CN113186313A - 基于RPA-LbCas12a-TTECDS体系的沙门氏菌检测引物组、方法与试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了，基于RPA‑LbCas12a‑TTECDS体系的沙门氏菌检测引物组、方法与试剂盒，涉及沙门氏菌检测领域。基于重组酶聚合酶扩增技术与CRISPR基因检测技术相结合，通过优化改造的crRNA双靶点基因组合检测沙门氏菌，针对沙门氏菌的invA基因和fimY基因分别筛选和优化了crRNA，根据crRNA相匹配序列两端的核苷酸序列设计了RPA反应的上下游引物，得到引物组。根据该引物组、crRNA设计了RPA‑LbCas12a‑TTECDS体系，根据该体系建立了沙门氏菌的检测方法及试剂盒。本发明提供的检测方法和试剂盒用于实际样品的检测，具有特异性强、检测迅速、灵敏度高、精度高的优点。

Description

基于RPA-LbCas12a-TTECDS体系的沙门氏菌检测引物组、方法 与试剂盒

技术领域

本发明涉及沙门氏菌检测领域，具体涉基于RPA-LbCas12a-TTECDS体系的沙门氏菌检测引物组、方法与试剂盒。

背景技术

沙门氏菌(Salmonella)是食源性感染中最常见的病原体之一，对公众健康构成全球性挑战。轻症患者的主要临床表现是呕吐和腹泻，重症患者可能死于感染。准确、快速地检测沙门氏菌是预防大规模公共卫生事件的必要手段。常规培养方法需要对样本进行预增菌、选择性分离和生化鉴定。这种传统的检测方法既繁琐又耗时，需要2～3个工作日筛选疑似沙门氏菌菌落，然后进行1～2个工作日的生化检测。然而，它不能满足大量样本快速检测的要求，因此需要替代技术来快速、灵敏、准确地检测沙门氏菌。

目前已经报道了几种检测病原体核酸特征的方法，包括基于聚合酶链式反应(PCR) 的检测技术：定量实时PCR(qPCR)，基于等温扩增的检测方法：环介导等温扩增反应(LAMP)和重组酶聚合酶扩增(RPA)；基于下一代测序的病原体诊断：宏基因组测序 (mNGS)。然而，这些技术既耗时又耗资，或者灵敏度和特异性都较低。因此，这些方法不能完全满足环境和食品样本中的现场检测和微量病原体的快速检测。

CRISPR-Cas系统包括一个用于靶点目标识别的向导RNA(crRNA)和一个Cas核酸酶，这种酶存在于细菌和古菌中，通过剪切外来核酸来免受病毒的侵袭。Cas蛋白家族中Cas9、Cas12、Cas13和Cas14可以识别DNA或者RNA产生侧链切割活性。在目标识别时，Cas核酸酶被激活，然后不加区分的切割旁边的单链DNA(ssDNA)。通过引入标记有荧光团和猝灭剂或荧光团和生物素的ssDNA报告分子，可以用荧光检测器或侧向流试纸条检测切割，同时通过PCR或其他等温扩增方法对目标DNA进行特异性扩增，来增加检测灵敏度。

对于沙门氏菌的检测，invA基因是一种入侵蛋白基因，编码一种建立沙门氏菌对肠黏膜细胞入侵能力的蛋白，该基因也是致病性沙门氏菌存在的最直接指标。另一个检测沙门氏菌的替代基因是fimY基因，据报道，该基因是沙门氏菌属特有的，调节1型菌毛的表达。此外，invA和fimY的氨基酸序列与GenBank数据库中已知的其他原核蛋白几乎没有同源性。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的缺陷，从而提供一种针对沙门氏菌的invA基因和fimY基因的基于RPA-LbCas12a-TTECDS体系的沙门氏菌检测引物组、方法与试剂盒，以提高沙门氏菌检测的特异性、灵敏度，达到快速检测的效果。

本发明提供了基于RPA-LbCas12a-TTECDS体系的沙门氏菌检测引物组，包括crRNA和RPA引物对，所述RPA引物对包括：根据针对invA基因的crRNA3分子的核苷酸序列设计的RPA引物对，所述crRNA3分子的核苷酸序列如SEQNO.19所示；以及根据针对fimY基因的crRNA10分子的核苷酸序列设计的RPA引物对，所述crRNA10分子的核苷酸序列如SEQNO.26所示。

优选地，所述根据crRNA3分子的核苷酸序列设计的RPA上下游引物包括：上游引物的核苷酸序列如SEQNO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQNO.4所示。

优选地，所述根据crRNA10分子的核苷酸序列设计的RPA上下游引物包括：上游引物的核苷酸序列如SEQNO.6所示，下游引物的核苷酸序列如SEQNO.8所示。

优选地，所述crRAN包括：针对invA基因的crRNA3分子优化成crRNA3+3'DNA7 (即在crRNA的3'-末端延伸了7mer DNA，其中DNA的核苷酸序列为TATTATT)，其核苷酸序列如SEQNO.29所示，以及针对fimY基因的crRNA10分子优化成 crRNA10+3'DNA7(即在crRNA的3'-末端延伸了7mer DNA，其中DNA的核苷酸序列为 TATTATT)，其核苷酸序列如SEQ NO.30所示。

