CN102205116A - 一种培养动物细胞生产疫苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于疫苗制备领域，提供了一种在片状载体培养动物细胞生产疫苗的方法，其包括：通过在片状载体上培养疫苗基质细胞，以一定浓度接种病毒，在生物反应器控制条件下继续培养细胞及病毒，收获病毒液，同时反复冻融片状载体及感染细胞，将全部收液混合成病毒悬液，制成疫苗。该方法应用片状载体培养技术在生物反应器中培养动物细胞来生产疫苗，片状载体为细胞生长及病毒繁殖提供三维空间及更大的比表面积，细胞实现更高的细胞密度，生物反应器控制培养条件等参数，可为细胞生长和病毒繁殖提供最佳生产环境，极大地提高病毒滴度，疫苗产量和质量都更稳定。

Description

一种培养动物细胞生产疫苗的方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种培养动物细胞生产疫苗的方法，更具体的说是涉及一种通过片状载体培养动物基质细胞生产疫苗的方法。

背景技术

传统的疫苗生产技术往往是通过接种鸡胚或动物的方法来分离、制备病毒液，但该方法因个体和种属差异，许多病毒难以找到合适的敏感动物，而且因个体差异大而影响结果的判定。随着细胞培养技术的发展，目前绝大多数病毒均可有相应的敏感细胞，为病毒的增殖创造了条件，随着细胞大规模培养技术的发展，只要有敏感的细胞，就可以进行大规模疫苗生产。

目前，疫苗的生产主要是通过转瓶工艺进行，但是该方法自动化程度低，劳动强度大，并因为转瓶细胞培养环境的不可控性，导致细胞和疫苗质量不稳定，产品批次差异大；另一方面，单个转瓶能提供的细胞吸附生长面积有限，细胞密度只能达到1～5×10⁵cells/ml，产能低，同时要扩大生产规模只能通过增加转瓶数量的方法，结果是车间规模、设备通入、人员等需求更大，劳动量更大。

最近，开始采用生物反应器进行疫苗生产的研究，通过生物反应器控制细胞或病毒增殖的最适培养条件，且环境均一，从而提高细胞密度和病毒产量，减少批间差异；另一方面，培养过程自动化控制，生产工艺稳定，易于规模放大，降低成本，提高效率。

发明内容

为了克服上述现有疫苗的生产技术所存在的缺陷和不足，实现简便、高效的生产疫苗的目的，发明人经过研究，提供了一种培养动物细胞生产疫苗的方法。

具体来讲，本发明的技术方案如下：

一种培养动物细胞生产疫苗的方法，其包括以下步骤：

（1）用片状载体培养动物细胞；

（2）步骤（1）获得的动物细胞上接种病毒；

（3）继续培养动物细胞及病毒；

（4）收获病毒液，或/和反复冻融片状载体及感染细胞，然后将全部收液混合成病毒悬液，制成疫苗。

研究发现，采用片状载体在生物反应器中培养易感细胞从而生产疫苗，可以获得质量稳定的疫苗。其一是因为片状载体为细胞生长及病毒繁殖提供了三维空间及更大的比表面积，细胞可以生长到更高的细胞密度；其二是采用生物反应器可以实现自动控制培养环境参数，从而使得细胞生长和病毒繁殖处于最佳的生产环境，极大地提高了病毒滴度，从而可保证疫苗产量更大和质量更稳定。

上述的步骤（4）可以采用各种方法来制备疫苗。比如，病变型疫苗：可以将所收获的上清病毒液冻存于-20℃中，片状载体及细胞-20℃反复冻融2~3次，然后和上清病毒液混合制成病毒悬液，过滤，灭活，后制备疫苗；分泌型疫苗：可以将所收获的上清病毒悬液-20℃冻存，检验合格后制备疫苗。

