CN103882006A - 适用于多种样本的dna提取试剂配制方法和提取方法 - Google Patents
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Abstract
适用于多种样本的DNA提取试剂配制方法和提取方法，它涉及生物技术领域，它样本的预处理过程为：刮取口腔细胞，将口腔细胞拭子浸入到1.5mlPBS溶液中，震荡混匀，然后再将液体转入新的Ep管中，采用离心机进行离心2-5min，吸弃上清液，只保留沉淀，它的DNA样本的提取过程为：在样本沉淀中加入350-420ul的溶解液1和10-15ul的20mg/ml蛋白酶K涡旋混匀30-40min，温度为60-80℃，期间每隔10min震荡一次，然后进行DNA样本的纯化处理及检测。它简化了提取步骤，只需要经过细胞裂解、漂洗和溶解三个步骤，使提取质量和纯度得到大幅提升，并适用于多种不同样本，降低了成本。
Description
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及适用于多种样本的DNA提取试剂配制方法和提取方法。
背景技术：
DNA提取是分子生物学的基本实验，也是不断发展的基因芯片检测中最基本的方法，它是基因芯片制备、分析和诊断的前提，因此，DNA提取是生物学最基础的技术之一，成功的核酸分离纯化需要四个重要的步骤：组织或细胞的破碎和裂解，核蛋白复合体的变性，核酸酶的灭活以及污染物的去除，理想的抽提方法可以获取高质量的靶核酸,同时没有蛋白、糖、脂和其它核酸污染等。酚抽提法 、异丙醇沉淀法、甲酞胺裂解法是动物来源的DNA最为经典的方法，现行的很多方法都是在此基础上改进得来，这三种方法均利用蛋白酶K和十二烷基硫酸钠消化破碎细胞，在前两种方法中裂解液先用酚/氯仿去除蛋白质，再分别用乙醇或异丙醇沉淀DNA。甲酞胺法是利用高浓度的甲酞胺解聚蛋白质与DNA的结合，然后利用透析来处理DNA样品。提取DNA的纯度很高，但操作繁琐，用时长，且所用试剂具有一定的毒性。植物来源的DNA提取方法有十六烷基三乙基澳化按(CTAB)法，SDS法和高盐低pH法等，细菌、真菌来源的DNA提取方法为碱裂解法、煮沸法、SDS裂解法以及Triton-溶菌酶裂解法等。以上方法虽然经典但多用到酚等有毒的有机试剂，安全性低，对人体毒性较大，步骤较多且繁琐，耗时较长，提取结果不稳定，鉴于这些缺点，目前使用相对较少。多数生物实验室开始使用试剂盒提取DNA，市场上大多数商业核酸抽提试剂盒采用固相纯化法，相对于传统方法，试剂盒提取较快速和高效，固相系统抽提核酸依赖缓冲液的pH 值和盐浓度来吸附核酸，基于以下原理：氢与亲水基质发生相互结合作用，在水溶液中则通过阴离子交换柱发生离子交换，以及通过亲和力和大小排除机制。固相纯化通常采用离心柱通过离心力作用运行，支持物有硅胶、玻璃颗粒、硅藻土、阴离子交换载体等，抽提包括细胞裂解、核酸吸附、漂洗和洗脱四个关键性步骤，但基于这种方法的提取结果存在从固相支持物上DNA洗脱不完全，导致得率低等缺点，不能满足下游某些对DNA质、量要求较高的实验操作，尤其不利于对小量珍贵样本的提取。
发明内容：
本发明的目的是提供适用于多种样本的DNA提取试剂配制方法和提取方法，它简化了提取步骤，只需要经过细胞裂解、漂洗和溶解三个步骤，针对前有方法提出的DNA质量不佳，含有杂质太多做了更进一步改进，使提取质量和纯度得到大幅提升，并适用于多种不同样本，不需要利用柱子吸附核酸，降低成本，最大程度减少核酸的损失，最终DNA得率高，质量好。
为了解决背景技术所存在的问题，本发明采用以下技术方案：1、样本的预处理过程为：刮取口腔细胞，将口腔细胞拭子浸入到1.5ml PBS溶液中，震荡混匀，然后再将液体转入新的Ep管中，采用离心机进行离心2-5min，吸弃上清液，只保留沉淀。
2、DNA样本的提取过程为：在样本沉淀中加入350-420ul的溶解液1和10-15ul 的20 mg /ml 蛋白酶K涡旋混匀30-40min，温度为60-80℃，期间每隔10min震荡一次。
