CN106957903A

CN106957903A - 一种检测叶酸代谢关键酶基因多态性位点基因分型试剂盒和其检测方法

Info

Publication number: CN106957903A
Application number: CN201610940238.1A
Authority: CN
Inventors: 熊乾斌
Original assignee: Shanghai Zeyin Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Yunqin Gene Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2016-11-01
Filing date: 2016-11-01
Publication date: 2017-07-18
Anticipated expiration: 2036-11-01
Also published as: CN106957903B

Abstract

本发明提供一种利用荧光标记探针结合多重PCR方法对叶酸代谢关键酶基因(MTHFR和MTRR)3个位点进行分型的方法。根据MTHFR和MTRR基因设计扩增引物和荧光探针，在PCR仪扩增中待测三段DNA序列，检测反应体系中的扩增和溶解过程中释放的荧光信号，结果判读通过：(1)根据野生型和突变型标准质粒的杂交峰所显示的Tm值为来判断分型结果；(2)同时又可以通过扩增曲线的荧光值高低分型。本发明使用的引物和探针特异性强，灵敏度高；三个位点的检测同时进行，操作简单，结果容易判读；两次校准的分型方式使得分型结果更加准确可靠。本发明所述方法可在指导孕妇口服补充叶酸、提示脑卒中、冠心病和静脉血栓的高风险性以及叶酸代谢活性评估等方面进行应用。

Description

一种检测叶酸代谢关键酶基因多态性位点基因分型试剂盒和其检测方法

技术领域

本发明属于生物科学和临床医疗诊断领域，涉及一种利用多重荧光PCR方法检测叶酸代谢关键酶基因多态性位点的方法。利用本发明的方法，一次可完成对多个SNP位点同时分型检测，特异性强，灵敏度高，操作简单，能够在指导孕妇口服补充叶酸的剂量、提示脑卒中、冠心病和静脉血栓的高风险性以及叶酸代谢活性评估等方面进行应用。

背景技术

亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenete-trahydmfolate reductase，MTHFR)是叶酸代谢过程中的关键酶，可将还原型叶酸转变为5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)，前者是胸苷酸合成的重要原料之一，参与DNA的合成与修复；后者是体内主要的甲基供体，参与DNA甲基化。MTHFR对于DNA的合成、活化及修复有着极为重要的调控作用，其功能异常可导致DNA正常功能不能维持。MTHFR基因位点突变对MTHFR酶的活性和热稳定性产生影响，从而影响叶酸、甲硫氨酸代谢。其中c677T突变(rs1801133)、A1298c位点突变(rs1801131)是常见的主要突变位点,可导致叶酸代谢关键酶活性降低，引起叶酸代谢障碍，从而引发多种疾病，其中以高同型半胱氨酸血症引起的脑卒中以及新生儿缺陷最为严重。

此过程中重要的一个关键中间产物即甲硫氨酸，而甲硫氨酸是蛋白质合成及一碳单位代谢过程中的必须氨基酸。其合成过程是由甲硫氨酸合酶(methionine synthetase，MTR)催化的，而MTR会因为辅助因子维生素B12被氧化最终导致其酶活性的丧失。丧失酶活性的MTR可在MTRR基因编码的相应酶作用下，通过还原型甲基化作用重新生成具有功能活性的MTR。MTRR是影响叶酸甲硫氨酸正常代谢的又一关键酶，编码此酶的基因位点突变也同样会影响到该酶的活性。与许多疾病(Down综合症-先天愚型、神经管疾病、心血管疾病等)相关，因此MTRR突变被认为是这些疾病的高风险因素。rs1801394是位于5p15.3-p15.2之间的MTRR基因第2个外显子处的一个A/G多态，引起MTRR基因编码的蛋白第22个氨基酸由Ile变为Met(Ile22Met)，是目前最主要也是研究最多的突变位点。

