CN104152436B - Dna分离纯化方法及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种DNA分离纯化方法及其试剂盒，方法包括下列步骤：(a)将裂解缓冲液加入到含有DNA的生物样本中以得到溶解的生物样本缓冲溶液；然后剧烈摇晃缓冲溶液；(b)在剧烈摇晃后的所述缓冲溶液中加入沉淀液，之后剧烈摇晃，离心，形成蛋白质沉淀和上清液；(c)将所述的上清液加入纯化柱中，洗脱DNA。使用本发明的DNA分离纯化方法：样本溶解，血红蛋白沉淀，柱纯化，洗脱DNA，小于15分钟。无需另外添加乙醇，或者调整pH，盐分等条件，DNA就可以吸附到纯化柱上。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术中的核酸纯化领域，特别是指一种DNA分离纯化方法及其试剂盒。
背景技术
传统的DNA纯化方法是用SDS(十二烷基磺酸钠)、TX-100、CTAB(cetyltrimethylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化铵)等试剂裂解细胞，然后经酚、氯仿(有毒性)抽提去除蛋白质，使DNA释放到上清中，上清液中的DNA再经乙醇或异丙醇沉淀回收。但是这样纯化的DNA中仍存留一部分蛋白质、多糖等物质，需采用其它形式的纯化方法进一步纯化DNA。如比格科技私人有限公司的公开号为CN102725407A，公开日为2012.10.10，名称为分离核酸的方法及其试剂盒的发明专利，即公开了如下的技术特征，一种从样本中分离核酸的方法，所述方法包括下列步骤：(a)将裂解缓冲液加入到含有核酸的样本中以得到裂解溶液；或者(b)将裂解缓冲液连同结合缓冲液一起加入到样本中以得到裂解溶液；(c)将结合缓冲液加入到步骤(a)的溶液中以使核酸与基质结合，或者使步骤(b)的溶液与基质直接结合；和(d)洗涤和洗脱与基质结合的核酸以分离和纯化核酸。
采用SDS(十二烷基硫酸钠)和氢氧化钠的溶解液溶解细胞，再用含有乙酸钾和乙酸的混合液中和溶解液，使大部分蛋白质沉淀下来，DNA溶解在上清液中。但是这种方法主要用于质粒DNA的分离纯化，如果用于抗凝全血中DNA的分离纯化，则根本不能使血红蛋白沉淀下来。
市场上其他公司已经商品化的血液DNA提取试剂盒，细菌DNA提取试剂盒均需要蛋白酶K消化步骤，价格昂贵，时间比较长。
发明内容
本发明提出一种DNA分离纯化方法及其试剂盒，解决了现有技术中无法快速分离纯化DNA的问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种DNA分离纯化方法，所述方法包括下列步骤：
(a)将裂解缓冲液加入到含有DNA的生物样本中以得到溶解的生物样本缓冲溶液；然后剧烈摇晃缓冲溶液；
(b)在剧烈摇晃后的所述缓冲溶液中加入沉淀液，之后剧烈摇晃，离心，形成蛋白质沉淀和上清液；
(c)将所述的上清液加入纯化柱中，洗脱DNA。
作为优选的技术方案，所述裂解缓冲液选自氯化铵、硫氰酸铵、硫氰酸胍、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫氰酸钠、TX-114、十二烷基肌氨酸钠中的几种的混合物。其中氯化铵、硫氰酸铵、硫氰酸胍、硫氰酸钠溶解用作溶解生物样本中的蛋白质组分。磷酸二氢钠、磷酸氢二钠维持裂解缓冲液稳定的pH值。TX-114、十二烷基肌氨酸钠用作溶解生物样本中的脂质组分。
作为优选的技术方案，所述裂解缓冲液为：
1％-5％(g/g)磷酸氢二钠
0.1％-1％(g/g)磷酸二氢钠
1％-5％(g/g)十二烷基氨酸钠
1-2M氯化铵
1.5-2.5M硫氰酸铵 以及
3.5-5M硫氰酸胍。
作为优选的技术方案，所述裂解缓冲液为：
1.5％(g/g)磷酸氢二钠
0.5％(g/g)磷酸二氢钠
1.6％(g/g)十二烷基肌氨酸钠
1.5M氯化铵
2M硫氰酸铵以及
4M硫氰酸胍。
作为优选的技术方案，所述样本为生物样本。
作为优选的技术方案，所述生物样本为抗凝全血、唾液、细胞或细菌。
作为优选的技术方案，所述生物样本选自抗凝全血。
