CN102690791A - 应用生物反应器微载体培养st细胞生产猪伪狂犬病病毒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种应用生物反应器微载体培养ST细胞生产猪伪狂犬病病毒的方法，本发明的方法包括如下步骤：(1)选择ST细胞作为制苗用细胞系；(2)ST细胞的传代与培养；(3)猪伪狂犬病病毒细胞毒种的繁殖；(4)ST细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养；(5)猪伪狂犬病病毒液的繁殖；(6)收获病毒液的处理。本发明的优点是：细胞活力≥90％、活细胞密度≥1×10⁷cells/mL，病毒液TCID₅₀≥10^8.0。生产过程衔接紧密、顺畅，规模放大容易，生产周期短，占用场地小，环境污染少且易于处理，病毒液收获方便，质量易于实现均衡稳定，可显著降低生产成本、提高疫苗产量和质量。

Description

应用生物反应器微载体培养ST细胞生产猪伪狂犬病病毒的方法

优先权说明

本申请案要求2011年10月25日向中国国家知识产权局提出的申请号为201110327706.5的临时申请案的优先权，所述专利申请案的说明书以全文引用的方式并入本文中。

技术领域

本发明涉及一种病毒的培养方法，特别涉及一种应用生物反应器微载体培养ST细胞生产猪伪狂犬病病毒的方法，属于细胞工程技术领域。

背景技术

伪狂犬病(Pseudorabies,PR)又名奥叶兹基氏病(Aujeszky′s Disease,AD)是由疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科中的伪狂犬病毒(PRV或ADV)引起的一种或多种动物感染的急性传染病。伪狂犬病毒可引起猪、牛、羊、犬、猫、家兔、小白鼠、水貂、狐等多种家畜和野生动物发病，症状与狂犬病类似，其中对猪的危害最大，并且猪是唯一的自然宿主。

成年猪主要表现隐性感染，仔猪常表现发热、昏迷、神经症状，且具有高致死率。

猪以外的其它动物发病通常具有发热、奇痒及脑脊髓炎等症状，呈散发形式，均为致死感染。不同日龄的猪感染后其症状各异，成年猪仅表现增重减慢等轻微温和症状；种猪表现不育，公猪发生睾丸肿胀、萎缩等，种用性能降低或丧失；母猪则表现为返情、屡配不孕，妊娠母猪常表现流产、产死胎和木乃伊胎；仔猪常表现高热、食欲废绝、呼吸困难、流涎、呕吐、腹泻、震颤、神经症状，继而出现运动失调、间歇性抽搐、昏迷以至衰竭死亡。该病可进行水平传播和垂直传播，可从猪传到其它动物，也可由其它动物传染猪。本病现已成为对养猪业主要危害的传染病之一，每年给养猪业带来巨大的经济损失。

由于PRV目前尚无有效的药物治疗方法，因此，该病的预防免疫就显得更为重要。

体外培养的动物细胞有两种类型，一种是非贴壁性细胞，培养时不贴附于支持物上，而呈悬浮状态生长，胞体为圆形。来源于血液、淋巴组织的细胞，多数肿瘤细胞和部分转化细胞属于这一类型，其培养方式类似微生物培养方式;另一种是贴壁依赖性细胞，培养时能贴附在支持物表面生长。当细胞贴附在支持物上后，会迅速铺展，然后开始有丝分裂，进入对数生长期，数天后可长成致密的细胞单层。成纤维细胞、上皮细胞以及Vero细胞、BHK细胞、ST细胞等大多数动物细胞都属于此类型。目前我国生物制品生产上培养贴壁依赖性细胞如Veor、ST细胞等多采用传统转瓶培养或静置培养，该工艺因具有技术成熟投资量小的特点而被广泛应用，但其生产中细胞所能增殖的区域仅限于培养瓶的有限面积，培养的环境条件难以监测和控制，因此细胞密度低，而且劳动强度大，操作过程不易控制，发生污染，疫苗产量及质量受到极大限制。1967年，Van Wezal首次开发了微载体系统，创建了生物反应器微载体培养细胞工艺，使动物细胞培养进入高密度培养阶段。