叶酸代谢关键酶基因突变检测可以在：

1.临床应用：提示脑卒中、冠心病和静脉血栓的高风险性

MTHFR、MTRR基因正常的人，摄入的叶酸能够在体内顺利代谢，降低高同型半胱氨酸的水平。这类人脑中风、冠心病和静脉血栓的发病风险较低。

MTHFR、MTRR基因异常的人，摄入的叶酸在体内的代谢途径受阻，可能引起高同型半胱氨酸血症，导致凝血倾向增高，因此发生脑中风、冠心病以及静脉血栓的风险也增高。

在中国人中，高达17％-47％的人为MTHFR和MTRR基因异常人群。

2.体检应用：指导孕妇补充叶酸

我国推荐孕期补充量为400微克/天，对于：MTHFR基因正常的人，摄取推荐量的叶酸，能够显著降低患儿的出生缺陷率41％-85％。

MTHFR基因异常的人，MTHFR酶活性明显降低，对叶酸代谢造成障碍，导致新生儿神经管缺陷、唐氏综合症及唇腭裂等疾病的发病风险明显增高。对于这类人需要补充更多的叶酸才能达到预期的效果，推荐剂量1-4mg/天。

目前对于基因突变的检测方法普遍应用的仍为DNA直接测序，它是检测各种基因突变的金标准，但是由于其耗时长，成本高，越来越多的基因突变检测方法不断涌现，如高分辨熔解曲线法(HRM),限制性酶切片段长度多态性分析法(RFLP)，单链构象多态性分析(SSCP)以及TaqMan系统等，每种方法都有其独特的优点或不足。PCR-RFLP方法是在PCR基础上发展起来的，将PCR与限制性酶切相结合，但其对基因突变点的检测受限制性内切酶的限制而不被广泛应用。1989年问世的PCR-SSCP方法是在测序之前用来筛查碱基突变的常用手段。其基本原理是PCR扩增后的双链DNA片段被变性成单链DNA后，相同长度的DNA单链因其核苷酸序列中仅有的单个碱基的差别形成不同的独有的折叠构象，这些单链通过非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳(PAGE)时产生不同的泳带而被分离开。目前该方法已被广泛应用于临床基因突变的筛查检测及诊断方面等领域。但是该方法对于检测大于400bp的PCR产物片段时，突变检出率低，并且该方法受电泳条件的局限而被限制应用。相对于其它基于PCR的DNA多态性检测技术，HRM通过实时监测镶嵌于DNA双链中荧光染料随着温度的升高从dsDNA上脱离时荧光信号值的变化，将PCR产物中存在的已知突变和未知突变直观地展示出来。但由于其对样本质量要求较高，对一些颠倒突变位点不易分型而受到应用限制。

发明内容

针对以上技术方法存在的缺陷，本发明所涉及的基因分型方法是利用荧光标记的探针与不同基因型靶序列特异性结合来指示扩增产物的变化，从而快速、准确的检测叶酸代谢关键酶基因SNP位点基因型的方法。本发明的检测体系中所用到的探针5’端和3’端分别带有一个作为供体的标记报告荧光基团和作为受体的淬灭荧光基团。当PCR体系中不存在DNA靶序列，探针保持完整时，系统激发供体产生的荧光基团被距离很近的淬灭基团淬灭；当PCR体系中存在DNA靶序列时，探针就会完全展开与互补序列杂交，使荧光基团和淬灭基团远离，从而使荧光集团发出的荧光不被淬灭基团猝灭。释放出来的荧光信号随着产物的增加也逐渐增加。本发明提供的基因分型检测试剂盒利用荧光标记探针结合多重PCR的方法灵敏度高，专一性强，所有的检测都在同一个管中进行，操作简单，根据探针与构建的已知野生型和突变型的标准质粒的杂交峰所显示的Tm值对基因型进行判定，并结合扩增曲线二次校正判读分型结果，准确性高。

实现上述目的的具体方案是：

1.我们对整个多重不对称PCR反应体系进行以下优化。在不改变其他成分浓度的条件下，分别对反应体系中的镁离子浓度，dNTPs和引物浓度进行优化，比较不同处理对反应结果的影响。增加了Mg²⁺为3mM来提高整个反应体系的扩增效果。

2.针对MTHFR编码基因上的两个SNP位点(rs1801131和rs1801133)和MTRR编码基因上的SNP rs1801394分别设计多对扩增引物(长度15-30bp的核苷酸链，Tm为50-65度)和多条荧光标记探针(长度15-40bp的核苷酸链，Tm为45-85度)。本试剂盒可以同时对rs1801131，rs1801133和rs1801394三个突变位点进行检测,所用通道分别设定为CY5，FAM和ROX通道。

