CN110964791B - 一种单核苷酸多态性的检测方法及相应的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种单核苷酸多态性的检测方法，包括：设计合成两段DNA连接序列，其与具有单核苷酸多态性的待检测基因的目标突变型基因的在突变位点的上游和下游各10‑20个碱基的序列完全匹配，而其中一段DNA连接序列与所述待检测基因的野生型基因的一个碱基不匹配，且不匹配碱基所在的位点位于该段DNA连接序列的连接位点上游或者下游1‑3个碱基位置处；2)以所述待检测基因为模板，利用Taq DNA连接酶进行连接反应；以及3)测定步骤2)所得产物的熔解温度，并根据熔解温度的不同来判断所述待检测基因是否存在单核苷酸多态性。该检测方法具有准确性高、通用性强、成本低、方便、快速的有益效果。此外，本发明还提供了一种用于检测单核苷酸多态性的试剂盒。

Description

一种单核苷酸多态性的检测方法及相应的试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测领域，更具体地，涉及单核苷酸多态性(SNP)的检测方法。
背景技术
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是一种人类最常见的遗传变异类型，占所有已知多态性的90％以上，在人类基因组中广泛存在。人类的许多表型差异，个体对药物的反应以及遗传性疾病都与SNP密切相关，因此针对SNP的筛查将成为遗传疾病诊断强有力的工具，因此在临床上有很重大的意义，同时这也是人类基因组计划从理论研究走向实际应用的重要进展。
目前SNP筛查方法既有传统经典技术，如限制性片段长度多态性(restrictionfragment length polymorphism，RFLP)、单链构象多态性(single strand conformationpolymorphism，SSCP)、等位基因特异性PCR(allele specific PCR，AS-PCR)等，又有高通量、自动化程度较高的新兴技术，如基因芯片法、焦磷酸测序技术、实时荧光PCR等。这些技术虽然能完成对SNP的检测，但在应用上还有一些不足。有些技术的检测过程繁琐，需要限制性内切酶消化；有些技术需两步PCR扩增反应；有些新技术虽具有通量高、易于自动化等优点，但要求成本昂贵的仪器设备。
一种好的临床检测技术应该同时具有准确、快速及成本低廉的特点，但是现有的SNP筛查方法无法同时满足以上要求。为了让SNP筛查更好地造福于人类，有必要发展和完善更快速、更简单、成本更低的SNP筛查技术。
发明内容
针对现有技术中的问题，本发明提供了一种全新的单核苷酸多态性的检测方法，以克服现有SNP检测方法的检测时间过长、步骤复杂、准确性低、仪器设备要求高或成本过高等缺陷。
根据本发明的第一方面，提供了一种单核苷酸多态性的检测方法，其中，所述方法包括以下步骤：
1)设计合成两段DNA连接序列，其中，所述两段DNA连接序列与具有单核苷酸多态性的待检测基因的目标突变型基因的在突变位点的上游和下游各10-20(如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)个碱基的序列完全匹配，所述两段DNA连接序列中的其中一段DNA连接序列与所述待检测基因的野生型基因的一个碱基不匹配，且所述不匹配碱基所在的位点位于该段DNA连接序列的连接位点上游或者下游1-3(如1、2或3)个碱基位置处；
2)以所述待检测基因为模板，利用Taq DNA连接酶进行连接反应；以及
3)测定步骤2)所得产物的熔解温度，并根据熔解温度的不同来判断所述待检测基因是否存在单核苷酸多态性。
根据本发明的第二方面，提供了一种用于检测单核苷酸多态性的试剂盒，所述试剂盒包括：
a)针对待测基因的目标突变型基因设计合成的两段DNA连接序列，其中，所述两段DNA连接序列与具有单核苷酸多态性的待检测基因的目标突变型基因的在突变位点的上游和下游各10-20(如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)个碱基的序列完全匹配，所述两段DNA连接序列中的其中一段DNA连接序列与所述待检测基因的野生型基因的一个碱基位点不匹配，且所述不匹配碱基所在的位点位于该段DNA连接序列的连接位点上游或者下游1-3(如1、2或3)个碱基位置处；
b)Taq DNA连接酶；以及
c)用于荧光定量检测的荧光染料。