本发明还提供了基于RPA-LbCas12a-TTECDS体系的沙门氏菌检测方法，该方法用于非诊断或治疗目的，包括如下步骤：向含有沙门氏菌靶标核酸分子的体系中加入上述的引物组、RPA冻干粉、Rehydration Buffer(缓冲液)、醋酸镁、适量无菌水，反应37℃ 20分钟，得到RPA扩增反应产物；然后向含有上述产物的体系中加入上述的crRNA、 LbCas12a、ssDNA-FQ报告基因分子、10×NEBuffer 2.1(缓冲液)、适量无菌水进行反应，于37℃在30分钟对产物持续进行荧光检测。

优选地，所述方法具体包括如下步骤：

(1)以沙门氏菌的invA基因和fimY基因为靶标核酸分子，分别设计靶点特异性的crRNA核苷酸序列，再构建crRNA体外转录载体并进行体外转录和纯化，或者直接合成，得到crRNA分子，针对crRNA分子的核苷酸序列设计RPA引物对；

(2)将步骤(1)所得引物对、RPA冻干粉、醋酸镁、Rehydration Buffer加入到含有沙门氏菌靶标核酸分子的体系构成扩增系统进行RPA扩增反应；

(3)将7merDNA延伸至步骤(1)得到的crRNA分子的核苷酸序列的3’末端，得到最终的crRNA，将crRNA、步骤(2)获得的RPA反应产物、LbCas12a、10×NEBuffer 2.1(缓冲液)、ssDNA-FQ报告基因分子构成系统进行反应，产物通过荧光检测获得检测结果。

步骤(2)中所述扩增系统具体为50μL RPA扩增反应系统，包括：一管RPA冻干粉，29.5μL Rehydration Buffer(RPA缓冲液)，2.4μL的正向引物和反向引物，适量的基因组DNA,2.5μL的醋酸镁，以适量的无菌水至50μL。

步骤(3)中所述ssDNA-FQ报告基因分子具体为FAM-TTTTTT-BHQ1。

步骤(3)中所述系统具体为50μLRPA-LbCas12a-TTECDS检测系统，包括：150nMLbCas12a、100nM crRNA分子、400nM ssDNA-FQ报告基因分子、5μL 10×NEBuffer 2.1、 10μL RPA扩增反应产物，以适量的无菌水定容至50μL。

需要说明的是，本发明中以沙门氏菌的invA基因和fimY基因为靶标，通过双靶点的荧光检测结果综合判断结果，在最终的荧光检测结果中，检测到任一一种或者两种呈阳性，均判定样品含有沙门氏菌。

本发明还提供了一种基于RPA-LbCas12a-TTECDS体系的沙门氏菌检测试剂盒，包括：上述的引物组、RPA冻干粉、Rehydration Buffer、醋酸镁、crRNA、LbCas12a、ssDNA-FQ报告基因分子、10×NEBuffer2.1(缓冲液)。

本发明技术方案，具有如下优点：

本发明基于RPA-LbCas12a-TTECDS体系建立了沙门氏菌检测方法，通过在每个基因的位点的6个crRNA中筛选出活性最高的crRNA，同时在crRNA的3'-末端延伸了7mer DNA，改变了引物和靶向物之间的结合能来增加靶体特异性，使筛选出来的 crRNA+7DNA荧光强度增加了1-2倍，而效率低下的crRNA荧光强度显著增加了约8 倍，提高了检测的灵敏度。针对沙门氏菌两种靶标基因设计了RPA引物组，同时检测两种靶标基因，提高了检测的精度。

本发明提供的试剂盒对人工添加的实际样品进行检测，并与qPCR和荧光RPA进行比较。该试剂盒具有较高的特异性和极高的敏感性。检测下限为10⁰CFU/mL，优于常规qPCR(10²CFU/mL)和荧光RPA(10¹CFU/mL)。且检测时间在50min左右。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1.体系中Cas12a、crRNA和ssDNA-FQ浓度的优化

其中，(A-1)不同Cas12a浓度的30min终点荧光；(A-2)不同crRNA浓度的30min 终点荧光；(A-3)不同ssDNA-FQ浓度的30min终点荧光；NTC无靶标对照；误差线代表平均值±SD，n＝3。

图2.最佳crRNA的确定

其中，(A-1)沙门氏菌invA基因的示意图，以及每个crRNA间隔区的相应位置； (A-2)沙门氏菌fimY基因的示意图，以及每个crRNA间隔区的相应位置；(B-1)在总共50ml反应体积中针对100ng沙门氏菌invA基因dsDNA测试不同crRNA的30分钟终点荧光；(B-2)在总共50ml反应体积中针对100ng沙门氏菌测试不同crRNA的30 分钟终点荧光fimY基因；(C)针对fimY和invA靶向的crRAN3和crRNA10和3'-末端 DNA取代的嵌合DNA/RNA crRNA即crRNA3+3'DNA7和crRNA10+3'DNA7在1小时内荧光曲线图；NTC无靶标对照；误差线代表平均值±SD，n＝3。

