CN103285390B - 一种制备狂犬病疫苗的方法 - Google Patents

Abstract

一种制备狂犬病疫苗的方法，属于生物技术领域。所述方法包括以下步骤：a.细胞接种；b.制苗用细胞培养；c.病毒接种；d.病毒培养与收获；e.疫苗制备。本发明对制苗用种毒进行了复壮，加强了病毒繁殖能力；采用激流灌注式生物反应器培养体系提高了病毒的增殖滴度及收获量；而且整个生产工艺不涉及其他生物安全和公共卫生问题，适合于大规模生产。

Description

一种制备狂犬病疫苗的方法

技术领域

本发明涉及一种利用激流灌注式生物反应器制备狂犬病疫苗的方法，属于生物技术领域

背景技术

狂犬病是由狂犬病病毒引起的所有温血动物都易感的人兽共患病，该病在世界范围内发生和流行，狂犬病病毒通过动物咬伤及抓伤而传播，病毒侵害动物和人的神经系统，一旦发病，死亡率约为100%。我国是世界上狂犬病的高发地区，狂犬病死亡人数在我国法定报告传染病中始终占据首位，是危害我国公共卫生安全的重大疫病。

犬、猫在携带和传播狂犬病中起重要作用，是人畜感染狂犬病病毒的最主要的来源。提高犬、猫等动物的狂犬病疫苗免疫率，是从根本上预防狂犬病的发生，控制和消灭狂犬病的必经之路。而高质量的兽用狂犬病疫苗是保障免疫成功的基础。

传统的狂犬病疫苗生产工艺为转瓶生产，具有生产病毒滴度低、劳动强度大、批间差异大等缺点。近几年，随着兽用疫苗行业的发展，生物反应器的应用研究越来越被重视，利用不同类型的生物反应器开发的多种培养工艺被相继报道。在狂犬病疫苗生产中，机械搅拌式生物反应器实现了全悬浮培养BHK21细胞和球状微载体培养贴壁BHK21细胞两种培养工艺，潮汐式生物反应器实现了纸片载体培养贴壁BHK21细胞的培养工艺。

从行业整体发展来看，应用生物反应器生产狂犬病疫苗比转瓶工艺有很大的进步，但在生产工艺优化与成本控制等方面均有很大的发展空间。应用激流灌注式生物反应器生产狂犬病疫苗的研究未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用激流灌注式生物反应器制备狂犬病疫苗的方法。由以下技术方案实现的：

一种制备狂犬病疫苗的方法，它利用激流灌注式生物反应器作为培养工具，所述激流灌注式生物反应器包括第一蠕动泵、第二蠕动泵、第三蠕动泵、第一硅胶管、第二硅胶管、第三硅胶管、有孔硅胶管、纸片载体、灌注袋、混匀器与激流罐；其中，混匀器是具有加热或保温功能、并能对内部液体进行混匀的罐状装置；所述反应器中液体的流向为：灌注袋——硅胶管——混匀器——硅胶管——激流罐——硅胶管——灌注袋；

疫苗制备按以下步骤进行：

a、细胞接种

将细胞悬液即BHK21细胞和细胞生长液混合液接种至激流灌注式生物反应器的灌注袋（9），使细胞贴附在聚酯纤维纸片载体（8）上，细胞接种密度为：每克载体接种0.8～1.5×10⁷个细胞；

b、制苗用细胞培养

设定设备参数：温度T1：37～37.5℃、T2：40～45℃、T3：34～36℃，pH：7.0～7.4，DO：40%～70%，振荡速度15～30r/min，空气流量100ml/min～1000ml/min，启动细胞培养程序，进行细胞培养，得到制苗用细胞；

c、病毒接种

当细胞单日耗糖趋于平稳时，表明细胞达到接毒要求，排空反应器内液体，将狂犬病病毒种毒接种制苗用细胞，接种剂量为有效培养体积的0.3%～1%（V/V），吸附15～30min；加入细胞维持液；

d、病毒培养

设定设备参数：温度T1：32～35℃、T2：37～40℃、T3：30～33℃，pH：7.2～7.6，DO：40%～70%，振荡速度15～25r/min，空气流量400ml/min～4000ml/min，启动病毒培养程序，扩增培养狂犬病病毒；

e、病毒液收获

接毒后72～96h开始，多批次收获病毒液；0.5微米滤膜过滤病毒液后，保存备用；

f、疫苗制备

将收获病毒液制备狂犬病活疫苗或狂犬病灭活疫苗。

上述制备狂犬病疫苗的方法，所述步骤b中，细胞培养过程中采用阶段流加方式补充细胞生长液，当残糖量低于1.5g/L时，流加补充细胞生长液，流加速度以培养液含糖量维持在1.5～2g/L之间为准，当培养液体积达到有效培养体积时，更换培养液。

