CN110241259A - 一种快速区分鹅1型星状病毒与鹅2型星状病毒的hrm检测方法及其引物 - Google Patents

一种快速区分鹅1型星状病毒与鹅2型星状病毒的hrm检测方法及其引物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速区分鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒的HRM检测方法及其引物，本发明操作简单，只需要一对通用引物，在PCR反应之前加荧光饱和染料即可；检测速度快且高通量，缩短了分型所需时间；不需要特异性荧光标记探针；特异性强、准确性高，可以快速、准确、高通量地对样品进行分析，有利于在临床实践中推广应用，具有较高的应用价值。

Description

一种快速区分鹅1型星状病毒与鹅2型星状病毒的HRM检测方 法及其引物
技术领域
本发明涉及病毒不同基因型的鉴别方法，具体涉及一种快速区分鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒的HRM检测方法及其引物。
背景技术
鹅星状病毒是一种新发的禽传染病，以痛风为主要特征的雏鹅高致病性传染性疾病，该病以内脏、关节等发生严重的尿酸盐沉积，鹅群发病率在80～90％之间，死亡率在20～70％之间，给养鹅业造成了巨大的经济损失。
目前，对动物传染性病原体进行分子诊断的方法包括单链构象多态性分析(SSCP)法、变性梯度凝胶电泳(DGGE)法、温度梯度毛细管电泳(TGCE)法、变性高效液相色谱(DHPLC)和质谱(MS)法、基于PCR技术的Taqman水解探针法和测序等等。但上述方法分析时间用时长，所用仪器设备昂贵等缺点限制了其在临床检测中的应用。尤其在病毒检测与分型中，由于病毒变异率高，传统的分型方法如Taqman探针或MGB探针法虽然能够检测不同基因型，但合成探针价格昂贵，针对每一个基因型均要合成不同的探针。此外，当病毒突变发生在探针区域时探针与模板结合能力下降，易造成假阴性结果影响其准确性。PCR-HRM分析方法与其它方法相比，操作简单，只需在PCR反应体系中加入一定体积的荧光饱和染料既能进行突变扫描和基因分型，样品无需通过凝胶或者其他基质分离，极大地缩短了检测分型所需时间，而且检测成本低廉，因此该方法适合用于传染病病原体快速鉴别与诊断。
由于鹅星状病毒是一种新发的禽传染病，目前主要研究内容包括基因组测序分析、病毒分离和致病性研究以及检测方法等。本研究采用RT-PCR方法在鹅星状病毒感染的临床样本中检测到2种星状病毒基因片段，随后对两个样品(SS和QY)进行了全基因测序，其中SS株基因序列与NCBI上报道的鹅星状病毒1型AHDY(MH410610.1)核苷酸相似性为98.8％，QY株基因序列与鹅星状病毒2型GD株(MG93457.1)相似性为99.3％。根据文献报道，鹅群里至少存在2种鹅星状病毒混合感染，这与临床检测结果相符合。目前针对鹅星状病毒检测方法分别有普通RT-PCR方法、荧光定量PCR方法(染料法和探针法)和环介导等温扩增方法，而且检测两种病毒需要设计两对特异性的引物。鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒存在差异，但是国内外还未有针对两种鹅星状病毒基因型的鉴别诊断方法的报道，因此建立一种快速有效的鉴别鹅1型星状病毒(GAstV-1)和鹅2型星状病毒(GAstV-2)的检测方法具有十分重要的意义。
发明内容
为了解决上述存在的问题，本发明建立了一种快速区分鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒的PCR-HRM引物和方法，该方法操作简易、快速、检测结果可靠且高通量。
本发明的目的之一在于提供一种快速区分鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒的HRM检测引物。
本发明的目的之二在于提供一种快速区分鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒的HRM检测方法。
本发明的目的之三在于提供一种快速区分鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒的HRM检测试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
一种快速区分鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒的HRM检测方法的引物，其核苷酸序列如下所示：
引物P1：TATGATGAKTWCTGGCTKRTKCAA(SEQ ID NO：1)，
引物P2：TCATCTKCAATCATMTCWTCATACC(SEQ ID NO：2)。