图3.不同引物PRA产物凝胶图像的研究

其中，通道M，DNA分子量标记；通道1，使用引物P1/P3的沙门氏菌RPA产物；通道2，使用引物P1/P4的沙门氏菌RPA产物；通道3，使用引物P2/P3的沙门氏菌RPA 产物；通道4，使用引物P2/P4的沙门氏菌RPA产物；通道5，使用引物P5/P7的沙门氏菌RPA产物；通道6，使用P5/P8引物的沙门氏菌RPA产品；通道7，使用P6/P7引物的沙门氏菌RPA产物；通道8，使用P6/P8引物的沙门氏菌RPA产物。

图4.RPA-LbCas12a-TTECDS测定灵敏度和特异性分析

其中，(A-1)利用invA-crRNA(crRNA3+3'DNA7)检测不同gDNA浓度的沙门氏菌的30分钟终点荧光；(A-2)利用fimY-crRNA(crRNA10+3'DNA7)检测不同gDNA 浓度的沙门氏菌的30分钟终点荧光；(B-1)靶向6种不同细菌的沙门氏菌crRNA (crRNA3+3'DNA7)的30分钟终点荧光，包括鼠伤寒沙门氏菌(S.enterica)、大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、单核细胞增生性李斯特菌(L.monocytogenes)、福氏杆菌(S.flexneri)、副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus)；(B-2)靶向六种不同细菌的沙门氏菌crRNA(crRNA10+3'DNA7)的30分钟终点荧光，包括鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特菌、福氏杆菌、副溶血性弧菌。NTC 无靶标对照；误差棒表示平均值±SD，n＝3，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001和****表示P<0.0001；n.s.表示不显著。

图5.RPA-LbCas12a-TTECDs应用于真实食物样品的测试

其中，(A-1)用针对invA基因的crRNA对受污染黄瓜样品进行工具箱敏感性分析：提供富集6h前后食品基质中30分钟终点荧光；(A-2)用针对fimY基因的crRNA对受污染黄瓜样品进行工具箱敏感性分析；提供6h富集前后食物基质中的终点荧光；(B) 评估污染细菌的影响；分别对黄瓜样品接种鼠伤寒沙门氏菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌和这三种菌的混合物(鼠伤寒沙门氏菌:大肠杆菌:金黄色葡萄球菌＝1:1:1)，每种菌接种量为10⁶CFU/mL；NTC无靶标对照；误差线代表平均值±SD，n＝3，*表示P<0.05， **表示P<0.01，***表示P<0.001和****表示P<0.0001；n.s.表示不显著。

图6.qPCR和荧光RPA测定的灵敏度

其中，(A-1)针对invA靶标对10⁶-10⁰CFU/mL的10倍稀释浓度的沙门氏菌菌液，进行qPCR反应的Ct值；(A-2)针对fimY靶标对10⁶-10⁰CFU/mL的10倍稀释浓度的沙门氏菌菌液，进行qPCR反应的Ct值；(B-1)针对invA靶标对10⁶-10⁰CFU/mL的 10倍稀释浓度的沙门氏菌菌液，进行RPA反应的20分钟终点荧光；(B-2)针对fimY 靶标对10⁶-10⁰CFU/mL的10倍稀释浓度的沙门氏菌菌液，进行RPA反应的20分钟终点荧光；NTC无靶标对照；误差棒表示平均值±SD，n＝3，*表示P<0.05，**表示P<0.01， ***表示P<0.001和****表示P<0.0001；n.s.表示不显著。

图7.RPA-LbCas12a-TTECDS检测系统应用示意图。

具体实施方式

实施例1

1.材料与方法

1.1 菌株筛选及DNA提取

标准菌株鼠伤寒沙门氏菌ATCC700720、金黄色葡萄球菌ATCC25923、单核增生李斯特菌ATCC15313、福氏志贺氏菌ATCC12022、大肠杆菌ATCC25922购自于ATCC 菌种库。黄瓜是从当地超市买来的。通过病原菌识别网收集常州市沙门氏菌临床标本沙 50株。采用水煮法提取沙门氏菌基因组DNA。

1.2 引物设计与RPA反应

invA基因核苷酸序列全长：

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fimY基因核苷酸序列全长：

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invA基因和fimY基因的引物核苷酸序列根据TwistAmp^TM反应试剂盒手册设计，如表1所示，由GENEWIZ(苏州)合成。标准RPA反应按照TwistAmp Basic Kit(TwistDx) 的说明进行。每个反应包括一管RPA冻干粉，29.5μL Rehydration Buffer(RPA缓冲液)， 2.4μl的正向引物和反向引物，适量的基因组DNA,2.5μl的醋酸镁和适量的无菌水至 50μl。37℃孵育20min。扩增产物用苯酚/氯仿提取，在2％琼脂糖凝胶上电泳。