上述制备狂犬病疫苗的方法，所述步骤b中，逐日增加空气流量，每24h增加100ml/min～1000ml/min。

上述制备狂犬病疫苗的方法，所述步骤c中，狂犬病病毒是回归鼠脑后，再经BHK21细胞传代适应的复壮毒；

上述制备狂犬病疫苗的方法，所述步骤d中，接毒15h后开始持续流加补充n倍浓缩DMEM液，流加速度以培养液残糖量维持在1～2g/L之间为准；所述n等于2～5。

上述制备狂犬病疫苗的方法，所述n倍浓缩DMEM液配制方法为：1份DMEM干粉培养基按照使用说明书用量加入去离子水配置成1×DMEM液后，再加入（n-1）份无Na-DMEM干粉培养基，溶解即成；所述n等于2～5。

上述制备狂犬病疫苗的方法，所述步骤e中，收获方式为多批次收获；第一次收获时间为接毒后72～96h，之后每36～48h收获一次，持续收获6～8次；每次收获量为培养液总体积的80%～100%。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.在本发明中，与常规激流灌注式生物反应器培养系统相比，增加了一个混匀器，增大了循环体系培养液的体积，减少了换液次数，简化了操作流程，优化了细胞生长环境，提高了病毒液产量。

2.本发明细胞培养过程中逐日增大空气流量，加快系统内气体循环，有利于培养液内CO2的溢出，减少NaHCO3的使用量。

3.本发明接种的狂犬病病毒为鼠脑复壮毒，其纯度高、增殖能力强、免疫原性好，既增加了收获病毒液的滴度，又提升了成品疫苗的免疫效果。

4.本发明使用的浓缩营养液，既可以倍增多种氨基酸含量，又不会明显增加培养液的渗透压，为病毒繁殖提供了充足的营养，有利于提高病毒滴度。

5.本发明多批次收获病毒液，既保证了收获病毒液的滴度，又大大提高了病毒液产量。

6.收获病毒液及时过滤，可有效去除细胞碎片，减少细胞核酸的含量，保证病毒液的纯净性，提高病毒液品质。

附图说明

图1 是激流灌注式生物反应器的液体循环系统组成平面示意图；

图2 是多批次收获狂犬病病毒的效价曲线图；

附图或文字中各标号清单为：1.第一蠕动泵（灌注出液泵）、2.第二蠕动泵（灌注进液泵），3.第三蠕动泵、4.第一硅胶管、5.第二硅胶管、6.第三硅胶管、7.有孔硅胶管、8.聚酯纤维纸片载体、9.灌注袋、10.混匀器、11.激流罐；

T1为激流罐内液体温度，T2为激流罐加热膜的温度，T3为灌注袋外环境温度，pH为激流罐内液体pH值，DO为激流罐内液体溶氧率，振荡速度为激流罐的振荡速度，空气流量为激流罐内空气交换量。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，其中各实施例仅用于说明本发明而并非限定本发明的专利保护范围。

实施例1  狂犬病病毒复壮

BHK21细胞、狂犬病病毒Flury-LEP株、巴黎株狂犬固定毒均购自中国兽医药品监察所。

细胞生长液的配方为体积百分含量92%高糖DMEM液，8%新生牛血清，调整PH值为7.2；

细胞维持液为体积百分含量99%高糖DMEM液，1%新生牛血清，调整PH值为7.3；

a.狂犬病病毒回归鼠脑

将狂犬病病毒Flury-LEP株毒种，用PBS(0.04mol/L，pH值7.6)10倍系列稀释，取10^-2，接种11-13g小白鼠，脑内接种，0.03mL/只，饲养观察，选择接种4～5d有典型狂犬病症状的小白鼠，无菌取其脑组织，研磨，加入无血清DMEM液制成20%悬液，6000r/min，离心20min，取上清液，-20℃保存。