3.优选的，所述引物的核苷酸序列如下：

SEQ ID NO.4：MTHFR rs1801131F:CTACCTGAAGAGCAAGTCCC

SEQ ID NO.5：MTHFR rs1801131R:CACTCCAGCATCACTCACTT

SEQ ID NO.6：MTHFR rs1801133F:GAAGCACTTGAAGGAGAAGG

SEQ ID NO.7：MTHFR rs1801133R:GTGCATGCCTTCACAAAGCG

SEQ ID NO.8：MTRR rs1801394F:TGCCTTGAAGTGATGAGGAG

SEQ ID NO.9：MTRR rs1801394R:AATCCATGTACCACAGCTTG；

优选的，扩增的目标序列如下：

SEQ ID NO.1：MTHFR rs1801131：(M代表C/A)

5’-CTACCTGAAGAGCAAGTCCCCCAAGGAGGAGCTGCTGAAGATGTGGGGGGAGGAGCTGACCAGTGAAGMAAGTGTCTTTGAAGTCTTCGTTCTTTACCTCTCGGGAGAACCAAACCGGAATGGTCACAAAGTGAGTGATGCTGGAGTG-3’

SEQ ID NO.2：MTHFR rs1801133：(Y代表T/C)

5’-GAAGCACTTGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGAGYCGATTTCATCATCACGCAGCTTTTCTTTGAGGCTGACACATTCTTCCGCTTTGTGAAGGCATGCAC-3’

SEQ ID NO.3：MTRR rs1801394：(R代表A/G)

5’-TGCCTTGAAGTGATGAGGAGGTTTCTGTTACTATATGCTACACAGCAGGGACAGGCAAAGGCCATCGCAGAAGAAATRTGTGAGCAAGCTGTGGTACATGGATT-3’

4.优选的，所述探针的核苷酸序列如下：

MTHFR rs1801131-probe:5’-F1-CTGACCAGTGAAGcAAGTGTCTTTGggtcag-BHQ1-3’

MTHFR rs1801133-probe：5’-F2-ccggATGATGAAATCGaCTCCCGtccgg-BHQ1-3’

MTRR rs1801394-probe：5’-F3-cgCGCAGAAGAAATaTGTGAGCAAcgcg-BHQ2-3’

其中，F1，F2和F3分别为不同颜色修饰的荧光基团(优选的，F1为CY5，F2为FAM和F3为ROX)。

5.所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液。

6.标准品的制备：分别以含有rs1801131，rs1801133和rs1801394野生和突变的人类基因组DNA为模板，通过PCR直接扩增，电泳，产物割胶回收得到相应的含有目的突变位点的DNA片段，利用T4DNA连接酶将定点突变片段插入到克隆载体pMD-T中，通过酶切鉴定和直接测序验证得到相应的野生和突变标准品，-20℃密封储存。

7.根据检测到的Tm值对叶酸代谢关键酶SNP位点基因型进行判定，rs1801131(C/A)：65℃/53℃；rs1801133(T/C)：65℃/58℃；rs1801394(A/G)：61℃/54℃，同时可以根据扩增曲线荧光值的高、中和低分为：野生纯合、杂合子和突变纯合子三种基因型。

8.所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

1)提取待测样本的基因组DNA；

2)以待测基因组DNA为模板，利用前述的引物和探针，根据荧光杂交探针-熔解曲线法对叶酸代谢关键酶基因突变位点进行检测；其中，实时荧光定量PCR反应使用的反应体系包含10×Buffer，2μl；25mM MgCl₂，2.4μl；2.5mM dNTP，1.6ul；10μM和1μM正反向引物混合物，6μl；10μM探针混合物；0.6μl，TaqDNA聚合酶，0.2μl；模板DNA(50-100ng)，2.0μl；最后去离子水补齐至20μl；

3)所述实时荧光定量PCR反应的程序为：95℃预变性5min；95℃变性20sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，45个循环；最后72℃延伸5min；

4)所述特异性荧光杂交探针熔解曲线法对突变位点进行检测，进行产物熔解检测的条件选自以下设置程序：95℃变性1min，45℃探针退火杂交2min；然后熔解温度40℃开始升温熔解至95℃，每升温1℃记录5次并在熔解进程中通过荧光信号实时进行检测。