一种快速区分鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒的HRM试剂盒，该试剂盒含有上述所述的引物。
一种快速区分鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒的HRM检测方法，包括以下步骤：
1)从样品中提取病毒核酸；
2)以核酸为模板，用上述所述的引物对P1、P2及荧光饱和染料进行PCR-HRM扩增反应获得扩增产物；
3)对扩增产物进行HRM分析，确定病毒基因型。
进一步的，步骤2)中PCR扩增反应体系为：
所述Syto9为荧光饱和染料。
进一步的，步骤2)中的扩增反应程序为：50℃反转录30min；94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s；循环35次，72℃终延伸8min；65℃到95℃以0.3℃/s的熔解速率进行熔解曲线分析。
进一步的，步骤3)中所述HRM分析的具体分析过程为：分别以鹅1型星状病毒(SS株)和鹅2型星状病毒(QY株)为阳性对照对临床样品进行基因分型；与鹅1型星状病毒阳性对照进行比较时，若其Tm值为79.70±0.08℃则判定为鹅1型星状病毒；与鹅2型星状病毒阳性对照进行比较时，若其Tm值为80.84±0.08℃则判定为鹅2型星状病毒。
本发明的有益效果是：
1)本发明首次建立了一种快速区分鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒的HRM检测方法及其引物，操作简单：只需在PCR反应之前加荧光饱和染料即可；检测速度快且高通量，缩短了分型所需时间；不需要特异性荧光标记探针；特异性强、准确性高，可以快速、准确、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用，为防控鹅星状病毒提供技术支持。
2)本发明的PCR-HRM引物，同一反应中只需要设计一对引物区分鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒，均有很好的扩增性，有助于提高PCR的效率，缩短病毒鉴别分型的时间和成本。
3)本发明的PCR-HRM引物特异性好，除可以与鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒结合外，不与其他常见鹅源病毒，如新城疫病毒(NDV)、鹅细小病毒(GPV)、番鸭细小病毒(MDPV)、鹅圆环病毒(DuCV)、鸭疫里默氏杆菌(RA)、巴氏杆菌(PM)、大肠杆菌(EC)等核酸结合，特异性扩增鹅星状病毒核酸，有利于提高本发明对基因型分析的准确性。
4)本发明灵敏度高，最低检测限达到每个反应43.2copies和25.3copies。
附图说明
图1为鹅1型星状病毒(GAstV-1)和鹅2型星状病毒(GAstV-2)HRM分析方法峰型化熔解曲线图；
图2为鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒分析方法临床样品峰型化熔解曲线图；其中样品鹅1型星状病毒(GAstV-1，SS株)和鹅2型星状病毒(GAstV-2，QY)分别作为阳性对照；
图3为本发明方法检测并区分鹅1型星状病毒(GAstV-1)和鹅2型星状病毒(GAstV-2)的特异性试验结果；
图4为本发明方法检测鹅1型星状病毒(PMD-GAstV-1)和鹅2型星状病毒(PMD-GAstV-2)的灵敏度试验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1一种快速区分鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒的HRM检测方法
引物
根据鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒的核酸序列，设计大量引物并进行筛选后，发现本申请引物碱基序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2对PCR-HRM方法区分鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒的效果最好，这组引物灵敏度高且特异性强，其碱基序列如下所示。
引物P1：TATGATGAKTWCTGGCTKRTKCAA(SEQ ID NO：1)，
引物P2：TCATCTKCAATCATMTCWTCATACC(SEQ ID NO：2)。
实施例2一种快速区分鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒的HRM检测方法
标准样品的PCR-HRM分析