表1 沙门氏菌RPA、qPCR和荧光RPA的引物和探针核苷酸序列

1.3 Cas12a/crRNA核酸检测

Cas12a介导的检测体系包括150nM的LbCas12a、100nM的crRNA、400nm的 ssDNA-FQ报告基因和5μL的10×NEBuffer 2.1(缓冲液)，底物为2μL的dsDNA，反应体积为50μL。LbCas12a购自BIO-LIFESCI(广州)。所有crRNA均由GENEWIZ(苏州)合成，如表2所示，并合成ssDNA-FQ报告基因分子FAM-TTTTT-BHQ1。检测反应在ABI7500荧光仪上进行，于37℃条件下进行1小时，每1分钟进行一次荧光测量。

表2 crRNA核苷酸序列

1.4 沙门氏菌人工污染试验

黄瓜样品在无菌条件下制备(样品在污染试验前用传统培养方法确认为沙门氏菌阴性)，加入225mL缓冲蛋白胨水(BPW)25g，然后加入沙门氏菌，以10倍系列稀释达到 10⁶～10⁰cfu/mL的不同浓度，将食物基质置于37℃孵育0或6h。然后以各时间点提取的 DNA为模板进行检测。

1.5 qPCR和荧光RPA

按照2×T5Fast qPCR Mix(Probe)(Tsingke)的说明进行标准qPCR反应。反应时间为：95℃5min,95℃10s,60℃35s，共40个循环。根据目的基因核苷酸序列，使用 Primer3web(http://bioinfo.ut.ee/primer3/)设计引物和TaqMan探针，并由GENEWIZ(苏州) 合成。根据TwistAmp^TM exo kit(TwistDx)的说明进行标准荧光RPA反应。正向引物和反向引物各2.1μL，Exo探针(10μmol/L)0.6μL，补液缓冲液29.5μL，DNA模板1μL，无菌水12.2μL。在反应管中与冻干粉混合，吹打吸收直至完全溶解，然后加入2.5μL280 mmol/L MgAc。根据操作指南，使用ABI7500仪器对水或黄瓜样品中不同浓度的细菌进行qPCR和荧光RPA分析。

1.6 统计分析

每个实验重复三次。数据以均数±标准差(SD)表示。统计分析采用SPSS 19.0软件和 GraphPad Prism5。P<0.05为差异有统计学意义。

2.结果与讨论

2.1 最佳crRNA的筛选

首先确定了各组分的有效反应浓度。由图1可知，最终的50μL RPA-LbCas12a-TTECDS检测系统分别由150nM LbCas12a、100nM crRNA、400nM ssDNA-FQ报告基因组成。为了获得高质量的crRNA，提高检测效率，如图2(A-1、A-2) 所示，设计了invA和fimY基因不同位置的6个crRNA。根据如图2(B-1、B-2)的荧光报告，invA的crRNA3和fimY的crRNA10产生了最大的荧光值。随后，将7mer(碱基数单位)DNA延伸至crRNA的3'末端，用于增强Lbcas12a介导的核酸检测的灵敏度和特异性。如图2(C)所示，与原始crRNA相比，加了7mer DNA的crRNA反式切割活性提高了1.5倍。因此，选择crRNA3+3'DNA7和crRNA10+3'DNA7作为目标，以获得最高效的活性。

2.2 RPA-LbCas12a-TTECDS的检测限及特异性测定

为提高检测灵敏度，降低假阳性结果的可能性，将重组酶聚合酶扩增(RPA)的预扩增与Cas12a/crRNA剪切结合。根据crRNA3针对的invA基因上配对的靶点序列和 crRNA10针对的fimY基因的靶点序列两端的保守片段核苷酸序列，人工设计RPA引物。在crRNA的上下游分别设计两条引物，两两结合配对进行PRA反应，选择最合适的引物。如图3所示，RPA引物P1和P4(invA基因)；P6和P8(fimY基因)在琼脂糖凝胶中条带的亮度最高，其性能最佳。

然后考察RPA-LbCas12a-TTECDS的检测灵敏度。选择测试的gDNA浓度范围为10⁶～10⁰aM，由图4(A-1、A-2)可知，终点荧光结果显示，每个crRNA在1aM浓度的gDNA 条件下仍然可以产生显著的荧光值相对于阴性对照，表明RPA-LbCas12a-TTECDS对两个基因靶点的检测灵敏度都可以达到1aM。

CRISPR检测技术的一个主要优点是，与RPA相比，它们具有高度的特异性。对crRNAs与其他一组食源性病原体进行了测试，以确认它们的特异性。如图4(B-1、B-2) B所示，目标菌的荧光信号较强，而非目标菌的荧光信号值极低。这些信号与空白对照得到的信号相似。因此，RPA-LbCas12a-TTECDS对两个基因靶点的检测都具有较高的特异性。