微载体是直径为60-50μm的微珠。由于微载体本身所占体积和质量不大，但有很大的有效面积可供细胞附着，大大提高了生产效率。微载体最早使用的材料是离子交换凝胶(DEAE-SephadexA-50)，轻微搅动即可悬浮于培养基中。这种载体对细胞具有一定毒性，并且对培养液PH也有一定影响。后来根据细胞生长特点，对微载体进行了改良，使其带有电荷或其它介质，更利于细胞的附着和生长。目前微载体已有葡聚糖微载体、聚苯乙烯微载体、中空玻璃微载体、交联明胶微载体、纤维素微载体、聚苯烯酞胺微载体等多种不同制造材料类型。使用较多的是Cyotdex型系列微载体(Cytodex1，Cytodex2，Cytodex3)，它们都是带有不同基团的葡聚糖交联而成的大分子。Cytodex1整个载体带有正电荷，用于传代细胞如Vero、CHO细胞的培养；Cytodex2仅表面带有正电荷；Cytodex3不带电荷，其外表被胶原层包裹，胶原是豚鼠皮肤的提取物，同样适于细胞的附着生长。第一个工业化应用微载体的是1980年Meignier等用于口蹄疫病毒疫苗的制造，及后来的小儿麻痹疫苗的生产制造。

采用生物反应器/微载体系统培养动物细胞，细胞贴附于微载体上，悬浮于培养基中，逐渐分裂生长成单层细胞。该培养模式把单层培养和悬浮培养融合起来，具有以下优点:

(1)表面积/体积比大，单位体积培养细胞的产率高。如1mg Cytodex 1微载体表面积可达5-6cm²，较传统的单层细胞培养面积大大增加。

(2)改良后的微载体无毒性，其大小和表面性质更适宜细胞生长，而且具有一定的透明度，便于显微镜观察细胞生长情况。

(3)微载体悬浮于培养基中，细胞生长环境均一，简化了培养条件的监测和控制，同时培养基利用率高。

(4)采样重演性好，收获过程不复杂，劳动强度小，占用空间小，操作简便，所需人员少，工艺容易放大生产。

目前通过ST细胞静态培养增殖猪伪狂犬病病毒（PRV）病毒液，已被广泛应用，然而目前所用转瓶系统培养ST细胞生产疫苗的工艺，虽技术简单，但劳动强度大，即使简单的换液都需付出巨大的劳动，且染菌风险大。应用生物反应器系统和微载体培养贴壁细胞具有高比表面积、细胞产量高，悬浮培养系统便于监测、控制和取样，生产规模容易放大，不易染菌等优点，工业上被广泛应用于生产如狂犬病毒、脊髓灰质炎病毒等疫苗。为此,本发明利用生物反应器系统和微载体培养ST细胞生产PRV，并优化了培养过程中的各项参数，公开了一种可用于大规模工业化生产PRV的方法。

发明内容

本发明的目的之一在于，克服现有培养方法对猪伪狂犬病病毒液培养产量偏低、成本过高的不足，提供一种利用生物反应器微载体悬浮培养ST细胞高效生产猪伪狂犬病病毒的生产方法。该方法根据ST细胞生长代谢及病毒增殖的特点，对搅拌式生物反应器灌注培养技术应用于猪伪狂犬病病毒疫苗生产进行技术参数研究，通过调节灌注流量，不仅在细胞增殖时稳定培养环境，并在接种病毒后细胞仍能得到足够的营养和平衡的环境；同时乳酸和氨等有毒代谢产物得以不断排除，因此细胞维持时间长，有利于病毒的持续繁殖。

