CN102100910B

CN102100910B - 一种生产病毒疫苗的方法

Info

Publication number: CN102100910B
Application number: CN2009102434150A
Authority: CN
Inventors: 张韧; 陈文庆; 王建超; 刘俊生
Original assignee: Beijing Skywing Technology Co Ltd
Current assignee: Merck Millipore Beijing Skywing Co ltd
Priority date: 2009-12-21
Filing date: 2009-12-21
Publication date: 2013-01-23
Anticipated expiration: 2029-12-21
Also published as: CN102100910A

Abstract

本发明提供了一种生产病毒疫苗的方法，其包括以下步骤：1)将用于生产病毒的细胞接种在装有

Disks载体的

Description

一种生产病毒疫苗的方法

技术领域

本发明涉及一种生产病毒疫苗的方法，特别是涉及利用

生物反应器和

Disks载体大规模生产病毒疫苗的方法。

背景技术

通常，通过大规模培养动物细胞作为宿主细胞来生产病毒疫苗。目前，用以大规模培养动物细胞的培养体系有两种，生物反应器和微载体，通常结合这两种体系进行宿主细胞培养，较常使用的是搅拌式生物反应器与球形微载体的结合。虽然搅拌式生物反应器与球形微载体结合的培养工艺具有可对培养过程与质量进行监控、生产工艺稳定、易于进行规模的扩大、可减少污染发生、易于控制产品批间质量、提高细胞培养密度的优点，但是，由于这两种体系自身的局限性，这种培养工艺存在着如下缺点：搅拌式反应器易对细胞产生剪切力从而影响细胞吸附效率最终影响细胞得率，反应器罐体的清洗、消毒费时费力，球状微载体利用次数少，耗费生产成本等。

专利文献1(专利号ZL 021120137)虽然提出了利用

Disks作为载体进行大规模连续生产病毒疫苗的方法，但是其中使用的生物反应器为固定床篮式搅拌系统的生物反应器，与传统的生物反应器一样，具有剪切力大因而影响细胞得率，反应器罐体清洗、消毒费时费力因而生产成本高，容易批间污染等缺点，并且该专利认为固定床篮式搅拌系统为唯一可使用聚酯切片载体的细胞培养系统。

生物反应器和

Disks载体是有别于传统的搅拌式生物反应器和球状微载体的新型细胞培养体系，现还没有将这两种培养体系结合起来用于大规模病毒疫苗生产的报道。

发明内容

鉴于现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于提供一种联合使用

生物反应器与

Disks载体进行动物细胞大规模培养以生产病毒疫苗的方法，解决现有生物反应器微载体培养体系中存在的对细胞产生的剪切力大的问题，提高细胞得率。另外，还可以解决反应器罐体清洗消毒费时费力，生产效率低，容易产生细胞污染等问题。

为了解决上述技术问题，本发明的发明人等进行了深入研究，从而提供了以下技术方案：

1.一种生产病毒疫苗的方法，其包括以下步骤：

1)将用于生产病毒的细胞接种在装有FibraCel Disks载体的WAVE生物反应器中，进行细胞培养；

2)收获病毒，制成疫苗。

2.根据技术方案1所述的生产病毒疫苗的方法，其特征在于，在培养所述用于生产病毒的细胞的步骤1)之后，进一步包括接种并增殖待生产的病毒的步骤。

3.根据技术方案1或2所述的生产病毒疫苗的方法，其特征在于，细胞培养时的培养体积为50mL～500L，培养体积为生物反应器最大工作体积的20-80％，所述载体的用量为10g/L～40g/L。

4.根据技术方案1或2所述的生产病毒疫苗的方法，其特征在于，培养细胞时，所述生物反应器的摇动角度为3-10°，摇动频率为6-30rpm。

5.根据技术方案1或2所述的生产病毒疫苗的方法，其特征在于，所述病毒疫苗是人用狂犬病疫苗、脊髓灰质炎疫苗、肾综合征出血热疫苗、乙型脑炎疫苗、甲型肝炎疫苗、兽用狂犬病疫苗、小反刍兽疫疫苗、口蹄疫病毒疫苗、猪蓝耳病疫苗、猪瘟疫苗、乙型肝炎疫苗、风疹减毒活疫苗或水痘减毒活疫苗。

