CN102296069B - 有效抑制不同毒株猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的非翻译区特异人工微小rna - Google Patents

Abstract

本发明涉及的有效抑制不同毒株猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）复制的非翻译区特异人工微小RNA（miRNA）属于基因工程和生物制品研究领域，所述微小RNA序列如SEQ ID NO：1-4之一所示。本发明还公开了包括基于RNA聚合酶II的人工miRNA表达载体构建、miRRNAi设计、双链寡核苷酸合成与克隆、miRNA表达检测及其对不同毒株PRRSV复制的抑制作用。与针对其它PRRSV基因的siRNA相比，本发明筛选的人工miRNA针对病毒RNA基因组的非翻译区保守序列，既能抑制同源毒株复制，也能抑制异源毒株复制，既可用于抗PRRSV感染制剂开发，也可用于转基因猪抗病品系培育。

Description

有效抑制不同毒株猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的非翻译区特异人工微小RNA

技术领域

本发明属于基因工程和生物制品研究领域。具体涉及有效抑制不同毒株猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）复制的非翻译区特异人工微小RNA的制备与使用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是危害世界养猪业的重要传染病，以母猪发热、流产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍以及仔猪呼吸道症状和高死亡率为主要特征。目前，该病主要用疫苗接种进行预防，但现有灭活苗的免疫效果不确实，弱毒疫苗有散毒风险，迫切需要研究防控该病的新策略。

RNA干扰(RNAi)是近年来快速发展的一种序列特异转录后基因沉默技术, 在功能基因组研究、新药开发、癌症治疗和抗病毒感染等方面具有广泛的应用。在抗病毒感染方面，RNAi几乎能抑制所有病毒的复制。具有RNAi作用的包括小干扰RNA（siRNA）和微小RNA（miRNA），两者既有相似性又有差异性，前者是化学合成和转染到细胞中的21碱基双链RNA，需与目标序列完全互补，结合导致相应mRNA的降解；后者是由长RNA转录子加工成的成熟产物，不需与目标序列完全互补，结合导致mRNA翻译阻滞。目前用于抑制PRRSV复制研究的都是针对病毒蛋白编码基因的siRNA，所用毒株都是同源单一毒株。

PRRSV的5'非翻译区（5'UTR）核酸序列高度保守，含病毒基因组复制和转录的顺式调控元件；3'UTR有高度保守的八核苷酸序列，对PRRSV复制具有重要作用，与病毒基因转录、翻译以及病毒颗粒包装密切相关。本发明根据PRRSV 5'UTR和3'UTR保守区序列设计人工miRNA，用人工miRNA表达载体转染MARC-145细胞，经抗性筛选获得稳定表达细胞，根据50%组织细胞感染剂量（TCID₅₀）和病毒基因表达抑制筛选有效的人工miRNA，筛选的人工miRNA不仅能有效抑制同源PRRSV的复制，而且能抑制异源毒株的复制。

发明内容

本发明的目的在于筛选有效抑制不同毒株猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的非翻译区特异人工微小RNA。

本发明所述的有效抑制不同毒株猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的非翻译区特异人工微小RNA（miRNA），它的序列如SEQ ID NO：1-4之一所示。

上述的特异人工miRNA表达载体构建、miRNA设计、双链寡核苷酸合成与克隆、miRNA表达检测及其对PRRSV复制的抑制作用如下：

a、人工miRNA表达载体构建：参考小鼠BIC基因非编码mRNA miR-155 5'和3'侧翼序列，人工合成miRNA表达盒，中间引入两个BbsI位点，两端分别引入HindIII和DraIII位点，将其插入真核表达载体pcDNA3的相同位点，获得人工miRNA表达载体pcDNA-miR；

b、miR RNAi设计：用BLOCK-iT^TM RNAi Designer软件分析PRRSV的UTR序列，获得10个针对5'UTR和6个针对3'UTR的目标序列，根据星级评分和序列比对结果，各选择3个进行表达研究；

c、双链寡核苷酸合成与克隆：用分析软件中的Design miR RNAi指令产生双链寡核苷酸，将人工合成的双链寡核苷酸插入限制酶BbsI线性化的pcDNA-miR载体；

d、有效miRNA筛选：用miRNA表达载体转染Marc-145细胞，用PRRSV感染后，根据细胞病变抑制程度初步选择有效miRNA；

e、miRNA稳定表达细胞获得：用miRNA表达载体转染Marc-145细胞，经G418筛选获得抗性细胞，用polyA加尾RT-PCR检测序列特异miRNA表达；

f、PRRSV复制抑制效果检测：用不同毒株PRRSV感染稳定转染细胞，定期收集病毒，在Marc-145细胞上进行50%组织细胞感染剂量（TCID₅₀）测定；定期收集细胞，用miRNA cDNA合成试剂盒检测miRNA表达。

