CN104328209B - 白血病微小残留病wt1基因快速检测方法的引物和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种白血病微小残留病WT1基因快速检测方法的引物和试剂盒，针对WT1基因设计5条特异性引物，这些引物针对靶序列上的7个不同区域从而保证了LAMP反应的特异性和敏感性。采用本试剂盒通过检测WT1基因诊断急性白血病微小残留病，结合RNA快速提取试剂盒，从取得样本到结果判定结束仅需1h，而且操作简单，结果准确直观，特异性与敏感性高，适合于各级医院快速诊断。

Description

白血病微小残留病WT1基因快速检测方法的引物和试剂盒

技术领域

本发明涉及基因的快速检测方法，尤其涉及一种白血病微小残留病WT1基因快速检测方法的引物和试剂盒。

背景技术

WT1基因的表达及表达量与急性白血病的发生、发展及预后有密切关系，在微小残留病检测方面具有重要意义。WT1基因在正常组织中仅在胎儿肾脏、睾丸、卵巢及早期造血组织中高度表达，在未成熟的淋巴系及髓系白血病细胞中高表达，可以作为急性白血病细胞的标志物。

WT1基因是影响白血病患者CR率的最重要危险因素之一，与白血病患者的化疗效果及预后密切相关，WT1基因表达阳性者，CR率低、易复发、预后差。WT1基因在白血病患者中的表达有规律可循，治疗前高表达，治疗缓解后转阴性，复发前再转为阳性表达，长期生存者多为阴性。因此，检测WT1的表达可作为化疗和骨髓移植后微小残留病(MRD)检测的敏感指标，也是研究白血病发生、发展和预测预后的手段。

目前检查WT1基因主要通过PCR或实时荧光定量PCR。PCR耗时长、一般需要4-5个小时，灵敏度和特异性低、仪器要求高，而且PCR结束之后需要通过电泳判断结果，电泳所用DNA染料EB有剧毒。实时荧光定量PCR方法虽然特异性和灵敏度有所提高，但是需要产生荧光的引物和探针，还需要昂贵的检测设备，而且需要2-3个小时的检测时间；因此现有的检测方法存在白血病微小残留病检测中易出现假阳性、检测成本高、操作复杂、检测时间长的问题。

环介导等温扩增方法已经广泛应用于微生物检测领域，并有很多相关专利获得授权，但在肿瘤及白血病研究领域未见应用。目前国内外均未见使用LAMP方法检测白血病WT1基因的报道。

发明内容

本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种白血病微小残留病WT1基因快速检测方法的引物和试剂盒。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种白血病微小残留病WT1基因快速检测方法的引物，F3:其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；B3：其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；FIP：其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，BIP：其核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；LP：其核苷酸序列如SEQIDNO：5所示。

上述引物在检测急性白血病微小残留病中的应用。

一种白血病微小残留病WT1基因快速检测方法的试剂盒，内含LAMP反应液、阳性对照、阴性对照，所述LAMP反应液的成分为：0.04μmol/μLpH为8.8的Tris-HCl，0.02μmol/μLKCl，0.016μmol/μLMgSO₄，0.02μmol/μL(HN₄)₂SO₄，0.002μl/μLTween₂₀，1.6μmol/μL甜菜碱，0.0028μmol/μL×4种dNTPs，10U/μL逆转录酶，8U/μLBstDNA聚合酶，0.00005μmol/μL钙黄绿素，0.2pmol/μLF3，0.2pmol/μLB3，1.6pmol/μLFIP，1.6pmol/μLBIP，0.8pmol/μLLP；

阳性对照为：反应时在反应液中加入WT1RNA表达阳性的NB4细胞的基因组RNA；

阴性对照为：反应时在反应液中加入超纯水。

上述试剂盒中LAMP反应液为1mL、阳性对照50μL、阴性对照1mL。

上述试剂盒还包括：反应管50个，1-10μL移液器头100个。

上述试剂盒的使用方法：取20μL反应液置于反应管中，将5μL待检RNA加入反应液内，用移液器吹打混匀，盖好反应管的盖子，将反应管置于水浴锅中进行扩增，扩增条件为：60-65℃水浴恒温反应25-30min；用户在初次使用时需要设置阴性对照和阳性对照。

本发明的有益效果：

本发明提供了用环介导等温扩增方法检测WT1基因的引物，建立了白血病微小残留病WT1基因检测新方法。采用本试剂盒检测WT1基因，结合RNA快速提取试剂，从取得样本到结果判定结束可以控制在1h内。