本发明通过利用Taq DNA连接酶对单碱基具有高特异性识别的特点来识别SNP位点，并通过利用所设计的DNA连接序列与待检测基因的目标突变型基因的连接产物或连接产物的扩增产物与待检测基因的野生型基因的相应产物的熔解温度不同来进行单核苷酸多态性检测。此外，本发明还可以利用低成本的荧光染料及常规荧光定量PCR仪来实现检测结果的可视化，从而区别出突变型基因和野生型基因，实现单核苷酸多态性的检测。
本发明提供的单核苷酸多态性的检测方法具有以下有益效果：
(1)准确性高
本发明采用Taq DNA连接酶，其具有特异性高的特点，一旦发生错配，所设计的两段DNA连接序列将不会发生连接反应，从而提高单核苷酸多态性检测的准确性。
(2)通用型强
本发明提供的检测方法对基因突变的类型和基因结构没有选择性，可以用于多种基因突变的检测，而不需要针对不同病症的基因突变使用不同的方法。
(3)成本低
本发明提供的检测方法使用低成本的Taq DNA连接酶、低成本的荧光染料、常规荧光定量PCR仪等，避免使用成本昂贵的试剂和染料，显著降低了检测成本。
(4)方便、快速
相比于现有技术，本发明提供的检测方法步骤简单、整个过程只需1.5-3小时，大大缩短了检测时间，使得该检测方法更便于工业化应用。
基于同样的特点，本发明提供的用于检测单核苷酸多态性的试剂盒也具有准确性高、通用性强、成本低、方便、快速的有益效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所涉及的附图作简单地介绍，其中：
图1示出高丰度(10μM)人工合成乙肝病毒DNA片段SNP的检测结果；
图2示出中丰度(1μM)人工合成乙肝病毒DNA片段SNP的检测结果；以及
图3示出低丰度(0.1μM)人工合成乙肝病毒DNA片段SNP的检测结果。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例以及说明书附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员能够获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的目的在于提供一种具有准确、通用、快速和成本低廉的特点的单核苷酸多态性的检测方法，以使得SNP的检测得到更广泛的实际应用，从而更好地造福于人类。
因此，根据本发明的第一方面，提供了一种单核苷酸多态性的检测方法，其中，所述方法包括以下步骤：
1)设计合成两段DNA连接序列，其中，所述两段DNA连接序列与具有单核苷酸多态性的待检测基因的目标突变型基因的在突变位点的上游和下游各10-20(如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)个碱基的序列完全匹配，所述两段DNA连接序列中的其中一段DNA连接序列与所述待检测基因的野生型基因的一个碱基不匹配，且所述不匹配碱基所在的位点位于该段DNA连接序列的连接位点上游或者下游1-3(如1、2或3)个碱基位置处；
2)以所述待检测基因为模板，利用Taq DNA连接酶进行连接反应；以及
3)测定步骤2)所得产物的熔解温度，并根据熔解温度的不同来判断所述待检测基因是否存在单核苷酸多态性。
如本领域技术人员所理解的，“突变型基因”是指在一定的条件下，野生型基因由于DNA分子中发生碱基对的增添、缺失或改变而产生的DNA分子发生改变的基因类型。
如本领域技术人员所理解的，“单核苷酸多态性(SNP)”主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。由此可知，SNP所表现的多态性只涉及单个碱基的变异。
因此，结合到本发明，“具有单核苷酸多态性的待检测基因的目标突变型基因”是指在一定的条件下，野生型基因中的单个碱基发生变异所得到的新的基因类型。
相应地，“突变位点”是相对于野生型发生改变的碱基在DNA序列中所在的位置。在某个突变型基因中仅涉及单个碱基改变的情况下，该突变位点也可以称为“SNP位点”。
如本领域技术人员所理解的，“野生型基因”指自然界中占多数的等位基因，其在本发明中作为标准对照基因，与“野生型基因”相对应的为上述“突变型基因”。因此，可以理解，本发明中的“具有单核苷酸多态性的待检测基因的目标突变型基因”是“野生型基因”中的单个碱基位点发生变异所得到的基因。
基于“具有单核苷酸多态性的待检测基因的目标突变型基因”与“野生型基因”的单个碱基位点的差异，本发明提供了一种单核苷酸多态性的检测方法。
