CN111485004B - 猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒超易感细胞系及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒超易感细胞系及其在PRRSV疫苗生产中的应用。本发明所构建的细胞系生长特性与正常细胞无差异，该细胞系对不同类型的PRRSV均超易感，能使病毒感染滴度增高，感染时间缩短；可以用于PRRSV的快速高滴度制备，同时为PRRSV疫苗的生产提供高效细胞系。

Description

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒超易感细胞系及其应用
技术领域
本发明涉及生物学技术领域，具体涉及一种猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒超易感细胞系及其在PRRSV疫苗生产中的应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV)是一种只感染猪的高度接触性传染病病原，是目前危害养猪业的首要传染病之一。仅美国每年由于PRRSV感染引起的经济损失高达60亿美元。PRRSV分为欧洲型和北美型，在我国主要流行北美型。目前临床上常见的毒株有经典低致病性PRRSV(LP-PRRSV)、高致病性PRRSV(HP-PRRSV)和2013年暴发的NADC30-like三种类型的毒株。疫苗免疫是目前该病的预防的主要手段。目前商品化的PRRSV疫苗有减毒活疫苗和灭活疫苗，由于灭活疫苗免疫效果较差，所以临床上主要以减毒活疫苗为主。减毒活疫苗需要将疫苗生产用的标准毒种接种到动物细胞上，适当培养若干时间后，收获细胞培养物，分离纯化后的病毒便是病毒疫苗生产使用的直接或间接原料。因此构建传代细胞，获得高滴度和免疫原性好的传代细胞适应株是疫苗生产过程中重要的关键技术之一。
但由于PRRSV具有高度的变异性，变异株不仅在基因组上发生变化，而且在毒力和诱导的机体的免疫反应等方面都发生了变化，因此，不同类型的PRRSV在同一动物细胞上的感染适应能力可能存在较大差异，在制备不同类型PRRSV的减毒活疫苗时，病毒的感染能力及高滴度病毒的生产严重制约了PRRSV减毒活疫苗的生产与应用。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒超易感细胞系，本发明所构建的细胞系可支持不同类型的PRRSV快速繁殖，能使病毒感染滴度增高，感染时间缩短；可以用于PRRSV的快速高滴度制备，同时为PRRSV疫苗的生产提供高效细胞系。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒超易感细胞系的构建方法，包括以下步骤：
以靶标1和靶标2作为CLDN4基因的双敲除靶序列，利用CRISPR-Case9技术对动物细胞中CLDN4基因进行完全敲除，即构建得到猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒超易感细胞系；
所述靶标1的正义链序列如SEQ ID NO.1所示，反义链序列如SEQ ID NO.2所示；所述靶标2的正义链序列如SEQ ID NO.3所示，反义链序列如SEQ ID NO.4所示。具体如下：
靶标1正义链：CACCGTGCCTCGCTCTACGTCGGCTGGG(SEQ ID NO.1)；
靶标1反义链：AAACCCCAGCCGACGTAGAGCGAGGCAC(SEQ ID NO.2)。
靶标2正义链：CACCGCCCGCCCCGTACAGACAAGCCTT(SEQ ID NO.3)；
靶标2反义链：AAACCAAGGCTTGTCTGTACGGGGCGGG(SEQ ID NO.4)。
优选的，所述动物细胞为Marc-145细胞。
采用本发明的构建方法，可以将动物细胞中的CLDN4基因完全敲除，无脱靶效应；而且敲除CLDN4基因后不改变细胞生长特性。
本发明的第二方面，提供上述方法构建的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒超易感细胞系。
上述方法构建的超易感细胞系很好的支持HP-PRRSV、LP-PRRSV和NADC30-like感染，能使病毒感染滴度增高，感染时间缩短。
本发明的第三方面，提供上述猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒超易感细胞系在PRRSV的快速高滴度制备中的应用。
上述应用中，所述PRRSV为HP-PRRSV、LP-PRRSV和/或NADC30-like。
本发明的第四方面，提供上述猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒超易感细胞系在PRRSV疫苗生产中的应用。
上述应用中，优选的，所述PRRSV疫苗为PRRSV减毒活疫苗。
