を行う際に、更に、野生型の塩基配列を有する標準核酸を鋳型としたPCR反応を行い、
前記核酸サンプルを鋳型に用いた場合の核酸の増幅量が、前記標準核酸を鋳型に用いた場合の核酸の増幅量と比較して多かった場合に、前記核酸サンプルの対象塩基配列に塩基変異が存在すると判定する請求項4に記載の検出方法。 - 前記対象塩基配列が、KRAS、NRAS、BRAF、EGFR、又はPIK3CA遺伝子の塩基配列である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の検出方法。
- 核酸サンプルの対象塩基配列中の塩基変異を検出するためのキットであって、
前記対象塩基配列を含む増幅対象領域をPCRによって増幅可能なプライマーセットと、
前記対象塩基配列に相補的な塩基配列を有し、少なくとも1残基の人工核酸を含む、ブロッカー核酸断片と、
前記増幅対象領域のうち、前記対象塩基配列と同一鎖上で、前記対象塩基配列よりも5’末端に近い領域にハイブリダイズし、5’末端又は3’末端の一方に蛍光物質を有し、他方に消光物質を有するプローブと、を含む、キット。 - 前記人工核酸は、BNAである、請求項7に記載のキット。
- 前記ブロッカー核酸断片の融解温度及び前記プローブの融解温度は、前記プライマーセットの融解温度よりも高い、請求項7又は8に記載のキット。
- 前記対象塩基配列が、KRAS、NRAS、BRAF、EGFR、又はPIK3CA遺伝子の塩基配列である、請求項7〜9のいずれか一項に記載のキット。
- 対象塩基配列を有する核酸サンプルのPCR増幅を抑制する方法であって、
前記核酸サンプルの前記対象塩基配列を含む増幅対象領域をPCRによって増幅可能なプライマーセットを用意し、
前記核酸サンプルを鋳型としたPCR反応を、前記対象塩基配列に相補的な塩基配列を有し、少なくとも1残基の人工核酸を含む、ブロッカー核酸断片を用いて行う、対象塩基配列を有する核酸サンプルのPCR増幅を抑制する方法。 - 前記人工核酸は、BNAである、請求項11に記載の方法。
- 前記ブロッカー核酸断片の融解温度は、前記プライマーセットの融解温度よりも高い、請求項12に記載の方法。
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