b.狂犬病病毒传代细胞适应

将上述鼠脑毒接种生长良好的BHK21细胞单层，接种量1%（V:V），接毒吸附40min后，补足维持液，于33℃培养96h，仅收获上清液，-20℃保存备用。

将收获的病毒上清液回归鼠脑，再进行传代细胞适应，重复上述操作2次，得到狂犬病复壮毒。

c.狂犬病复壮毒LD₅₀测定

取狂犬病复壮毒，用PBS(0.04mol/L，pH值7.6)10倍系列稀释，取10^-3~10^-6，接种11-13g小白鼠，脑内接种，0.03ml/只，每个稀释度接种5只，接种后饲养观察14d，计数小鼠的死亡数量，按Reed-Muench法计算LD₅₀。得到的狂犬病复壮毒病毒效价为10^5.8 LD₅₀/0.03ml，与复壮前相比病毒效价可提高约0.5个滴度。

d.狂犬病复壮毒毒力检验

将收获的复壮毒病毒液肌肉或皮下注射10-14周龄的比格犬2只，1.0ml/只，观察21-28日，均无不良反应。

用复壮毒病毒液肌肉注射成年家兔2只，0.5ml/只，观察21-28日，均无任何狂犬病症状。

e.狂犬病复壮毒免疫原性检验

将狂犬病复壮毒制备灭活疫苗，分别取0.75 IU、0.5 IU、0.25 IU和0.1 IU的疫苗腹腔接种体重为11-13g小白鼠，0.5ml/只，每组10只小白鼠。14日后用10-100LD₅₀的巴黎株狂犬固定毒脑内攻击，0.03ml/只。同时，取同体重的未免疫小白鼠10只，用相同剂量的巴黎株狂犬固定毒脑内接种作为对照，0.03ml/只。对照组小白鼠全部死亡，接种0.75 IU、0.5 IU和0.25 IU的小白鼠全部保护，接种0.1 IU疫苗的小白鼠有9/10获得保护。

而复壮前原毒接种0.75 IU、0.5 IU的小白鼠全部保护，接种0.25 IU疫苗的小白鼠有9/10获得保护，接种0.1 IU疫苗的小白鼠有7/10获得保护。狂犬病复壮毒免疫原性更好。

f.特异性检验

将狂犬病复壮毒用PBS(0.04mol/L，pH值7.6)作10^-2稀释，与等量狂犬病病毒阳性血清（中和指数1000以上）混合，置37℃水浴中和1小时后，脑内注射11-13g小鼠4只，每只0.03ml，观察至14日，全部健活。

复壮后得到的狂犬病病毒Flury-LEP株于2012年11月14日保藏在中国典型培养物保藏中心，培养物名称：狂犬病病毒Flury-LEP株（Rabies virus），保藏号为CCTCC NO ：V201249，保藏地址为：中国武汉大学。所述病毒为常见病毒，故其特征描述不再赘述。

实施例2  AP20C型激流灌注式生物反应器制备狂犬病活疫苗

本实施例中所用的AP20C型激流灌注式生物反应器，灌注袋9容积为4.5L，混匀器10容积为8L，激流罐11容积为15L，灌注袋9内含有200g聚酯纤维纸片载体8；理论有效培养体积为18L。

BHK21细胞同实施例1；

种毒同实施例1中菌种保藏的狂犬病病毒Flury-LEP株，某一批次种毒效价为10^5.8LD₅₀/0.03ml。

细胞生长液的配方为体积百分含量90%高糖DMEM液，10%新生牛血清，调整PH值为7.3；

细胞维持液为体积百分含量98%高糖DMEM液，2%新生牛血清，调整PH值为7.4；

无Na-DMEM干粉培养基为不含有NaCL和酚红的高糖DMEM培养基，由Invitrogen Corporation公司生产销售；

A、准备工作：

检验系统气密性，校准电极，PBS处理纸片载体8，连接灌注袋9、混匀器10与激流罐11，用细胞生长液浸泡纸片载体8，平衡系统。

B、制备工作，具体步骤如下：

a.制苗用细胞的复苏与前期培养

从液氮罐中取出冻存的BHK21细胞复苏后，用细胞生长液于37℃培养，长成良好单层后消化转至10L转瓶中培养、备用。

b.制苗用细胞在生物反应器中的接种

取5个长满单层细胞的转瓶，用0.025%胰酶消化细胞，制备细胞悬液5L（含细胞和细胞生长液），细胞总数约2.0×10⁹个。

细胞接种采用两步接种法，第一步：灌注袋9中各从下部泵入细胞悬液4.0L，静置吸附1h；第二步：将灌注袋9中的液体泵出1.0L，再从灌注袋9上部深层管泵入1.0L剩余细胞悬液，静置吸附0.5h；同时在激流罐11内补充5L细胞生长液预热；细胞接种密度为：每克载体接种1.0×10⁷个细胞。

c.制苗用细胞培养

吸附过程完成后，设置设备参数如下：T1：37.2℃、T2：42℃，T3：36℃，PH：7.25，DO：40%～70%，震荡速度30r/min，液体循环速度300ml/min，空气流量100ml/min。启动细胞培养程序，进行细胞培养。