2.3 应用于人工污染的样本

由于RPA-LbCas12a-TTECDS检测方法具有较高的特异性、敏感性和稳定性，进一步研究其在实际食品样品中的应用潜力。黄瓜样品是具有代表性的初级农产品。由于黄瓜可作为即食蔬菜直接食用，因此病原菌的快速检测具有重要意义。用浓度为10⁶～10⁰ CFU/mL的沙门氏菌污染黄瓜，然后将食物基质在37℃下孵育0h或6h。将上述污染样本利用RPA-LbCas12a-TTECDS进行检测。如图5(A-1、A-2)所示，表明 RPA-LbCas12a-TTECDS检测方法对两个基因靶点的LOD值(检测限)降低到10⁰ CFU/mL，同时也显示出6小时的培养为样品提供了一个显著的荧光提升。实际情况下，食品样品往往有多种细菌污染的风险。为研究不同crRNA对沙门氏菌与其他污染细菌的区分作用，我们还在黄瓜样品中接种了鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，每个10⁶CFU/mL进行检测。如图5B所示，荧光读数无统计学差异，表明每个crRNA 不受食品样本细菌污染的影响，具有高度特异性。

2.4 与qPCR和荧光RPA比较

将RPA-LbCas12a-TTECDS与最常用的金标准检测方法qPCR和最快捷的检测方法荧光RPA进行比较。制备10⁶～10⁰CFU/mL菌稀释液，测定qPCR和荧光RPA对invA 和fimY的分析灵敏度。采用沸水法提取细菌基因组，每次qPCR反应和荧光RPA中加入上清2uL，所有实验重复3次。沙门氏菌标准菌株两个靶标的Ct值如图6(A-1、A-2) 所示。沙门氏菌标准菌株两个靶标的荧光RPA分析荧光曲线如图6(B-1、B-2)所示。 qPCR和荧光RPA的检出限分别为10²CFU/mL和10¹CFU/mL。对人工污染样品的沙门氏菌qPCR的Ct值和荧光RPA的分析荧光值得到了类似的结果(数据未显示)。制备50 株细菌，与qPCR和荧光RPA比较，以确定检测的准确性。对invA和fimY基因，qPCR 准确率为100％。而对于荧光RPA，其准确度分别为66％和60％。而对于invA和fimY 基因，RPA-LbCas12a-TTECDS的准确率分别为96％和94％，但是两个基因组合判断就可以使准确率达到100％，可以与qPCR相媲美。为了更好的理解和参考，本申请对这些方法的灵敏度、时间、可改形性、温度、程序简单性、显示结果和准确性进行了比较，如表3所示。

表3.用于检测沙门氏菌的RPA-CRISPR-Cas12a和qPCR与荧光RPA的比较

实施例2

本申请还提供了一种快速，超灵敏，高精度的基于RPA-LbCas12a-TTECDS的沙门氏菌检测试剂盒，其工作原理如图7所示。为了提高检测灵敏度，选择6个不同位置的 crRNA作为最佳的crRNA荧光，crRNA在靶基因不同位置的效率不同。对于快速检测技术，尽快得到足够的荧光值对于检测至关重要。因此，特别需要筛选crRNA，同时选择了在crRNA3'-末端加入7个DNA碱基形成嵌合DNA-RNA。这样做有以下几个好处：首先，通过改变crRNA和靶标之间的结合能来提高靶标特异性。其次，嵌合DNA-RNA 形式更便于产品储存，最终在嵌合DNA-RNA形式可以改善高效crRNA切割活性，使荧光强度增加1-2倍，而使低效crRNA的荧光强度显著增加约8倍(数据未显示)。

RPA-LbCas12a-TTECDS体系已初步应用于人工添加实际样品的检测，并与qPCR 和荧光RPA检测进行了比较，获得的结果表明，该试剂盒可以在不同细菌的混合样本中检测出沙门氏菌，表明此方法具有高度特异性，同时检测限为10⁰CFU/mL，优于qPCR (10²CFU/mL)和荧光RPA(10¹CFU/mL)。

常见的RPA需要采用琼脂糖凝胶电泳进行分析，操作繁琐，而由于探针结构相对复杂，荧光RPA又很难建立系统，影响检测的准确性。与荧光RPA相比， RPA-LbCas12a-TTECDS检测方法的建立只需要一对普通的RPA扩增引物和一个靶特异性crRNA，不需要设计和合成相对复杂的RPA荧光探针，通过模板的RPA扩增后，crRNA 诱导的Cas蛋白产生侧链切割活性，切割旁边的ssDNA报告分子，表现为信号放大效应，因此RPA-Cas12a-TTECDS体系对沙门氏菌的检测具有很高的敏感性。其次，crRNA 诱导的Cas蛋白活化是一种核苷酸序列特异性识别，因此非特异性扩增产物不激活Cas 蛋白，这决定了RPA-CRISPR-Cas12a-TTECDS体系检测的特异性。

