CN103571928A - 检测基因点突变的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测基因点突变的方法，包括以下步骤：针对点突变基因设计检测探针和匹配探针，检测探针5′端带有识别分子，3′端第一个碱基是与突变碱基互补配对的识别碱基；匹配探针3′端具有信号标记；对包含突变碱基的基因区域进行PCR预扩增；将检测探针和匹配探针，以PCR预扩增产物为模板，在连接酶的作用下进行连接反应；用磁珠捕获连接后的完整探针；对磁珠表面捕获的完整探针3′端的信号标记进行检测和分析。本发明还公开了检测基因点突变的试剂盒。本发明检测基因点突变的方法，灵敏度高，可检测到样品中含量为0.1％的突变型基因，能实现高通量检测，检测结果精确、可靠，在肿瘤分子诊断、遗传分子诊断等领域有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和医学领域，尤其涉及一种检测基因点突变的方法及试剂盒。
背景技术
肿瘤发生发展的重要因素是细胞增殖、分化失控、细胞凋亡障碍及血管生成通路异常，它是一个多基因改变的积累过程。随着生物科学和临床医学的不断发展，越来越多的证据显示恶性肿瘤以及遗传性疾病与基因的变化有紧密联系。人类的许多遗传性疾病都是由于基因的变异引起的，其中尤以单碱基突变最为普遍，因此，实现对DNA热点突变的早期、准确、简便、快速的确认，对于人类相关疾病的发病机理及早期治疗具有非常重要的意义。
目前，国内外有关突变检测的技术和方法层出不穷，应用较多的突变检测方法主要有：DNA测序、变性高效液相色谱(dHPLC)、DNA芯片技术、限制性酶切片段长度多态性技术(RFLP)、DxS蝎子引物法、高分辨率熔解曲线分析技术(HRM)等。其中DNA测序技术应用最广，更是被誉为“金标准”，但是，对于一些较大分子，外显子较多的基因不宜用测序法直接检测突变，传统的突变检测技术很难检出丰度低于5％的突变基因，且检测突变基因时往往存在野生型基因背景的干扰。DxS蝎子引物技术和HRM技术是两项高通量突变检测技术，突变检测极限一般在1％-5％，其缺点是样本处理要求较高，且检测结果判读相对困难。
发明内容
本发明要解决目前基因点突变检测灵敏度不高、检测过程易受样本中野生型基因干扰的技术问题，提供一种检测基因点突变的方法，该方法的检测结果更加精确、特异性更高。
此外，还需要提供一种检测基因点突变的试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
在本发明的一个方面，提供了一种检测基因点突变的方法，包括以下步骤：
针对点突变基因设计检测探针和匹配探针，所述检测探针5′端带有识别分子，其3′端第一个碱基为识别碱基，该识别碱基与突变碱基互补配对，所述匹配探针5′端磷酸化，3′端具有信号标记；
对包含突变碱基的基因区域进行PCR预扩增；
将检测探针和匹配探针，以PCR预扩增产物为模板，在连接酶的作用下进行探针连接反应；
用磁珠捕获连接后的完整探针，该磁珠表面带有捕获分子，能与检测探针上的识别分子特异性结合；
对磁珠表面捕获的完整探针3′端的信号标记进行检测和分析，获取基因突变的检测结果。
所述PCR预扩增产物的长度为100～400bp。
所述检测探针和匹配探针的Tm温度为60～80℃。
所述检测探针5′端的识别分子包括生物素、地高辛、核酸适配体、或与突变基因序列无关的寡核苷酸。
所述检测探针3′端第三个碱基与突变型基因和野生型基因对应结合位置的碱基均不互补配对。
所述匹配探针3′端的信号标记包括荧光标记，该荧光标记包括SA-PE、Cy3、Cy5、或FAM。
所述连接反应中检测探针与匹配探针的分子数比例为1∶1～1∶10。
所述磁珠的平均直径为0.1-10μm。优选的，所述磁珠具有超顺磁性。
所述捕获分子包括：链霉亲和素、抗地高辛抗体、或与寡核苷酸识别分子互补配对的寡核苷酸序列。
所述信号标记的检测仪器包括荧光酶标仪、流式细胞仪等。
在本发明的另一方面，还提供了一种检测基因点突变的试剂盒，包含：
针对点突变基因设计的检测探针和匹配探针，所述检测探针5′端带有识别分子，其3′端第一个碱基为识别碱基，该识别碱基与突变碱基互补配对，所述匹配探针3′端具有信号标记；
连接酶；
表面带有捕获分子的磁珠，所述捕获分子与检测探针上的识别分子特异性结合。