3、DNA样本的纯化处理及检测过程为：取出Ep管瞬甩，加入180-200 ul的溶解液2，60-80℃保温10-15min，将Ep管中的液体转移到新的1.5ml的Ep管中，采用离心机进行离心，离心6-8min，抽吸上清液到另一个Ep管中，然后加入等体积的冷的异丙醇，颠倒混匀，采用离心机进行离心5-10min，缓缓倒出上清液，在干净的吸水纸上倒扣Ep管将其中少量的液体倒出，再加入1-3ml的 70%乙醇洗涤沉淀，采用离心机进行离心5-8min，缓缓倒出上清，在干净的吸水纸上倒扣Ep管使其中少量的液体自然流出，并晾干15-20min，加入30ul的DNA溶解液3，涡旋5秒，瞬甩，再采用离心机离心5-8min，吸取上清液，然后转移到新的Ep管中，采用分光光度计检测OD值。
所述的溶解液1为10mmol /L 的Tris -HCl，10 mmol /L 的KCl， 10 mmol /L 的MgCl2，2 mmol /L 的EDTA，0.4 mol /L的 NaCl，1% 的SDS配制而成的水溶液。
所述的溶解液2为5 mol /L NaCl溶液。
所述的溶解液3为去离子水或者为采用10 mmol /L 的Tris -HCl，1 mmol /L 的EDTA配制成的水溶液。
本发明具有以下有益效果：它简化了提取步骤，只需要经过细胞裂解、漂洗和溶解三个步骤，针对前有方法提出的DNA质量不佳，含有杂质太多做了更进一步改进，使提取质量和纯度得到大幅提升，并适用于多种不同样本，不需要利用柱子吸附核酸，降低成本，最大程度减少核酸的损失，最终DNA得率高，质量好。
具体实施方式一：
本具体实施方式采取以下技术方案：1、样本的预处理过程为：刮取口腔细胞，将口腔细胞拭子浸入到1.5ml PBS溶液中，震荡混匀，然后再将液体转入新的Ep管中，采用离心机进行离心2-5min，吸弃上清液，只保留沉淀。
2、DNA样本的提取过程为：在样本沉淀中加入350-420ul的溶解液1和10-15ul 的20 mg /ml 蛋白酶K涡旋混匀30-40min，温度为60-80℃，期间每隔10min震荡一次。
3、DNA样本的纯化处理及检测过程为：取出Ep管瞬甩，加入180-200 ul的溶解液2，60-80℃保温10-15min，将Ep管中的液体转移到新的1.5ml的Ep管中，采用离心机进行离心，离心6-8min，抽吸上清液到另一个Ep管中，然后加入等体积的冷的异丙醇，颠倒混匀，采用离心机进行离心5-10min，缓缓倒出上清液，在干净的吸水纸上倒扣Ep管将其中少量的液体倒出，再加入1-3ml的 70%乙醇洗涤沉淀，采用离心机进行离心5-8min，缓缓倒出上清，在干净的吸水纸上倒扣Ep管使其中少量的液体自然流出，并晾干15-20min，加入30ul的DNA溶解液3，涡旋5秒，瞬甩，再采用离心机离心5-8min，吸取上清液，然后转移到新的Ep管中，采用分光光度计检测OD值。
所述的溶解液1为10mmol /L 的Tris -HCl，10 mmol /L 的KCl， 10 mmol /L 的MgCl2，2 mmol /L 的EDTA，0.4 mol /L的 NaCl，1% 的SDS配制而成的水溶液。
所述的溶解液2为5 mol /L NaCl溶液。
所述的溶解液3为去离子水或者为采用10 mmol /L 的Tris -HCl，1 mmol /L 的EDTA配制成的水溶液。
本具体实施方式具有以下有益效果：它简化了提取步骤，只需要经过细胞裂解、漂洗和溶解三个步骤，针对前有方法提出的DNA质量不佳，含有杂质太多做了更进一步改进，使提取质量和纯度得到大幅提升，并适用于多种不同样本，不需要利用柱子吸附核酸，降低成本，最大程度减少核酸的损失，最终DNA得率高，质量好。
具体实施方式二：本具体实施方式的与具体实施方式一的不同之处在于它的样本预处理过程不同，它的样本的预处理过程为：采用钥匙将血凝块转入干净的玻璃研磨器中，加入380-410ul的溶液4，充分研磨直到没有明显的血凝块，吸取0.4-0.5ml的研磨液到新的1.5ml的Ep管中，然后加入适量的溶解液4补充体积到1.5ml，室温静置10-15min，然后采用离心机进行离心，吸弃上清液，重复上步骤2-3次，得到白细胞沉淀。其它处理方法与具体实施方式一相同。