本发明选择了两个检测靶点，类似于SARS-CoV-2选择了双通道检测，双靶点检测可以提高检测精度，排除假阴性。单个靶点基因的检测准确度不能达到100％，但是两个靶点基因的组合检测提高了检测准确度，达到了qPCR标准，并且高于荧光RPA。

综上，本发明提供的检测方法和试剂盒操作简单，完成时间为50min，检测结果可以通过便携式荧光检测仪显示，可用于沙门氏菌的快速即时检验。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110> 常州市疾病预防控制中心

<120> 基于RPA-LbCas12a-TTECDS体系的沙门氏菌检测引物组、方法与试剂盒

<130> 2021.04.25

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Arttificial Sequence)

<400> 1

ctctacttaa cagtgctcgt ttacgacctg 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Arttificial Sequence)

<400> 2

ctatgttcgt cattccatta cctacctatc 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Arttificial Sequence)

<400> 3

ctgaggattc tgtcaatgta gaacgacccc 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Arttificial Sequence)

<400> 4

acgactggta ctgatcgata atgccagacg 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Arttificial Sequence)

<400> 5

tatcagataa aacctccgct ataacacagt 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Arttificial Sequence)

<400> 6

ctccgctata acacagttta tccgtatggc 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Arttificial Sequence)

<400> 7

ctttccgata agcgaggttt ggaggctgat 30

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Arttificial Sequence)

<400> 8

cgccttgcgc taaagtttca atcatcaacc 30

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Arttificial Sequence)

<400> 9

aaattatcgc cacgttcggg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Arttificial Sequence)

<400> 10

actcatctgt ttaccgggca 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Arttificial Sequence)

<400> 11

cggaagtcgc ggcccgattt 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Arttificial Sequence)

<400> 12

ccaacgccgc agatatttga 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Arttificial Sequence)

<400> 13

atacaggaga caggtagcgc 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Arttificial Sequence)

<400> 14

aattatgcct tgccggttgg 20

<210> 15

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Arttificial Sequence)

<400> 15

gtgctcgttt acgacctgaa ttactgattc ggactaatgg tgatg 45

<210> 16

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Arttificial Sequence)

<400> 16

acgcgaagcc ttgttatcag cctccaaacc cctatcggaa agctt 45

<210> 17

<211> 41

<212> RNA

<213> 人工序列(Arttificial Sequence)

<400> 17

uaauuucuac uaaguguaga uuauguucgu cauuccauua c 41

<210> 18

<211> 41

<212> RNA

<213> 人工序列(Arttificial Sequence)

<400> 18

uaauuucuac uaaguguaga uucguuauua ccaaagguuc a 41

<210> 19

<211> 41

<212> RNA

<213> 人工序列(Arttificial Sequence)

<400> 19

uaauuucuac uaaguguaga ucugaucgca cugaauaucg u 41

<210> 20

<211> 41

<212> RNA

<213> 人工序列(Arttificial Sequence)

<400> 20

uaauuucuac uaaguguaga uacggugcga ugaaguuuau c 41

<210> 21

<211> 41

<212> RNA

<213> 人工序列(Arttificial Sequence)

<400> 21

uaauuucuac uaaguguaga ucugauuuac uuaaagaagu g 41

<210> 22

<211> 41

<212> RNA

<213> 人工序列(Arttificial Sequence)

<400> 22

uaauuucuac uaaguguaga uucauaaauu cgccaauggc g 41

<210> 23

<211> 41

<212> RNA

<213> 人工序列(Arttificial Sequence)

<400> 23

uaauuucuac uaaguguaga uagaaaugcu aaagacugcg c 41

<210> 24

<211> 41

<212> RNA

<213> 人工序列(Arttificial Sequence)

<400> 24

uaauuucuac uaaguguaga uaucgccuug aguuacugaa c 41

<210> 25

<211> 41

<212> RNA

<213> 人工序列(Arttificial Sequence)

<400> 25

uaauuucuac uaaguguaga uuggauugaa aaggggucgc u 41

<210> 26

<211> 41

<212> RNA

<213> 人工序列(Arttificial Sequence)

<400> 26

uaauuucuac uaaguguaga uuccguaugg cugggcguuu u 41

<210> 27

<211> 41

<212> RNA

<213> 人工序列(Arttificial Sequence)

<400> 27

uaauuucuac uaaguguaga uuccugucgc gacgacaaaa u 41

<210> 28

<211> 41

<212> RNA

<213> 人工序列(Arttificial Sequence)

<400> 28

uaauuucuac uaaguguaga uccggcuuaa acaacuuauc a 41

<210> 29

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Arttificial Sequence)

<400> 29

uaauuucuac uaaguguaga ucugaucgca cugaauaucg utattatt 48

<210> 30

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Arttificial Sequence)