相对于现有点突变检测技术，本发明检测基因点突变的方法具有以下优点：
特异性和灵敏高。本发明一方面通过PCR信号放大结合LDR来提高检测灵敏度，另一方面通过磁珠富集分离突变型和野生型信号结合LDR来提高检测特异性，本发明方法可以检测到样品中含量为0.1％的突变型基因，灵敏度非常高。
操作简单。本发明实际操作简单，简化了操作上造成的结果误差。
结果易于判读。本发明检测结果主要是荧光信号值，其大小与突变率成正比，具有较好的线性关系，通过划出阴性区间，可以很直观的区分阳性和阴性结果。
高通量。本发明利用荧光酶标仪检测可以达到同时检测96或128或384个突变类型，大大缩短了大量样本的检测时间。
低成本。本发明大大降低了仪器、试剂、人力等成本。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明基于连接酶检测反应与磁珠分离相结合的基因点突变检测方法示意图；
图2是本发明实施例1的检测结果图；
图3是本发明实施例2的检测结果图。
具体实施方式
为了提高大量野生型基因背景下低丰度点突变基因的检测灵敏度，本发明研发出了一种检测基因点突变的方法，该方法将连接酶检测反应技术(ligase detection reaction，LDR)与磁珠分离技术相结合，主要包括PCR预扩增、LDR连接、磁珠捕获、信号检测四个步骤。
如图1所示，本发明检测基因点突变的方法，具体包括以下步骤：
针对发生点突变的碱基设计检测探针和匹配探针，其中检测探针5′端带有识别分子，其3′端第一个碱基为识别碱基，该识别碱基与突变碱基互补配对，检测探针3′端第三个碱基与突变型基因和野生型基因对应结合位置的碱基均不互补配对；匹配探针5′端磷酸化，3′端具有信号标记，该信号标记包括荧光标记。检测探针和匹配探针的Tm温度为60～80℃。
对细胞或非细胞体系中提取的包含突变碱基的基因组DNA进行PCR预扩增，PCR预扩增产物的长度为100～400bp。
将检测探针和匹配探针，以PCR预扩增产物为模板，在连接酶的作用下进行探针连接反应。连接反应中检测探针与匹配探针的分子数比例为1∶1～1∶10。
用磁珠捕获连接后的完整探针，该磁珠表面带有捕获分子，能与检测探针上的识别分子特异性结合。磁珠又称磁性微球，本发明的磁珠具有超顺磁性，且平均直径为0.1-10μm。在本发明中，检测探针上的识别分子包括生物素、地高辛、核酸适配体、或与突变基因序列无关的寡核苷酸；磁珠表面的捕获分子包括：链霉亲和素、抗地高辛抗体、或与寡核苷酸识别分子互补配对的寡核苷酸序列。
对磁珠表面捕获的完整探针3′端的信号标记进行检测和分析，获取基因突变的检测结果。可通过荧光酶标仪、或流式细胞仪等检测仪器对完整探针3′端的标记信号进行检测，从而获得基因突变的信息。
实施例1本发明方法对TP53基因659A＞G突变的检测
1.设计引物和探针
针对TP53基因659位碱基A＞G突变设计PCR预扩增引物和LDR连接探针：
2.PCR预扩增
1)PCR体系
| 组分 | 体积 | 组分浓度 |
| H2O | 18μl | 去离子水 |
| 10×PCR缓冲液 | 2.5μl | 10× |
| 引物 | 2μl | 5μM |
| dNTP | 1.3μl | 2.5mM |
| Taq Hot酶 | 0.2μl | 5U/μl |
| 模板 | 1μl | ≈25ng/μl |
2)PCR条件
95℃5min预变性后，95℃30s，60℃30s，72℃30s，反应35循环。
3.LDR反应
1)LDR体系
| 组分 | 体积 | 组分浓度 |
| H2O | 23.75μl | 去离子水 |
| 10×缓冲液 | 3μl | 10× |
| Taq DNA连接酶 | 0.25μl | 40U/μl |
| 探针 | 0.5μl | 检测探针(2μM)/匹配探针(8μM) |
| PCR产物 | 2.5μl | ≈25ng/μl |
2)LDR条件
94℃2min预变性后，94℃30s，65℃1min，30循环。
4.磁珠捕获LDR连接产物
LDR结束后，30μl反应体系中加入50μl 2×Tm杂交液(0.4M NaCl，0.2M Tris，0.16％TritonX-100，pH 8.0)、5μg捕获分子修饰的磁珠和20μl去离子水，37℃水浴30min。磁铁分离磁珠后，加入100μl含2μg/μl SA-PE的1×Tm杂交液37℃水浴孵育磁珠30min，使生物素结合SA-PE为连接探针标记荧光。