1)鹅星状病毒标准品核酸的提取：
将鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒感染的病鹅组织样品(肝脏、脾脏)，加入3mLPBS盐酸缓冲溶液进行研磨，将研磨好的匀浆液4000×g离心8min，并吸取离心上清液至-20℃保存备用。分别取该两种研磨液上清各200μL，并按TAKARA的MiniBEST Viral RNA/DNAExtraction Kit Ver.4.0的说明书进行样品中核酸的提取。
2)阳性标准样品的PCR-HRM操作步骤
为了验证所设计的引物对临床样品的鉴别能力，本研究利用鹅1型星状病毒(SS株)和鹅2型星状病毒(QY株)作为标准样品进行PCR-HRM分析。分别以上述标准样品提取核酸作为核酸模板，分别进行PCR-HRM扩增反应和分析。
PCR-HRM扩增反应体系如下：
所述Syto9为荧光饱和染料
扩增反应程序为：50℃反转录30min；94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s；循环35次，72℃终延伸8min；65℃到95℃以0.3℃/s的熔解速率进行熔解曲线分析。HRM试验结果用Rotor-GeneTMQ 2.0.2.软件进行分析。
3)阳性标准样品PCR-HRM结果分析
PCR扩增产物用Rotor-Gene Q分析仪进行分析。鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒HRM分析结果如图1所示。
图1为鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒HRM分析方法峰型化熔解曲线图。分析结果显示，本发明HRM分析方法能够区分鹅1型星状病毒(SS株)和鹅2型星状病毒(QY株)。其中鹅1型星状病毒(SS株)Tm值为79.70℃，鹅2型星状病毒(QY株)Tm值为80.84℃。
实施例3临床样品PCR-HRM分析
1)从样本中提取病毒核酸：分别取疑似感染有鹅1型星状病毒的组织样品(肝脏、脾脏)2g，以及疑似感染有鹅2型星状病毒的组织样品(肝脏、脾脏)2g。分别加入3mL PBS盐酸缓冲溶液进行研磨，将研磨好的匀浆液4000×g离心8min，并吸取离心上清液至-20℃保存备用。取组织样品匀浆液200μL按TAKARA的MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction KitVer.4.0的说明书进行核酸提取。
2)以提取的病毒核酸为模板，进行RT-PCR扩增(参照One Step RT-PCR Kit试剂盒说明书)，扩增反应体系为：
所述Syto9为荧光饱和染料
扩增反应程序为：50℃反转录30min；94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s；循环35次，72℃终延伸8min；65℃到95℃以0.3℃/s的熔解速率进行熔解曲线分析。HRM试验结果用Rotor-GeneTMQ 2.0.2.软件进行分析。
4)对扩增产物进行HRM分析(用Rotor-GeneTM Q 2.0.2.软件进行分析)，确定病毒为鹅1型星状病毒或鹅2型星状病毒，具体分析过程为：
以鹅1型星状病毒的标准样品(SS株)和鹅2型星状病毒(QY株)的标准样品为阳性对照，采用Tm值作为分型标准，若其Tm值为79.70±0.08℃则判定为鹅1型星状病毒；与鹅2型星状病毒阳性对照进行比较时，若其Tm值为80.84±0.08℃则判定为鹅2型星状病毒。
为了验证实施例3所建立的方法对实际临床样品的鉴别能力。本发明对广东省收集到的9份疑似鹅星状病毒临床样品进行PCR-HRM分析，分析结果如图2。
从图2中可以看出，1份样品Tm值为79.64℃，另8份样品Tm值在80.81℃～80.90℃之间，由此确定其中1份样品为鹅1型星状病毒，其他8份样品为鹅2型星状病毒，说明本发明方法的准确性高，达到100％。
另外，对上所述9份样品使用针对鹅星状病毒的ORF1a基因的引物进行扩增并测序，做进化分析分析结果与本发明方法检测的结果完全一致，说明本发明方法的准确性高，可达100％。
实施例4特异性实验
下面对本发明的区分鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒HRM检测方法进行特异性检测。
分别提取一些常见鹅病毒核酸，如新城疫病毒(NDV)、鹅细小病毒(GPV)、番鸭细小病毒(MDPV)、鹅圆环病毒(DuCV)、鸭疫里默氏杆菌(RA)、巴氏杆菌(PM)、大肠杆菌(EC)的核酸为模板，以上述实施例3中所述的方法进行HRM分析，验证引物P1/P2的特异性，同时以鹅1型星状病毒(SS株)和鹅2型星状病毒(QY)为阳性对照，水作为阴性对照进行PCR-HRM分析。
