CN111467486A - 一种狂犬病疫苗的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种狂犬病疫苗的纯化方法，包括采用含有硅羟基的硅化合物载体进行吸附纯化，以及在狂犬病疫苗病毒液中加入带有碱金属离子的缓冲液。本发明不仅解决了狂犬病疫苗以往在生产过程中单一采用柱层析方法DNA难去除、蛋白质容易聚合沉淀的问题或者依赖于添加非限制性核酸内切酶、鱼精蛋白等化合物对疫苗安全性有影响的问题，在保证疫苗效价的前提下，针对现有的去除宿主DNA方法的不足，本采用物理吸附的方式纯化狂犬病疫苗中的宿主DNA，将二氧化硅入特制的滤器中，加入收获液进行过滤纯化。通过硅化物对DNA的特异性吸附作用，在可接受的抗原回收率下，可以从狂犬病疫苗中吸附宿主DNA，对断裂的宿主DNA也有吸附能力，对疫苗的安全性没有影响。

Description

一种狂犬病疫苗的纯化方法
技术领域
本发明涉及疫苗生产的提纯方法，具体是一种狂犬病疫苗的纯化方法。
背景技术
狂犬疫苗的生产需要经过Vero细胞培养、病毒增殖、病毒收获、纯化等过程，其中Vero细胞具有无限传代的能力，具有整合入接种者基因组、成为癌变的潜在诱发条件的风险，因此《中国药典》中对其DNA在狂犬疫苗中的浓度限制较为严格。作为狂犬疫苗中主要的杂质之一，Vero细胞DNA一般产生于细胞培养时的机械搅拌、病毒增殖造成的细胞凋亡及破碎等过程。出于安全性考虑，《中华人民共和国药典规定》，经杂交法检测狂犬疫苗DNA含量合格标准为100pg/mL。但是经检测，中间产品DNA含量可高达10000pg/mL，单纯依靠柱层析法纯化不仅成本增加、抗原损失量大，而且纯化效果不理想。去除宿主DNA成为狂犬病疫苗(Vero细胞)生产纯化的难题。
现有的专利公开了以鱼精蛋白和非限制性核酸内切酶为主的DNA去除法，如专利CN 101270350 A，但是两种试剂和成本高并且这些措施意味着在狂犬病疫苗中引入了新的杂质，且鱼精蛋白的加入会大大降低病毒抗原的含量，病毒回收率仅为20～30％，不仅提高了潜在的安全性风险和生产过程中纯化的难度还提高了疫苗生产的成本。
而针对其他的采用离子交换介质去除狂犬疫苗的已公开专利，如CN 103571800B，DNA去除率为99％，但工艺复杂，抗原回收率仅为50％左右。大大提高了疫苗生产的成本。
因此本发明的目的为采用物理吸附的方式吸附狂犬疫苗中的残留Vero细胞DNA，使其与疫苗中间产品分离，达到去除宿主DNA的目的。该方法简便、操作便捷、更符合大规模生产的需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种狂犬病疫苗的纯化方法，以解决现有技术中的工艺复杂，回收率低，导致的疫苗生产成本较高的技术难题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种专利名称狂犬病疫苗的纯化方法，具体纯化步骤包括：采用含有硅羟基的硅化合物载体进行吸附纯化，以及在狂犬病疫苗病毒液中加入带有碱金属离子的缓冲液。
与现有技术相比，上述技术方案的有益效果是：
在保证疫苗效价的前提下，针对现有的去除宿主DNA方法的不足，上述技术方案采用物理吸附的方式纯化狂犬病疫苗中的宿主DNA，在疫苗纯化过程中加入含有硅羟基的硅化合物载体，对收获液进行过滤纯化。通过硅化物对DNA的特异性吸附作用，在可接受的抗原回收率下，可以从狂犬病疫苗中吸附宿主DNA，对断裂的宿主DNA也有吸附能力，对疫苗的安全性没有影响；另外，在保证疫苗不引入新的化学杂质的情况下，采用物理方法有效吸附去除宿主DNA的含量，提高疫苗产品质量及合格率，为疫苗纯化提供新方法。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种狂犬病疫苗的纯化方法，具体纯化步骤包括：采用含有硅羟基的硅化合物载体进行吸附纯化，以及在狂犬病疫苗病毒液中加入带有碱金属离子的缓冲液。
