CN116970574B - 一种鹅源波形蛋白的用途、促进增殖鹅星状病毒的方法及用途、疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及疫苗生产技术领域，公开了一种波形蛋白的用途，通过实验验证，使用波形蛋白能够促进鹅星状病毒的增殖，这大大提高了鹅星状病毒疫苗制备时的便利性，同时，本申请还公开了一种促进增殖鹅星状病毒的方法，包括将鹅星状病毒感染能够表达鹅源波形蛋白的细胞系，此外，本申请还公开了使用上述的增殖鹅星状病毒的方法制得的疫苗及使用上述的增殖鹅星状病毒的方法培养得到的病毒用于制备疫苗的用途。

Description

一种鹅源波形蛋白的用途、促进增殖鹅星状病毒的方法及用 途、疫苗

技术领域

本发明涉及疫苗生产技术领域，尤其涉及一种鹅源波形蛋白的用途、促进增殖鹅星状病毒的方法及用途、疫苗。

背景技术

自2017年以来，我国江苏、安徽、山东及广东等地陆续报道了一种因感染新型鹅星状病毒(Goose astrovirus，GAstV)而引起的高度致死性雏鹅痛风疾病，其感染率和死亡率分别可高达80％和50％左右；GAstV属于星状病毒科，禽星状病毒属，3型禽星状病毒成员；GAstV为单股正链、无囊膜的RNA病毒。截至目前，由GAstV造成的致死性雏鹅痛风疾病仍在我国广泛流行，给养鹅业造成了严重的经济损失；且该疾病疫苗研发的进展尤其缓慢，尚无疫苗可用，其防控形势十分严峻。当下可用于GAstV增殖的可传代细胞系仅有LMH细胞，但其培养的病毒滴度较低，一定程度上限制了该病毒致病机制的高效深入研究，同时也限制了该疾病疫苗研发的高效性和便利性。因此，提高GAstV在LMH细胞中的增殖滴度对疫苗研发、生产和该疾病致病机制的研究具有重要意义。

波形蛋白(Vimentin，VIM)作为一种高度保守的中间纤维蛋白，最初发现于间叶细胞内，是细胞骨架的重要组成成分之一。波形蛋白可影响细胞黏附与迁移、参与细胞的信号传导、调节细胞凋亡和增殖、趋化运动，并具有警报素功能。或许是因为波形蛋白在细胞内的高丰度，其在细胞表面及胞外的存在直到近些年才被发现，这便使得波形蛋白在多种病毒的侵入和感染过程中发挥着重要作用。

四川大学徐大为在其论文《表达鹅星状病毒Cap基因的重组鹅副粘病毒载体疫苗的初步研制》中通过对鹅星状病毒的Cap蛋白基因在骨架载体pFL-SH的不同位点之间的变换，寻找到了使Cap蛋白在P/M之间的表达量最高的这一位点，以此实现鹅星状病毒的增殖，并将在此位点插入Cap蛋白基因而制作出的拯救病毒作为候选疫苗株；

扬州大学陆小龙在其论文《Vimentin蛋白调控不同毒力基因Ⅲ型新城疫病毒感染的机制研究》中进行了病毒感染CEF细胞后Vimentin的表达水平分析，并在分析中发现在敲低Vimentin的CEF细胞进行NDV感染后，细胞上清中的病毒滴度以及细胞中的病毒NP蛋白水平明显下降；而在过表达大的Vimentin的CEF细胞进行NDV感染后，细胞上清中的病毒滴度以及细胞中的病毒NP蛋白水平有一定程度的上升，该作者推测，HN与Vimentin互作缺失促进了Vimentin对病毒复制的影响，不过需要注意的时，新城疫病毒的形状多为圆形、椭圆形或长杆状，与星状病毒的微观形貌存在差异。

同时中国专利申请CN201310491696.8公开了一种提高猪蓝耳病病毒靶细胞感染滴度的方法及其应用，该方案通过构建能够表达猪蓝耳病病毒受体硫酸乙酰肝素、唾液酸粘附素、波形蛋白、CD163、CD151和非肌肉肌球蛋白重链ⅡA受体中的单个或多个的Marc145细胞或MA-104细胞，再利用该细胞接种猪蓝耳病病毒，收集病毒液，猪蓝耳病毒感染滴度得到大幅提高，但需要注意的是，本方案中，表达猪蓝耳病病毒受体的细胞为Marc145细胞或MA-104细胞，且蓝耳病毒为卵圆形病毒，其微观形貌与鹅星状病毒存在一定的差距，并且，该方案在实施例中仅对能够对CD163、CD151过表达的细胞对猪蓝耳病毒的增殖效果进行了展示，并未展示波形蛋白过表达的细胞对猪蓝耳病毒的增殖效果。