在步骤1)中，为了检测是否存在具有单核苷酸多态性的待检测基因的目标突变型基因，设计了两段DNA连接序列，其中，所述两段DNA连接序列具有如下特点：所述两段DNA连接序列与具有单核苷酸多态性的待检测基因的目标突变型基因的在突变位点的上游和下游各10-20个碱基的序列完全匹配，而所述两段DNA连接序列中的其中一段DNA连接序列与待检测基因的野生型基因的一个碱基位点(即SNP位点)不匹配，并且所述不匹配碱基所在的位点位于该段DNA连接序列的连接位点上游或下游1-3个碱基位置处。
在本文中，所谓“上游”是指核酸序列的5’端，所谓“下游”是指核酸序列的3’端。另外，所谓“匹配”是指碱基可以根据碱基互补配对原则通过氢键彼此键合的过程；相应地，所谓“不匹配”是指碱基不能够通过碱基互补配对原则通过氢键彼此键合的过程。
所述“在突变位点的上游和下游各10-20个碱基的序列”包括在突变位点的5’端和3’端各10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碱基的序列。另外，还需要指出，此处所述的5’端和3’端的碱基数目可以相同，也可以不相同。另外，所述“连接位点上游或下游1-3个碱基位置处”是指在连接位点的5’端或3’端1、2或3个碱基位置处。
在步骤2)中，以待检测基因为模板，利用Taq DNA连接酶进行连接反应。
如本领域技术人员所理解的，“连接反应”是指在两个多核苷酸末端之间形成核苷酸间连接的任何酶促或非酶促过程。例如，可通过在一个DNA末端的3’-羟基与另一个DNA末端的5’-磷酰基之间形成磷酸二酯键来连接DNA片段的末端。在一些情况下，核苷酸间连接反应可在两个多核苷酸片段之间(分子间)发生。在一些情况下，核苷酸间连接反应可在单个片段(分子内)的两个末端(5’端和3’端)之间发生。
在本发明中，可采用本领域技术人员已知的方法和程序使所述两段DNA连接序列发生连接反应，本发明对此不作进一步的限制。在一个实施方案中，连接反应在如下程序下进行三个循环：95℃45s；45℃10s。此外，连接反应可包括使用酶，诸如连接酶。
在本发明中，使用Taq DNA连接酶进行连接反应。如本领域技术人员所理解的，“Taq DNA连接酶”能够催化磷酸二酯键的形成，使杂交到同一互补靶DNA链上的两条寡核苷酸链的5’-磷酸末端和3’-羟基末端通过磷酸二酯键连接。这个连接反应只有当两条寡核苷酸链与互补靶DNA完全配对并且两条寡核苷酸链之间没有空隙的条件下才可发生。结合到本发明，只有在所设计的两段DNA连接序列与待检测基因的目标突变型基因的突变位点的上游和下游各10-20个碱基的序列完全匹配时，Taq DNA连接酶才将这两段DNA连接序列连接起来。因此，在以待检测基因为连接模板采用Taq DNA连接酶对所述两段DNA连接序列进行连接时，只有当待检测基因为具有单核苷酸多态性的目标突变型基因时，所设计的这两段DNA连接序列才能在Taq DNA连接酶的作用下发生连接反应，形成一段DNA序列，而当待检测基因为野生型基因时，由于存在一个碱基位点的不匹配，连接反应不能发生，最终保持了两段连接序列的长度。
由于Taq DNA连接酶具有特异性强的特点，因此当发生错配时，不进行连接反应，因而可以避免假阳性的结果出现，从而保证所得到的连接产物是由与具有单核苷酸多态性的待检测基因的目标突变型基因的突变位点附近(即，在突变位点的上游和下游各10-20个碱基的序列)的序列完全匹配的两段DNA连接序列进行连接反应获得的，这样可以进一步提高后续检测结果的准确性。
Taq DNA连接酶的上述特点，使得所述两段DNA连接序列在具有单核苷酸多态性的待检测基因的目标突变型基因的反应体系中发生连接反应，而在具有野生型基因的反应体系中不发生连接反应。由于不同长度的DNA其熔解温度是不同的，因此发明人提出了利用不同的DNA片段的熔解温度的不同来进行单核苷酸多态性检测。
如本领域技术人员所理解的，DNA熔解温度是指DNA双链变性过程中一半双链解离为单链的温度，是DNA片段的一个重要特征，而DNA熔解温度与DNA片段的长度等因素有关。结合到本发明，由于第2)步骤的连接产物实际上并非是DNA单链，而是连接产物的部分区域与模板基因互补的双链DNA。以突变型基因作为模板的连接体系的连接产物互补区域为一整段较长的区域，而以野生型基因作为模板的连接体系的连接产物的中间存在缺口(Nick)，互补区域为两段较短的区域，两者的DNA片段的长度不用，相应地熔解温度也存在明显的差异性。