在上述步骤d中，利用表达载体细胞转染和病毒感染试验，筛选得针对5'UTR和3'UTR的人工miRNA各2条，其中有效抑制不同毒株PRRSV复制的5'UTR 人工miRNA两条 ，针对的目标序列分别为5-ACATTTGTTGTCAGGAGCT -3（SEQ ID NO：1）和5- TTTGTATTCAGGAGCTGTG-3（SEQ ID NO：2）；有效抑制不同毒株PRRSV复制的3'UTR 人工miRNA两条，针对的目标序列分别为5-TGCCTCTATCACCTATTCA-3（SEQ ID NO：3）和5-TGTGCCTCAGTCACCTATT-3（SEQ ID NO：4）。

步骤e中，从稳定转染细胞中能检测到序列特异miRNA；步骤f中，miRNA稳定表达细胞在两株PRRSV感染后48h检测不到病毒复制，感染后72h的TCID₅₀较对照组下降4.0log以上，感染后96h的TCID₅₀较对照组下降3.5log以上。本发明筛选的人工miRNA不仅能抑制同源株PRRSV复制，而且能抑制异源株PRRSV复制。

本发明中，用BLOCK-iT^TM RNAi Designer软件进行miR RNAi设计，是因为该公司是提供RNAi产品和技术服务的专业公司，其可靠性已被实验证实；用pcDNA-miR作为人工miRNA表达载体，是因为该载体用限制酶BbsI线性化后，可直接与编码人工miRNA的双链寡核苷酸连接，不仅可同时表达两个针对相同或不同病毒（基因）的人工miRNA，而且其CMV启动子用组织特异表达启动子替换后可用于靶向RNA干扰研究。

与针对PRRSV蛋白编码基因的siRNA相比，本发明筛选的针对病毒5'UTR和3'UTR的人工miRNA不仅能抑制同源毒株复制，而且能抑制异源毒株复制，不仅可作为抗PRRS的新型生物制剂进行开发，而且可用于抗病猪品系培育。

附图说明

图1 是人工miRNA表达载体结构示意图

P_cmv代表人巨细胞病毒（CMV）早期启动子；5'miR 和3'miR 代表小鼠miR-155侧翼序列；pre-miRNA ds oligo为编码前体miRNA的双链寡核苷酸；TK polyA为TK基因转录终止序列；NruI、HindIII、BbsI、DraIII为限制酶切位点。

图2是 有效人工miRNA筛选

miR5UTR1-3分别代表PRRSV 5'UTR 人工miRNA miR5UTR1、miR5UTR2、miR5UTR3表达载体转染细胞；miR3UTR1-3分别代表3'UTR 人工miRNA miR3UTR1、miR3UTR2、miR3UTR3表达载体转染细胞；miRcon为针对绿色荧光蛋白基因的对照miRNA表达载体转染细胞；No miRNA为未转染细胞对照。

图3 稳定转染细胞中序列特异miRNA的RT-PCR检测

M: DNA分子量标准；1: miR5UTR1表达载体转染细胞；2: miR5UTR2表达载体转染细胞; 3: miR3UTR1表达载体转染细胞; 4: miR3UTR2表达载体转染细胞; 5: 空载体转染细胞对照; 6: 未转染细胞对照。

图4  VR2332株PRRSV感染miRNA表达细胞中的GP5基因半定量RT-PCR检测

顶图为PRRSV GP5和内参猴β-actin基因转录RT-PCR扩增产物的电泳图；底图纵坐标为两个基因转录扩增产物的相对百分率；miR5UTR1-2分别代表PRRSV 5'UTR 人工miRNA miR5UTR1、miR5UTR2表达载体转染细胞；miR3UTR1-2分别代表3'UTR 人工miRNA miR3UTR1、miR3UTR2表达载体转染细胞；miRcon为对照miRNA表达载体转染细胞；No miRNA为未转染细胞 。

图5 VR2332株PRRSV感染miRNA表达细胞中的病毒滴度检测

纵坐标代表病毒滴度（TCID₅₀）；横坐标代表病毒感染后时间；miR5UTR1-2分别代表PRRSV 5'UTR 人工miRNA miR5UTR1、miR5UTR2表达载体转染细胞；miR3UTR1-2分别代表3'UTR 人工miRNA miR3UTR1、miR3UTR2表达载体转染细胞；miRcon为对照miRNA表达载体转染细胞；No miRNA为未转染细胞。