本发明的有益效果：
本发明利用CRISPR-Cas9双位点敲除方法将动物细胞中的CLDN4基因完全敲除，无脱靶效应，敲除CLDN4基因之后不改变细胞生长特性；不同类型的PRRSV均在敲除CLDN4基因后构建的细胞系具有超强的感染能力，能使病毒感染滴度增高，感染时间缩短；可以用于PRRSV的快速高滴度制备，同时为PRRSV疫苗的高效生产提供易感细胞系。
附图说明
图1：Marc-145细胞感染HP-PRRSV对紧密连接蛋白家族成员(CLDN3，CLDN4，OCLN，ZO-1，ZO-2和JAM-1)mRNA水平影响的Real-time PCR检测结果。
图2：Marc-145细胞上Real-time PCR和Western blot检测在CLDN4过表达细胞系Marc-145CLDN4过表达效果(A)及Real-time PCR(B)和Western blot(C)检测CLDN4过表达后对PRRSV N基因的影响。
图3：CLDN4敲除细胞系Marc-145CLDN4-KO中CLDN4表达的Western blot结果(A)和敲除细胞系对细胞活性的影响的CCK-8结果(B)以及敲除细胞系中PRRSV N蛋白表达(C)的Western blot结果，以及一步法(D)和多步法(E)验证PRRSV病毒滴度的Titration结果。
图4：CLDN4敲除细胞系Marc-145CLDN4-KO中LP-PRRSV CH-1R(A)和NADC30-like(D)增殖的Real-time PCR结果以及一步法和多步法验证LP-PRRSV CH-1R(B)(C)和NADC30-like(E)病毒滴度的结果。
图5：CLDN4过表达细胞系Marc-145CLDN4(A)和敲除细胞系Marc-145CLDN4-KO(B)中疫苗株TJ(TJM-F92株，华蓝康)、CH-1R(普莱柯生物)、R98(瑞普保定生物药业)的病毒滴度的结果。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分所介绍的，针对目前PRRSV的防治现状，疫苗免疫是目前该病的预防的主要手段，并且临床上主要以减毒活疫苗为主。减毒活疫苗需要将疫苗生产用的标准毒种接种到动物细胞上，从而得到病毒疫苗生产使用的直接或间接原料。因此筛选传代细胞，获得高滴度的传代细胞适应株是疫苗生产过程中重要的关键技术之一。
闭合蛋白(claudin，CLDN)是构成细胞间紧密连接(Tight junctions，TJ)重要组成成分。CLDN分子不仅可以作为细胞与细胞之间的物理性屏障阻止病毒感染，也可以被病毒利用或者破坏，从而有利于病毒的感染。我们前期对PRRSV感染Marc-145细胞的转录组学发现，PRRSV在感染前期可以下调CLDN4表达，为了进一步研究CLDN4在HP-PRRSV感染过程中的作用，本发明建立了CLDN4的过表达细胞系和敲除细胞系，感染PRRSV，发现CLDN4敲除Marc-145细胞系能显著的提高PRRSV感染。
为了保证实验结果的精确性，本发明使用了CRISPR-Case9技术将Marc-145细胞中CLDN4进行完全敲除构建了Marc-145CLDN4-KO细胞系。CRISPR-Cas9系统是一种被广泛运用基因组编辑工具，它来源于细菌的适应性免疫系统。CRISPR-Cas9系统包括：Cas9酶和一个向导RNA。向导RNA作用是引导Cas9到基因组的特异性位点上切割。目前为止，CRISPR-Cas9系统主要有两方面应用：基因敲除和基因敲入。对于基因敲除时，一旦DNA的双链断裂反应(DSB)被Cas9切割诱导发生，细胞会启动NHEJ DNA修复方式，这会造成DNA的删除和插入，但该方法的弊端是容易引起脱靶效应，而引起靶基因敲除不彻底或无敲除现象。为实现CLDN4的完全敲除，本发明对CRISPR-Cas9系统进行了优化，本发明针对CLDN4基因的两个外显子区域采用双靶点进行基因敲除，本发明通过构建出插入双靶标点的载体，并将其转染到Marc-145细胞中，可以实现Marc-145细胞中CLDN4完全敲除，并防止脱靶效应，从而保证CLDN4基因敲除的稳定性，并且对细胞活性及其生长特性无影响。
为了进一步研究不同类型的PRRSV在上述CLDN4敲除的Marc-145细胞系上的感染情况，用HP-PRRSV(代表毒株为TA-12，GenBank的登录号为HQ416720)，以CH-1R代表毒株为LP-PRRSV，和以TA01为代表的NADC30-like感染该敲除细胞系。研究发现，CLDN4敲除Marc-145细胞系均能显著的促进不同致病性的PRRSV的感染，病毒感染时间缩短；这在之前的研究中一直未见应用。
综上：本发明的CLDN4敲除Marc-145细胞系可以作为PRRSV超易感细胞系，对细胞活性及其生长特性无影响。不同类型的PRRSV均在敲除CLDN4基因后构建的细胞系具有超强的感染能力，可以提高不同类型的PRRSV的感染性，缩短感染时间，可以用于PRRSV的快速高滴度制备，同时为PRRSV疫苗的生产提供了高效细胞系。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。