所述的溶解液4采用1.0g的KHCO3，8.3g 的NH4CL和0.037 g 的EDTA-Na2，加入1000ml双蒸水配制成的工作液。
具体实施方式三：本具体实施方式与具体实施方式一的不同之处在于样本的预处理过程不同，它的样本的预处理过程为：将抗凝血吹吸均匀，取出0.3-0.5ml的血液到1.5ml的Ep管中，然后加入适量的溶解液4补充体积到1.5ml，室温静置10-15min，采用离心机进行离心3min，吸弃上清液，重复上步骤2-3次，得到白细胞沉淀。其它处理方法与具体实施方式一相同。
Claims (7)
1.适用于多种样本的DNA提取试剂配制方法和提取方法，其特征在于：(1)、样本的预处理过程为：刮取口腔细胞，将口腔细胞拭子浸入到1.5ml PBS溶液中，震荡混匀，然后再将液体转入新的Ep管中，采用离心机进行离心2-5min，吸弃上清液，只保留沉淀；(2)、DNA样本的提取过程为：在样本沉淀中加入350-420ul的溶解液1和10-15ul 的20 mg /ml 蛋白酶K涡旋混匀30-40min，温度为60-80℃，期间每隔10min震荡一次；(3)、DNA样本的纯化处理及检测过程为：取出Ep管瞬甩，加入180-200 ul的溶解液2，60-80℃保温10-15min，将Ep管中的液体转移到新的1.5ml的Ep管中，采用离心机进行离心，离心6-8min，抽吸上清液到另一个Ep管中，然后加入等体积的冷的异丙醇，颠倒混匀，采用离心机进行离心5-10min，缓缓倒出上清液，在干净的吸水纸上倒扣Ep管将其中少量的液体倒出，再加入1-3ml的 70%乙醇洗涤沉淀，采用离心机进行离心5-8min，缓缓倒出上清，在干净的吸水纸上倒扣Ep管使其中少量的液体自然流出，并晾干15-20min，加入30ul的DNA溶解液3，涡旋5秒，瞬甩，再采用离心机离心5-8min，吸取上清液，然后转移到新的Ep管中，采用分光光度计检测OD值。
2.根据权利要求1所述的适用于多种样本的DNA提取试剂配制方法和提取方法，其特征在于所述的溶解液1为10mmol /L 的Tris -HCl， 10 mmol /L 的KCl， 10 mmol /L 的MgCl2， 2 mmol /L 的EDTA， 0.4 mol /L的 NaCl， 1% 的SDS配合而成的水溶液。
3.根据权利要求1所述的适用于多种样本的DNA提取试剂配制方法和提取方法，其特征在于所述的溶解液2为5 mol /L NaCl溶液。
4.根据权利要求1所述的适用于多种样本的DNA提取试剂配制方法和提取方法，其特征在于所述的溶解液3为去离子水或者为采用10 mmol /L 的Tris -HCl，1 mmol /L 的EDTA配制成的水溶液。
5.根据权利要求1所述的适用于多种样本的DNA提取试剂配制方法和提取方法，其特征在于所述的样本的预处理过程为：采用钥匙将血凝块转入干净的玻璃研磨器中，加入380-410ul的溶液4，充分研磨直到没有明显的血凝块，吸取0.4-0.5ml的研磨液到新的1.5ml的Ep管中，然后加入适量的溶解液4补充体积到1.5ml，室温静置10-15min，然后采用离心机进行离心，吸弃上清液，重复上步骤2-3次，得到白细胞沉淀。
6. 根据权利要求1所述的适用于多种样本的DNA提取试剂配制方法和提取方法，其特征在于所述的溶解液4采用1.0g的KHCO3，8.3g 的NH4CL和0.037 g 的EDTA-Na2，加入1000ml双蒸水配制成的工作液。
7.根据权利要求1所述的适用于多种样本的DNA提取试剂配制方法和提取方法，其特征在于所述的样本的预处理过程为：它的样本的预处理过程为：将抗凝血吹吸均匀，取出0.3-0.5ml的血液到1.5ml的Ep管中，然后加入适量的溶解液4补充体积到1.5ml，室温静置10-15min，采用离心机进行离心3min，吸弃上清液，重复上步骤2-3次，得到白细胞沉淀。
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104152438A (zh) * | 2014-08-15 | 2014-11-19 | 四川农业大学 | 用于提取家禽dna的细胞裂解液、试剂盒和方法 |
