CN107208089A - 用于纯化质粒dna的方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及用于核酸纯化的方法，所述方法包括(a)将包含至少一种核酸的样品与悬浮缓冲液结合以形成悬浮液，(b)将所述悬浮液与裂解缓冲液结合以形成裂解液，(c)将所述裂解液与结合缓冲液结合以形成溶液；(d)将所述溶液与至少一种磁性颗粒结合以形成合并溶液，所述合并溶液包含与至少一种核酸可逆结合的至少一种修饰的磁性颗粒，(e)从所述合并溶液中分离所述至少一种修饰的磁性颗粒，(f)用第一洗涤缓冲液和第二洗涤缓冲液洗涤所述至少一种修饰的磁性颗粒，以及(g)将至少一种修饰的磁性颗粒与洗脱缓冲液结合。本文还公开了包含这些缓冲液和磁性颗粒的试剂盒。

Description

用于纯化质粒DNA的方法和试剂盒
本申请根据35U.S.C.§119，要求2014年12月9日提交的序列号为62/089333的美国临时申请的优先权的权益，本文以该申请为基础并将其全文通过引用结合于此。
技术领域
本公开一般涉及用于核酸纯化的方法和试剂盒，更具体地，涉及用于纯化转染级别质粒DNA的基于磁性颗粒的试剂盒和方法。
背景技术
核酸纯化(如DNA或RNA的分离)可以是多种生物化学和诊断过程中的重要步骤。质粒DNA(pDNA)可用于许多应用中，从制备载体用于克隆到产生模板用于转录或偶联转录/翻译反应。在能够进行其他加工步骤(如克隆、转染、测序、扩增、杂交和/或合成等)之前，需要从其中常发现核酸的复杂混合物(例如组织、细胞、流体等)中分离出核酸。污染物质(例如蛋白质、脂质和/或碳水化合物)的存在可能阻碍或阻止这些过程中的许多过程。例如，在分离期间携带的杂质可降低产量和/或防止酶系统合成感兴趣的产物。另外，DNA还可能污染RNA应用，反之亦然。因此，从各种不同的起始物质中有效地分离出核酸以确保所需的最终用途功能可以是重要的。
在一些情况下，所选用于纯化核酸的方法影响分离的产物的多种特性，包括核酸样品的产量、质量和/或纯度。虽然已开发了许多用于核酸纯化的方法，但这些方法可能具有一种或多种缺点，包括例如成本高、复杂程度高、速度低、产量低、纯度低、污染、毒性和/或低效。先前已经用磁性颗粒在各种纯化方法中结合和分离核酸。这些方法可以具有一些优势，如消除了离心和/或真空处理步骤，得到了较高纯度的产物和/或提高了操作者的安全性。然而，使用磁性颗粒的方法仍然可能具有各种缺点，例如速度慢、复杂程度高和/或总产量低。
因此，将会有利的是提供可以更快、复杂程度更低、更便宜和/或使产品纯度和/或产量提高的，用于核酸纯化的基于磁性颗粒的方法和试剂盒。所形成的经纯化的核酸可用于各种各样的生物化学和诊断应用，例如聚合酶链反应(PCR)、克隆、转染、限制性消化和临床诊断。
发明内容
在各个实施方式中，本公开涉及用于纯化核酸的方法，所述方法包括(a)将包含至少一种核酸的样品与悬浮缓冲液结合以形成悬浮液，(b)将所述悬浮液与裂解缓冲液结合以形成裂解液，(c)将所述裂解液与结合缓冲液结合以形成溶液；(d)将所述溶液与至少一种磁性颗粒结合以形成合并溶液，所述合并溶液包含与至少一种核酸可逆结合的至少一种修饰的磁性颗粒，(e)从所述合并溶液中分离所述至少一种修饰的磁性颗粒，(f)用第一洗涤缓冲液和第二洗涤缓冲液洗涤所述至少一种修饰的磁性颗粒，以及(g)将修饰的磁性颗粒与洗脱缓冲液结合。
根据各个实施方式，悬浮缓冲液可包含至少一种离子螯合剂，其存在的浓度范围为约1mM至约10mM；和至少一种缓冲化合物，其存在的浓度范围为约10mM至约100mM。裂解缓冲液可包含至少一种去垢离液剂，其存在的浓度范围为，以重量计，约1％至约10％；和至少一种缓冲化合物，其存在的浓度为大于或等于约0.2M。在非限定性的实施方式中，结合缓冲液可包含至少一种离液剂，其存在的浓度范围为约4M至约6M；任选地，至少一种盐，其存在的浓度范围为约0.1M至约2M；至少一种醇，以体积计，其存在的浓度范围为约1％至约5％和至少一种缓冲化合物，其存在的浓度范围为，以重量计，约0.25％至约3％。根据其他实施方式，第一洗涤缓冲液可包含至少一种离液剂，其存在的浓度范围为约4M至约6M；至少一种离子螯合剂，其存在的浓度范围为约1mM至约10mM；至少一种缓冲化合物，其存在的浓度范围为约10mM至约100mM和至少一种醇，其存在的浓度范围为，以体积计，约30％至约50％。在另外的实施方式中，第二洗涤缓冲液可以包含至少一种醇和任选的至少一种盐。磁性颗粒可选自，例如，羧基包被的磁性颗粒、基于二氧化硅的磁性颗粒及其组合。本文还公开了一种核酸纯化试剂盒，其包含这些缓冲液和磁性颗粒。
在以下的详述中给出了本发明的其他特征和优点，对本领域的技术人员而言，其中的部分特征和优点根据所作描述就可以容易地看出，或者通过实施包括以下详述、权利要求书和附图在内的本文所述的本发明而被认识。