<400> 30

uaauuucuac uaaguguaga uuccguaugg cugggcguuu utattatt 48

<210> 31

<211> 2058

<212> DNA

<213> 人工序列(Arttificial Sequence)

<400> 31

gtgctgcttt ctctacttaa cagtgctcgt ttacgacctg aattactgat tctggtacta 60

atggtgatga tcatttctat gttcgtcatt ccattaccta cctatctggt tgatttcctg 120

atcgcactga atatcgtact ggcgatattg gtgtttatgg ggtcgttcta cattgacaga 180

atcctcagtt tttcaacgtt tcctgcggta ctgttaatta ccacgctctt tcgtctggca 240

ttatcgatca gtaccagtcg tcttatcttg attgaagccg atgccggtga aattatcgcc 300

acgttcgggc aattcgttat tggcgatagc ctggcggtgg gttttgttgt cttctctatt 360

gtcaccgtgg tccagtttat cgttattacc aaaggttcag aacgtgtcgc ggaagtcgcg 420

gcccgatttt ctctggatgg tatgcccggt aaacagatga gtattgatgc cgatttgaag 480

gccggtatta ttgatgcgga tgccgcgcgc gaacggcgaa gcgtactgga aagggaaagc 540

cagctttacg gttcctttga cggtgcgatg aagtttatca aaggtgacgc tattgccggc 600

atcattatta tctttgtgaa ctttattggc ggtatttcgg tggggatgac tcgccatggt 660

atggatttgt cctccgccct gtctacttat accatgctga ccattggtga tggtcttgtc 720

gcccagatcc ccgcattgtt gattgcgatt agtgccggtt ttatcgtgac ccgcgtaaat 780

ggcgatagcg ataatatggg gcggaatatc atgacgcagc tgttgaacaa cccatttgta 840

ttggttgtta cggctatttt gaccatttca atgggaactc tgccgggatt cccactgccg 900

gtttttgtta ttttatcggt ggttttaagc gtactcttct attttaaatt ccgtgaagca 960

aaacgtagcg ccgccaaacc taaaaccagc aaaggcgagc agccgctcag tattgaggaa 1020

aaagaagggt cgtcgttagg actgattggc gatctcgata aagtctctac agagaccgta 1080

ccgttgatat tacttgtgcc gaagagccgg cgtgaagatc tggaaaaagc tcaacttgcg 1140

gagcgtctac gtagtcagtt ctttattgat tatggcgtgc gcctgccgga agtattgtta 1200

cgcgatggcg agggcctgga cgataacagc atcgtattgt tgattaatga gatccgtgtt 1260

gaacaattta cggtctattt tgatttgatg cgagtggtaa attattccga tgaagtcgtg 1320

tcctttggta ttaatccaac aatccatcag caaggtagca gtcagtattt ctgggtaacg 1380

catgaagagg gggagaaact ccgggagctt ggctatgtgt tgcggaacgc gcttgatgag 1440

ctttaccact gtctggcggt gacgctggcg cgcaacgtca atgaatattt cggtattcag 1500

gaaacaaaac atatgctgga ccaactggaa gcgaaatttc ctgatttact taaagaagtg 1560

ctcagacatg ccacggtaca acgtatatct gaagttttgc agcgtttgtt aagcgaacgt 1620

gtttccgtgc gtaatatgaa gttaattatg gaagcgctcg cattgtgggc gccaagagaa 1680

aaagatgtca ttaaccttgt ggagcatatt cgtggagcaa tggcgcgtta tatttgtcat 1740

aaattcgcca atggcggcga attacgagca gtaatggtat ctgctgaagt tgaggatgtt 1800

attcgcaaag ggatccgtca gacctctggc agtaccttcc tcagccttga cccggaagcc 1860

tccgctaatt tgatggatct cattacactt aagttggatg atttattgat tgcacataaa 1920

gatcttgtcc tccttacgtc tgtcgatgtc cgtcgattta ttaagaaaat gattgaaggt 1980

cgttttccgg atctggaggt tttatctttc ggtgagatag cagatagcaa gtcagtgaat 2040

gttataaaaa caatataa 2058

<210> 32

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列(Arttificial Sequence)

<400> 32

atgcgcagcg taccacgcag ggaaagacac cgccgtttaa gaaatgctaa agactgcgcc 60

tgccgttatc actctccaac gccgcagata tttgatcgcc ttgagttact gaaccaacag 120

ctcaattatg ccttgccggt tggtatcatt tctcaggcaa taattacaac tgacaactac 180

ctcggctatt cattgagtca ctacttattt tccggaaaac gtaccgcagc attccgctca 240

ttagatgaca tttctttgtg gattgaaaag gggtcgctca gacaactgat tgtagatatg 300

gaggcgctac ctgtctcctg tattgaggcg cttaaccagc tacgcgcgct cagttggcaa 360

caaagcgata tccagattta cctgctggta tcagataaaa cctccgctat aacacagttt 420

atccgtatgg ctgggcgttt ttttgtcctg tcgcgacgac aaaatctggc ctcagtacgc 480

gaagccttgt tatcagcctc caaacctcgc ttatcggaaa gctttagccg tactgactgg 540

ttgatgattg aaactttagc gcaaggcgcc tctttaaaag aaatagcacg tcagcaaagc 600

gtaccttatc atcgtgtagt ttaccggctt aaacaactta tcaccctcct taaccttccc 660

cacaggcaaa gctttcttcg gctgatccag cagctaaacg ttactttcca cgacattttt 720

taa 723

Claims (10)