图6 JXA1株PRRSV感染miRNA表达细胞中的病毒滴度检测

纵坐标代表病毒滴度（TCID₅₀）；横坐标代表病毒感染后时间；miR5UTR1-2分别代表PRRSV 5'UTR 人工miRNA miR5UTR1、miR5UTR2表达载体转染细胞；miR3UTR1-2分别代表3'UTR 人工miRNA miR3UTR1、miR3UTR2表达载体转染细胞；miRcon为对照miRNA表达载体转染细胞；No miRNA为未转染细胞。

具体实施方式

生物材料来源：

pcDNA3载体：从美国Invitrogen life technologies公司引进；

[ pMD-18载体：从宝生物工程（大连）有限公司引进；

VR2332株和JXA1株：分别从美国ATCC和中国动物疫病预防控制中心引进。

实施例

一、人工miRNA表达载体构建

参考小鼠BIC非编码mRNA序列（GenBank ACCESSION  AY096003）中5'miR侧翼序列（134-160核苷酸）和3'miR侧翼序列（221-265核苷酸）以及单纯疱疹病毒TK基因（GenBank  ACCESSION  HQ686001）polyA序列（1115-1136核苷酸），设计人工miRNA表达盒，两端分别引入HindIII和DraIII位点，5'miR和3'miR侧翼序列之间引入两个BbsI位点（5-GTGTCTTCAAGATCTGGAAGACAT-3，SEQ ID NO：5）。将序列送南京金斯瑞生物科技有效公司进行化学合成，合成序列克隆在pMD-18载体。用限制酶HindIII和DraIII将miRNA表达盒从合成载体上切下，与同酶切去除多克隆位点和BGH polyA序列的真核表达载体pcDNA3（Invitrogen公司）连接，获得由人巨细胞病毒CMV启动子和单纯疱疹病毒TK基因polyA信号控制的人工miRNA表达载体pcDNA-miR（见图1），经序列测定证明表达载体构建正确。

二、miR RNAi设计

用Invitrogen公司的BLOCK-iT^TM RNAi Designer在线软件（www.invitrogen.com）分析Ch-1a株PRRSV 5'UTR和3'UTR序列（ACCESSION  AY032626），获得10个针对5'UTR和6个针对3'UTR的目标序列（表1），根据该软件推荐的星级评分和序列比对结果，各选择3个星级评分最高和GenBank中100株PRRSV保守的目标序列进行表达研究，选择出的5'UTR6、5'UTR7、5'UTR10、3'UTR2、3'UTR3和3'UTR4对应的人工miRNA分别命名为miR5UTR1、miR5UTR2、miR5UTR3、miR3UTR1、miR3UTR2和miR3UTR3。用同样的策略，设计1个针对绿色荧光蛋白基因（GenBank Accession U55762）的人工miRNA作为对照，命名为miRcon。

三、双链寡核苷酸合成与克隆

用BLOCK-iT^TM RNAi Designer软件中的Design miR RNAi指令产生双链寡核苷酸（表2）序列，将序列送美国 IDT 公司进行单链寡核苷酸（oligo）合成。将每对单链寡核苷酸进行退火，反应体系为：正链DNA oligo (200 μM) 5μl，负链DNA oligo (200μM) 5μl，10X Oligo Annealing Buffer 2μl（100mM Tris-Hcl PH 8.0，500mM Nacl，10mM EDTA），去离子水8μl。将反应体系在94°C孵育5min，然后缓慢冷却到室温使其退火。用限制酶BbsI消化pcDNA-miR载体（图1），与退火产生的双链寡核苷酸连接，获得的人工miRNA表达载体分别命名为pcDNA-miR5UTR1、pcDNA-miR5UTR2、pcDNA-miR5UTR3、pcDNA-miR3UTR1、pcDNA-miR3UTR2、pcDNA-miR3UTR3、pcDNA-miRcon。用酶切法和序列测定法验证载体构建的正确性。