5)根据探针杂交熔解曲线法对扩增后的目的基因进行突变位点的基因型判读：正常情况下，探针与野生型靶序列完全匹配时双链杂合体最为稳定，Tm值最高；而探针与突变型的靶序列形成的双链杂合体因为一个碱基的不匹配导致双链杂合体不稳定，Tm值下降，根据野生型和突变型靶序列的Tm值的差异可以清楚的对突变位点进行分型。结果判断标准：rs1801131(C/A)：65℃/53℃；rs1801133(T/C)：65℃/58℃；rs1801394(A/G)：61℃/54℃(分别见图1-3)。

6)根据扩增曲线二次校准基因分型结果：由于探针跟突变型或野生型杂交温度不同，选择合适的退火温度时，只让完全匹配的野生型跟探针杂交，而野生型跟探针杂交不上，这样，就可以通过扩增曲线荧光值的高低，把野生纯和、杂合子和突变纯和基因型由高到低区分开来，见图4。

7)本发明所建立的三重突变检测体系，同时通过探针杂交熔解曲线方法及扩增曲线精确的对叶酸代谢相关酶基因的3个SNP位点进行检测和基因分型，具有简便、经济、高效、精准且避免污染的特点，可以临床指导叶酸个体化用药，对叶酸代谢异常可能引起的各种疾病的预防具有重要的意义。

附图说明

图1：利用健康志愿者口腔黏膜上皮细胞作为模板对叶酸关键酶基因的SNP位点rs1801133进行基因分型的熔解曲线图。

图2：利用健康志愿者口腔黏膜上皮细胞作为模板对叶酸关键酶基因的SNP位点rs1801131进行基因分型的熔解曲线图。

图3：利用健康志愿者口腔黏膜上皮细胞作为模板对叶酸关键酶基因的SNP位点rs1801394进行基因分型的熔解曲线图。

图4：扩增曲线分型模式图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明

1.实验材料处理：

将擦拭过的口腔样本棉签置于0.5ml离心管中，用剪刀将棉签部分从其杆上剪下，加入300μl免提取溶液，涡旋10秒混匀。65℃，30分钟裂解细胞。

2.探针杂交熔解曲线法进行基因分型

a.叶酸代谢关键酶基因分型检测体系的设计主要是针对MTHFR和MTRR基因。基于探针杂交熔解曲线基因分型方法对MTHFR编码基因上的两个SNP位点(rs1801131和rs1801133)和MTRR编码基因上的SNP rs1801394进行基因分型。根据这3个突变位点在相应的基因序列上的分布情况，我们首先设计了覆盖这些突变位点的3条荧光探针，然后再根据探针的分布分别设计了三对特异性扩增靶序列的引物对。

b.所述目的基因靶序列来自NCBI的dbSNP数据中有关三个位点的序列。

c.采用Primer3在线软件对所述目的基因引物对进行设计。

d.PCR反应体系：以上述合成的探针和引物在荧光定量PCR系统中进行以下扩增(20μL反应体系)：10×Buffer，2μl；25mM MgCl₂，2.4μl；2.5mM dNTP，1.6ul；10μM和1μM正反向引物混合物，6μl；10μM探针混合物；0.6μl，TaqDNA聚合酶，0.2μl；模板DNA(50-100ng)，2.0μl；最后去离子水补齐至20μl。

e.将配置好的PCR反应体系放入Roche Lightcycler96实时荧光PCR仪上，反应的程序为：

95℃预变性5min；

95℃变性20sec，60℃退火1min，72℃延伸30sec，45个循环，在每个循环退火阶段采集相应检测通道的荧光信号；

最后72℃延伸5min；

PCR产物进行熔解曲线分析的程序为：95℃变性1min，45℃探针退火杂交2min；然后熔解温度40℃开始升温熔解至95℃，每升温1℃记录5次并在熔解进程中通过荧光信号实时进行检测。