本发明的一种利用生物反应器微载体悬浮培养ST细胞高效生产猪伪狂犬病病毒的生产方法，具体的包括以下步骤：

（1）微载体的处理：按欲培养病毒液的终体积称取微载体适量，使微载体的终浓度为3mg/ml，放入搅拌瓶中，加入无Ca²⁺、Mg²⁺离子的PBS（磷酸缓冲液）溶液，室温浸泡过夜或在37℃下作用3hr，弃去PBS溶液，再用无Ca²⁺、Mg²⁺离子的PBS溶液洗一次，弃去，最后加入无Ca²⁺、Mg²⁺离子的PBS溶液，高压灭菌，弃去搅拌瓶中的PBS，加入DMEM（高糖）细胞生长液，室温过夜，临用前再用上述生长液洗一次；

（2）ST细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养：按生物反应器总体积的50-70%加入无菌的细胞培养液，且每升无菌细胞培养液中按5-7g/L的浓度加入步骤（1）处理得到的微载体，启动生物反应器，转速为40rpm，搅拌30min；取生长良好的致密单层ST细胞，用EDTA-胰酶细胞消化液制备细胞悬液，细胞计数后按1×10⁵个/ml的密度接种到生物反应器中，调整转速为80rpm搅拌1-3分钟，再将转速调整为50-60rpm，反应器温度逐步调整至37℃，搅拌至微载体上的细胞长满80-90%，空球率低于5%，满球率大于85%，培养细胞处于对数生长期，且细胞计数达到1×10⁷cells/mL以上；

（3）细胞毒种的繁殖：将猪伪狂犬病病毒毒种按1-5%（V/V）比例接种到生长良好的致密单层ST细胞中，细胞70-100%病变时收获猪伪狂犬病病毒液；

（4）制苗毒液的繁殖：当微载体上的ST细胞长满80-90%，空球率低于5%，满球率大于85%，培养细胞处于对数生长期，且细胞计数达到1×10⁷cells/mL以上时，将罐体温度调整为35℃，用正压排出罐中液体，加入PBS洗涤细胞，50-60rpm搅拌10分钟后排出罐中液体，重复洗涤2次；将步骤（3）中获得的猪伪狂犬病病毒液以感染复数为0.01MOI直接感染ST细胞，并用小牛血清维持液补足至工作体积，维持罐体温度为35℃，转速为50-60rpm，继续搅拌；

（5）收获病毒液的处理：接毒后每隔一定时间取生物反应器中的微载体，用显微镜观察细胞病变情况，并检测样品TCID50；当微载体上的细胞全部脱落，且DO值（溶解氧（dissolved oxygen,DO））呈明显上升趋势，停止反应器搅拌，待微载体全部沉到反应器底部后，收获病毒液和微载体；病毒液和微载体经3次冻融后，离心去除细胞碎片，置-20℃保存备用。

在本发明的一个具体实施例中，所述的微载体为Cytodex-1。

在本发明的一个具体实施例中，所述的搅拌瓶使用前经过硅化处理。

在本发明的一个具体实施例中，ST细胞在生物反应器的微载体中悬浮培养时控制PH为7.0，接种病毒后控制PH为7.2，PH波动为±0.1。

在本发明的一个具体实施例中，ST细胞培养初期使用压缩空气调节溶氧值，控制溶氧为60%，溶氧波动为±10%；培养中后期，当细胞密度大于10⁷cells/mL时，使用氧气和氮气调节溶氧值，控制溶氧为50%，溶氧波动范围为30%-80%。

在本发明的一个具体实施例中，所述的细胞培养液为含有质量分数为6%小牛血清的DMEM培养基，所述的维持液为含有质量分数为1%小牛血清的DMEM培养基。

本发明的目的之二在于提供由所述的方法制备得到的猪伪狂犬病病毒液。

本发明的目的之三在于公开了有本发明方法所制备得到的猪伪狂犬病病毒液在制备预防猪伪狂犬病疫苗药物中的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