每日取样2次测残糖量，计算单日耗糖量，细胞培养36h培养液残糖量低于1.5g/L，开始流加补充细胞生长液，流加速度为4.2ml/min；细胞培养72h泵出总培养体积50%的培养液，流加速度调为6.1ml/min；培养96h时泵出总培养体积70%的培养液，泵入生长液3.6L，流加速度为6.1ml/min；

细胞培养液循环灌注速度随培养时间的增加逐渐增大，使硅胶管4、硅胶管6内液体颜色保持基本一致。逐日增加空气流量，每24h增加100ml/min。

d.狂犬病病毒接种制苗用细胞

细胞接种后第5日（120h）单日耗糖量达到1.8g/L/24h，且趋于平稳，确定细胞密度达到了接毒要求。排空反应器内液体，将110ml狂犬病病毒液泵入激流袋11内，连同激流袋11内的4L无血清单倍DMEM液，一同泵入灌注袋9内，静置吸附20min，同时在激流袋11中补充6L含血清3.3%的DMEM营养液，病毒接种剂量约为有效体积的0.61%。

e.病毒培养与收获

吸附过程完成后，设置设备参数如下：T1：33℃、T2：38℃、T3：32℃，PH：7.3，DO：40%～70%，震荡速度15r/min，液体循环速度500ml/min，通气量400ml/min，启动病毒培养程序开始培养。

接毒15h后开始持续流加补充4倍浓缩DMEM液（1份DMEM干粉培养基按照使用说明书用量加入去离子水配置成1×DMEM液后，再加入3份无Na-DMEM干粉培养基，溶解而成），流加速度1.6ml/min。

接毒后96h第一次收获，收获量为培养液总体积的80%；一收完毕后补充细胞维持液，使培养液总量为10L，流加浓缩营养液更换为2倍浓缩DMEM液，流加速度为2.7ml/min，再培养48h，进行第二次收获，第二次收获量为培养液总体积的90%，补充细胞维持液至培养液总量为10L；二收之后病毒培养与收获方式同二收，再收获4次，最后一次收获全部培养液。6次收获量分别为：14.4L、16.2L、16.2L、16.2L、16.2L、18L。

每次收获的毒液，先经过0.5微米的过滤器，除去细胞碎片后，于-20℃冷冻保存；

收获的病毒液测定效价，6批次收获病毒液效价均≥10^7.0LD₅₀/0.03ml（多批次收获狂犬病病毒的效价曲线见图2）；

f.配苗、分装及冻干：

将冻干保护剂（5%的蔗糖脱脂乳）与病毒液按V/V 6：1比例混合，充分摇匀，定量分装，2ml/瓶，迅速冷冻真空干燥即得狂犬病活疫苗（Flury-LEP株）成品，10头份/瓶。

g.疫苗效力检验

将疫苗用PBS(0.04mol/L，pH值7.6)稀释成1ml内含有5头份，再作10倍系列稀释，取10^-3~10^-6，接种11-13g小白鼠，脑内接种，0.03ml/只，每个稀释度接种5只，接种后饲养观察14d，计数小鼠的死亡数量，按Reed-Muench法计算，LD₅₀为10^5.5/0.03ml。

h.疫苗安全性检验

将疫苗用PBS(0.04mol/L，pH值7.6)充分溶解后，肌肉注射成年家兔4只，每只2.5头份，观察21-28日，无任何狂犬病症状（兴奋或抑郁型脑炎症状），家兔安检合格。