中国专利201910150093.9公开了一种鸭星状病毒疫苗及其制备方法，该方案在传代细胞系BHK-21细胞上接种鸭星状病毒Ⅰ型和Ⅲ型毒种得到的灭活疫苗。用BHK-21传代细胞进行鸭星状病毒Ⅰ型和Ⅲ型增殖，利用ReedMuench方法测定其病毒滴度可以稳定达到10^6.5-10^7.0TCID50/0.1mL；尽管该方案制备的疫苗中病毒滴度较高，但该方案主要通过BHK-21传代细胞系的培养对鸭星状病毒进行增殖，并未使用其他的增殖方式。

中国专利申请202110014104.8公开了一种防控鹅星状病毒复合佐剂灭活疫苗的制备方法，该方法包括病毒增殖与病毒液灭活、制备灭活疫苗，该方法在说明书第19段提到病毒的增殖方法为：将分离鉴定后的鹅星状病毒按1％比例接种到鹅胚肝细胞中，增殖培养48-72h，待细胞病变超过80％，将细胞反复冻融(冻融的次数为2次，冷冻温度为20度以下)，收取细胞液，离心除去细胞碎片，得到上清液；

中国专利申请201810494586.X公开了一种防治新型鹅星状病毒的灭活疫苗及其制备方法，该方法中的病毒增殖的方式为：将保藏编号为CCTCC NO：

V201808的鹅星状病毒株接种到鹅胚肾细胞(GKC)中，对鹅星状病毒进行增殖培养后，通过冻融破碎细胞，收取上清液，并进行纯化，即得鹅星状病毒株病毒液。

综上来看，在现有技术中，并未有利用波形蛋白促进鹅星状病毒增殖的先例。

一般来说，本领域中，可促进病毒增殖的蛋白和靶点有很多种，比如ACE2蛋白、TERT蛋白、FN蛋白、beta-catenin蛋白、VP90蛋白、Viper蛋白等；但是每种病毒基于其敏感靶点的不同，同一蛋白会对不同的病毒表现为促进或不促进增殖的效果，不同蛋白会对同一病毒表现为促进或不促进增殖的效果。

本方案需要解决的问题：如何使用一种新的方法实现对鹅星状病毒的增殖。

发明内容

本申请的目的是以一种新的方法实现促进对鹅星状病毒的增殖，以便于通过体外细胞培养较高滴度的病毒用于灭活疫苗的研制。

本申请不作特殊说明的情况下：nM代表纳摩尔/升，μM代表微摩尔/升，mM代表毫摩尔/升，M代表摩尔/升；

为实现上述目的，本申请公开了鹅源波形蛋白作为促进鹅星状病毒增殖的活性成分的用途。

此外，本申请还公开了一种促进增殖鹅星状病毒的方法，将鹅星状病毒感染能够表达鹅源波形蛋白的细胞系。

优选地，所述细胞系为过表达鹅源波形蛋白的细胞系。

优选地，所述细胞系为慢病毒介导的LMH细胞系；

所述慢病毒为可表达波形蛋白的慢病毒。

优选地，所述慢病毒的制备方法为：

步骤1：获取VIM基因；所述VIM基因如SEQ NO.1所示；

步骤2：将VIM基因和慢病毒载体进行同源重组，得到质粒；

步骤3：将质粒转染293T细胞，得到慢病毒。

优选地，所述慢病毒载体为pLV-sfGFP(2A)Puro载体。

优选地，所述病毒的制备方法具体包括如下步骤：

步骤11：从鹅组织细胞中提取总RNA并反转成cDNA；

步骤12：以cDNA为模板采用引物VIM-F和引物VIM-R通过PCR扩增VIM基因；引物VIM-F和引物VIM-R的核苷酸序列如SEQ NO.2、SEQ NO.3所示；