（1）搅拌速度对细胞贴壁的影响

搅拌速度设定为50prm、100prm、150prm，接种细胞后，对细胞贴壁情况进行监测，取样进行细胞计数，结果显示，搅拌速度对细胞贴壁影响很大，低转速有利于细胞贴壁，当搅拌速度达150prm左右时，细胞几乎不贴壁。

（2）ST细胞批式培养和灌注培养比较

以细胞浓度为1×10⁵/mL反应器，分别用批式培养法和灌注培养法培养，每天取样测微载体上细胞数，结果显示灌注培养的细胞密度明显高于批式培养。

（3）灌注法细胞培养及细胞接种浓度

分别用1×10⁴/mL、1×10⁵/mL和1×10⁶/mL的细胞浓度接种反应器，观察发现细胞在接种6小时后，90%细胞贴附上微载体，并开始伸展;24小时内生长缓慢;第二天后细胞生长速度增快。随着细胞增殖速度增加，灌注量也随之调节增加，在我们实验灌注培养的条件下，细胞的形态一直保持较好。1×10⁵/mL接种浓度的第7天细胞密度达1×10⁷/mL，细胞状态稳定，维持时间长，利于病毒繁殖;而接种浓度为1×10⁴/mL的培养12天细胞密度才能达到高峰;接种1×10⁶/mL浓度的培养3天细胞密度即达高峰，但细胞老化快，部分提前脱落，不利于病毒生产。

（4）病毒感染复数对毒力的影响

以1×10⁵/mL细胞密度接种反应器，于第7天细胞密度达1×10⁷/mL左右时接种病毒，接种前洗涤2-3次后换用维持液。病毒感染复数分别为0.01MOI和0.05MOI，取样测定毒力发现，毒力高峰出现在3-7天，以后逐渐下降。两种感染复数的毒力差别不显著，0.01MOI的毒力整体水平略高于0.05MOI，且毒力高峰较早于后者。

（5）灌注培养葡萄糖消耗

在培养过程中每天监测葡萄糖含量，发现接种细胞后的前3天，葡萄糖消耗量较低，随着培养时间的增长，细胞增殖速度加快，细胞数量增多，葡萄糖日消耗量也增大，到第6、7天当细胞密度达1×10⁷/mL左右时，葡萄糖消耗量达到高峰。病毒感染细胞后，葡萄糖消耗量在感染后的2天内逐步降低，以后基本维持平衡，直至感染十几天后，消耗量才以较快速度降低。

（6）灌注培养乳酸的产生

在培养过程中通过对乳酸产生量的监测发现，乳酸产生量随细胞数量的增加而增加。接种细胞后的1-3天，乳酸生成量较小，PH值相对稳定。细胞进入生长对数期后，乳酸产生量加大，PH值下降较快，反应罐系统补充较多的碱，至第七天左右产生量达到高峰。感染病毒后，乳酸产生量在一定水平范围内降低，但仍维持在30mmoL/天左右。

（7）灌注培养氨的产生

在培养过程中，随着细胞的生长代谢，氨会不断产生。在细胞增殖期间，产氨量逐步缓慢增加，感染病毒后氨的产生量仍保持相对稳定，在2.2mmoL/天左右波动。

本发明方法的优点在于：培养得到的细胞活力≥90％、活细胞密度≥1×10⁷cells/mL，猪伪狂犬病病毒TCID50≥10⁸。生产过程衔接紧密、顺畅，规模放大容易，生产周期短，占用场地小，环境污染少且易于处理，猪伪狂犬病病毒的收获方便质量易于实现均衡稳定，可显著降低生产成本、提高疫苗产量和质量。

附图说明

图1生物反应器微载体培养ST细胞生产猪伪狂犬病病毒液的工艺流程图

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实验材料：

1.细胞:ST细胞（购自中监所）

2.毒种：猪伪狂犬病病毒PRV（H）株，分类命名：猪伪狂犬病毒；保存编号为：CGMCC No.5013，保藏时间：2011年6月29日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