四、有效miRNA筛选

在24孔细胞培养板上培养Marc-145 细胞，培养液为含 10%胎牛血清（FCS） 的DMEM, 细胞密度为0.8×10⁵个/孔。培养24小时后，将细胞分为pcDNA-miR5UTR1、pcDNA-miR5UTR2、pcDNA-miR5UTR3、pcDNA-miR3UTR1、pcDNA-miR3UTR2、pcDNA-miR3UTR3、pcDNA-miRcon转染组和未转染对照组，以聚乙烯亚胺为转染试剂进行基因转染（文献：Gao B, Sun HC, Fang HX, et al. Expression and preliminary characterization of recombinant human tissue kallikrein in egg white of laying hens. Poultry Sci, 2006, 85: 1239-1244）。继续培养 24h后，用VR2332株PRRSV感染细胞，感染指数MOI=1。每天观察细胞病变情况，连续观察5天，根据细胞病变抑制程度，初步筛选有效抑制PRRSV复制的人工miRNA。结果显示：载体表达的5'UTR和3'UTR人工miRNA均能不同程度地抑制PRRSV复制，其中miR5UTR1、miR5UTR2、miR3UTR1、miR3UTR2抑制效果较好，对照miRcon与未转染组无明显差异（图2）。

五、稳定表达细胞获得及miRNA检测

以上述转染条件，分别用抑制效果较好的miR5UTR1、miR5UTR2、miR3UTR1和miR3UTR2表达载体转染Marc-145细胞。在转染后24h，改换含500μg/mL G418的培养基，每隔3天换液1次，培养15天后获得G418抗性细胞。

按照RNAiso Plus（TaKaRa公司）说明书从G418抗性细胞和未转染细胞提取总RNA，按照One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit（TaKaRa公司）说明书检测miRNA表达。结果显示：4组稳定表达染细胞中均能检测到预期大小的miRNA，而未转染和空载体转染细胞未能检测到相应的miRNA（图3）。

六、PRRSV复制抑制效果检测

以0.8×10⁵个/孔的细胞密度，在24 孔板中培养miRNA稳定表达Marc-145 细胞，培养24h后分别用美洲VR2332株和中国高致病JXA1株PRRSV感染（MOI=1）。在感染后72h收集细胞，按照RNAiso Plus（TaKaRa 公司）说明书提取细胞总RNA，用核酸酶DNase I（TaKaRa 公司）消化去除细胞基因组DNA。以β-actin基因为内参，按照RevertAid^TM Reverse Transcriptase（Fermentas公司）说明书进行PRRSV GP5基因转录半定量 RT-PCR检测。内参β-actin正、反向引物序列为：5-AGAGGCATTCTCACCCTGAAGTACC-3（SEQ ID NO：25）和5-CATACCCCTCATAGATGGGCACAGT-3（SEQ ID NO：26），预期扩增片段长度为 325bp；GP5序列特异引物序列为：5-TGGCAATTTGAATGTTCAAGTATG-3（SEQ ID NO：27）和5-CTGTGCTATCATTGCAGAAGTCGT-3（SEQ ID NO：28），预期扩增片段长度为 603bp。25μL PCR 反应体系为：10×PCR buffer 2.5μL，10μM 正反向引物各1μL，2.5mM dNTP 4μL，Taq DNA聚合酶（TaKaRa公司）1U，反转录产物4μL。30次循环PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸40s；72℃延伸10min。取8μL PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，经EB染色后用BIO-RAD Gel Doc XR+凝胶成像系统分析两个基因的相对表达量。结果显示：在PRRSV感染后72h，miR5UTR1、miR5UTR2、miR3UTR1、miR3UTR2稳定表达细胞的GP5基因表达抑制率分别为83.1%、81.5%、84.1%和81.0%，对照miRcon表达细胞与未转染细胞的GP5基因转录无明显差异（图4）。

在PRRSV感染后48、72、96h收集细胞上清，参考文献（殷震，刘景华，等主编. 动物病毒学. 第二版，北京：科学出版社，1997）在MARC-145细胞上进行病毒TCID₅₀测定。结果显示：在VR2332株PRRSV感染后48h，未转染细胞和对照miRcon表达细胞的TCID₅₀分别为3.8和3.7log，miR5UTR1、miR5UTR2、miR3UTR1、miR3UTR2表达细胞中检测不到病毒；在感染后72h，未转染细胞和对照miRcon表达细胞的TCID₅₀分别为6.4和6.3log，四个miRNA表达细胞的TCID₅₀分别为2.0log；在感染后96h，未转染细胞和对照miRcon表达细胞的TCID₅₀分别为6.7和6.6log，四个miRNA表达细胞的TCID₅₀分别是2.5、2.8、2.6和3.2log（图5）。

在感染JXA1株PRRSV后48h，未转染细胞和对照miRcon表达细胞的TCID₅₀为3.8log，miR5UTR1、miR5UTR2、miR3UTR1、miR3UTR2 表达细胞中检测不到病毒；在感染后72h，未转染细胞和对照miRcon表达细胞的TCID₅₀为6.4log，四个miRNA表达细胞的TCID₅₀分别为2.0、2.1、1.9和2.2log；在感染后96h，未转染细胞和对照miRcon表达细胞的TCID₅₀分别为6.8和6.6log，四个miRNA表达细胞的TCID₅₀分别为2.5、2.9、2.4和3.2log（图6）。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  扬州大学