6.根据技术方案1或2所述的生产病毒疫苗的方法，其特征在于，所述用于生产病毒的细胞是Vero细胞、Marc145细胞、CHO细胞、PK15细胞、ST细胞、2BS细胞、KMB-17、MRC-5细胞或BHK21细胞。

7.根据技术方案6所述的生产病毒疫苗的方法，其特征在于，所述用于生产病毒的细胞是CHO细胞或Vero细胞。

8.根据技术方案2所述的生产病毒疫苗的方法，其特征在于，所述细胞培养4-8天后，接种病毒。

9.根据技术方案2所述的生产病毒疫苗的方法，其特征在于，病毒增殖阶段的培养温度为32-35℃，pH值为7.2-7.8。

10.根据技术方案1或2所述的生产病毒疫苗的方法，其特征在于，在细胞培养中，起始培养阶段即细胞粘附期的摇动频率和摇动角度大于维持培养阶段即细胞生长阶段的摇动频率和摇动角度。

11.一种细胞培养体系，其用于技术方案1或2所述的方法，该细胞培养体系包括FibraCel Disks载体和WAVE生物反应器。

本发明具有以下的有益效果：

通过本发明的联合使用

生物反应器与

Disks载体培养细胞来生产病毒疫苗的方法，可以减小剪切力对细胞培养的影响，细胞得率高。另外，无需进行罐体的灭菌和消毒从而可以节省生产成本并提高生产效率，降低细胞培养的污染风险。另外，本发明还具有以下的有益效果：可以为细胞提供较好的营养物质与氧气的供给，培养的细胞密度高、可连续收获且产量高，同时，由于

生物反应器具有规模不同的系列产品，因而生产规模与生产产物可灵活更换。

具体实施方式

本发明的一个实施方式提供了生产病毒疫苗的方法，其包括以下步骤：

1)将用于生产病毒的细胞接种在装有

Disks载体的

生物反应器中，进行细胞培养；

2)收获病毒，制成疫苗。

上述方法中，根据要生产的病毒的类型及选用的细胞的类型不同，有时在培养所述用于生产病毒的细胞的步骤1)之后，进一步包括接种并增殖待生产的病毒的步骤。

即，本发明的方法中，如上所述可以包括细胞培养阶段、病毒增殖阶段和病毒收获阶段。

本发明的方法中，Disks载体可以在装入反应器之前进行平衡。所述平衡可以按照本领域通常方式来适当进行，本发明中例如可以如下进行平衡：用含10体积％CO₂的空气将装有已灭菌

Disks载体的细胞袋充气充满，加入细胞培养基使细胞培养基的体积约为最终体积的50％，夹住入口滤器和出口滤器，轻微摇动细胞袋约1-2小时，以平衡温度和pH值。

本发明中，可以在培养用于生产病毒的细胞前，进行放大培养所述细胞来制备所述细胞的细胞悬液的步骤，所述放大培养可以通过转瓶培养来进行。

本发明的方法中，收获病毒后，可以进行进一步纯化和加工，来制成疫苗。

本发明中所说的Disks载体是由New Brunswick Scientific公司生产的。该载体由聚酯非纺织纤维和聚丙烯构成，同时经过了静电处理从而使悬浮细胞易于粘附到载体上并固定在纤维体系中。

Disks载体具有更高量的营养物质与氧气的转移，同时不易受剪切力和气泡的影响。

本发明中所说的

生物反应器是由GE生命科学部生产的。

采用

生物反应器的优点如下：

生物反应器温和的波浪形设计可以提供良好的供氧与混合，同时减少气泡的出现，并且这种运动方式产生的剪切力远远小于传统罐体中所产生的剪切力。该生物反应器配备特制的一次性的无菌消毒的生物反应器细胞袋(cellbag)来使用，所述细胞袋具有气体进出口(具备通气滤膜)、注射器取样口、溶氧探头插入口和补料/收获端口。