选用3月龄（无狂犬病抗体）犬2只，每只肌肉注射疫苗10头份，观察21-28日，全部健活，犬安检合格。

与转瓶工艺比较：转瓶培养工艺每瓶收获体积1L，病毒效价约是10^5.0～5.5 LD₅₀/0.03ml；本次实验病毒总产量与3000个10L转瓶产量持平。

实施例3  AP200型激流灌注式生物反应器制备狂犬病灭活疫苗

本实施例中所用的激流灌注式生物反应器包括AP20C型和AP200型两种。

AP20C型激流灌注式生物反应器同实施例2。

AP200型灌注袋9容积为45L，混匀器10容积为80L，激流罐11容积为150L，灌注袋9内含有2000g聚酯纤维纸片载体8；理论有效培养体积为180L。

制苗用细胞、种毒均同实施例2。

A、准备工作

选用AP20C型和AP200型两种激流灌注式生物反应器，做培养细胞前准备工作。

B、制备工作，具体步骤如下：

a.制苗用细胞的培养

按照实施例2方法，在AP20C型生物反应器内培养制苗用细胞120h，至细胞耗糖量增至1.7g/L/24h且趋于平稳时，用0.025%胰酶消化灌注袋9内细胞，制得细胞悬液50L，内含BHK21约2.0×10¹⁰个。将制得的细胞悬液分两步接种于AP200型生物反应器灌注袋9内：第一步：灌注袋9中从下部泵入细胞悬液40L，静置吸附1h；第二步：将灌注袋9中的液体泵出10L，再从灌注袋9上部深层管各泵入10L剩余细胞悬液，静置吸附0.5h；同时在激流罐11内补充50L细胞生长液预热；细胞接种密度为：每克载体接种1.0×10⁷个细胞。

吸附过程完成后，设置设备参数如下：T1:37℃，T2:41℃，T3:34℃，PH:7.3，DO:50～70%，振荡速度30r/min，循环速度3000ml/min，空气流量1000ml/min。启动细胞培养程序，进行细胞培养。

每日取样2次测残糖量，计算单日耗糖量，细胞培养36h培养液残糖量低于1.5g/L，开始流加补充细胞生长液，流加速度为42ml/min；细胞培养72h泵出总培养体积50%的培养液，流加速度调为60ml/min；培养96h时泵出总培养体积70%的培养液，泵入生长液30L，流加速度调为60ml/min。

细胞培养液循环灌注速度随培养时间的增加逐渐增大，使硅胶管4、硅胶管6内液体颜色保持基本一致。逐日增加空气流量，每24h增加1000ml/min。

b.狂犬病病毒接种制苗用细胞

细胞接种后第5日（120h）单日耗糖量达到1.7g/L/24h，且趋于平稳，确定细胞密度达到了接毒要求。排空反应器内液体，将1000ml狂犬病病毒液泵入激流袋11内，连同激流袋11内的40L无血清单倍DMEM液，一同泵入灌注袋9内，静置吸附20min，同时在激流袋11中补充60L含血清3.3%的DMEM营养液，病毒接种剂量约为0.56%。

c.病毒培养与收获

吸附过程完成后，设置设备参数如下：T1：33℃、T2：38℃、T3：31℃，PH：7.4，DO：50%～70%，震荡速度15r/min，液体循环速度5000ml/min，通气量4000ml/min，启动病毒培养程序开始培养。

接毒15h后开始流加补充4倍浓缩DMEM液（1份DMEM干粉培养基按照使用说明书用量加入去离子水配置成1×DMEM液后，再加入3份无Na-DMEM干粉培养基，溶解而成），流加速度16ml/min。

接毒后96时第一次收获，收获量为培养液总体积的80%；一收完毕补充维持液，使培养液总量为100L，流加培养液更换为2倍浓缩DMEM液，流加速度为27ml/min，再培养48h，进行第二次收获，第二次收获量为培养液总体积的90%，补充维持液至培养液总量为100L；二收之后细胞培养与病毒收获方式同二收，再收获4次，最后一次收获全部培养液。6次收获量分别为：144L、162L、162L、162L、162L、180L。