本发明的片状载体包括但不限于M、N、W、Z、星型、五角形、正方形、菱形等多边形状。

作为优选方案，根据本发明所述的培养动物细胞生产疫苗的方法，其中：所述的步骤(1）用片状载体培养细胞按以下方法进行：在已经过灭菌和浸泡处理后的片状载体上接种动物细胞，在培养条件温度为37℃、pH值为 6.8～7.6及DO（溶氧）为 30～60%下培养细胞，片状载体上的细胞量达到1～3×10⁸cells/g。片状载体上接种动物细胞，在生物反应器控制培养条件下，检测营养消耗，进行补液或换液处理，培养细胞达到1～3×10⁸cells/g时，片状载体上的细胞形成健康、致密的单层，有利于病毒的吸附、感染并在细胞上实现增殖。过高的细胞密度容易导致营养供应不足，过低的细胞密度则无法实现片状载体培养可实现高密度的优点，生产成本会增加。

灭菌采用本领域通用的技术手段即可，比如将片状载体经伽马射线24kGy辐照杀菌。浸泡处理采用本领域通用的技术手段处理即可，比如将片状载体首先用PBS缓冲液浸泡，排尽PBS后再用培养液浸泡。

作为优选方案，根据本发明所述的培养动物细胞生产疫苗的方法，其中：所述的片状载体上接种动物细胞，其接种量为0.5～2×10⁷cells/g。接种量过高或过低在本发明的片状载体上都不能获得好的动物细胞培养效果。

作为优选方案，根据本发明所述的培养动物细胞生产疫苗的方法，其中：所述的步骤（2）中，按病毒感染复数MOI为0.001-0.2的量接种病毒。在本文中，术语“病毒感染复数MOI”是指每一个细胞上所感染病毒的数量。MOI=有感染力的病毒量/细胞总量。

作为优选方案，根据本发明所述的培养动物细胞生产疫苗的方法，其中：所述的步骤（3）的继续培养细胞及病毒的条件为：温度为30～37℃、pH 值为6.8～7.8、DO为30～60%，以及病毒繁殖所需要的营养条件。根据接种的病毒，按照本领域现有技术提供其繁殖所需要的营养条件即可。

作为优选方案，根据本发明所述的培养动物细胞生产疫苗的方法，其中：所述的步骤（4）中，病毒液直接收获并于-20℃冻存；片状载体及感染细胞于-20℃下反复冻融2～3次，最终将病毒液或/和反复冻融收液混合成病毒悬液，制成疫苗。

作为优选方案，根据本发明所述的培养动物细胞生产疫苗的方法，其中：所述的培养动物细胞采用批式、流加、灌注或半连续的培养工艺。更优选地，所述培养细胞采用灌注培养方式。细胞灌注培养是指在细胞培养过程中，往生物反应器中不断地流加新鲜培养液，同时通过载体对细胞的吸附使得培养液不断流出，带走代谢副产物如乳酸，氨等，使其维持在低浓度水平，不会成为细胞生长的抑制因素，所以细胞可生长在良好的培养环境中，能获得很高的细胞培养密度和产物生产速率。灌注培养具有反应器体积小，回收培养液上清体积大，产品在罐内停留时间短，可及时回收产品至低温下保存，有利于保持产品活性等显著特点。

作为优选方案，根据本发明所述的培养动物细胞生产疫苗的方法，其中：所述的动物细胞选自Marc-145细胞、MDCK细胞、ST细胞、BHK-21细胞或DF-1细胞等。

作为优选方案，根据本发明所述的培养动物细胞生产疫苗的方法，其中：所述的培养动物细胞生产疫苗的方法是在生物反应器中进行的。在本发明中，所采用的生物反应器包括但不限于激流式生物反应器、鼓泡式生物反应器、搅拌式生物反应器，气升式生物反应器，wave生物反应器和中空纤维反应器等。生物反应器可以实现自动控制培养环境参数，从而使得细胞生长和病毒繁殖处于最佳的生产环境，极大地提高了病毒滴度，从而可保证疫苗产量更大和质量更稳定。