3.微载体:Cytodex-1，Pharmacia公司产品；生物反应器：WAVE^TM生物反应器（SYSTEM20/50+KIT50），GE Healthcare公司产品。

实施例1：微载体的处理

1.硅化:取数ml硅油，将搅拌瓶内壁浸湿，回收多余的硅油，烘干搅拌瓶后，用自来水洗九次，双蒸水洗三次，烘干备用。

2.水化:按培养的终体积称取微载体适量，使微载体Cytodex1的终浓度为3mg/ml，放入搅拌瓶中，用无Ca²⁺、Mg²⁺-PBS 100ml/g（即每克微载体对应加入无Ca²⁺、Mg²⁺-PBS 100ml。），室温浸泡过夜，或37℃3hr，弃去PBS，再用无Ca²⁺、Mg²⁺-PBS50ml/g洗一次，弃去，最后加入无Ca²⁺、Mg²⁺-PBS 50ml/g，高压灭菌，115℃，10psi，15min。

3.平衡:弃去搅拌瓶中的PBS，加入DMEM（高糖）细胞生长液（购自Gibco公司。）100ml/g，室温过夜，临用前再用上述培养液洗一次，30ml/g。

实施例2：生物反应器微载体培养ST细胞

1、细胞复苏：从液氮罐中取出冻存管，迅速放入盛有36℃-37℃水中，摇动冻存管，尽快解冻；用吸管吸出细胞悬液，装入无菌离心管中，补加10mL细胞培养液（6%小牛血清的DMEM培养液），吹打使细胞悬浮;将细胞悬液离心，1000rpm离心10分钟，弃上清;加入细胞培养液适当稀释后，移入细胞培养瓶中，置37℃培养箱培养，6小时后更换细胞培养液一次，再继续培养。

2、细胞的传代与培养：取生长良好的致密单层ST细胞，吸出细胞培养液，用PBS洗涤1-2次;再加入质量分数为0.25%的胰酶消化液适量，37℃消化5分钟，待细胞层松散、细胞圆缩时，吸出细胞消化液，加入少量细胞培养液吹打细胞，制成均匀细胞悬液，将适量细胞悬液移入灭菌细胞瓶，每瓶补加适量细胞培养液，置37℃恒温培养，形成良好细胞单层时，用于继续传代或接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养。

3、细胞毒种的繁殖：用小牛血清维持液（1%小牛血清的DMEM培养液）将猪伪狂犬病病毒毒种按3%（V/V）比例接种到步骤2形成的细胞单层培养，细胞80%病变时收获病毒液；再将此病毒液作为种毒，在细胞上继续进行传代复壮，作为生产种子。

4、ST细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养：生物反应器按总体积的50-70%加入无菌细胞培养液（6%小牛血清的DMEM培养液），且每升无菌细胞生长液中按6g/L浓度加入微载体，启动生物反应器，40rpm搅拌30min后。取步骤2中的ST细胞，用EDTA-胰酶细胞消化液制备细胞悬液，细胞计数后按1×10⁵个/ml的密度接种到生物反应器中，调整转速为80rpm搅拌1-3分钟，再将转速调整为50-60rpm，反应器温度逐步调整至37℃。

5、制苗毒液的繁殖：当微载体上的细胞长满80-90%，空球率低于5%，满球率大于85%，培养细胞处于对数生长期，且细胞计数达到1×10⁷cells/mL以上时，将罐体温度调整为35℃，用正压排出罐中液体，加入2L PBS洗涤细胞，搅拌10分钟后排出，重复洗涤2次。再用蠕动泵加入适量毒种，将步骤3中获得的猪伪狂犬病病毒液以感染复数为0.01MOI直接感染ST细胞，并用小牛血清维持液补足至工作体积，维持罐体温度为35℃，转速为60rpm，继续搅拌。接毒后每隔一定时间取生物反应器中的微载体，用显微镜观察细胞病变情况，并检测样品TCID50；当为载体上的细胞全部脱落，且DO值呈明显上升趋势，停止反应器搅拌，待微载体全部沉到反应器底部后，收获病毒液和微载体。