在步骤3)中，测定步骤2)所得产物的熔解温度，并根据熔解温度的不同来判断所述待检测基因是否存在单核苷酸多态性。传统上，多采用紫外分光光度计来测定DNA分子的熔解温度，但是该方法具有一定的局限性，溶液的需要量较大，操作起来不方便，因此本发明利用荧光染料与双链DNA分子结合后荧光大大增强，同时与双链DNA分子结合的荧光染料的荧光强度随DNA的解链也会产生显著的变化特点，采用荧光定量法来测定产物的熔解温度。在本发明中，可以利用荧光定量PCR仪来测定产物的熔解温度。荧光定量PCR仪的溶液需求量较小，不需要太多的操作，并且能很好地控制反应的温度，进行实时自动化检测。在本发明中，可以使用的荧光染料为SYBR Green I或Evagreen，但不限于此。本发明通过荧光染料来表征双链DNA的熔解温度，从而判断两段DNA连接序列是否被连接在一起。当然也可以使用其他方法来测试熔解温度。
此外，在检测过程中，如果待检测基因的丰度较高，则可以直接进行步骤3)中的熔解温度的测定。在一些实施方案中，在所述待检测基因的丰度≥1μM的情况下，直接进行步骤3)中的熔解温度的测定。如果待检测基因的丰度较低，则所述检测方法还可以包括对步骤2)所得产物进行扩增反应的步骤。在一些实施方案中，在所述待检测基因的丰度≤0.1μM的情况下，对所述步骤2)所得的产物进行扩增反应。所述扩增反应可以一直进行，直到达到可以用于通过荧光染料和荧光定量PCR仪对其熔解温度进行快速、准确测定的水平。在一些实施方案中，利用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增反应。在本发明中，只有当连接产物的量较少时，为了增加信号强度，才进行PCR扩增反应。换言之，PCR扩增反应是一个可选过程而非必需过程。
本发明通过利用Taq DNA连接酶对单碱基具有高特异性识别的特点来识别SNP位点，并通过利用所设计的DNA连接序列与待检测基因的目标突变型基因的连接产物或连接产物的扩增产物与待检测基因的野生型基因的相应产物的熔解温度不同来进行单核苷酸多态性检测，同时利用低成本的荧光染料及常规荧光定量PCR仪来实现检测结果的可视化，从而区别出突变型基因和野生型基因，实现单核苷酸多态性的检测。
本发明提供的单核苷酸多态性的检测方法具有以下有益效果：
(1)准确性高
本发明采用Taq DNA连接酶，其具有特异性高的特点，一旦发生错配，所设计的两段DNA连接序列将不会发生连接反应，从而提高单核苷酸多态性检测的准确性。
(2)通用型强
本发明提供的检测方法对基因突变的类型和基因结构没有选择性，可以用于多种基因突变的检测，而不需要针对不同病症的基因突变使用不同的方法。
(3)成本低
本发明提供的检测方法使用低成本的Taq DNA连接酶、低成本的荧光染料、常规荧光定量PCR仪等，避免使用成本昂贵的试剂和染料，显著降低了检测成本。
(4)方便、快速
相比于现有技术，本发明提供的检测方法步骤简单、整个过程只需1.5-3小时，大大缩短了检测时间。
在第二方面，本发明提供了一种用于检测单核苷酸多态性的试剂盒，所述试剂盒包括：
a)针对待测基因的目标突变型基因设计合成的两段DNA连接序列，其中，所述两段DNA连接序列与具有单核苷酸多态性的待检测基因的目标突变型基因的在突变位点的上游和下游各10-20(如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)个碱基的序列完全匹配，所述两段DNA连接序列中的其中一段DNA连接序列与所述待检测基因的野生型基因的一个碱基位点不匹配，且所述不匹配碱基所在的位点位于该段DNA连接序列的连接位点上游或者下游1-3(如1、2或3)个碱基位置处；
b)Taq DNA连接酶；以及
c)用于荧光定量检测的荧光染料。
在上述试剂盒中，所述荧光染料为SYBR Green I或Evagreen。
此外，所述试剂盒还包括：d)用于指导单核苷酸多态性检测的说明书。
基于同样的特点，本发明所提供的试剂盒具有准确性高、通用型强、成本低、方便、快速等有益效果。
下面结合附图以及实施例对本发明进行更为具体和详细的描述。需要注意，在本发明中未明确记载的方法/实验步骤均可以通过本领域的常规方法/实验步骤来进行，同时可以参考相应的实验工具书。
实施例
下面以乙肝病毒DNA片段的单核苷酸多态性的检测为例来对本发明的检测方法进行说明。
仪器和试剂
仪器：
荧光定量PCR仪：CFX96TM Realtime System，Bio-Rad；
基因扩增仪：C1000 TouchTM Thermal Cycler，Bio-Rad。
试剂：
Taq连接酶缓冲液(Taq Ligase Buffer)：Novoprotein，货号M024-01B，批号0512931；