上述技术方案采用物理吸附的方式纯化狂犬病疫苗中的宿主DNA，在疫苗纯化过程中加入含有硅羟基的硅化合物载体，二氧化硅表面硅烷醇基团与DNA磷酸基团可形成大量氢键。虽然两者之间形成的氢键作用力较弱，但是数量巨大，可以使DNA在短时间内牢牢的吸附在二氧化硅表面，实现对收获液进行过滤纯化。通过硅化物对DNA的特异性吸附作用，在可接受的抗原回收率下，可以从狂犬病疫苗中吸附宿主DNA，对断裂的宿主DNA也有吸附能力，对疫苗的安全性没有影响；
另外，在溶液中同时引入碱金属阳离子，后者可以通过形成阳离子桥而中和DNA和二氧化硅表面的负电荷并使二者结合，从而提升宿主DNA和硅化合物之间的相互作用力，增强对宿主DNA的吸附稳定性，提升束缚力。
进一步的，所述硅化合物为硅胶、介孔SBA-15、玻璃纤维、二氧化硅粉体中的任意一种。
选用含有较大比表面积的硅化合物，可利用其表面较大的比表面积，进一步提升产品对宿主DNA的吸附固定效果。
进一步的，所述硅化合物为二氧化硅粉体。
选用二氧化硅粉体，不仅仅可以利用其较大的比表面积，吸附宿主DNA，同时，粉体在溶液中更容易分散，从而实现体系整体电荷平衡，使体系整体对宿主DNA的吸附作用力较为均衡，不会出现局部浓度差的现象，进一步提升产品对宿主DNA的吸附固定效果。
进一步的，所述的一种狂犬病疫苗的纯化方法，所述具体纯化步骤包括：
将二氧化硅粉体分散于含有钠离子和钾离子的磷酸盐缓冲溶液中，得分散液；
在狂犬病疫苗病毒收获液中加入所述分散液，混合后，离心分离，收集上层清液，即完成狂犬病疫苗的纯化。
先将二氧化硅分散于缓冲溶液中，利用硅化合物表面带有负电荷与缓冲溶液中阳离子进行相互作用，从而在硅化合物表面吸附一层阳离子基团，再与狂犬病疫苗病毒收获也混合时，可在阳离子基团表面吸附带有负电荷的宿主DNA，从而完成对狂犬病疫苗的纯化。
进一步的，所述的一种狂犬病疫苗的纯化方法，所述具体纯化步骤包括：
将二氧化硅粉体分散于含有钠离子或钾离子的磷酸盐缓冲溶液中，调节pH至7.2-7.4，得分散液；
在狂犬病疫苗病毒收获液中加入所述分散液，于温度为2-6℃条件下混合，再经离心分离，收集上层清液，即完成狂犬病疫苗的纯化。
实施例1
将500mL PBS与50g纳米二氧化硅粉体混合，用搅拌器以300r/min转速搅拌混合20min，得二氧化硅悬浊液，用Na2HPO4溶液调整二氧化硅悬浊液pH至7.20，吸取二氧化硅悬浊液，加入狂犬病疫苗病毒浓缩液10mL中，使其终浓度为0.36g/L，迅速放入湘仪L-500型低速离心机中1000rpm离心10min，收集上层清液，即完成狂犬病疫苗的纯化。
吸取上清测定其DNA和抗原含量。根据《中华人民共和国药典》2015版三部附录规定的DNA探针杂交法检测狂犬病疫苗中Vero细胞DNA残留量：吸取1mL液体，蛋白酶处理2h，苯酚提取后采用印迹法检测各试验组DNA含量。根据《中华人民共和国药典》2015版三部附录规定的酶联ELISA法检测狂犬病毒抗原含量。结果见表1。
实施例2
将500mL PBS与50g纳米二氧化硅粉体混合，用搅拌器以300r/min转速搅拌混合20min，得二氧化硅悬浊液，用Na2HPO4溶液调整二氧化硅悬浊液pH至7.20，吸取二氧化硅悬浊液，加入狂犬病疫苗病毒浓缩液10mL中，使其终浓度为0.1g/L，迅速放入湘仪L-500型低速离心机中1000rpm离心10min，收集上层清液，即完成狂犬病疫苗的纯化。