实施例1：CLDN4参与PRRSV感染
CLDN4是紧密连接家族的重要成员，是构成细胞紧密连接的主要骨架蛋白。我们前期在研究HP-PRRSV感染Marc-145细胞的转录组学时发现，CLDN4参与PRRSV的感染。因此我们进一步通过Real-time PCR检测HP-PRRSV感染Marc-145细胞时重要的紧密连接家族成员CLDN3、CLDN4、OCLN、ZO-1、ZO-2和JAM-1的mRNA水平变化，发现病毒感染早期下调CLDN4表达，感染后期上调CLDN4表达(见图1)。
实施例2：CLDN4抑制PRRSV感染
为了进一步研究CLDN4参与PRRSV感染，我们也使用了过表达CLDN4的Marc-145细胞系Marc-145CLDN4进行验证，分析对HP-PRRSV感染的影响。
荧光定量和Western blot结果显示CLDN4过表达后(见图2A)能显著抑制HP-PRRSV感染。在感染后12h、24h、36h时，对照组病毒拷贝数分别是过表达组的10.5、11.5、10.4倍(见图2B)。Western blot验证也得到了相同的结果(见图2C)。
实施例3：CLDN4敲除细胞系构建
为了进一步验证该结果，本发明构建CLDN4敲除细胞系进行验证。将携带两个向导RNA表达盒的CRISPR-Cas9载体系统用于构建含有靶标1和靶标2的重组质粒(靶标1和靶标2序列见序列表中SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4)。首先根据靶标1和靶标2序列合成相应的引物，将正向引物和反向引物混合后并在PCR仪中进行引物磷酸化和退火备用，然后进一步将PX459M和EZ-GuideXH载体进行BbsI酶消化，并胶回收纯化酶切产物。接下来将靶标1和PX459M载体以及靶标2和EZ-GuideXH载体进行连接转化实验并鉴定阳性克隆和测序验证。接下来，我们将靶标2从EZ-GuideXH载体上进行酶切并连接到含有靶标1的PX459M载体上构建出插入双靶标点的载体(重组CRISPR/Cas9 KO质粒)并进一步鉴定阳性克隆和测序验证。
鉴定出的重组CRISPR/Cas9 KO质粒被转染到Marc145细胞中，然后大约每2-3天用含有10％FBS和10μg/mL嘌呤霉素抗生素的培养基替换含有10％FBS和1％双抗的普通培养基，并筛选未死亡的转染成功的阳性细胞至少3–5天。通过Western blot确认敲除(图3A)，并将其命名为Marc145CLDN4-KO。空白载体也用相同的程序处理，相应的细胞系命名为Marc145VEC。同时进一步通过CCK-8实验验证CLDN4敲除对细胞活性的影响，结果发现CLDN4的敲除对细胞活性无不利影响。
本发明采用双靶点敲除的目的和作用主要是针对CLDN4基因的两个外显子区域进行基因敲除，保证对CLDN4基因的完全敲除，并防止脱靶效应，从而保证CLDN4基因敲除的稳定性(图3B)。
在Marc145CLDN4-KO和Marc145VEC细胞上感染HP-PRRSV(TA-12)，用Western blot进行检测对HP-PRRSV感染的影响，结果发现在感染后24h、36h、48h时敲除组的HP-PRRSV的感染显著增加(图3C)。
为了进一步验证该结果，通过滴度测定实验进行分析。在96孔板中的单层Marc145CLDN4-KO和Marc145VEC细胞上按照梯度稀释法将HP-PRRSV病毒感染Marc-145细胞后不同时间的细胞上清液进行梯度(10-1-10-7)稀释，将稀释液和细胞维持液混合后加入细胞中孵育24小时后，加入冰无水乙醇固定细胞，并通过PRRSV N单克隆抗体和FITC抗小鼠抗体孵育，最后通过荧光显微镜下观察病毒感染情况，发现在空载体Marc145VEC细胞系中，在病毒感染4h时可以检测到病毒滴度，而在Marc145CLDN4-KO细胞系中，在病毒感染2h时就可以检测到病毒滴度，感染时间缩短2个小时(图3D)，同时随着病毒感染时间的延长，Marc145CLDN4-KO细胞系病毒感染滴度显著高于Marc145VEC细胞系中的病毒感染滴度，在病毒感染4h、6h、8h、10h时，Marc145CLDN4-KO细胞系病毒感染滴度分别是Marc145VEC细胞系中的125.9、2.51、3.98、3.16倍，在病毒感染12h、24h、36h、48h时，Marc145CLDN4-KO细胞系病毒感染滴度分别是Marc145wpxld细胞系中的10、7.5、15.85、5.01倍(图3E)。
表1：本发明中所用的引物序列
Figure BDA0002479869750000061
注：本发明中使用了Marc-145细胞系，Marc-145细胞系是PRRSV的易感细胞系，来自于猴肾上皮细胞。CLDN4基因序列找的是猴源保守的序列。
实施例4：不同PRRSV毒株在Marc-145CLDN4-KO细胞系上滴度增加