生物反应器通过使用一次性的细胞袋培养系统代替传统发酵罐的不锈钢罐体，不需进行罐体的灭菌和消毒，提高了生产效率，并且显著降低了细胞培养时批间污染的风险。

生物反应器具有规模不同的系列产品，结合

Disks载体，同一设备在一定范围内更换配套的细胞袋即可培养不同性质和不同规模的细胞，生产规模与生产产物可灵活更换。另外，

生物反应器还具有完整的温度控制、通气泵以及摇床控制器，同时可以配备不同摇床主机单元，以及附加的重量控制器、溶氧控制器或pH控制器等。

本发明的另一个实施方式提供一种用于上述本发明的生产病毒疫苗的方法的细胞培养体系，该体系包括Disks载体和生物反应器。

本发明的培养体系，由于使用

Disks载体和

生物反应器，因此组装运转时间比传统的反应器微载体培养体系短，同时投资及运转的成本要低，并无需进行罐体的灭菌和消毒，节省了时间成本和生产成本，提高了生产效率。

能够用于本发明的生产病毒疫苗的方法的、或能够利用本发明的细胞培养体系培养的宿主细胞可以为疫苗生产最常用的贴壁生长细胞或兼性贴壁细胞，例如哺乳动物传代细胞，如非洲绿猴肾细胞的传代细胞系Vero细胞、幼仔地鼠肾的传代细胞系BHK21细胞、猴肾细胞的传代细胞系Marc145细胞、中华仓鼠卵巢细胞的传代细胞系CHO细胞、猪肾细胞的传代细胞系PK15细胞或猪睾丸细胞的传代细胞系ST细胞等；例如人二倍体细胞，如2BS细胞、KMB-17、MRC-5细胞等。

能够以利用本发明的生产病毒疫苗的方法或本发明的细胞培养体系大规模培养的细胞作为宿主细胞的病毒，均可利用本发明的细胞培养体系来生产。例如可用Vero细胞生产的人用狂犬病纯化疫苗、脊髓灰质炎灭活纯化疫苗、肾综合征出血热纯化疫苗、乙型脑炎纯化疫苗、甲型肝炎疫苗，以及兽用狂犬疫苗和小反刍兽疫疫苗等，可用BHK21细胞生产的口蹄疫病毒疫苗、狂犬疫苗，可用Marc145细胞生产的猪蓝耳病疫苗，可用PK细胞或ST细胞生产的猪瘟疫苗，可用CHO细胞生产的乙肝疫苗，如分别使用2BS、KMB-17、MRC-5细胞作为宿主细胞的甲型肝炎疫苗、脊髓灰质炎疫苗、风疹减毒活疫苗、水痘减毒活疫苗等。

本发明的生产病毒疫苗的方法和细胞培养体系中，细胞培养、病毒增殖和病毒收获的步骤可采用批培养、流加培养和灌注培养方式来进行，优选在病毒收获步骤中采用灌注培养方式。

灌注培养是指在细胞培养过程中，往生物反应器中不断地添加新鲜培养基，同时通过细胞截留装置排出培养上清，而活细胞被继续截留在生物反应器中的一种培养操作方式。采用灌注培养的优点是：连续灌注的培养基可以提供充分的营养成分，并可带走代谢产物，同时，细胞保留在反应器系统中，可以达到很高的细胞密度。

本发明中，采用灌注培养时，起始灌注培养时，灌注速率为每天0.5-1个培养体积，随着细胞密度的增加，增加至灌注速率为每天1-3个培养体积。具体增加速率可以根据本领域技术常识依照具体情况如细胞密度等而定，例如可每天逐步按恒定速率如0.5体积或1体积增加，也可每天增加速率不一致。