Taq DNA连接酶(Taq DNA Ligase)：Novoprotein，货号M024-01B，批号0512931；
Sybr GreenⅠ荧光染料：Solarbio，货号SR4110，批号20180509。
乙肝病毒DNA片段的序列如下：
突变型基因(MT)：5’gctttcagctatattgatgatgtggtattg 3’，来源于生工生物工程(上海)股份有限公司，在序列表中标记为SEQ ID No.1；
野生型基因(WT)：5’gctttcagctatatggatgatgtggtattg 3’，来源于生工生物工程(上海)股份有限公司，在序列表中标记为SEQ ID No.2。
设计的连接序列、参考序列、正向引物和反向引物的序列如下：
连接序列1(LS1)：5’gaattcatggttaaccccacccaataccacatcatcaa 3’，来源于生工生物工程(上海)股份有限公司，在序列表中标记为SEQ ID No.3；
连接序列2(LS2)：5’tatagctgaaagcctgactgtggacaaatctaa 3’，5’磷酸化，来源于生工生物工程(上海)股份有限公司，在序列表中标记为SEQ ID No.4；
参考序列(RS)：5’gaattcatggttaaccccacccaataccacatcatcaatatagctgaaagcctgactgtggacaaatctaa3’，来源于生工生物工程(上海)股份有限公司，在序列表中标记为SEQID No.5；
正向引物(PF)：根据检测基因进行设计，本实施例中该序列为5’gaattcatggttaaccccacc 3’，来源于生工生物工程(上海)股份有限公司，在序列表中标记为SEQ ID No.6；
反向引物(PR)：根据检测基因进行设计，本实施例中该序列为5’ttagatttgtccacagtcag 3’，来源于生工生物工程(上海)股份有限公司，在序列表中标记为SEQ ID No.7。
实施例1：高丰度(10μM)人工合成乙肝病毒DNA片段的SNP检测(拉米夫定耐药基因突变位点检测)
1.储存液配制
用超纯水分别将上述突变型基因(MT)、野生型基因(WT)、连接序列1(LS1)、连接序列2(LS2)和参考序列(RS)配制成10μM的水溶液。
2.用Taq连接酶进行DNA连接反应
1)反应体系的配制
MT的反应体系的配制：按照以下用量配制(共50μL)：5μL的10×Taq连接酶缓冲液、2μL的Taq DNA连接酶、1μL的LS1、1μL的LS2、1μL的MT和40μL超纯水。
WT的反应体系的配制：按照以下用量配制(共50μL)：5μL的10×Taq连接酶缓冲液、2μL的Taq DNA连接酶、1μL的LS1、1μL的LS2、1μL的WT和40μL超纯水。
2)按照下列程序设定PCR仪程序：95℃反应45s，45℃反应10min，共3个循环，并将各样本试管加入进行反应。
3.单核苷酸多态性的检测
连接反应后，从各样品试管中取出45μL加入1μL Sybr GreenⅠ染料(200倍稀释)，在荧光定量PCR仪上检测熔解曲线。
阳性对照溶液的配制：1μL的RS、1μL的MT、43μL的超纯水和1μL的Sybr Green I染料。
阴性对照溶液的配制：1μL的WT、1μL的LS1、1μL的LS2、42μL的超纯水和1μL的SybrGreen I染料。
4.检测结果
检测结果如图1所示，可以看到只有突变型基因和阳性对照能够出现特征峰(70℃左右)，野生型基因及阴性对照没有出现特征峰。由此可知，可以根据熔解曲线的特征峰来进行单核苷酸多态性检测。
实施例2：中丰度(1μM)人工合成乙肝病毒DNA片段SNP检测(拉米夫定耐药基因突变位点检测)
1.储存液配制
用超纯水分别将上述突变型基因(MT)和野生型基因(WT)配制为1μM的水溶液，以及用超纯水将连接序列1(LS1)、连接序列2(LS2)和参考序列(RS)配制成10μM的水溶液。
2.用Taq连接酶进行DNA连接反应
1)反应体系的配制
MT的反应体系的配制：按照以下用量配制(共50μL)：5μL的10×Taq连接酶缓冲液、2μL的Taq DNA连接酶、1μL的LS1、1μL的LS2、1μL的MT和40μL超纯水。
WT的反应体系的配制：按照以下用量配制(共50μL)：5μL的10×Taq连接酶缓冲液、2μL的Taq DNA连接酶、1μL的LS1、1μL的LS2、1μL的WT和40μL超纯水。
2)按照下列程序设定PCR仪程序：95℃反应45s，45℃反应10min，共3个循环，并将各样本试管加入进行反应。