为了进一步验证CLDN4敲除对不同致病性的PRRSV均发挥作用，首先在Marc145CLDN4-KO和Marc145VEC细胞上分别感染LP-PRRSV CH-1R和NADC30-like病毒，并在感染后不同时间收取细胞，提取细胞RNA并进行反转录进行Real-time验证，结果发现CLDN4敲除后使CH-1R和NADC30-like病毒复制均显著增加，与Marc145VEC细胞系相比，CH-1R在Marc145CLDN4-KO细胞系中感染12h、36、48h后拷贝数增加10.8、11.2、11倍(图4A)，NADC30-like的拷贝数在感染12h、24h、36、48h、60h后拷贝数增加11.3、12、11.9、11.1、10.8倍(图4D)。同时进一步通过病毒滴度测定实验验证出CH-1R和NADC30-like在Marc145CLDN4-KO细胞系中感染滴度增加(图4C和4E)，感染时间缩短2h(图4B)。
实施例5：不同PRRSV疫苗株在Marc-145CLDN4-KO细胞系上滴度增加
为了进一步验证CLDN4敲除的Marc-145细胞系在生产实践中的应用，我们使用PRRSV不同类型的疫苗株进行验证，通过病毒滴度测定实验验证出TJ(TJM-F92株，华蓝康)、CH-1R(普莱柯生物)、R98(瑞普保定生物药业)3种商品化疫苗毒株在CLDN4过表达细胞系Marc-145CLDN4中的病毒滴度受到抑制(见图5A)，在Marc145CLDN4-KO细胞系中病毒滴度显著增加(见图5B)，TJM-F92株提高了54.33倍，CH-1R株提高了41.21倍，R98株提高了84.14倍。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东农业大学
<120> 猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒超易感细胞系及其应用
<130> 2020
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
caccgtgcct cgctctacgt cggctggg 28
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aaaccccagc cgacgtagag cgaggcac 28
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
caccgcccgc cccgtacaga caagcctt 28
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aaaccaaggc ttgtctgtac ggggcggg 28
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctcgtcatca tcagcatca 19
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggcagagtaa gccttgtc 18
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
agatcatcgc ccaacaaaac 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gacacaattg ccgctcacta 20
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
acccactctt ccaccttcga cgct 24
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tgttgctgta gccaaattcg 20

Claims (1)

1.猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒超易感细胞系在增加PRRSV疫苗株R98病毒滴度中的应用；
所述猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒超易感细胞系由如下方法构建而成：
以靶标1和靶标2作为CLDN4基因的双敲除靶序列，利用CRISPR-Case9技术对Marc-145细胞中CLDN4基因进行完全敲除，即构建得到猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒超易感细胞系；
所述靶标1的正义链序列如SEQ ID NO.1所示，反义链序列如SEQ ID NO.2所示；所述靶标2的正义链序列如SEQ ID NO.3所示，反义链序列如SEQ ID NO.4所示。
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