3.结果判读

根据三个探针与相应的已知突变型和野生型的靶序列杂交所形成的双链杂交体的熔点(Tm)为标准，比较待测样本在各个检测通道中(FAM，CY5和ROX)的Tm值来判断样本的基因型，即当待测样本的Tm值与已知基因型的标准品的Tm值一致时，可判读该样本属于这一基因型。结果判断标准：rs1801131(C/A)：65℃/53℃；rs1801133(T/C)：65℃/58℃；rs1801394(A/G)：61℃/54℃。

以最优方案进行检测，结果显示，对于rs1801131位点，待测样本在CY5通道的58℃有峰，则该样本的为rs1801131野生型；对于rs1801133位点，待测样本在FAM通道的58℃和66℃都有峰，则该样本的为rs1801133杂合型；对于rs1801394位点，待测样本在ROX通道的54℃有峰，则该样本的rs1801394突变型。同时通过扩增曲线荧光信号强度二次校准分型结果：野生纯合型扩增荧光信号最强，突变纯合型扩增荧光信号最低，杂合子居于中间。

4.接着我们对100个人基因组DNA进行的基因分型，分型成功率达到100％。另外，分型结果与随机挑选出来的90个样本的测序结果也100％相符，展示了该试剂盒具有很高的灵敏度和特异性。

5.结论：本发明所述检测方法能够快速、准确的检测叶酸代谢关键酶基因的突变，对于临床上大规模人群体内的叶酸水平筛查和居民每日叶酸的摄入量的补充具有重要的指导意义，从而达到预防各种由于叶酸缺乏所致疾病的目的。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海泽因生物科技有限公司

<120> 一种检测叶酸代谢关键酶基因多态性位点基因分型试剂盒和其检测方法

<130> 1

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 148

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

ctacctgaag agcaagtccc ccaaggagga gctgctgaag atgtgggggg aggagctgac 60

cagtgaagma agtgtctttg aagtcttcgt tctttacctc tcgggagaac caaaccggaa 120

tggtcacaaa gtgagtgatg ctggagtg 148

<210> 2

<211> 99

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

gaagcacttg aaggagaagg tgtctgcggg agycgatttc atcatcacgc agcttttctt 60

tgaggctgac acattcttcc gctttgtgaa ggcatgcac 99

<210> 3

<211> 104

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

tgccttgaag tgatgaggag gtttctgtta ctatatgcta cacagcaggg acaggcaaag 60

gccatcgcag aagaaatrtg tgagcaagct gtggtacatg gatt 104

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ctacctgaag agcaagtccc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

cactccagca tcactcactt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

gaagcacttg aaggagaagg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

gtgcatgcct tcacaaagcg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

tgccttgaag tgatgaggag 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

aatccatgta ccacagcttg 20

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

ctgaccagtg aagcaagtgt ctttgggtca g 31

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

ccggatgatg aaatcgactc ccgtccgg 28

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

cgcgcagaag aaatatgtga gcaacgcg 28

Claims

1.一种用于MTHFR、MTRR基因型分型检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：

(1)用于扩增样本DNA中MTHFR、MTRR编码基因上3个SNP位点rs1801131，rs1801133和rs1801394的相应的PCR引物对，优选的，所述样本为血液、组织、体液；

(2)3条分别特异性结合由3组引物对扩增的目的片段的非标记探针；

(3)必要的核酸扩增和杂交试剂。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述PCR引物对的核苷酸序列分别为：

SEQ ID NO.4：MTHFR rs1801131F:CTACCTGAAGAGCAAGTCCC，

SEQ ID NO.5：MTHFR rs1801131R:CACTCCAGCATCACTCACTT，

SEQ ID NO.6：MTHFR rs1801133F:GAAGCACTTGAAGGAGAAGG，

SEQ ID NO.7：MTHFR rs1801133R:GTGCATGCCTTCACAAAGCG，

SEQ ID NO.8：MTRR rs1801394F:TGCCTTGAAGTGATGAGGAG，和

SEQ ID NO.9：MTRR rs1801394R:AATCCATGTACCACAGCTTG。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述非标记探针的核苷酸序列分别为：

SEQ ID NO.10：MTHFR rs1801131-probe:

5’-CTGACCAGTGAAGcAAGTGTCTTTGggtcag-3’，

SEQ ID NO.11：MTHFR rs1801133-probe：5’