5.荧光检测
孵育完成后，磁珠用1×Tm杂交液洗涤2次，50μl去离子水分散磁珠，转入96孔板中荧光酶标仪检测。
6.结果
如图2A和2B所示，横坐标为检测样本中TP53突变型基因组与野生型基因组的比值，纵坐标为荧光酶标仪检测的磁珠表面总荧光量。其中野生型和突变型基因组分别来源于HepG2细胞系和Huh7细胞系，经基因组抽提纯化，对TP53基因区域进行扩增、测序，已验证HepG2细胞系TP53基因区域为野生型，Huh7细胞系TP53基因区域为突变型。如图2A所示，检测的总荧光量随着检测样本中TP53基因突变含量增大而增大，根据荧光信号强度的差异，可以分析检测样本基因组中0.1％的TP53基因突变。如图2B所示，检测的磁珠荧光强度与样本中TP53突变基因含量成线性关系，根据相关线性方程可以对检测样本中的TP53突变基因进行相对定量。
实施例2本发明方法对kras基因34G＞A的检测
1.设计引物和探针
针对kras基因34位碱基G＞A突变设计PCR预扩增引物和LDR连接探针：
2.PCR预扩增
1)PCR体系
| 组分 | 体积 | 组分浓度 |
| H2O | 18μl | 去离子水 |
| 10×PCR缓冲液 | 2.5μl | 10× |
| 引物 | 2μl | 5μM |
| dNTP | 1.3μl | 2.5mM |
| Taq Hot酶 | 0.2μl | 5U/μl |
| 模板 | 1μl | ≈25ng/μl |
2)PCR条件
95℃5min预变性后，95℃30s，60℃30s，72℃30s，反应35循环。
3.LDR反应
1)LDR体系
| 组分 | 体积 | 组分浓度 |
| H2O | 23.75μl | 去离子水 |
| 10×缓冲液 | 3μl | 10× |
| Taq DNA连接酶 | 0.25μl | 40U/μl |
| 探针 | 0.5μl | 检测探针(2μM)/匹配探针(8μM) |
| PCR产物 | 2.5μl | ≈25ng/μl |
2)LDR条件
94℃2min预变性后，94℃30s，65℃1min，30循环。
4.磁珠捕获LDR连接产物
LDR结束后，30μl反应体系中加入50μl 2×Tm杂交液(0.4M NaCl，0.2M Tris，0.16％TritonX-100，pH 8.0)、5μg捕获分子修饰的磁珠和20μl去离子水，37℃水浴30min。磁铁分离磁珠后，加入100μl含2μg/μl SA-PE的1×Tm杂交液37℃水浴孵育磁珠30min，使生物素结合SA-PE为连接探针标记荧光。
5.荧光检测
孵育完成后，磁珠用1×Tm杂交液洗涤2次，50μl去离子水分散磁珠，转入96孔板中荧光酶标仪检测。
6.结果
如图3A和3B所示，横坐标为检测样本中kras突变型基因组与野生型基因组的比值，纵坐标为荧光酶标仪检测的磁珠表面总荧光量。其中kras基因组来源于HepG2细胞系或A549细胞系，经基因组抽提纯化，对kras基因区域进行扩增、测序，已验证HepG2细胞系kras基因区域为野生型，A549细胞系kras基因区域为突变型。如图3A所示，检测的磁珠总荧光强度随着基因组中kras基因突变含量增大而增大，根据荧光信号的差异，可以分析检测样本中0.1％的kras基因突变。如图3B所示，检测的磁珠总荧光强度与样本中kras突变基因含量成线性关系，根据相关线性方程以及内标物可以对检测样本中kras突变基因进行相对定量。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110>上海生物芯片有限公司
<120>检测基因点突变的方法及试剂盒
<160>8
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物
<400>1
ttgcgtgtgg agtatttgga 20
<210>2
<211>20
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<400>7
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<210>8