本试剂盒采用环介导等温扩增技术检测WT1基因的表达，一步法反应，不需要将RNA预先逆转录为cDNA，基因扩增和结果判定在一个管中，不需要跑电泳，可以有效避免因形成气溶胶而导致的DNA污染及假阳性的产生，仪器设备只需要恒温水浴锅，检测时间不超过0.5小时，而且因为扩增效率极高，痕量RNA即可被扩增检测到，所以对标本质量及数量要求不高。

解决了现有技术时间长、工作量大、交叉污染、操作复杂、基层实验室难以开展等缺陷。本试剂对仪器设备和操作人员要求低，不具有高级实验室的基层医院也可以开展，患者可以就近检查，当天拿结果，而不用再长途跋涉到条件好的大医院，排除了基层医院难以开展此类检查的障碍，方便了患者，节约时间和费用，为治疗争取宝贵时间。

附图说明

图1为裸眼目视观察反应结果，其中，1号管为检测管，2号管为阳性对照，3号管为阴性对照；

图2为灵敏度检测，其中，1-5号管中加入的为倍比稀释的RNA，浓度依次为100、10、1、0.1、0.01ng/μL，1-3号为阳性，4、5号为阴性；

图3为LAMP法目视检测试剂盒特异性结果，1-5号管为急性白血病患者血液，6号管为NB4细胞，7-11号管为正常人样本，12为U937细胞，1-6号为阳性，7-12为阴性。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。

1.材料与方法

1.1.样本：用培养的NB4细胞的基因组总RNA作为标准品用于本方法的建立。临床样本采用抗凝外周血或骨髓0.2-1.0ml。

1.2.总RNA提取：利用商品化的RNA提取试剂盒(购自北京天恩泽生物技术有限公司，型号为3701-50)抽提总RNA。

抽提总RNA具体操作步骤：

(1)将0.2-1.5mL抗凝全血13000g离心3分钟，弃上清；

(2)将1mL溶液A加入到血液细胞沉淀中，用移液枪吹打沉淀使细胞裂解；

(3)将0.3mL的溶液B和0.2mL氯仿加入离心管，剧烈震荡30秒,13000g离心5分钟，将上清液转移到另一干净离心管中；

(4)加入0.5mL的溶液C和0.2mL的氯仿到上清液中，剧烈摇晃30秒，13000g室温离心3分钟，将上清液转移到另一干净离心管中；

(5)在上清液中加入体积为其1/2的溶液D，剧烈摇晃30秒，13000g离心5分钟，移弃上清液；

(6)在离心管中加入1mL体积分数为75％的乙醇，振荡器上振荡混均30秒，离心13000g1分钟，吸弃上清液；

(7)室温放置2分钟，加入10-30μL无RNase水使RNA沉淀溶解，即为总RNA。

1.3.引物设计及筛选

根据WT1基因mRNA的7段序列设计引物组。利用PrimerExplorerV4软件(https://primerexplorer.jp)设计多组引物，每个引物组包括F3、B3、FIP、BIP、LP，根据反应时间及特异性对不同引物的反应进程和结果进行检测、筛选，确定反应快、特异性高的最佳引物。筛选到的最佳引物序列见表1。

WT1的mRNA序列，其核苷酸序列如SEQIDNO：6所示。

表1引物序列

1.4.LAMP反应体系

LAMP反应总体系为25μL，反应时加入20μL反应液，再加入5μL待检测RNA。同时设阳性对照和阴性对照。

阳性对照为：反应时在反应液中加入含WT1的基因组RNA溶液5μL；

阴性对照为：反应时在反应液中加入超纯水5μL。

20μL反应液成分及含量见表2。

表2反应缓冲液成分及含量

1.5.试剂盒组装

试剂盒内含LAMP反应液、阳性对照、阴性对照3管试剂，以50次反应计，试剂盒组装如表3所示。

表3白血病微小残留病WT1基因快速检测试剂盒设置

1.6.反应条件

取20μL反应液置于反应管中，将5μL待检RNA加入反应液内，用移液器吹打混匀，盖好反应管的盖子，将反应管置于水浴锅中进行扩增，扩增条件为：60-65℃水浴恒温反应25-30min。初次使用本试剂盒建议设置阴性对照和阳性对照，但不是必要步骤。