 

<120>  有效抑制不同毒株猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的非翻译区特异人工微小R

       NA

 

<130> 

 

<160>  28   

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

acatttgttg tcaggagct                                                  19

 

 

<210>  2

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

tttgtattca ggagctgtg                                                  19

 

 

<210>  3

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

tgcctctatc acctattca                                                  19

 

 

<210>  4

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

tgtgcctcag tcacctatt                                                  19

 

 

<210>  5

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

gtgtcttcaa gatctggaag acat                                            24

 

 

<210>  6

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

ataggtgttg gctctatgcc a                                               21

 

 

<210>  7

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  7

ttggctctat gccacgacat t                                               21

 

 

<210>  8

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  8

tctatgccac gacatttgta t                                               21

 

 

<210>  9

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  9

ctatgccacg acatttgtat t                                               21

 

 

<210>  10

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  10

cgacatttgt attgtcagga g                                               21

 

 

<210>  11

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  11

ttgtcaggag ctgtgaccat t                                               21

 

 

<210>  12

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  12

ttgctgcacg gaaacaccct t                                               21

 

 

<210>  13

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  13

tagcaccttg cttccggagt t                                               21

 

 

<210>  14

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  14

ctgtgcctct aagtcaccta t                                               21

 

 

<210>  15

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  15

gagatttaat tggcgagaac c                                               21

 

 

<210>  16

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  16

agatttaatt ggcgagaacc a                                               21

 

 

<210>  17

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  17

atttaattgg cgagaaccat g                                               21

 

 

<210>  18

<211>  128

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  18

tgctgagctc ctgacaatac aaatgtgttt tggccactga ctgacacatt tgttgtcagg     60

 

agctctcgag gactgttatg tttacacaaa accggtgact gactgtgtaa acaacagtcc    120

 

tcgagtcc                                                             128

 

 

<210>  19

<211>  128

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  19

tgctgcacag ctcctgacaa tacaaagttt tggccactga ctgactttgt attcaggagc     60

 

tgtgcgtgtc gaggactgtt atgtttcaaa accggtgact gactgaaaca taagtcctcg    120

 

acacgtcc                                                             128

 

 

<210>  20

<211>  128

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  20

tgctgaactc cggaagcaag gtgctagttt tggccactga ctgactagca cctcttccgg     60

 

agttcttgag gccttcgttc cacgatcaaa accggtgact gactgatcgt ggagaaggcc    120

 

tcaagtcc                                                             128

 

 

<210>  21

<211>  128

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  21

tgctgaatag gtgacttaga ggcacagttt tggccactga ctgactgtgc ctcagtcacc     60

 

tattcttatc cactgaatct ccgtgtcaaa accggtgact gactgacacg gagtcagtgg    120

 

ataagtcc                                                             128

 

 

<210>  22

<211>  128

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  22

tgctgtgaat aggtgactta gaggcagttt tggccactga ctgactgcct ctatcaccta     60

 

ttcacactta tccactgaat ctccgtcaaa accggtgact gactgacgga gatagtggat    120

 

aagtgtcc                                                             128

 

 

<210>  23

<211>  128

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  23

tgctgggttc tcgccaatta aatctcgttt tggccactga ctgacgagat ttatggcgag     60

 

aacccccaag agcggttaat ttagagcaaa accggtgact gactgctcta aataccgctc    120

 

ttgggtcc                                                             128

 

 

<210>  24

<211>  128

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  24

tgctgtagtg acgagacaag cacagcgttt tggccactga ctgacgctgt gcttctcgtc     60

 

actacatcac tgctctgttc gtgtcgcaaa accggtgact gactgcgaca cgaagagcag    120

 

tgatgtcc                                                             128

 

 

<210>  25

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  25

agaggcattc tcaccctgaa gtacc                                           25

 

 

<210>  26

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  26

catacccctc atagatgggc acagt                                           25

 

 

<210>  27

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  27

tggcaatttg aatgttcaag tatg                                            24

 

 

<210>  28

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  28

ctgtgctatc attgcagaag tcgt                                            24

 

 

Claims (1)

1.一种有效抑制不同毒株猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的非翻译区特异人工微小RNA，其特征在于，它的序列如SEQ ID NO：1-4之一所示；所述毒株是VR2332株和JXA1株。

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