本发明的生产病毒疫苗的方法和细胞培养体系中，起始细胞接种密度优选为2×10⁵-5×10⁵细胞数/mL。需要接种病毒时，可以在当细胞在反应器中培养约4-8天，优选约5-6天时来进行病毒接种。

本发明的生产病毒疫苗的方法和细胞培养体系中，细胞培养时的培养体积可以根据所使用的WAVE生物反应器系统类型和该生物反应器所用的细胞袋类型来确定，该培养体积可以是50mL～500L。优选培养体积为生物反应器最大工作体积(即所用细胞袋的最大工作体积)的20-80％，优选为25～75％，更优选为30～70％。

本发明所使用的载体的用量为10g/L～40g/L，优选为15g/L～35g/L。

本发明中，通过选用上述培养体积和载体用量，可以在其他生长条件一定时提供最佳细胞吸附率，提供最佳细胞生长表面积，从而得到最大细胞产量。

本发明中，在细胞培养时，反应器的摇动角度优选为3-10°，更优选为5-8°；摇动频率优选为6-30rpm，更优选为8-28rpm。

通过选用上述摇动角度和摇动频率，可以达到载体和细胞的最佳混合效果，以获得很大细胞吸附率和细胞生长率，并最终得到很大的细胞产量。

载体培养细胞时，通常分为三个阶段：1)细胞吸附、贴壁到载体上(attachment)；2)细胞在载体上铺开(spreading)；3)细胞在载体上生长(growth)。

本发明中，在上述各阶段中，在本发明的摇动频率和摇动角度的范围内，可以采用不同的摇动频率和摇动角度来混合载体和细胞。例如，在起始培养阶段即细胞粘附期(即前述的第一阶段，也可包括第二阶段)，使用较大的摇动频率和摇动角度(依照接种细胞密度和细胞袋大小而定)，直至培养基不再浑浊，通常认为此时细胞都已吸附到载体中，即进入了维持培养阶段即细胞生长阶段(即前述的第三阶段)，该阶段减小反应器的摇动频率和摇动角度。即，本发明的细胞培养中，优选起始培养阶段即细胞粘附期的摇动频率和摇动角度大于维持培养阶段即细胞生长阶段，具体来说，优选的是在本发明的摇动频率和摇动角度的范围内，起始培养阶段即细胞粘附期的摇动角度比维持培养阶段即细胞生长阶段大1-3°，优选起始培养阶段即细胞粘附期的摇动频率比维持培养阶段即细胞生长阶段大1-5rpm。

通过起始培养阶段即细胞粘附期的摇动频率和摇动角度大于维持培养阶段即细胞生长阶段，可以获得更大的细胞吸附率和细胞生长率，并最终得到更大的细胞产量。

本发明中，根据要生产的病毒的类型及选用的细胞的类型不同，有时在培养所述用于生产病毒的细胞的步骤1)之后，进一步包括接种并增殖待生产的病毒的步骤，即病毒增殖阶段。在病毒增殖阶段，优选采用持续混合的方式，该阶段的培养条件优选是比细胞培养阶段更温和的温度和pH值条件，即，与细胞培养阶段相比，病毒增殖阶段的培养温度更低，pH值更接近碱性。具体来说，本发明的病毒增殖阶段和细胞培养阶段例可以采用如下的条件范围：

细胞培养阶段：36-38℃的温度，7.0-7.4的pH值，溶氧20％-80％

病毒增殖阶段：32-35℃的温度，7.2-7.8的pH值，溶氧20％-80％

在病毒增殖阶段和细胞培养阶段，生物反应器的摇动角度和摇动频率可以是相同的。病毒增殖阶段与病毒收获阶段的培养条件可以是相同的。

相对于现有技术而言，本发明具有如下有益效果：

1.WAVE生物反应器温和的波浪形设计可以提供良好的供氧与混合，同时减少气泡的出现，并且这种运动方式产生的剪切力远远小于传统罐体中所产生的剪切力。而

Disks载体具有更高量的营养物质与氧气的转移，同时不易受剪切力和气泡的影响。所以本发明的培养体系可提供较好的营养物质与氧气的供给，同时最大限度上减少了剪切力和气泡对细胞培养的影响。