| CN105567677A (zh) * | 2016-02-23 | 2016-05-11 | 浙江师范大学 | 棘胸蛙快速无损伤取样方法 |
| CN106754865A (zh) * | 2016-11-24 | 2017-05-31 | 上海交通大学医学院附属新华医院 | 一种血凝块液化方法 |
| CN107119045A (zh) * | 2017-05-18 | 2017-09-01 | 厦门美因生物科技有限公司 | 一种口腔拭子基因组dna提取方法及试剂盒 |
| CN107794255A (zh) * | 2016-08-30 | 2018-03-13 | 天津市康婷生物工程有限公司 | 专门用于快速大量提取口腔上皮细胞dna 的方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101153309A (zh) * | 2007-09-12 | 2008-04-02 | 中国农业大学 | 从哺乳动物凝固血中提取基因组dna的方法 |
| CN101935645A (zh) * | 2010-09-13 | 2011-01-05 | 原平皓(天津)生物技术有限公司 | 一种从组织细胞中提取dna的试剂盒及其方法 |
| CN102604935A (zh) * | 2012-04-09 | 2012-07-25 | 邢秀梅 | 一种安全快速从血液中提取基因组dna的方法 |
| CN102725407A (zh) * | 2010-01-07 | 2012-10-10 | 比格科技私人有限公司 | 分离核酸的方法及其试剂盒 |
-
2012
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101153309A (zh) * | 2007-09-12 | 2008-04-02 | 中国农业大学 | 从哺乳动物凝固血中提取基因组dna的方法 |
| CN102725407A (zh) * | 2010-01-07 | 2012-10-10 | 比格科技私人有限公司 | 分离核酸的方法及其试剂盒 |
| CN101935645A (zh) * | 2010-09-13 | 2011-01-05 | 原平皓(天津)生物技术有限公司 | 一种从组织细胞中提取dna的试剂盒及其方法 |
| CN102604935A (zh) * | 2012-04-09 | 2012-07-25 | 邢秀梅 | 一种安全快速从血液中提取基因组dna的方法 |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104152438A (zh) * | 2014-08-15 | 2014-11-19 | 四川农业大学 | 用于提取家禽dna的细胞裂解液、试剂盒和方法 |
| CN105567677A (zh) * | 2016-02-23 | 2016-05-11 | 浙江师范大学 | 棘胸蛙快速无损伤取样方法 |
| CN105567677B (zh) * | 2016-02-23 | 2018-05-18 | 浙江师范大学 | 棘胸蛙快速无损伤取样方法 |
| CN107794255A (zh) * | 2016-08-30 | 2018-03-13 | 天津市康婷生物工程有限公司 | 专门用于快速大量提取口腔上皮细胞dna 的方法 |
| CN106754865A (zh) * | 2016-11-24 | 2017-05-31 | 上海交通大学医学院附属新华医院 | 一种血凝块液化方法 |
| CN107119045A (zh) * | 2017-05-18 | 2017-09-01 | 厦门美因生物科技有限公司 | 一种口腔拭子基因组dna提取方法及试剂盒 |
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