步骤13：以VIM基因为模板，利用引物VIM-F2、引物VIM-R-Flag进一步通过PCR在VIM基因末端添加上Flag标记与目标基因融合表达得到目的基因VIM-Flag；引物VIM-F2、引物VIM-R-Flag的核苷酸序列如SEQ NO.4、SEQ NO.5所示；

步骤14：以目的基因VIM-Flag作为模板，利用同源臂引物VIM-pLV-F、同源臂引物VIM-pLV-R进行PCR扩增，使得VIM-Flag基因两端分别添加上位于慢病毒载体的Xba I和XhoI酶切位点两侧至少长为20bp左右的序列，然后与酶切后的慢病毒载体进行同源重组，构成质粒pLV-VIM；同源臂引物VIM-pLV-F、同源臂引物VIM-pLV-R的核苷酸序列如SEQ NO.6、SEQNO.7所示；

步骤15：在直径为10cm的细胞培养皿中，待293T细胞单层融合至90％时采用质粒pLV-VIM进行转染得到慢病毒。

优选地，所述鹅星状病毒的感染复数为1。

此外，本申请还公开了一种疫苗，采用上述的方法培养得到鹅星状病毒。

此外，本申请还公开了如上述的方法培养得到鹅星状病毒作为制造疫苗的用途。

本申请的有益效果是：

本申请中的鹅源波形蛋白能够在鹅星状病毒感染时进行重排，从而加强与病毒蛋白的相互作用并促进病毒的复制，并且，我们发现鹅源波形蛋白具有一定的使鹅星状病毒增殖的能力，我们推测其原因是波形蛋白与病毒衣壳蛋白之间具有直接相互作用，其能够促进鹅星状病毒的病毒衣壳蛋白的表达，进而促进鹅星状病毒的复制，进而使得将其应用在疫苗研发上时，能够获得较高滴度的鹅星状病毒，有助于降低疫苗研发的成本并提高疫苗的效果。

附图说明：

图1为pLV-VIM质粒双酶切后的琼脂糖凝胶电泳图，图1中1处为未酶切的pLV-VIM质粒、图1中2处为pLV-VIM质粒经Xba I和Xho I双酶切后产生的片段、图1中3处为DNAmarker；

图2为利用Flag抗体进行Western Blot检测分析LMH细胞中VIM-Flag融合蛋白的表达量的示意图；

图3为利用VIM抗体进行Western Blot检测分析LMH细胞中VIM蛋白的表达量的示意图；

图4为RT-qPCR分析VIM过表达对GAstV在细胞中的mRNA表达水平的影响的示意图；

图5为RT-qPCR分析VIM过表达对GAstV在细胞中的蛋白表达水平的影响的示意图；

图6为TCID₅₀分析VIM过表达对病毒增殖的影响的示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例，对本发明进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实验材料

在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实验的材料及信息如表1所示：

表1实验材料来源信息表

实施例1

(1)过表达波形蛋白的LMH细胞系的构建

1.基因扩张和质粒构建：

按相关试剂盒说明书，从鹅组织细胞中提取总RNA并反转成cDNA。参考NCBI中鹅源VIM的基因序列(Genebank：XM_048061750.1)，按照表2中自行设计的引物(VIM-F、VIM-R)，以cDNA为模板通过PCR扩增VIM基因(反应体系和程序见下表2)，其PCR产物大小为1383bp(SEQ NO.1)；

PCR反应体系见表2：

表2反应体系配方表

组分	用量
		2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)	25μL
VIM-F(10μM)	2μL
		VIM-R(10μM)	2μL
cDNA	2μL
		ddH2O	补足至50μL

PCR反应程序见表3：

表3 PCR反应程序表

以扩增后的VIM基因为模板，利用引物(VIM-F2、VIM-R-Flag)进一步通过PCR在VIM基因末端添加上Flag标记与VIM基因融合表达(VIM-Flag)以便于其检测；

PCR反应体系见表4：

表4反应体系配方表

组分	用量
		2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)	25μL
VIM-F2(10μM)	2μL
		VIM-R-Flag(10μM)	2μL
DNA(VIM)	50ng
		ddH2O	补足至50μL