2.WAVE生物反应器使用一次性的细胞袋培养系统代替传统发酵罐的不锈钢罐体，显著降低了细胞培养的污染风险。

3.本培养体系组装运转时间比传统的反应器微载体培养体系短，同时投资及运转的成本要低，并无需进行罐体的灭菌和消毒，节省了时间成本和生产成本，提高了生产效率。

4.WAVE生物反应器具有规模不同的系列产品，结合Disks载体同一设备在一定范围内更换配套的细胞袋即可培养不同性质和不同规模的细胞，生产规模与生产产物可灵活更换。

5.利用本发明的培养体系培养病毒疫苗，具有培养的细胞密度高、可连续收获以及产量高的优点。

实施例

实施例1利用WAVE生物反应器与FibraCel Disks载体培养CHO细胞生产重组乙肝疫苗

实验设备与实验材料：

生物反应器：WAVE生物反应器系统200(通用电气公司生命科学部)，配用细胞袋为Cellbag-200L(通用电气医疗集团生命科学部)；

载体：直径6mm的FibraCel Disks(New Brunswick Scientific公司)；

培养液：添加5％小牛血清的DMEM培养基(MD 208，北京清大天一生物技术有限公司)。

所用CHO细胞为CHO-C28细胞株。

操作步骤：

准备阶段：从种子细胞库中复苏CHO-C28细胞株，在转瓶中放大培养，消化制成细胞悬液。用高压蒸汽灭菌锅将FibraCel Disks载体与培养液121℃高压蒸汽灭菌30分钟。

细胞培养：将灭菌后的微载体与培养液通过进料口加入细胞袋中，以3×10⁵的细胞密度接种CHO细胞，培养体积为80L，载体使用量为35g/L。

起始培养时摇动频率为20rpm，摇动角度为7°。约0.5h后培养液变清澈，调整摇动频率为18rpm，摇动角度为6°。培养温度：37±0.2℃；培养液pH：7.2；培养液溶氧：50％。

病毒蛋白收获：培养48小时后开始灌注培养，起始灌注速率为每天40L，以后逐渐增加至每天80L到160L，并收获含有乙型肝炎病毒表面抗原的上清液于4℃低温储存，连续收液10天共收获1200L，乙肝病毒表面抗原的特异性浓度为3.41mg/L。所得上清液可进一步浓缩、沉淀、提纯、加入佐剂以获得重组乙肝疫苗。

实施例2利用WAVE生物反应器与FibraCel Disks载体培养Vero细胞生产狂犬病病毒疫苗

实验设备与实验材料：

生物反应器：WAVE生物反应器系统20/50(通用电气公司生命科学部)，配用细胞袋为Cellbag-50L(通用电气公司生命科学部)；

载体：直径6mm的FibraCel Disks(New Brunswick Scientific公司)；

细胞培养液：添加5％小牛血清的MEM培养基(MD505，北京清大天一生物技术有限公司)。

所用Vero细胞为ATCC系Vero细胞株。(购自武汉大学中国典型培养物保藏中心)

操作步骤：

准备阶段：从种子细胞库中复苏Vero细胞株，在转瓶中放大培养，消化制成细胞悬液。用高压蒸汽灭菌锅将FibraCel Disks载体与培养液121℃高压蒸汽灭菌30min。

细胞培养：将灭菌后的微载体与培养液通过进料口加入细胞袋中，以3.5×10⁵的细胞密度接种Vero细胞，培养体积为15L，载体使用量为30g/L。起始培养摇动频率23rpm，摇动角度8°，约1h后培养液变清澈，调整为摇动频率20rpm，摇动角度7°。培养温度：37℃；培养液pH：7.2；培养液溶氧：50％。