吸取上清测定其DNA和抗原含量。吸取1mL液体，采用荧光定量PCR法检测各试验组DNA含量。根据《中华人民共和国药典》2015版三部附录规定的酶联ELISA法检测狂犬病毒抗原含量。结果见表1。
实施例3
将500mL PBS与50g纳米二氧化硅粉体混合，用搅拌器以300r/min转速搅拌混合20min，得二氧化硅悬浊液，用Na2HPO4溶液调整二氧化硅悬浊液pH至7.20，吸取二氧化硅悬浊液，加入狂犬病疫苗病毒浓缩液10mL中，使其终浓度为0.05g/L，迅速放入湘仪L-500型低速离心机中1000rpm离心10min，收集上层清液，即完成狂犬病疫苗的纯化。
吸取上清测定其DNA和抗原含量。根据《中华人民共和国药典》2015版三部附录规定的DNA探针杂交法检测狂犬病疫苗中Vero细胞DNA残留量：吸取1mL液体，蛋白酶处理2h，苯酚提取后采用印迹法检测各试验组DNA含量。根据现行的《中华人民共和国药典》2015版三部附录规定的酶联ELISA法检测狂犬病毒抗原含量。结果见表1。
实施例4
将500mL磷酸盐缓冲液与50g纳米二氧化硅粉体混合，用搅拌器以300r/min转速搅拌混合20min，得二氧化硅悬浊液，用Na2HPO4溶液调整二氧化硅悬浊液pH至7.20，吸取二氧化硅悬浊液，加入狂犬病疫苗病毒收获液10mL中，使其终浓度为0.026g/L，迅速放入湘仪L-500型低速离心机中1000rpm离心10min，收集上层清液，即完成狂犬病疫苗的纯化。
吸取上清测定其DNA和抗原含量。根据《中华人民共和国药典》2015版三部附录规定的DNA探针杂交法检测狂犬病疫苗中Vero细胞DNA残留量：吸取1mL液体，蛋白酶处理2h，苯酚提取后采用印迹法检测各试验组DNA含量。根据《中华人民共和国药典》2015版三部附录规定的酶联ELISA法检测狂犬病毒抗原含量。结果见表1。
对比例1
用Na2HPO4溶液调整PBS缓冲液的pH至7.20，吸取缓冲液，加入狂犬病疫苗病毒收获液10mL中，迅速放入湘仪L-500型低速离心机中1000rpm离心10min，收集上层清液，即完成狂犬病疫苗的纯化。
吸取上清测定其DNA和抗原含量。根据《中华人民共和国药典》2015版三部附录规定的DNA探针杂交法检测狂犬病疫苗中Vero细胞DNA残留量：吸取1mL液体，蛋白酶处理2h，苯酚提取后采用印迹法检测各试验组DNA含量。根据《中华人民共和国药典》2015版三部附录规定的酶联ELISA法检测狂犬病毒抗原含量。结果见表1。
表1：
Figure BDA0002473458570000071
由表1可见，纳米二氧化硅对DNA的吸附能力在50％以上，各处理组抗原回收率在用量小于0.36g/L时显著升高，基本各组可达到抗原回收率的标准。当二氧化硅用量为0.05g/L～1.0g/L时，抗原回收率达到80％以上，DNA去除率达到75％以上。表明二氧化硅对狂犬病疫苗收获液中的宿主DNA具有极强的吸附能力，且在0.05-0.1g/L之间对狂犬病病毒抗原回收率在75％～95％之间，可以满足生产纯化需要。
实施例5
取狂犬病疫苗病毒收获液15mL，用电子天平(Sartorius-BS323S)精密称取0.025g二氧化硅粉末，倒入10mL注射器底部，分两次加入15mL狂犬病毒收获液。静置所有试验组，在4℃环境下使其自然流下，收集流下液体，即完成狂犬病疫苗的纯化。
待样品流出的体积均停止流下后，记录流出的收获液体积，结果见表2。