PCR反应程序见表5：

表5 PCR反应程序表

回收目的基因VIM-Flag，以其作为模板，利用同源臂引物(VIM-pLV-F、VIM-pLV-R)进行PCR扩增，使得VIM-Flag基因两端分别添加上位于pLV-sfGFP(2A)Puro载体Xba I和XhoI酶切位点两侧至少长为20bp左右的序列，即同源臂；

PCR反应体系见表6：

表6反应体系配方表

组分	用量
		2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)	25μL
VIM-pLV-F(10μM)	2μL
		VIM-pLV-R(10μM)	2μL
DNA(VIM-Flag)	50ng
		ddH2O	补足至50μL

PCR反应程序见表7：

表7 PCR反应程序表

将添加同源臂后的VIM-Flag基因与酶切后(Xba I和Xho I双酶切)的线性化慢病毒载体pLV-sfGFP(2A)Puro进行同源重组，构成质粒pLV-sfGFP(2A)Puro-VIM-Flag，下文简称pLV-VIM；

同源重组反应体系及条件见表8：

表8同源重组反应体系配方表和反应条件表

组分	用量
		线性化载体	90ng
带同源臂的VIM-Flag基因	28ng
		5×CE II Buffer	4μL
Exnase II	2μL
		ddH2O	补足至20μL
反应条件	37℃30min

参考图1，对构建好的pLV-VIM质粒进行双酶切，酶切后电泳产生的基因片段大小符合预期；进一步通过测序分析表明上述质粒构建无误；

双酶切反应体系及条件见表9：

表9双酶切反应体系配方表及条件表

组分	用量
		pLV-VIM质粒	1μg
内切酶Xba I	1μL
		内切酶Xho I	1μL
10x Buffer	5μL
		ddH2O	补足至50μL
反应条件	37℃30min

VIM-F、VIM-R、VIM-F2、VIM-R-Flag、VIM-pLV-F、VIM-pLV-R的序列及退火温度如表10所示：

表10引物序列表

2.慢病毒包装并感染LMH细胞：

在直径为10cm的细胞培养皿中，待293T细胞单层融合至90％时进行转染；

取无菌1.5mL离心管(A管)，加入500μL DMEM培养基，随后加入20μL的DNA体外转染试剂PolyJet并充分混匀；另取一无菌1.5mL离心管(B管)，加入500μL DMEM培养基，随后加入待包装的慢病毒基因过表达质粒(pLV-VIM)5μg、慢病毒包装辅助载体pH1 3.75μg及pH21.25μg并充分混匀；

将A管中已稀释好的转染试剂加入B管中，立刻充分混匀，室温静置孵育15min。在孵育等待时，胰酶消化293T细胞，用含10％FBS的DMEM培养基制备成约6×10⁵个·mL^-1的细胞悬液。根据需要制备的病毒量，将细胞悬液放入50mL离心管备用；将每1mL转染混合液(A+B)加入10mL细胞悬液，轻轻吹吸细胞混匀，得到混匀细胞悬液；将混匀细胞悬液加入10cm细胞培养皿，37℃、5％CO₂条件下培养24h；去除含有转染试剂的培养基，清洗2遍细胞，加入10mL慢病毒培养基，所述慢病毒培养基由DMEM培养基添加10％FBS和丙酮酸钠1mM配制；

待48h后收集细胞培养液上清，取500g在4℃的温度下离心10min去除细胞碎片；该上清中即含有待表达基因的重组慢病毒颗粒，可以直接用于感染LMH细胞。

(2)稳定过表达VIM的LMH细胞系的构建及鉴定：

将状态良好的LMH细胞均匀接种到24孔板中培养，待细胞生长至70％弃去培养液，加入pLV-VIM重组慢病毒悬液于37℃中孵育，同时设置空白对照组；

孵育2h后弃去病毒液，加入新的培养基继续培养传代；培养72h后加入终浓度为2μg/mL的嘌呤霉素确认进行抗性筛选；得到阳性克隆株即为慢病毒介导的过表达VIM的LMH细胞系，命名为LMH-VIM，空白对照组为LMH-NC。