2.结果判定

在LAMP反应进行的过程中，随着大量DNA的合成，还产生一种副产物焦磷酸根离子，焦磷酸根离子浓度与生成的DNA成正比。反应初期，显色液中的钙黄绿素与荧光淬灭剂锰离子结合而不发荧光。由于焦磷酸根离子更易与锰离子结合从而释放了钙黄绿素。游离的钙黄绿素可以自发荧光，在镁离子存在的条件下，这种荧光效果得到了加强。而且这种荧光在自然光下可被裸眼观察到。扩增反应前，反应液为淡橙色，待检测样本DNA被扩增后反应液变为绿色。因此从反应开始至结果判读均不需要打开反应管，可以有效避免因形成气溶胶而导致的DNA污染及假阳性的产生。

所以，反应液变为绿色的为阳性结果；反应液不变色仍为淡橙色的为阴性结果，如图1所示，1号管为检测管，2号管为阳性对照，反应结束后1、2号管中的液体变为绿色，为阳性，3号管中的液体仍保持淡橙色，为阴性。若反应时间延长至30min以上，可能会出现假阳性，结果判定以30分钟以内时为准。

3.敏感性检测

用微量分光光度计(购自美国Nanodrop公司，型号为ND-1000)检测样本RNA的浓度，并将RNA的浓度调整为1000ng/μl，用无RNA酶的双蒸水对待检测RNA进行10倍梯度稀释，得到所需要的不同浓度，即100、10、1、0.1、0.01ng/μl。按照1.6条件进行LAMP反应，检测出现阳性反应的最低模板浓度，稀释至1ng/μl仍为阳性。如图2所示，1-3号管浓度为100、10、1ng/μl，反应结束后变为绿色，为阳性。4、5号管浓度为0.1、0.01ng/μl，反应结束后仍为淡橙色，为阴性。表明本试剂盒最低可检测到1ng/μl的基因组RNA。

4.特异性检测

选择正常人血液5例、急性白血病患者血液5例，WT1表达阴性的白血病细胞株1例(U937细胞)，WT1表达阳性的白血病细胞株1例(NB4细胞)，根据上述方法抽提总RNA，按照1.6条件进行LAMP扩增。25分钟时，阳性结果6例，均为急性白血病患者的RNA及NB4细胞，时间延长至40分钟，其他RNA仍为阴性，正确率100％，表明本试剂盒具有很高的特异性。如图3所示，1-5号管为急性白血病患者血液，6号管为NB4细胞，反应结束后1-6号管均变为绿色，为阳性。7-11号管为正常人样本，不表达WT1，12为U937细胞，反应结束后仍为淡橙色，为阴性。

本实验针对WT1基因设计特异性引物，这5条引物针对靶序列上的7个不同区域从而保证了LAMP反应的特异性和敏感性。采用本试剂盒通过检测WT1基因诊断急性白血病微小残留病，结合RNA快速提取试剂盒，从取得样本到结果判定结束仅需1h，而且操作简单，结果准确直观，特异性与敏感性高，适合于各级医院快速诊断。

Claims (4)

1.一种白血病微小残留病WT1基因快速检测方法的引物，其特征在于，引物F3：其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；引物B3：其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；引物FIP：其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，引物BIP：其核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；引物LP：其核苷酸序列如SEQIDNO：5所示。

2.一种白血病微小残留病WT1基因快速检测方法的试剂盒，其特征在于，内含LAMP反应液、阳性对照、阴性对照，所述LAMP反应液的成分为：0.04μmol/μLpH为8.8的Tris-HCl，0.02μmol/μLKCl，0.016μmol/μLMgSO₄，0.02μmol/μL(NH₄)₂SO₄，0.002μl/μLTween 20，1.6μmol/μL甜菜碱，4种dNTPs各0.0028μmol/μL，10U/μL逆转录酶，8U/μLBstDNA聚合酶，0.00005μmol/μL钙黄绿素，0.2pmol/μL引物F3：其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，0.2pmol/μL引物B3：其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示，1.6pmol/μL引物FIP：其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，1.6pmol/μL引物BIP：其核苷酸序列如SEQIDNO：4所示，0.8pmol/μL引物LP：其核苷酸序列如SEQIDNO：5所示；阳性对照为：WT1RNA表达阳性的NB4细胞的基因组RNA；阴性对照为：超纯水。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，LAMP反应液为1ml、阳性对照50μL、阴性对照1ml。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，上述试剂盒还包括：反应管50个，10μL移液器头100个。