根据《中华人民共和国药典》2015版三部附录规定的DNA探针杂交法检测狂犬病疫苗中Vero细胞DNA残留量：吸取1mL液体，蛋白酶处理2h，苯酚提取后采用印迹法检测各试验组DNA含量。结果见表3。
实施例6
取狂犬病疫苗病毒收获液15mL，用电子天平(Sartorius-BS323S)精密称取0.05g二氧化硅粉末，倒入10mL注射器底部，分两次加入15mL狂犬病毒收获液。静置所有试验组，在4℃环境下使其自然流下，收集流下液体，即完成狂犬病疫苗的纯化。
待样品流出的体积均停止流下后，记录流出的收获液体积，结果见表2。
根据《中华人民共和国药典》2015版三部附录规定的DNA探针杂交法检测狂犬病疫苗中Vero细胞DNA残留量：吸取1mL液体，蛋白酶处理2h，苯酚提取后采用印迹法检测各试验组DNA含量。结果见表3。
实施例7
取狂犬病疫苗病毒收获液15mL，用电子天平(Sartorius-BS323S)精密称取0.1g二氧化硅粉末，倒入10mL注射器底部，分两次加入15mL狂犬病毒收获液。静置所有试验组，在4℃环境下使其自然流下，收集流下液体，即完成狂犬病疫苗的纯化。
待样品流出的体积均停止流下后，记录流出的收获液体积，结果见表2。
根据《中华人民共和国药典》2015版三部附录规定的DNA探针杂交法检测狂犬病疫苗中Vero细胞DNA残留量：吸取1mL液体，蛋白酶处理2h，苯酚提取后采用印迹法检测各试验组DNA含量。结果见表3。
表2：
二氧化硅加入量 0.025g 0.05g 0.10g
收获液体积 15.0mL 14.5mL 14.4mL
表3：
Figure BDA0002473458570000101
结果表明，随二氧化硅质量增加，各组收获液流出体积呈减少趋势，但最多不超过0.6mL，液体损失量小于等于4％，不会大幅减少收获液体积，可以保证产量。收获液处理前DNA含量为100～200pg/mL，各试验组随粉末质量增加DNA残留量降低梯度明显，当二氧化硅粉末质量大于0.1g之后，15mL收获液中DNA残留量降至10pg/mL，疫苗检测达标。该结果表明，在现行版《中华人民共和国药典》规定的检测方法下，二氧化硅粉末可以满足狂犬病疫苗的纯化要求。
无论现行检定方法还是即将推行的检定方法，均能证明二氧化硅的纯化效果。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内，不应将权利要求中的任何标记视为限制所涉及的权利要求。

Claims (5)

1.一种狂犬病疫苗的纯化方法，其特征在于，具体纯化步骤包括：采用含有硅羟基的硅化合物载体进行吸附纯化，以及在狂犬病疫苗病毒液中加入带有碱金属离子的缓冲液。
2.根据权利要求1所述的一种狂犬病疫苗的纯化方法，其特征在于，所述硅化合物为硅胶、介孔SBA-15、玻璃纤维、二氧化硅粉体中的任意一种。
3.根据权利要求2所述的一种狂犬病疫苗的纯化方法，其特征在于，所述硅化合物为二氧化硅粉体。
4.根据权利要求1所述的一种狂犬病疫苗的纯化方法，其特征在于，所述具体纯化步骤包括：
将二氧化硅粉体分散于含有钠离子及钾离子的磷酸盐缓冲溶液中，得分散液；
在狂犬病疫苗病毒收获液中加入所述分散液，混合后，离心分离，收集上层清液，即完成狂犬病疫苗的纯化。
5.根据权利要求4所述的一种狂犬病疫苗的纯化方法，其特征在于，所述具体纯化步骤包括：
将二氧化硅粉体分散于含有钠离子及钾离子的磷酸盐缓冲溶液中，调节pH至7.2-7.4，得分散液；
在狂犬病疫苗病毒收获液中加入所述分散液，于温度为2-6℃条件下混合，再经离心分离，收集上层清液，即完成狂犬病疫苗的纯化。
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