1.基于RPA-LbCas12a-TTECDS体系的沙门氏菌检测引物组，包括crRNA和RPA引物对，其特征在于，所述RPA引物对包括：根据针对invA基因的crRNA3分子的核苷酸序列设计的RPA引物对，所述crRNA3分子的核苷酸序列如SEQ NO.19所示；以及根据针对fimY基因的crRNA10分子的核苷酸序列设计的RPA引物对，所述crRNA10分子的核苷酸序列如SEQ NO.26所示。

2.根据权利要求1所述的基于RPA-LbCas12a-TTECDS体系的沙门氏菌检测引物组，其特征在于，所述根据crRNA3分子的核苷酸序列设计的RPA引物对包括：上游引物的核苷酸序列如SEQ NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ NO.4所示。

3.根据权利要求1所述的基于RPA-LbCas12a-TTECDS体系的沙门氏菌检测引物组，其特征在于，所述根据crRNA10分子的核苷酸序列设计的RPA引物对包括：上游引物的核苷酸序列如SEQ NO.6所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ NO.8所示。

4.根据权利要求1所述的基于RPA-LbCas12a-TTECDS体系的沙门氏菌检测引物组，其特征在于，所述crRNA包括：针对invA基因的crRNA3分子改进的crRNA3+3'DNA7，其核苷酸序列如SEQ NO.29所示；以及针对fimY基因的crRNA10分子改进的crRNA10+3'DNA7，其核苷酸序列如SEQ NO.30所示。

5.基于RPA-LbCas12a-TTECDS体系的沙门氏菌检测方法，其特征在于，该方法用于非诊断或治疗目的，包括如下步骤：向含有沙门氏菌靶标核酸分子的体系中加入权利要求1-4任意一项所述的引物组、RPA冻干粉、醋酸镁、Rehydration Buffer、无菌水进行RPA扩增反应，然后取RPA反应产物、加入权利要求4所述的crRNA、LbCas12a、ssDNA-FQ报告基因分子、10×NEBuffer 2.1、无菌水进行反应，再将反应产物进行荧光检测。

6.根据权利要求5所述的基于RPA-LbCas12a-TTECDS体系的沙门氏菌检测方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：

(1)以沙门氏菌的invA基因和fimY基因为靶标核酸分子，分别设计靶点特异性的crRNA核苷酸序列，再构建crRNA体外转录载体并进行体外转录和纯化，或者直接合成，得到crRNA分子，针对crRNA分子的核苷酸序列设计RPA引物对；

(2)将步骤(1)所得引物对、RPA冻干粉、醋酸镁、Rehydration Buffer加入到含有沙门氏菌靶标核酸分子的体系构成扩增系统进行RPA扩增反应，得到RPA扩增产物；

(3)将7mer DNA延伸至步骤(1)得到的crRNA分子的核苷酸序列的3’末端，得到最终的crRNA，将crRNA、RPA扩增产物、LbCas12a、10×NEBuffer 2.1(缓冲液)、ssDNA-FQ报告基因分子构成系统进行反应，产物通过荧光检测获得检测结果。

7.根据权利要求6所述的基于RPA-LbCas12a-TTECDS体系的沙门氏菌检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述扩增系统具体为50μL RPA扩增反应系统，包括：一管RPA冻干粉，29.5μL Rehydration Buffer(RPA缓冲液)，2.4μL的正向引物和反向引物，适量的基因组DNA,2.5μL的醋酸镁，以适量的无菌水至50μL。

8.根据权利要求6所述的基于RPA-LbCas12a-TTECDS体系的沙门氏菌检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述ssDNA-FQ报告基因分子具体为FAM-TTTTTT-BHQ1。

9.根据权利要求6所述的基于RPA-LbCas12a-TTECDS体系的沙门氏菌检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述系统具体为50μLRPA-LbCas12a-TTECDS检测系统，包括：150nMLbCas12a、100nM权利要求4所述的crRNA分子、400nM ssDNA-FQ报告基因分子、5μL 10×NEBuffer 2.1、10μL RPA扩增反应产物，以适量的无菌水定容至50μL。

10.基于RPA-LbCas12a-TTECDS体系的沙门氏菌检测试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1-3任意一项所述的引物组、醋酸镁、Rehydration Buffer、RPA冻干粉以及权利要求4所述的crRNA、LbCas12a、ssDNA-FQ报告基因分子、10×NEBuffer 2.1。

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