病毒接种与增殖：细胞培养6天后，以0.1病毒感染复数MOI(在本文中，“病毒感染复数MOI(multiplicity of infection)”是指每一个细胞上所感染病毒的数量，MOI＝有感染力的病毒量/细胞总量。)接种狂犬病病毒aG株(购自中国药品生物制品检定所)。培养温度：35℃；培养液pH：7.5；培养液溶氧：50％。

病毒蛋白收获：培养48小时后开始灌注培养，起始灌注速率为每天15L，后来逐渐增加至每天20-30L。连续灌注培养并收获病毒液低温储存于4℃，连续灌注培养15天，收获约250L病毒液，参照中国药典(2005版)人用狂犬病疫苗规程中的小鼠脑内测定法测定收获液的病毒滴度，最高达9.3lgLD₅₀/mL。所得病毒溶液可进一步浓缩、沉淀、提纯、添加佐剂以获得疫苗。

实施例3～5、比较例1、参考实施例1～2

除了按照表1改变实验条件以外，进行与实施例1相同的操作，得到乙肝疫苗，乙肝疫苗的特异性浓度结果一并示于表1。

实施例6～8、比较例2、参考实施例3～4、

除了按照表2改变实验条件以外，进行与实施例2相同的操作，得到狂犬病病毒疫苗，狂犬病病毒疫苗的特异性浓度结果一并示于表2。

表1

实施例3

实施例4

实施例5

比较例1

参考实施例1

参考实施例2

反应器

WAVE生物反应器200型(100L细胞袋)

WAVE生物反应器20/50型(20L细胞袋)

WAVE生物反应器20/50型(50L细胞袋)

100LCLAVORURS^TM搅拌式生物反应器

WAVE生物反应器200型(200L细胞袋)

载体

直径6mm的FibraCelDisks载体

Cytodex-1微载体

直径6mm的FibraCelDisks载体

培养体积

50L

16L

35L

80L

载体用量

20g/L

40g/L

28g/L

8g/L

35g/L

8g/L

反应器的摇动角度

5°

9°

7°

/

2°

6°

反应器的摇动频率

16

25

23

/

5

18

病毒疫苗

乙肝疫苗特异性浓度3.55mg/L

乙肝疫苗特异性浓度3.84mg/L

乙肝疫苗特异性浓度3.21mg/L

乙肝疫苗特异性浓度2.6mg/L

乙肝疫苗特异性浓度2.9mg/L

乙肝疫苗特异性浓度2.82mg/L

表2

实施例6

实施例7

实施例8

比较例2

参考实施例3

参考实施例4

反应器

WAVE生物反应器200型(100L细胞袋)

WAVE生物反应器2/10型(10L细胞袋)

WAVE生物反应器20/50型(50L细胞袋)

50LCLAVORUS^TM搅拌式生物反应器

WAVE生物反应器20/50型(50L细胞袋)