6、收获病毒液的处理：病毒液和微载体经3次冻融后，离心去除细胞碎片，置-20℃保存备用。

上述方案中，反应器参数调节：

1）搅拌速度:培养初期使用40rpm，培养后视微载体上ST细胞生长情况及微载体悬浮情况逐步增大搅拌速度至50-60rpm，最大搅拌速度不超过80rpm。

2)温度:ST细胞增殖培养时控制温度设定为37℃，接种PRV后控制温度设定为35℃。

3)PH值：ST细胞增殖培养时控制PH设定为7.0，接种病毒液后控制PH设定为7.4。PH波动为±0.1。

4)溶氧：ST细胞培养初期使用压缩空气调节溶氧值，控制溶氧设定为60%。溶氧波动为±10%；培养中后期，当细胞密度大于10⁶cells/mL时，使用氧气和氮气调节溶氧值，控制溶氧设定为50%。溶氧波动范围为30%-80%。

5）灌流量:每天取样测定罐体收集液的葡萄糖浓度，以葡萄糖残余浓度为参考调整液体的灌流量。

实施例3病毒活性的测定

利用TCID50方法进行病毒活性测定。病毒TCID50测定时，以MEM培养液将培养得到的猪伪狂犬病毒液作连续10倍稀释，即10^-1、10^-2……10^-8，每个稀释度取100μL加入96孔细胞培养板的孔中，随后加入经胰蛋白酶-EDTA消化分散的ST细胞悬液，每孔100μL（细胞含量以3×10⁵/mL左右为宜），每个稀释度作8个重复，并设正常细胞培养对照，置5%CO2培养箱中，37℃培养，逐日观察细胞病变和对照，共观察2～4日，并记录细胞病变的孔数，按照Reed-Muench法计算病毒的TCID50；同时以相同的方法对用转瓶培养的猪伪狂犬病毒液进行TCID50测定。以此作为对照组。结果表明，利用微载体培养的猪伪狂犬病毒液其TCID50≥10⁸，利用转瓶培养的猪伪狂犬病毒，即对照组的TCID50不大于10⁸。由此可见，利用本方法培养的病毒，能保持其原有的活性。

实施例4：猪伪狂犬病病毒病灭活苗的制备

1、收获病毒液毒价测定：将以上收获的细胞病毒液混合后取样，测定毒价。猪伪狂犬病病毒TCID50≥10⁸。

2、灭活：按病毒液总量的0.2%（v/v）向病毒液中加入甲醛溶液，充分振荡后，于37℃、100r/min摇床上灭活36h，然后加入1%硫代硫酸钠溶液，终止灭活。并作无菌检验及灭活检验。

3、油佐剂灭活疫苗的配制：按照注射用白油94份、司本-806份和硬脂酸铝1.5份的比例配制油相；按照96ml抗原加入4ml吐温-80及0.01%加入硫柳汞的比例配制水相；水相和油相按照1∶1.5比例进行乳化，制成油包水单相苗。

4、猪伪狂犬病油乳剂灭活疫苗的安全性与免疫性试验：用本方法制备病毒抗原液，毒价不低于IO⁸TCID50／ml，经0.2%浓度的甲醛溶液灭活后与油相佐剂乳化研制成油乳剂灭活苗3批，并对该制品的安全性、免疫性进行了测定。3批疫苗的安全性和免疫性测定均得到良好的结果。安全性试验：对18g左右小白鼠10只，接种0.3ml/只，观察14天；初生仔猪、断奶仔猪及妊娠母猪加倍剂量注射，观察14天，均未出现不良反应，安全性良好，对母猪的繁殖性能不产生影响。免疫性试验：后备母猪及妊娠母猪血清中和抗体指数于免疫后21d达到316以上，间隔35d加强免疫一次后，中和抗体指数可达1000以上。断奶仔猪及初生仔猪免疫后对强毒的攻击，保护率分别为100％及92．62％。