3.单核苷酸多态性的检测
连接反应后，各样品试管中取出45μL加入1μL Sybr GreenⅠ染料(200倍稀释)，在荧光定量PCR仪上检测熔解曲线。
阳性对照溶液的配制：1μL的RS、1μL的MT、43μL的超纯水和1μL的Sybr Green I染料。
阴性对照溶液的配制：1μL的WT、1μL的LS1、1μL的LS2、42μL的超纯水和1μL的SybrGreen I染料。
4.检测结果
检测结果如图2所示，可以看到只有突变型基因和阳性对照能够出现特征峰(70℃左右)，野生型基因及阴性对照没有出现特征峰。由此可知，可以根据熔解曲线的特征峰来进行单核苷酸多态性检测。
实施例3：低丰度(0.1μM)人工合成乙肝病毒DNA片段SNP检测(拉米夫定耐药基因突变位点检测)
1.储存液配制
用超纯水分别将上述突变型基因(MT)和野生型基因(WT)配制成0.1μM的水溶液，用超纯水将参考序列(RS)配制成0.001μM的水溶液，以及用超纯水将连接序列1(LS1)和连接序列2(LS2)配制成10μM的水溶液。
2.用Taq连接酶进行DNA连接反应
1)反应体系的配制
MT的反应体系的配制：按照以下用量配制(共50μL)：5μL的10×Taq连接酶缓冲液、2μL的Taq DNA连接酶、1μL的LS1、1μL的LS2、1μL的MT和40μL超纯水。
WT的反应体系的配制：按照以下用量配制(共50μL)：5μL的10×Taq连接酶缓冲液、2μL的Taq DNA连接酶、1μL的LS1、1μL的LS2、1μL的WT和40μL超纯水。
2)按照下列程序设定PCR仪程序：95℃反应45s，45℃反应10min，共3个循环，并将各样本试管加入进行反应。
3.PCR反应及单核苷酸多态性检测
1)PCR反应体系的配制：按照以下用量配制(共50μL)：25μL的2×Taq Master Mix、20μL的连接反应产物、1μL的PF、1μL的PR、2μL的超纯水和1μL的Sybr GreenⅠ染料(200倍稀释)。
2)对照溶液的配制
阳性对照溶液的配制：25μL的2×Taq Master Mix、0.4μL的RS、1μL的PF、1μL的PR、1μL的Sybr GreenⅠ染料(200倍稀释)和21.6μL的超纯水
阴性对照溶液的配制：25μL的2×Taq Master Mix、0.4μL的LS2、1μL的PR、1μL的Sybr GreenⅠ染料(200倍稀释)和22.6μL的超纯水
3)按照下列程序设定荧光定量PCR仪程序：95℃反应3min，95℃反应30s，55℃反应30s，68℃反应1min，共10个循环，加入Melting Curve程序，并将各样本试管加入进行反应及检测。
4.检测结果
检测结果如图3所示，阳性对照出现的熔解峰为突变特异性峰(82℃左右)，阴性对照形成的则为非特异性峰，因此可以看到，只有突变型基因才能出现与阳性对照重叠的主峰，与阴性对照的主峰相对应的野生型基因的主峰则为非特异性峰。因此，可以根据熔解曲线的特征峰来进行单核苷酸多态性检测。
以上仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 贵州中医药大学第二附属医院
<120> 一种单核苷酸多态性的检测方法及相应的试剂盒
<141> 2019-12-26
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 乙肝病毒(Hepatitis B virus)
<400> 1
gctttcagct atattgatga tgtggtattg 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 乙肝病毒(Hepatitis B virus)
<400> 2
gctttcagct atatggatga tgtggtattg 30
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaattcatgg ttaaccccac ccaataccac atcatcaa 38
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tatagctgaa agcctgactg tggacaaatc taa 33
<210> 5
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaattcatgg ttaaccccac ccaataccac atcatcaata tagctgaaag cctgactgtg 60