作为优选的技术方案，所述沉淀液选自氯化锌、硫酸钠、乙酸锌、氯化钠、氯化钾、硫酸锌、硫酸胍、乙酸钾、乙酸钠、乙酸胍、盐酸胍中的几种的混合物。其中氯化锌、乙酸锌、硫酸锌等物质提供锌离子作为蛋白组分的沉淀内核。硫酸钠、氯化钠、氯化钾等物质可促成蛋白组分盐析沉淀。乙酸钾、乙酸钠等物质维持沉淀液稳定的pH值。硫酸胍、乙酸胍、盐酸胍等物质维持沉淀液中含有高浓度的盐分。
作为优选的技术方案，所述沉淀液为：
5％-10％(g/g)乙酸钠或乙酸钾
2％-10％(g/g)乙酸
10％-50％(g/g)硫酸锌
1-2M氯化钾 以及
1-2M盐酸胍。
作为优选的技术方案，所述沉淀液为：
8％(g/g)乙酸钠或乙酸钾
5％(g/g)乙酸
15％(g/g)硫酸锌
1M氯化钾 以及
1.5M盐酸胍。
作为优选的技术方案，所述纯化柱为含有二氧化硅介质的纯化柱。
作为优选的技术方案，所述缓冲液、样本、沉淀液的体积比是3-5：2-4：1-3。
作为优选的技术方案，所述缓冲液、样本、沉淀液的体积比是3:4:3。
一种DNA分离纯化试剂盒，包括上述裂解缓冲液和沉淀液。
有益效果
(1)简便、快速
传统全血DNA分离纯化方法：红细胞去除，白细胞蛋白酶K消化，酚氯仿抽提，异丙醇沉淀，乙醇洗涤，DNA溶解，约1-2小时；
QIAGEN全血试剂盒：样本溶解，蛋白酶K消化，补加乙醇，柱纯化，洗脱DNA，约30-45分钟；
使用本发明的DNA分离纯化方法：样本溶解，血红蛋白沉淀，柱纯化，洗脱DNA，小于15分钟。无需另外添加乙醇，或者调整pH，盐分等条件，DNA就可以吸附到纯化柱上。
(2)廉价，蛋白酶K是昂贵的试剂，本发明不使用蛋白酶K。
(3)环保，与传统DNA分离纯化方法相比，无需酚、氯仿等有害化学品的使用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方案或现有技术中的技术方案，下面将对实施方案或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方案，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1：从11个不同的人抗凝全血样本中分离纯化DNA的效果图(实施例1)。
图2：从6个相同的金黄色葡萄球菌样本中分离纯化DNA的效果图(实施例2)。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明涉及一种DNA分离纯化方法，它能将生物大分子中的蛋白质分子沉淀去除，DNA分子溶解在溶液中，特别适合蛋白含量很高的生物学样本(比如抗凝全血)中DNA的分离纯化，溶解在溶液中的DNA的还可以直接吸附到含有二氧化硅介质的纯化柱上，洗脱后即获得高纯度的DNA。我公司利用该技术开发成的产品有：全血DNA小量试剂盒、细菌DNA试剂盒。本发明的一种DNA分离纯化方法，所述方法包括下列步骤：
(a)将裂解缓冲液加入到含有DNA的样本中以得到缓冲溶液；然后剧烈摇晃缓冲溶液；
(b)在剧烈摇晃后的所述缓冲溶液中加入沉淀液，之后剧烈摇晃，离心，形成蛋白质沉淀和上清液；
(c)将所述的上清液加入纯化柱中，洗涤、洗脱DNA。
详见实施例。
实施例1
全血DNA小量试剂盒操作步骤：
其中Buffer L1为裂解缓冲溶液为：
1.5％磷酸氢二钠
0.5％磷酸二氢钠
1.6％十二烷基肌氨酸钠
1.5M氯化铵
2M硫氰酸铵 以及
4M硫氰酸胍。
Buffer L2为沉淀液：
8％乙酸钾
5％乙酸
15％硫酸锌
1M氯化钾以及
1.5M盐酸胍。
本操作步骤是为从400μl全血中提取DNA而设计，如果血液体积小于400μl但大于200μl，可按比例减少Buffer L1和Buffer L2的用量，其他试剂用量不变；但如果血液体积小于200μl，建议在血液中补充生理盐水至血液体积至少至200μl。
1.加300μl Buffer L1到1.5ml离心管中。
2.加入400μl全血，盖上管盖，旋涡振荡30秒。
3.加入300μl Buffer L2，剧烈摇晃离心管3－5次，再旋涡振荡30秒混匀。
4.13000rpm离心2分钟。
5.将步骤4中的上清液倒入到核酸纯化柱中(核酸纯化柱置于2ml离心管中)，盖上管盖，12000rpm离心30秒。
6.弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，在核酸纯化柱中加入500μl Buffer WA,盖上管盖，12000rpm离心30秒。