具体实施方式

下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。若无特别指明，实施例采用的方法为本领域通用技术。

培养液： DMEM培养基（DMEM培养液），GIBCO公司。

实施例1（10L生物反应器培养Marc-145细胞制备蓝耳病疫苗）

猪繁殖和呼吸综合征病毒：CH-1R株。

片状载体经伽马射线24kGy辐照杀菌后，首先用PBS浸泡，接着用PBS冲洗后，再用培养液过夜浸泡，备用。

生物反应器中的片状载体上接种1×10⁷个Marc-145细胞，于DO控制在30～60%，pH值维持在7.0～7.2，温度37℃的条件下培养生长5～7天时间，期间检测葡萄糖消化，根据糖耗情况进行换液处理，以使糖量维持在日耗糖量为1g/L以上为准，随着细胞密度的提高，日耗糖量逐渐增加直到达到2.5g/L以上。

排出培养液，用无菌PBS清洗两次，按病毒感染复数MOI为0.001-0.01的量接种猪繁殖和呼吸综合征病毒。其中猪繁殖和呼吸综合征病毒PRRSV，无论是欧洲型还是美洲型，强毒株还是弱毒株，对Marc-145细胞或其他易感细胞普遍具有适应性和敏感性，所以本发明所述的方法适用于所有的PRRSV毒株。

继续培养所述的易感细胞Marc-145，采用流加培养方式，维持pH在7.2-7.4，DO维持在30～60%，温度37℃，以及病毒繁殖所需要的营养条件。在病毒感染易感细胞一段时间（10-20小时）后，可以采用流加培养方式往生物反应器中添加病毒维持液，或添加葡萄糖浓缩液，维持合适营养成分，30～40h后收获细胞及病毒液。将所收获的上清病毒液于-20℃放置，片状载体及细胞于-20℃反复冻融2～3次，然后和上清病毒液混合制成病毒悬液，检验合格后冻干制备获得蓝耳病疫苗。

病毒滴度TCID50的测定按照常规方法进行。收获阶段收集的病毒液的病毒滴度与转瓶培养工艺相比，提高了1-2个TCID50/ml（即病毒滴度是转瓶培养工艺的10^1-2倍），每次收获体积是转瓶10倍，病毒总产量是转瓶工艺的100倍。

经检测，疫苗质量控制的结果符合中国药典2005年版三部和中国生物制品规程2000年版要求。

将本实施例中的N型片状载体替换为M、W、Z、星型、五角形、正方形或菱形等多边形状，也能实现同样的技术效果，此处不再一一赘述。

实施例2（10L生物反应器培养MDCK细胞制备禽流感疫苗）

片状载体经伽马射线24kGy辐照杀菌后，首先用PBS浸泡，接着PBS冲洗后，再用培养液过夜浸泡，备用。

生物反应器中的片状载体上接种0.5×10⁷个MDCK细胞，DO控制在30～60%，pH维持在7.2～7.4，温度37℃。检测葡萄糖消化，根据糖耗情况进行换液或补液处理，使糖量维持在1g/L以上，基本上5～7天时间，细胞密度达到最大值。

排空培养液，无菌PBS清洗两次，按病毒感染复数MOI为0.01～0.1接种H5N1病毒。对MDCK细胞或其他易感细胞普遍具有适应性和敏感性的所有毒株，本发明的方法均适用。

继续培养所述的易感细胞MDCK，采用流加培养方式，维持pH在7.3-7.5，DO维持在30～60%，温度37℃，以及病毒繁殖所需要的营养条件。在病毒感染易感细胞一段时间后，比如10-20小时后，可以采用流加培养方式往生物反应器中添加病毒维持液，或添加葡萄糖浓缩液，3～4天后收获病毒液。将所收获的上清病毒液放置于-20℃中，片状载体及细胞于-20℃反复冻融3次，然后和上清病毒液混合制成病毒悬液，过滤，灭活，乳化后制得禽流感疫苗。

病毒血凝价的测定按照常规方法进行。收获阶段收集的病毒液的病毒HA与转瓶工艺相比，提高了4-8个HA，即病毒滴度是转瓶培养工艺的2^2-3倍；病毒液的病毒HA与鸡胚工艺相比，提高了1-2个HA，即病毒滴度是鸡胚培养工艺的2^1-2倍。