gacaaatcta a 71
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaattcatgg ttaaccccac c 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttagatttgt ccacagtcag 20

Claims (13)

1.一种用于非诊断目的的单核苷酸多态性的检测方法，其中，所述方法包括以下步骤：
1)设计合成两段DNA连接序列，其中，所述两段DNA连接序列与具有单核苷酸多态性的待检测基因的目标突变型基因的在突变位点的上游和下游各10-20个碱基的序列完全匹配，所述两段DNA连接序列中的其中一段DNA连接序列与所述待检测基因的野生型基因的一个碱基不匹配，且所述不匹配碱基所在的位点位于该段DNA连接序列的连接位点上游或者下游1个碱基位置处；
2)以所述待检测基因为模板，利用Taq DNA连接酶进行连接反应；以及
3)测定步骤2)所得产物的熔解温度，并根据熔解温度的不同来判断所述待检测基因是否存在单核苷酸多态性。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其中，步骤2)中的连接反应在如下程序下进行三个循环：95℃45s；45℃10s。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其中，在所述待检测基因的丰度≤0.1μM的情况下，所述方法还包括对所述步骤2)所得的产物进行扩增反应。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其中，所述扩增反应为利用Taq DNA聚合酶的PCR扩增反应。
5.根据权利要求1-4任一项所述的检测方法，其中，使用荧光染料来测定所得产物的熔解温度。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其中所述荧光染料为SYBRGreenI或Evagreen。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其中在步骤1)中，所述两段DNA连接序列与具有单核苷酸多态性的待检测基因的目标突变型基因的在突变位点的上游和下游各10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碱基的序列完全匹配。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其中设计合成的两段DNA连接序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。
9.一种用于检测单核苷酸多态性的试剂盒，所述试剂盒包括：
a)针对待测基因的目标突变型基因设计合成的两段DNA连接序列，其中，所述两段DNA连接序列与具有单核苷酸多态性的待检测基因的目标突变型基因的在突变位点的上游和下游各10-20个碱基的序列完全匹配，所述两段DNA连接序列中的其中一段DNA连接序列与所述待检测基因的野生型基因的一个碱基位点不匹配，且所述不匹配碱基所在的位点位于该段DNA连接序列的连接位点上游或者下游1个碱基位置处；
b)Taq DNA连接酶；以及
c)用于荧光定量检测的荧光染料。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其中，所述荧光染料为SYBRGreenI或Evagreen。
11.根据权利要求9或10所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括：d)用于指导单核苷酸多态性检测的说明书。
12.根据权利要求9所述的试剂盒，其中在步骤1)中，所述两段DNA连接序列与具有单核苷酸多态性的待检测基因的目标突变型基因的在突变位点的上游和下游各10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碱基的序列完全匹配。
13.根据权利要求9所述的试剂盒，其中设计合成的两段DNA连接序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。
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