7.弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，在核酸纯化柱中加入600μl Buffer WB,盖上管盖，12000rpm离心30秒。
8.弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，14000rpm离心1分钟。
9.弃2ml离心管，将核酸纯化柱置于一个洁净的1.5ml离心管中，在纯化柱中央加100-200μl 56℃温育的Buffer TE，盖上管盖，室温静置1分钟，12000rpm离心30秒。
10.弃纯化柱，洗脱的DNA可立即用于各种分子生物学实验；或者将DNA储存于-20℃备用。
参见图1：从左至右11个血样DNA的紫外吸收值数据如下：
| 样品编号 | Abs260 | Abs280 | 260/280 | 样品浓度 | 样品类型 |
| 1 | 1.008 | 0.578 | 1.75 | 50.4193ng/ul | dDNA |
| 2 | 3.632 | 2.005 | 1.81 | 181.5965ng/ul | dDNA |
| 3 | 1.465 | 0.849 | 1.72 | 73.2436ng/ul | dDNA |
| 4 | 0.864 | 0.491 | 1.76 | 43.2097ng/ul | dDNA |
| 5 | 0.967 | 0.548 | 1.76 | 48.3490ng/ul | dDNA |
| 6 | 0.489 | 0.275 | 1.78 | 24.4487ng/ul | dDNA |
| 7 | 0.796 | 0.447 | 1.78 | 39.7854ng/ul | dDNA |
| 8 | 0.438 | 0.257 | 1.71 | 21.9022ng/ul | dDNA |
| 9 | 0.891 | 0.501 | 1.78 | 44.5579ng/ul | dDNA |
| 10 | 0.323 | 0.188 | 1.72 | 16.1646ng/ul | dDNA |
| 11 | 0.629 | 0.354 | 1.74 | 31.4288ng/ul | dDNA |
实施例2
细菌DNA试剂盒操作步骤
其中Buffer L1为裂解缓冲溶液：
5％磷酸氢二钠
1％磷酸二氢钠
5％十二烷基肌氨酸钠
2M氯化铵
2.5M硫氰酸铵 以及
3.5M硫氰酸胍。
Buffer L2为沉淀液：
10％乙酸钾
10％乙酸
50％硫酸锌
2M氯化钾 以及
1M盐酸胍。
具体步骤如下：
1.用1.5ml离心管收集≤2.0×109细菌培养物，加入200μl Buffer TE，旋涡震荡充分悬浮细菌。
2.加入100μl溶菌酶溶液，旋涡振荡约15秒混匀，37℃水浴30分钟。
3.加入225μl Buffer L1，旋涡振荡30秒。
4.加入225μl Buffer L2，剧烈摇晃离心管3－5次，再旋涡振荡30秒混匀。
5.13000rpm离心2分钟。
6.将步骤5中的上清液倒入到核酸纯化柱中(核酸纯化柱置于2ml离心管中)，盖上管盖，12000rpm离心30秒。
7.弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，在核酸纯化柱中加入500μl Buffer WA,盖上管盖，12000rpm离心30秒。
8.弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，在核酸纯化柱中加入600μl Buffer WB,盖上管盖，12000rpm离心30秒。
9.弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，14000rpm离心1分钟。
10.弃2ml离心管，将核酸纯化柱置于一个洁净的1.5ml离心管中，在纯化柱中央加100～200μl 37℃温育的Buffer TE，盖上管盖，室温静置1分钟，12000rpm离心30秒。
11.弃纯化柱，洗脱的DNA可立即用于各种分子生物学实验；或者将DNA储存于-20℃备用。
参见图2：从左至右6个金黄色葡萄球菌样本DNA的紫外吸收值数据如下：