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
agctccaact accacaagtt tatattcagt cattttc 37
Claims (10)
1.一种检测基因点突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
针对点突变基因设计检测探针和匹配探针，所述检测探针5′端带有识别分子，其3′端第一个碱基为识别碱基，该识别碱基与突变碱基互补配对，所述匹配探针5′端磷酸化，3′端具有信号标记；
对包含突变碱基的基因区域进行PCR预扩增；
将检测探针和匹配探针，以PCR预扩增产物为模板，在连接酶的作用下进行探针连接反应；
用磁珠捕获连接后的完整探针，该磁珠表面带有捕获分子，能与检测探针上的识别分子特异性结合；
对磁珠表面捕获的完整探针3′端的信号标记进行检测和分析，获取基因突变的检测结果。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR预扩增产物的长度为100～400bp。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测探针和匹配探针的Tm温度为60～80℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测探针5′端的识别分子包括生物素、地高辛、核酸适配体、或与突变基因序列无关的寡核苷酸。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测探针3′端第三个碱基与突变型基因和野生型基因对应结合位置的碱基均不互补配对。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述匹配探针3′端的信号标记包括荧光标记。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述荧光标记包括SA-PE、Cy3、Cy5、或FAM。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述连接反应中检测探针与匹配探针的分子数比例为1∶1～1∶10。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述捕获分子包括：链霉亲和素、抗地高辛抗体、或与寡核苷酸识别分子互补配对的寡核苷酸序列。
10.一种检测基因点突变的试剂盒，其特征在于，包含：
针对点突变基因设计的检测探针和匹配探针，所述检测探针5′端带有识别分子，其3′端第一个碱基为识别碱基，该识别碱基与突变碱基互补配对，所述匹配探针3′端具有信号标记；
连接酶；
表面带有捕获分子的磁珠，所述捕获分子与检测探针上的识别分子特异性结合。
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| CN (1) | CN103571928A (zh) |
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| CN116042779A (zh) * | 2022-12-22 | 2023-05-02 | 山东省海洋科学研究院(青岛国家海洋科学研究中心) | 一种检测pik3ca基因突变的方法 |
| CN110964791B (zh) * | 2019-12-26 | 2023-08-15 | 贵州中医药大学第二附属医院 | 一种单核苷酸多态性的检测方法及相应的试剂盒 |
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| CN1936550A (zh) * | 2006-08-29 | 2007-03-28 | 中国科学院南海海洋研究所 | 检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的试剂盒及方法 |
-
2012
- 2012-07-23 CN CN201210256411.8A patent/CN103571928A/zh active Pending
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20140212 |