参考图2，VIM-Flag融合蛋白成功在LMH-VIM细胞中过表达，而空白对照组细胞LMH-NC中则未检测出该融合蛋白表达；

另一方面，利用VIM单克隆抗体进行检测也能发现LMH-VIM细胞中的波形蛋白表达量显著高于空白对照组LMH-NC，表明稳定过表达VIM的LMH细胞系构建成功。

4.过表达鹅源波形蛋白的LMH细胞系对GAstV增殖的促进作用分析

以感染复数MOI＝1的GAstV分别感染LMH-VIM和LMH-NC细胞，并置于37℃、5％CO₂培养箱吸附2h。吸附结束后弃去接种物，用PBS清洗细胞3次，更换为维持培养基进行培养。于感染后24h、48h、72h不同时间点收取细胞，提取细胞蛋白及RNA；通过Western Blot及RT-qPCR(引物5’-GGGTGATCCGCAAGGAAATA-3’，5’-AAGTTTCGCCAGGGTTAGAG-3’)分析GAstV在细胞内的复制水平；同时收取细胞上清病毒液，将病毒液反复冻融三次，离心取上清液，将上清液分别10倍梯度稀释，感染96孔板中的LMH细胞，病毒感染后共维持3d，通过RT-qPCR判定各细胞孔中GAstV呈阳性或阴性的情况，按照Reed-Muench法测定各上清液中的病毒滴度。

参考图4-6可见，在过表达VIM基因的LMH细胞系中，不论是病毒在细胞内的mRNA表达水平、蛋白表达水平，亦或是细胞上清液中的病毒滴度，均显著高于LMH-NC细胞。其中，图4中，病毒在细胞内的mRNA表达水平在72h时，提高了2-3倍左右。

以上表明过表达波形蛋白的LMH细胞系对GAstV的增殖具有显著的促进作用。

Claims (8)

1.鹅源波形蛋白作为促进鹅星状病毒(Goose astrovirus)增殖的活性成分的用途。

2.一种促进增殖鹅星状病毒的方法，其特征在于，将鹅星状病毒感染能够表达鹅源波形蛋白的细胞系。

3.根据权利要求2所述的促进增殖鹅星状病毒的方法，其特征在于，所述细胞系为过表达鹅源波形蛋白的细胞系。

4.根据权利要求3所述的促进增殖鹅星状病毒的方法，其特征在于，所述细胞系为慢病毒介导的LMH细胞系；

所述慢病毒为可表达鹅源波形蛋白的慢病毒。

5.根据权利要求4所述的促进增殖鹅星状病毒的方法，其特征在于，所述慢病毒的制备方法为：

步骤1：获取VIM基因；所述VIM基因的核苷酸序列如SEQ NO.1所示；

步骤2：将VIM基因和慢病毒载体进行同源重组，得到质粒；

步骤3：将质粒转染293T细胞，得到慢病毒。

6.根据权利要求5所述的增殖鹅星状病毒的方法，其特征在于，所述慢病毒载体为pLV-sfGFP（2A）Puro载体。

7.根据权利要求5所述的促进增殖鹅星状病毒的方法，其特征在于，所述病毒的制备方法具体包括如下步骤：

步骤11：从鹅组织细胞中提取RNA并反转成cDNA；

步骤12：以cDNA为模板采用引物VIM-F和引物VIM-R通过PCR扩增VIM基因；引物VIM-F和引物VIM-R的核苷酸序列如SEQ NO.2、SEQ NO.3所示；

步骤13：以VIM基因为模板，利用引物VIM-F2、引物VIM-R-Flag进一步通过PCR在VIM基因末端添加上Flag标记与目标基因融合表达得到目的基因VIM-Flag；引物VIM-F2、引物VIM-R-Flag的核苷酸序列如SEQ NO.4、SEQ NO.5所示；

步骤14：以目的基因VIM-Flag作为模板，利用同源臂引物VIM-pLV-F、同源臂引物VIM-pLV-R进行PCR扩增，使得VIM-Flag基因两端分别添加上位于慢病毒载体的Xba I和Xho I酶切位点两侧至少长为20 bp左右的序列，然后与酶切后的慢病毒载体进行同源重组，构成质粒pLV-VIM；同源臂引物VIM-pLV-F、同源臂引物VIM-pLV-R的核苷酸序列如SEQ NO.6、SEQNO.7所示；

步骤15：在直径为10 cm的细胞培养皿中，待293T细胞单层融合至90％时采用质粒pLV-VIM进行转染得到慢病毒。

8.根据权利要求2所述的促进增殖鹅星状病毒的方法，其特征在于，所述鹅星状病毒的感染复数为1。