| 样品编号 | Abs260 | Abs280 | 260/280 | 样品浓度 | 样品类型 |
| 1 | 0.517 | 0.291 | 1.780 | 129.3ng/ul | dDNA |
| 2 | 0.526 | 0.298 | 1.763 | 131.4ng/ul | dDNA |
| 3 | 0.568 | 0.320 | 1.772 | 141.9ng/ul | dDNA |
| 4 | 0.562 | 0.317 | 1.775 | 140.5ng/ul | dDNA |
| 5 | 0.568 | 0.324 | 1.750 | 141.9ng/ul | dDNA |
| 6 | 0.573 | 0.324 | 1.770 | 143.2ng/ul | dDNA |
实施例3
从培养细胞、唾液中分离纯化DNA的操作步骤
其中Buffer L1为裂解缓冲溶液：
1％磷酸氢二钠
0.1％磷酸二氢钠
1％十二烷基肌氨酸钠
1M氯化铵
1.5M硫氰酸铵 以及
5M硫氰酸胍。
Buffer L2为沉淀液：
5％乙酸钠
2％乙酸
10％硫酸锌
1M氯化钾 以及
2M盐酸胍。
1A.从细胞中分离纯化DNA
a)悬浮培养的细胞
用1.5ml离心管300×g离心5分钟，收集5～10×106细胞，弃培养基，加入300μlPBS溶液悬浮沉淀。
b)贴壁培养的细胞
用胰酶消化或者细胞刮刀刮取的方法收集5～0×106细胞到1.5ml离心管，300×g离心5分钟，弃培养基，加入300μl PBS溶液悬浮沉淀。
1B.从唾液中分离纯化DNA
用1.5ml离心管收集300μl唾液。
2.加入225μl Buffer L1，盖上管盖，旋涡振荡30秒。
3.加入225μl Buffer L2，剧烈摇晃离心管3－5次，再旋涡振荡30秒混匀。
4.13000rpm离心2分钟。
5.将步骤4中的上清液倒入到核酸纯化柱中(核酸纯化柱置于2ml离心管中)，盖上管盖，12000rpm离心30秒。
6.弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，在核酸纯化柱中加入500μl Buffer WA,盖上管盖，12000rpm离心30秒。
7.弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，在核酸纯化柱中加入600μl Buffer WB,盖上管盖，12000rpm离心30秒。
8.弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，14000rpm离心1分钟。
9.弃2ml离心管，将核酸纯化柱置于一个洁净的1.5ml离心管中，在纯化柱中加入100～200μl 56℃温育的Buffer TE，盖上管盖，室温静置1分钟，12000rpm离心30秒。
10.弃纯化柱，洗脱的DNA可立即用于各种分子生物学实验，或者将DNA储存于-20℃备用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种DNA分离纯化方法，所述方法包括下列步骤：
(a)将裂解缓冲液加入到含有DNA的生物样本中以得到溶解的生物样本缓冲溶液；然后剧烈摇晃缓冲溶液；
(b)在剧烈摇晃后的所述缓冲溶液中加入沉淀液，之后剧烈摇晃，离心，形成蛋白质沉淀和上清液；
(c)将所述的上清液加入纯化柱中，洗脱DNA；
所述裂解缓冲液由1-2M氯化铵、1.5-2.5M硫氰酸铵、3.5-5M硫氰酸胍、0.1％-1％g/g磷酸二氢钠、1％-5％g/g磷酸氢二钠、1％-5％g/g十二烷基肌氨酸钠组成；
所述沉淀液由5％-10％g/g乙酸钠或乙酸钾、2％-10％g/g乙酸、10％-50％g/g硫酸锌、1-2M氯化钾以及1-2M盐酸胍组成；
所述裂解缓冲液、样本、沉淀液的体积比是3∶4∶3。
2.根据权利要求1所述的一种DNA分离纯化方法，其特征在于，所述生物样本为抗凝全血、唾液、细胞或细菌。
3.根据权利要求1所述的一种DNA分离纯化方法，其特征在于，所述纯化柱为含有二氧化硅介质的纯化柱。
4.一种DNA分离纯化试剂盒，包括上述权利要求1-3任一权利要求所述裂解缓冲液和沉淀液。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |