CN102038944B - 应用生物反应器工业化生产猪瘟活疫苗的方法 - Google Patents

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本发明涉及一种应用生物反应器工业化生产猪瘟活疫苗的方法，包括如下步骤：(1)将微载体和生物反应器经灭菌后，加入细胞生长液，接种制苗用细胞进行培养，待微载体上的细胞形成致密的单层，弃去细胞生长液，加入病毒维持液并接种猪瘟病毒，继续培养使病毒繁殖；(2)接毒后18h，连续收获病毒培养液于-15℃以下保存，合并病毒培养液加冻干保护剂制备猪瘟活疫苗。本发明具有工艺参数可控性好，细胞培养密度高，病毒滴度高，疫苗安全性好、质量稳定可靠，生产效率高等优点。

Description

应用生物反应器工业化生产猪瘟活疫苗的方法
技术领域
本发明涉及到兽用生物制品技术领域，具体涉及到一种应用生物反应器工业化生产猪瘟活疫苗的方法。
背景技术
猪瘟是由猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)引起的一种高度接触性传染病，它对全世界的养猪业构成巨大威胁。不同年龄、性别和品种的猪均能感染，死亡率高达80～90％。在我国，猪瘟流行呈现典型猪瘟和非典型猪瘟共存、持续感染与隐性感染共存、免疫耐受和带毒综合症共存等现象。猪瘟新的流行形式给我国养猪业提出了新的挑战，免疫接种仍是防制猪瘟的重要措施。
当前猪瘟活疫苗的生产主要采用传统的转瓶培养工艺。虽然该工艺已经使用数十年，且已成熟稳定，但转瓶培养技术至今仍存在培养细胞密度低、细胞碎片与杂蛋白多、培养病毒滴度低、产品质量不均一、不稳定以及生产效率低、成本高等缺陷，这与当前猪瘟活疫苗的大规模生产需要越来越不相适应。
专利公开号为CN 101492657A的专利申请，公开了猪瘟活疫苗ST细胞培养方法，生产工艺为转瓶培养。专利公开号为CN 101181637A的专利申请，公开了用细胞系生产猪瘟活疫苗的方法，其细胞系为ST、PK-15和IBRS-2细胞系，生产工艺为细胞培养瓶单层培养。专利公开号为CN101695571 A的专利申请，公开了一种利用生物反应器生产猪瘟活疫苗的方法及制品，其生物反应器为TideCell固定床微载体生物反应器。但是利用搅拌式生物反应器，采用逐级放大的倒罐式操作技术，进行细胞的高密度培养以制备疫苗，未见报道。
发明内容
本发明的目的为了克服猪瘟活疫苗现有生产工艺的缺陷，提供了一种应用生物反应器工业化生产猪瘟活疫苗的方法，其优点是设备占地面积小、生产规模大；培养速度快、生产效率高；生产机械化，易于自动控制；培养设备密闭，不易污染；副产物少，疫苗的副反应小；生产的病毒液效价高，与传统的转瓶工艺相比，收获的病毒液滴度增加了5～10倍，疫苗质量稳定。
本发明的技术方案为：
应用生物反应器工业化生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将微载体和生物反应器经灭菌后，加入细胞生长液，接种制苗用细胞进行培养，待微载体上的细胞形成致密的单层，弃去细胞生长液，加入病毒维持液并接种猪瘟病毒，继续培养使病毒繁殖；(2)接毒后18h，连续收获病毒培养液，合并病毒培养液加冻干保护剂制备猪瘟活疫苗。
病毒的接种量为培养体积的1～2％。
所述的生物反应器设定参数为：pH 6.5～7.8、温度33～37℃、溶氧30～80％、搅拌速度30～100rpm。考虑到细胞培养的最适条件，优选的pH7.0～7.4、细胞培养阶段温度设定37℃，病毒培养阶段温度设定35℃、溶氧50％、搅拌速度30～100rpm。
所述的微载体为Cytodex系列微载体，微载体的使用密度为2～25g/L。
所述的制苗用细胞为SK6细胞、ST细胞或PK-15细胞。
所述的细胞生长液为含体积浓度为8～10％小牛血清的DMEM或DMEM/F12，病毒维持液为含体积浓度为1～2％小牛血清的DMEM或DMEM/F12。
所述的生物反应器容积为14～150L，或，制苗用细胞经过14L～40L或14L～40L～150L逐级放大培养后，即通过胰酶将14L生物反应器培养的细胞消化下来，作为种子细胞接种到40L的生物反应器，再将40L生物反应器内培养的细胞消化下来作为种子细胞接种到150L生物反应器，如此形成生物反应器之间的逐级放大培养，从而避免了单纯的用转瓶培养种子细胞而容易造成污染和增加劳动强度的缺陷，于40L或150L生物反应器培养猪瘟病毒；或直接用14L、40L的生物反应器培养病毒。
所述生物反应器的培养采用批式、流加或灌注培养的方式，灌注的速率根据细胞的密度为每天0.5～5个工作体积。细胞接种病毒后，可以采用灌注的方式不断收获培养上清病毒液。
所述的生物反应器为搅拌式生物反应器。
本发明采用生物反应器微载体培养技术进行细胞的高密度培养，生产猪瘟活疫苗，与传统的转瓶生产工艺相比，自动化控制程度高，生产可实时监控；节省人力，降低成本；生产用地少，规模易于扩大；生产的病毒滴度高，批间差异小，产品质量稳定，副反应小。
附图说明
图1为本发明实施例1的工艺流程图。
图2为细胞生长曲线。
具体实施方式
以下是本发明一个具体的实施方案，以进一步的阐述本发明，但不能解释为限制本发明的范围。
实施例1
生物反应器：美国NBS公司14L和40L生物反应器；
微载体：Cytodex-1(通用电气医疗集团生命科学部)；
猪瘟病毒：猪瘟兔化弱毒株；
细胞生长液：含体积浓度为8％小牛血清的DMEM(北京清大天一生物技术有限公司)；
病毒维持液：含体积浓度为1％小牛血清的DMEM；(北京清大天一生物技术有限公司)；
细胞培养：分别在14L生物反应器内，按照10g/L的浓度加入Cytodex-1微载体，水化后，用pH 7.2的磷酸盐缓冲液PBS淘洗几遍，灭菌后加入细胞生长液平衡、接种SK6细胞进行培养。培养的方法参数为：pH 7.2、温度37℃、溶氧50％、搅拌速度30～100rpm；每天定时取样观察细胞生长情况，进行细胞计数，测定葡萄糖的消耗，当细胞的密度达到1.5×106/ml时，开始灌注，灌注的速度依据细胞的密度、葡萄糖的消耗以每天0.5～5个工作体积逐渐，以维持细胞的生长，培养4d，细胞的密度达到7×106/ml。
微载体培养的放大：待14L生物反应器细胞的密度达到7×106/ml，将长满细胞的微载体收集到特定密闭容器中，用含质量浓度为0.02％EDTA的PBS缓冲液清洗细胞两次，加入37℃预热的含质量浓度为0.02％EDTA、质量浓度为0.25％胰酶的胰酶消化液，消化8min，排出多余的胰酶溶液，加入细胞生长液，终止残余胰酶的消化，启动容器搅拌使其充分分散消化的细胞，然后将消化分散的细胞悬液接种到40L的生物反应器，按照上述的培养方法进行培养。
病毒繁殖：当40L生物反应器细胞的密度达到8×106/ml，弃去微载体培养灌中的细胞生长液，加入病毒维持液并接种猪瘟病毒；接毒后6h开始灌注培养，以维持病毒繁殖所必需的营养物质，18h后开始收获病毒液，可连续收获21d。测定病毒含量3×106RID/ml，将收获的病毒液置于2～8℃中，或保存在-15℃。
制备疫苗：将上述收获的病毒液合并，按病毒液与冻干保护剂的体积比为1∶1加入质量浓度为5％蔗糖脱脂乳冻干保护剂，冻干制备成冻干活疫苗。
实施例2
生物反应器：美国NBS公司14L和40L生物反应器；
微载体：Cytodex-1(通用电气医疗集团生命科学部)；
猪瘟病毒：猪瘟兔化弱毒株；
细胞生长液：含体积浓度为10％小牛血清的DMEM/F12(Hyclone)；
病毒维持液：含体积浓度为2％小牛血清的DMEM/F12(Hyclone)；
细胞培养：分别在14L生物反应器内，按照10g/L的浓度加入Cytodex-1微载体，水化后，用pH 7.2的磷酸盐缓冲液PBS淘洗几遍，灭菌后加入细胞生长液平衡、接种PK-15细胞进行培养。每天定时取样观察细胞生长情况，进行细胞计数，测定葡萄糖的消耗，当细胞的密度达到1.5×106/ml时，开始灌注，灌注的速度依据细胞的密度、葡萄糖的消耗以每天0.5～5个工作体积，以维持细胞的生长，培养4d，细胞的密度达到7×106/ml。
微载体培养的放大：待14L生物反应器细胞的密度达到7×106/ml，将长满细胞的微载体收集到特定密闭容器中，用含质量浓度为0.02％EDTA的PBS缓冲液清洗细胞两次，加入37℃预热的含质量浓度为0.02％EDTA、质量浓度为0.25％胰酶的胰酶消化液，消化10min，排出多余的胰酶溶液，加入细胞生长液，终止残余胰酶的消化，启动容器搅拌使其充分分散消化的细胞，然后将消化分散的细胞悬液接种到40L的生物反应器，按照上述的培养方法进行培养。
病毒繁殖：当40L生物反应器细胞的密度达到8×106/ml，弃去微载体培养灌中的细胞生长液，加入病毒维持液并接种猪瘟病毒；接毒后6h开始灌注培养，以维持病毒繁殖所必需的营养物质，18h后开始收获病毒液，可连续收获21d，测定病毒含量为3×106RID/ml，将收获的病毒液置于2～8℃中，或保存在-15℃。
制备疫苗：将上述收获的病毒液合并，按病毒液与冻干保护剂的体积比为1∶1加入质量浓度为5％蔗糖脱脂乳冻干保护剂，冻干制备成冻干活疫苗。

Claims (1)

1. 应用生物反应器工业化生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）将微载体和生物反应器经灭菌后，加入细胞生长液，接种制苗用细胞进行培养，待微载体上的细胞形成致密的单层，弃去细胞生长液，加入病毒维持液并接种猪瘟病毒，继续培养使病毒繁殖，其中，所述的微载体为Cytodex系列微载体，微载体的使用密度为2～25g/L；所述的生物反应器为搅拌式生物反应器，所述的生物反应器容积为14～150L，所述制苗用细胞经过14L～40L或14L～40L～150L逐级放大培养后，再将其置于40L或150L生物反应器中培养猪瘟病毒；所述猪瘟病毒的接种量为培养体积的1～2%；（2）接毒后18h，连续收获病毒培养液于-15℃以下保存，合并病毒培养液加冻干保护剂制备猪瘟活疫苗。
2、根据权利要求1所述的应用生物反应器工业化生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于：所述的生物反应器设定参数为：pH 6.5～7.8、温度33～37℃、溶氧30～80%、搅拌速度30～100rpm。
3、根据权利要求1或2所述的应用生物反应器工业化生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于：所述的制苗用细胞为SK6细胞、ST细胞或PK-15细胞。
4、根据权利要求3所述的应用生物反应器工业化生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于：所述的细胞生长液为含体积浓度为8～10%小牛血清的DMEM或DMEM/F12，病毒维持液为含体积浓度为1～2%小牛血清的DMEM或DMEM/F12。
5、根据权利要求3所述的应用生物反应器工业化生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于：所述生物反应器的培养采用批式、流加或灌注培养的方式，灌注的速率根据细胞的密度为每天0.5～5个工作体积。
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