收获的病毒液测定效价，6批次收获病毒液效价均≥10^6.8LD₅₀/0.03ml。

收获病毒液先经0.5微米的过滤器过滤，再加入V:V 1:4000的β丙内酯进行灭活，灭活后病毒液经30万分子量浓缩系统浓缩10倍，浓缩病毒液-20℃冷冻保存。

d.纯化

浓缩病毒液经4FF柱层析系统纯化，纯化后病毒液通过0.22微米滤膜过滤除菌，并于-20℃冷冻保存备用。

e.配苗、分装及冻干

将纯化病毒液混合于同一容器，加入冻干保护剂，定量分装，每头份疫苗至少含3.0IU，分装后迅速冷冻真空干燥即得狂犬病病毒灭活疫苗（Flury-LEP株）成品，10头份/瓶。

f.安全检验

用10-14周龄比格犬2只，每只皮下或肌肉注射疫苗2头份，观察21日，检验犬均无明显局部和全身反应，安全检验合格。

g.效力检验

采用NIH法，每头份疫苗含3.0IU。

与转瓶工艺比较：转瓶培养工艺每瓶收获体积1L，病毒效价约是10^5.0～5.5 LD₅₀/0.03ml；本次实验病毒总产量与20000个10L转瓶产量持平。

Claims (4)

1.一种制备狂犬病疫苗的方法，其特征在于：它利用激流灌注式生物反应器作为培养工具，所述激流灌注式生物反应器包括第一蠕动泵（1）、第二蠕动泵（2）、第三蠕动泵（3）、第一硅胶管（4）、第二硅胶管（5）、第三硅胶管（6）、有孔硅胶管（7）、纸片载体（8）、灌注袋（9）、混匀器（10）与激流罐（11）；其中，混匀器（10）是具有加热或保温功能、并能对内部液体进行混匀的罐状装置；所述反应器中液体的流向为：灌注袋（9）——第一硅胶管（4）——混匀器（10）——第二硅胶管（5）——激流罐（11）——第三硅胶管（6）——灌注袋（9）；

疫苗制备按以下步骤进行：

a、细胞接种

将细胞悬液即BHK21细胞和细胞生长液混合液接种至激流灌注式生物反应器的灌注袋（9），使细胞贴附在聚酯纤维纸片载体（8）上，细胞接种密度为：每克载体接种0.8～1.5×10⁷个细胞；

b、制苗用细胞培养

设定设备参数：温度T1：37～37.5℃、T2：40～45℃、T3：34～36℃，pH：7.0～7.4，DO：40%～70%，振荡速度15～30r/min，空气流量100ml/min～1000ml/min，启动细胞培养程序，进行细胞培养，得到制苗用细胞；

c、病毒接种

当细胞单日耗糖趋于平稳时，表明细胞达到接毒要求，排空反应器内液体，将狂犬病病毒种毒接种制苗用细胞，接种剂量为有效培养体积的0.3%～1%（V/V），吸附15～30min；加入细胞维持液；

d、病毒培养

设定设备参数：温度T1：32～35℃、T2：37～40℃、T3：30～33℃，pH：7.2～7.6，DO：40%～70%，振荡速度15～25r/min，空气流量400ml/min～4000ml/min，启动病毒培养程序，扩增培养狂犬病病毒；

e、病毒液收获

接毒后72～96h开始，多批次收获病毒液；0.5微米滤膜过滤病毒液后，保存备用；

f、疫苗制备

将收获病毒液制备狂犬病活疫苗或狂犬病灭活疫苗；

所述步骤b中，细胞培养过程中采用阶段流加方式补充细胞生长液，当残糖量低于1.5g/L时，流加补充细胞生长液，流加速度以培养液含糖量维持在1.5～2g/L之间为准，当培养液体积达到有效培养体积时，更换培养液；

其中，所述T1为激流罐内液体温度，T2为激流罐加热膜的温度，T3为灌注袋外环境温度；

所述步骤d中，接毒15h后开始持续流加补充n倍浓缩DMEM液，流加速度以培养液残糖量维持在1～2g/L之间为准；所述n等于2～5；

所述n倍浓缩DMEM液配制方法为：1份DMEM干粉培养基按照使用说明书用量加入去离子水配置成1×DMEM液后，再加入（n-1）份无Na-DMEM干粉培养基，溶解即成；所述n等于2～5。

2.根据权利要求1所述制备狂犬病疫苗的方法，其特征在于，所述步骤b中，逐日增加空气流量，每24h增加100ml/min～1000ml/min。

3.根据权利要求2所述制备狂犬病疫苗的方法，其特征在于，所述步骤c中，狂犬病病毒是回归鼠脑后、再经BHK21细胞传代适应的复壮毒。

4.根据权利要求3所述制备狂犬病疫苗的方法，其特征在于，所述步骤e中，收获方式为多批次收获；第一次收获时间为接毒后72～96h，之后每36～48h收获一次，持续收获6～8次；每次收获量为培养液总体积的80%～100%。