分析结果如图3所示，本发明HRM检测方法能特异性扩增出鹅1型星状病毒(SS株)和鹅2型星状病毒(QY)熔解峰，而其它常见鹅类病毒如新城疫病毒(NDV)、鹅细小病毒(GPV)、番鸭细小病毒(MDPV)、鹅圆环病毒(DuCV)、鸭疫里默氏杆菌(RA)、巴氏杆菌(PM)、大肠杆菌(EC)样品均未扩增出熔解峰，表明本发明使用的引物P1/P2特异性高，适合作为HRM引物。
实施例5灵敏度试验
下面对本发明建立的区分鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒的HRM检测方法进行灵敏度检测。
1)阳性质粒样品的制备
把GAstV-1和GAstV-2的PCR产物切胶纯化，分别连接至pMD-18T载体中，通过氨苄抗性筛选、菌落PCR及测序，筛选得到阳性克隆子即为阳性质粒样品。
2)用构建好的PMD-GAstV-1和PMD-GAstV-2阳性质粒样品进行灵敏度试验，阳性质粒用灭菌双蒸水作10倍倍比稀释至10-10，共10个稀释度，并用灭菌双蒸水作阴性对照。PCR-HRM的扩增反应：方法同实施例2步骤2)的反应体系和反应程序。
3)灵敏度试验PCR-HRM结果分析
PCR扩增产物用Rotor-Gene Q分析仪进行分析。结果如图4。
图4为PMD-GAstV-1和PMD-GAstV-2的峰型化熔解曲线图，从图中可以看出，PMD-GAstV-1和PMD-GAstV-2阳性质粒在10-1～10-8共8个稀释度均出现了特异性的熔解峰。结果表明该方法的灵敏度高，对PMD-GAstV-1和PMD-GAstV-2阳性质粒的最低检测限分别为43.2copies和25.3copies。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所
<120> 一种快速区分鹅1型星状病毒与鹅2型星状病毒的HRM检测方法及其引物
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 1
tatgatgakt wctggctkrt kcaa 24
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 2
tcatctkcaa tcatmtcwtc atacc 25

Claims (6)

1.一种快速区分鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒的HRM检测方法的引物，其核苷酸序列如下所示：
引物P1：TATGATGAKTWCTGGCTKRTKCAA(SEQ ID NO：1)，
引物P2：TCATCTKCAATCATMTCWTCATACC(SEQ ID NO：2)。
2.一种快速区分鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒的HRM试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有权利要求1所述的引物。
3.一种快速区分鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒的HRM检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)从样品中提取病毒核酸；
2)以核酸为模板，用权利要求1所述的引物对P1、P2及荧光饱和染料进行PCR-HRM扩增反应获得扩增产物；
3)对扩增产物进行HRM分析，确定病毒基因型。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤2)中PCR扩增反应体系为：
所述Syto9为荧光饱和染料。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤2)中的扩增反应程序为：50℃反转录30min；94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s；循环35次，72℃终延伸8min；65℃到95℃以0.3℃/s的熔解速率进行熔解曲线分析。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤3)中所述HRM分析的具体分析过程为：分别以鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒为阳性对照对临床样品进行分型；与鹅1型星状病毒阳性对照进行比较时，若其Tm值为79.70±0.08℃则判定为鹅1型星状病毒；与鹅2型星状病毒阳性对照进行比较时，若其Tm值为80.84±0.08℃则判定为鹅2型星状病毒。
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