经检测，疫苗质量控制的结果符合中国药典2005年版三部和中国生物制品规程2000年版要求。

将本实施例中的N型片状载体替换为M、W、Z、星型、五角形、正方形或菱形等多边形状，也能实现同样的技术效果，此处不再一一赘述。

实施例3（10L生物反应器培养ST细胞制备猪瘟疫苗）

片状载体经伽马射线24kGy辐照杀菌后，首先用PBS浸泡，接着用PBS冲洗后，再用培养液过夜浸泡，备用。

生物反应器中的片状载体上接种2×10⁷个ST细胞，DO控制在30～60%，pH维持在7.0～7.2，温度37℃。检测葡萄糖消化，根据糖耗情况每2～3天全换液1次，使糖量维持在1g/L以上，5～7天达到最大细胞密度。

排出全部培养液，无菌PBS清洗片状载体及细胞两次，以2～3%脾毒的浓度接种于ST细胞。对ST细胞或其他易感细胞普遍具有适应性和敏感性的所有毒株，本发明的方法均适用。

继续培养所述的ST细胞，采用流加培养，批次收获的方式，维持pH在7.2-7.4，DO维持在30～60%，温度37℃，以及病毒繁殖所需要的营养条件。在病毒感染易感细胞后，每12h检测糖耗，可以采用流加培养方式往生物反应器中添加病毒维持液，或添加葡萄糖浓缩液，接毒后第5天开始收获病毒液，以后每4天收获一次。将所收获的上清病毒液，冻干后制得猪瘟疫苗。

滴度的测定按照定型热反应实验方法进行。收获阶段收集的病毒液的病毒滴度与转瓶培养工艺相比，转瓶工艺最好情况能达到每毫升含病毒≥100,000个家兔感染量，片状载体培养生产猪瘟疫苗可达到每毫升含病毒≥500,000个家兔感染量，提高5倍以上。

经检测，疫苗质量控制的结果符合中国药典2005年版三部和中国生物制品规程2000年版要求。

将本实施例中的N型片状载体替换为M、W、Z、星型、五角形、正方形或菱形等多边形状，也能实现同样的技术效果，此处不再一一赘述。

实施例4（10L生物反应器培养BHK-21细胞制备狂犬疫苗）

片状载体经伽马射线24kGy辐照杀菌后，首先用PBS浸泡，接着用PBS冲洗后，再用培养液过夜浸泡，备用。

生物反应器中的片状载体上接种1×10⁷个BHK-21细胞，DO控制在30～60%，pH维持在7.0～7.4，温度37℃。检测葡萄糖消化，根据糖耗情况换液或补液，使糖量维持在1g/L以上，5～7天细胞密度达到最大。

排出全部培养液，无菌PBS清洗片状载体及细胞两次，按病毒感染复数MOI为0.01-0.2的量接种狂犬病毒。对BHK-21细胞或其他易感细胞普遍具有适应性和敏感性的所有毒株，本发明的方法均适用。

继续培养所述的BHK-21细胞，采用流加培养，批次收获的方式，维持pH在7.2-7.6，DO维持在30～60%，温度35～36℃，以及病毒繁殖所需要的营养条件。在病毒感染易感细胞后，每12小时检测一次培养液残糖，可以采用流加培养方式往生物反应器中添加病毒维持液，或添加葡萄糖浓缩液，接毒后开始连续或分批收获病毒液20天以上。将所收获的上清病毒液灭活后制得狂犬疫苗。

病毒滴度的测定按照常规方法进行，收获阶段收集的病毒液的病毒滴度与转瓶培养工艺相比，提高了1-2个LD50/ml（即病毒滴度是转瓶培养工艺的10^1-2倍），每次收获体积是转瓶10倍，病毒总产量是转瓶工艺的100倍。

经检测，疫苗质量控制的结果符合中国药典2005年版三部和中国生物制品规程2000年版要求。

将本实施例中的N型片状载体替换为M、W、Z、星型、五角形、正方形或菱形等多边形状，也能实现同样的技术效果，此处不再一一赘述。

实施例5（10L生物反应器培养DF-1细胞制备法氏囊疫苗）

片状载体经伽马射线24kGy辐照杀菌后，首先用PBS浸泡，接着用PBS冲洗后，再用培养液过夜浸泡，备用。

生物反应器中的片状载体上接种1×10⁷个DF-1细胞，DO控制在30～60%，pH维持在7.0～7.2，温度37℃。检测葡萄糖消化，根据糖耗情况换液或补加培养液，使糖量维持在1g/L以上，5～7天时间细胞密度达到最大。