载体

直径6mm的FibraCelDisks载体

直径6mm的FibraCel Disks载体

Cytodex-1微载体

直径6mm的FibraCel Disks载体

培养体积

40L

6L

20L

15L

载体用量

25g/L

15g/L

32g/L

10g/L

30g/L

45g/L

反应器的摇动角度

8°

6°

7°

/

12°

7°

反应器的摇动频率

20

18

28

/

35

20

病毒疫苗

狂犬病病毒疫苗病毒滴度9.63lgLD₅₀/mL

狂犬病病毒疫苗病毒滴度9.55lgLD₅₀/mL

狂犬病病毒疫苗病毒滴度9.58lgLD₅₀/mL

狂犬病病毒疫苗病毒滴度7.9lgLD₅₀/mL

狂犬病病毒疫苗病毒滴度8.95gLD₅₀/mL

狂犬病病毒疫苗病毒滴度8.70gLD₅₀/mL

通过上述实施例、参考实施例和比较例可以看出，实施例和参考实施例的乙肝疫苗的特异性浓度和狂犬病疫苗的病毒滴度高于比较例，从而说明，通过组合使用特定的生物反应器和载体，可以提高细胞得率；进而，实施例的结果优于参考实施例，从而说明，在组合使用WAVE生物反应器和FibraCel Disks载体的基础上，进一步选用特定的培养体积、载体用量、生物反应器的摇动角度和摇动频率的培养条件，可以进一步提高细胞得率，从而显著提高了病毒疫苗的产率。本发明在大规模生产病毒疫苗方面具有很高的应用价值。

本发明技术方案中两种系统的组合使用特别之处：生物反应器与微载体培养系统应当能够提供充分的混合以保证良好的传质传热，以及良好的营养浓度分布和细胞分散，尤其提供足够的溶解氧供细胞生长。因此WAVE生物反应器和FibraCel Disks的组合培养系统即根据两者特征确定一定的摇动频率、摇动角度、培养体积和载体用量，通过限定上述条件，达到充分混合和供氧的目的，同时又不会使细胞从载体脱落，形成良好的培养环境。

另外，本发明的本领域技术人员在以上教导的指导下，可以进行关于本发明的各种改进和变化。因此，可以理解的是，在权利要求的范围内，可以以除了本文具体描述的方式之外的其他方式实施本发明。

Claims

1.一种生产病毒疫苗的方法，其包括以下步骤：

1)将用于生产病毒的细胞接种在装有FibraCel Disks载体的WAVE生物反应器中，进行细胞培养，细胞培养时的培养体积为50mL～500L，培养体积为生物反应器最大工作体积的20-80％，所述载体的用量为10g/L～40g/L，所述生物反应器的摇动角度为3-10°，摇动频率为6-30rpm；

2)收获病毒，制成疫苗。

2.根据权利要求1所述的生产病毒疫苗的方法，其特征在于，在培养所述用于生产病毒的细胞的步骤1)之后，进一步包括接种并增殖待生产的病毒的步骤。

3.根据权利要求1或2所述的生产病毒疫苗的方法，其特征在于，细胞培养时的培养体积为50mL～500L，培养体积为生物反应器最大工作体积的25-75％，所述载体的用量为15g/L～35g/L。

4.根据权利要求1或2所述的生产病毒疫苗的方法，其特征在于，培养细胞时，所述生物反应器的摇动角度为5-8°，摇动频率为8-28rpm。

5.根据权利要求1或2所述的生产病毒疫苗的方法，其特征在于，所述病毒疫苗是人用狂犬病疫苗、脊髓灰质炎疫苗、肾综合征出血热疫苗、乙型脑炎疫苗、甲型肝炎疫苗、兽用狂犬病疫苗、小反刍兽疫疫苗、口蹄疫病毒疫苗、猪蓝耳病疫苗、猪瘟疫苗、乙型肝炎疫苗、风疹减毒活疫苗或水痘减毒活疫苗。

6.根据权利要求1或2所述的生产病毒疫苗的方法，其特征在于，所述用于生产病毒的细胞是Vero细胞、Marc145细胞、CHO细胞、PK15细胞、ST细胞、2BS细胞、KMB-17、MRC-5细胞或BHK21细胞。

7.根据权利要求6所述的生产病毒疫苗的方法，其特征在于，所述用于生产病毒的细胞是CHO细胞或Vero细胞。

8.根据权利要求2所述的生产病毒疫苗的方法，其特征在于，所述细胞培养4-8天后，接种病毒。

9.根据权利要求2所述的生产病毒疫苗的方法，其特征在于，病毒增殖阶段的培养温度为32-35℃，pH值为7.2-7.8。

10.根据权利要求1或2所述的生产病毒疫苗的方法，其特征在于，在细胞培养中，起始培养阶段即细胞粘附期的摇动频率和摇动角度大于维持培养阶段即细胞生长阶段的摇动频率和摇动角度。