-ccggATGATGAAATCGaCTCCCGtccgg-3’，和

SEQ ID NO.12：MTRR rs1801394-probe：

5’-cgCGCAGAAGAAATaTGTGAGCAAcgcg-3’。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述由3组引物对扩增的目的片段的核苷酸序列分别为：

SEQ ID NO.1：MTHFR rs1801131，

SEQ ID NO.2：MTHFR rs1801133，和

SEQ ID NO.3：MTHFR rs1801394。

5.一组用于检测MTHFR、MTRR基因型分型的引物组和非标记探针，其特征在于：所述的引物组的核酸序列分别为：

SEQ ID NO.4：MTHFR rs1801131F:CTACCTGAAGAGCAAGTCCC，

SEQ ID NO.5：MTHFR rs1801131R:CACTCCAGCATCACTCACTT，

SEQ ID NO.6：MTHFR rs1801133F:GAAGCACTTGAAGGAGAAGG，

SEQ ID NO.7：MTHFR rs1801133R:GTGCATGCCTTCACAAAGCG，

SEQ ID NO.8：MTRR rs1801394F:TGCCTTGAAGTGATGAGGAG，和

SEQ ID NO.9：MTRR rs1801394R:AATCCATGTACCACAGCTTG；

所述非标记探针的核苷酸序列分别为：

SEQ ID NO.10：MTHFR rs1801131-probe:

5’-CTGACCAGTGAAGcAAGTGTCTTTGggtcag-3’，

SEQ ID NO.11：MTHFR rs1801133-probe：5’

-ccggATGATGAAATCGaCTCCCGtccgg-3’，和

SEQ ID NO.12：MTRR rs1801394-probe：

5’-cgCGCAGAAGAAATaTGTGAGCAAcgcg-3’。

6.根据权利要求1-4任一项所述试剂盒或权利要求5所述引物组和非标记探针，其特征在于：其中探针序列5’端标记荧光基团为ALEX-350、FAM、VIC、TET、CAL Flour Gold 540、JOE、CAL Flour Orange 560、TAMRA、Cal Flour Red 590、ROX、Cal Flour Red610、TEXASRED、Cal Flour Red635、Quasar 670、CY3、CY5、CY5.5、Quasar705中的一种，3’端标记淬灭基团为DABCYL、BHQ系列、ECLIPSE、TAMRA中的一种；

优选的，所述探针的核苷酸序列如下：

MTHFR rs1801131-probe:5’

-CY5-CTGACCAGTGAAGcAAGTGTCTTTGggtcag-BHQ1-3’，

MTHFR rs1801133-probe：5’

-FAM-ccggATGATGAAATCGaCTCCCGtccgg-BHQ1-3’，或/和

MTRR rs1801394-probe：5’-ROX-cgCGCAGAAGAAATaTGTGAGCAAcgcg-BHQ2-3’。

7.根据权利要求1-4任一项所述试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括双蒸水，dNTPs、3对PCR引物混合液，3条荧光标记探针，TaqDNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液；优选的，所述试剂盒中还包括阳性对照品。

8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于：所述的阳性对照品是合成的已知3个SNP位点rs1801131，rs1801133和rs1801394野生型和突变型的标准质粒。

9.权利要求1-4任一项所述试剂盒或权利要求5所述引物组和非标记探针在制备用于指导孕妇口服补充叶酸剂量、诊断提示脑卒中、冠心病和静脉血栓的高风险性以及评估叶酸代谢活性的制剂中的应用。

10.根据权利要求1-4、8任一项所述试剂盒或权利要求9所述应用，其特征在于：检测目的基因扩增的PCR反应的条件为：95℃预变性5min；95℃变性20sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，45个循环；最后72℃延伸5min；使用特异性荧光杂交探针熔解曲线法对3个SNP位点进行检测，进行产物熔解检测的条件为：95℃变性1min，40℃探针退火杂交2min；然后熔解温度从45℃开始升温熔解至95℃，每升温1℃记录5次并在熔解进程中通过荧光信号实时进行检测；

优选的，PCR反应体系中Mg²⁺浓度为3mM；

任选的，还可以根据溶解曲线分成三组，野生纯合型扩增信号最强，突变纯合型扩增信号最低，杂合子居于中间，对根据溶解曲线分型的结果进行第二次的分型校正。