排出全部培养液，无菌PBS清洗片状载体及细胞两次，按病毒感染复数MOI为0.01-0.1的量接种法氏囊病毒。

继续培养所述的DF-1细胞，采用流加培养，批次收获的方式，维持pH在7.2-7.4，DO维持在30～60%，温度37℃，以及病毒繁殖所需要的营养条件。在病毒感染易感细胞一段时间后，可以采用流加培养方式往生物反应器中添加病毒维持液，或添加葡萄糖浓缩液，接毒后第3～4天收获病毒液及细胞。将所收获的全部收液混合成病毒悬液，放置于-20℃中，检验合格后制得法氏囊疫苗。

病毒滴度TCID50的测定按照常规方法进行。收获阶段收集的病毒液的病毒滴度与转瓶培养工艺相比，提高了1-2个TCID50/ml（即病毒滴度是转瓶培养工艺的10^1-2倍）。

经检测，疫苗质量控制的结果符合中国药典2005年版三部和中国生物制品规程2000年版要求。

将本实施例中的N型片状载体替换为M、W、Z、星型、五角形、正方形或菱形等多边形状，也能实现同样的技术效果，此处不再一一赘述。

尽管发明人已经对本发明的技术方案做了较为详细的阐述和列举，应当理解，对于本领域一个熟练的技术人员来说，对上述实施例作出修改和/或变通或者采用等同的替代方案是显然的，都不能脱离本发明精神的实质，本发明中出现的术语用于对本发明技术方案的阐述和理解，并不能构成对本发明的限制。

Claims (9)

1.一种培养动物细胞生产疫苗的方法，其包括以下步骤：

（1）用片状载体培养动物细胞；

（2）步骤（1）获得的动物细胞上接种病毒；

（3）继续培养动物细胞及病毒；

（4）收获病毒液，或/和反复冻融片状载体及感染细胞，然后将全部收液混合成病毒悬液，制成疫苗。

2.根据权利要求1所述的培养动物细胞生产疫苗的方法，其特征在于：所述的步骤(1）用片状载体培养细胞按以下方法进行：在经过灭菌和浸泡处理后的片状载体上接种动物细胞，在培养条件温度为37℃、pH值为 6.8～7.6及DO为 30～60%下培养细胞，片状载体上的细胞量达到1～3×10⁸cells/g。

3.根据权利要求2所述的培养动物细胞生产疫苗的方法，其特征在于：所述的片状载体上接种动物细胞，其接种量为0.5～2×10⁷cells/g。

4.根据权利要求1中所述的培养动物细胞生产疫苗的方法，其特征在于：所述的步骤（2）中，按病毒感染复数MOI为0.001-0.2的量接种病毒。

5.根据权利要求1中所述的培养动物细胞生产疫苗的方法，其特征在于：所述的步骤（3）的继续培养细胞及病毒的条件为：温度为30～37℃、pH 值为6.8～7.8、DO为30～60%，以及病毒繁殖所需要的营养条件。

6.根据权利要求1中所述的培养动物细胞生产疫苗的方法，其特征在于：所述的步骤（4）中，病毒液直接收获并于-20℃冻存；片状载体及感染细胞于-20℃下反复冻融2～3次，最终将病毒液和/或反复冻融收液混合成病毒悬液，制成疫苗。

7.根据权利要求1所述的培养动物细胞生产疫苗的方法，其特征在于：所述的培养动物细胞采用批式、流加、灌注或半连续的培养工艺。

8.根据权利要求1所述的培养动物细胞生产疫苗的方法，其特征在于：所述的动物细胞选自Marc-145细胞、MDCK细胞、ST细胞、BHK-21细胞或DF-1细胞。

9.根据权利要求1所述的培养动物细胞生产疫苗的方法，其特征在于：所述的培养动物细胞生产疫苗的方法是在生物反应器中进行的。