Claims (9)

1.一种利用生物反应器微载体培养ST细胞生产猪伪狂犬病病毒的方法，其特征在于：以生物反应器微载体培养的ST细胞作为猪伪狂犬病病毒的生产细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：具体的包括以下步骤：

（1）微载体的处理：按欲培养病毒液的终体积称取微载体适量，使微载体的终浓度为3mg/ml，放入搅拌瓶中，加入无Ca²⁺、Mg²⁺离子的PBS溶液，室温浸泡过夜或在37℃下作用3hr，弃去PBS溶液，再用无Ca²⁺、Mg²⁺离子的PBS溶液洗一次，弃去，最后加入无Ca²⁺、Mg²⁺离子的PBS溶液，高压灭菌，弃去搅拌瓶中的PBS，加入DMEM高糖细胞生长液，室温过夜，临用前再用上述生长液洗一次；

（2）ST细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养：按生物反应器总体积的50-70%加入无菌的细胞培养液，且每升无菌细胞培养液中按5-7g/L的浓度加入步骤（1）处理得到的微载体，启动生物反应器，转速为40rpm，搅拌30min；取生长良好的致密单层ST细胞，用EDTA-胰酶细胞消化液制备细胞悬液，细胞计数后按1×10⁵个/ml的密度接种到生物反应器中，调整转速为80rpm搅拌1-3分钟，再将转速调整为50-60rpm，反应器温度逐步调整至37℃，搅拌微载体上的细胞长满80-90%，空球率低于5%，满球率大于85%，培养细胞处于对数生长期，且细胞计数达到1×10⁷cells/mL以上；

（3）细胞毒种的繁殖：将猪伪狂犬病病毒毒种按1-5%（V/V）比例接种到生长良好的致密单层ST细胞中，细胞70-100%病变时收获猪伪狂犬病病毒液；

（4）制苗毒液的繁殖：当微载体上的ST细胞长满80-90%，空球率低于5%，满球率大于85%，培养细胞处于对数生长期，且细胞计数达到1×10⁷cells/mL以上时，将罐体温度调整为35℃，用正压排出罐中液体，加入PBS洗涤细胞，50-60rpm搅拌10分钟后排出罐中液体，重复洗涤2次；将步骤（3）中获得的猪伪狂犬病病毒液以感染复数为0.01MOI直接感染ST细胞，并用小牛血清维持液补足至工作体积，维持罐体温度为35℃，转速为50-60rpm，继续搅拌；

（5）收获病毒液的处理：接毒后每隔一定时间取生物反应器中的微载体，用显微镜观察细胞病变情况，并检测样品TCID50；当微载体上的细胞全部脱落，且DO值呈明显上升趋势，停止反应器搅拌，待微载体全部沉到反应器底部后，收获病毒液和微载体；病毒液和微载体经3次冻融后，离心去除细胞碎片，置-20℃保存备用。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的微载体为Cytodex-1。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的搅拌瓶使用前经过硅化处理。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于：ST细胞在生物反应器的微载体中悬浮培养时控制PH为7.0，接种病毒后控制PH为7.2，PH波动为±0.1。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于：ST细胞培养初期使用压缩空气调节溶氧值，控制溶氧为60%，溶氧波动为±10%；培养中后期，当细胞密度大于10⁷cells/mL时，使用氧气和氮气调节溶氧值，控制溶氧为50%，溶氧波动范围为30%-80%。

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的细胞培养液为含有质量分数为6%小牛血清的DMEM培养基，所述的维持液为含有质量分数为1%小牛血清的DMEM培养基。

8.由权利要求1-7任一项所述的方法制备得到的猪伪狂犬病病毒液。

9.权利要求8所述的猪伪狂犬病病毒液在制备预防猪伪狂犬病疫苗药物中的应用。

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