应理解，前面的一般性描述和以下的发明详述都显示了本公开的多种实施方式，并旨在提供用于理解权利要求的性质和特性的总体评述或框架。包括的附图提供了对本公开的进一步的理解，附图结合于本说明书中并构成说明书的一部分。附图例示了本公开的各种实施方式，并与说明书一起用来解释本发明的原理和操作。
附图简要说明
结合以下附图阅读，便可以最好地理解下文中的详述，图中相同的结构用相同的附图标记表示，其中：
图1为示出了根据本公开的一个实施方式的核酸纯化方法的流程图；
图2为与现有技术方法相比，示出了根据本公开的多个实施方式的方法的pDNA产量图；
图3为与现有技术方法相比，示出了根据本公开的多个实施方式的方法的转染效率图；
图4示出了使用根据本公开的多个实施方式的方法和使用现有技术方法纯化的pDNA(使用或未使用EcoRI切割)的琼脂糖凝胶电泳分析；
图5为与现有技术方法相比，示出了根据本公开的多个实施方式的方法的pDNA产量图；和
图6为与现有技术方法相比，示出了根据本公开的多个实施方式的方法的转染效率图。
详述
方法
本文公开了用于核酸纯化的方法，所述方法包括(a)将包含至少一种核酸的样品与悬浮缓冲液结合以形成悬浮液，(b)将所述悬浮液与裂解缓冲液结合以形成裂解液，(c)将所述裂解液与结合缓冲液结合以形成溶液，(d)将所述溶液与至少一种磁性颗粒结合以形成合并溶液，所述合并溶液包含与至少一种核酸可逆结合的至少一种修饰的磁性颗粒，(e)从所述合并溶液中分离所述至少一种修饰的磁性颗粒，(f)用第一洗涤缓冲液和第二洗涤缓冲液洗涤所述至少一种修饰的磁性颗粒，以及(g)将所述至少一种修饰的磁性颗粒与洗脱缓冲液结合。
参考图1将对本公开的实施方式进行讨论，图1示出了根据本公开的非限定性实施方式的核酸纯化方法的流程图。以下总体说明旨在提供权利要求所主张方法的概述，并将参考非限定性实施方式在整个公开中对多个方面进行更具体地讨论，这些实施方式在下文所讨论的通用方法的上下文中可彼此互换。
如在图1中所示，在步骤S中，包含至少一种核酸的样品(例如细菌)105可悬浮在悬浮缓冲液中。然后，在步骤L中可以裂解样品以生成裂解液，该裂解液包含pDNA 120和各种污染物110，该污染物110包括不期望的核酸115(例如RNA和基因组DNA)。裂解液还可与结合/中和缓冲液结合和孵育，并且在步骤C中通过离心分离出附聚物或大分子125进行处理。接着可将磁性颗粒130加入到剩余溶液中。在步骤B中，从样品(细菌)105中释放出来的pDNA120可以可逆地结合至磁性颗粒130的表面。磁体135可用于吸引磁性颗粒130并且将它们从剩余溶液中分离出来。在步骤W中，通过使用一种或多种洗涤缓冲液洗涤磁性颗粒130，可除去未结合的污染物110。接着，在步骤E中，使用洗脱缓冲液可从磁性颗粒中洗脱并分开pDNA120。在步骤P中，例如使用磁体，可从溶液中除去磁性颗粒130以生成经纯化的pDNA产物，其接着可用于各种应用。
本文所用术语“包含至少一种核酸的样品”及其变化形式旨在表示从生物或环境样品中获得的任何材料(如试样或培养物)，其可以含有至少一种核酸，例如DNA分子、RNA分子或DNA/RNA杂交分子。所述至少一种核酸可包括，例如，基因组DNA、染色体DNA(cDNA)、质粒DNA(pDNA)、总RNA、信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)和/或RNA/DNA杂交体。生物样品可包括人和动物样品，例如细胞、组织和体液，所述体液如尿、全血和源自血液的流体(如血清和血浆)。举例来说，环境样品可包括植物组织(例如琼脂糖)和细菌样品。在各个实施方式中，样品可包括细菌培养物。例如，细菌培养物可在O.D.600浓度大致等于1(8x 108细胞/ml)下过夜制备。根据另外的实施方式，待纯化的所述至少一种核酸可为DNA，例如，pDNA。
包含所述至少一种核酸的样品可结合于(例如悬浮于)悬浮缓冲液(S1)中(参见图1中的步骤S)。在各个实施方式中，悬浮缓冲液S1可包含至少一种离子螯合剂(IC1)和至少一种缓冲化合物(B1)。悬浮缓冲液S1还可包含RNA酶，其浓度在约10μg/ml至约1,000μg/ml的范围内，如约50μg/ml至约500μg/ml，或约100μg/ml至约250μg/ml，包括其间所有范围和子范围。在某些实施方式中，可将RNA酶先加入到悬浮缓冲液S1中再与样品结合。
所述至少一种离子螯合剂IC1可以一定的浓度范围存在于悬浮缓冲液S1中，例如约1mM至约10mM，如约2mM至约9mM、约3mM至约8mM、约4mM至约7mM或约5mM至约6mM，包括其间所有范围和子范围。例如，IC1浓度可为约1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、5mM、5.5mM、6mM、6.5mM、7mM、7.5mM、8mM、8.5mM、9mM、9.5mM或10mM，包括其间所有范围和子范围。根据各个实施方式，所述至少一种离子螯合剂IC1可选自：乙二胺四乙酸(EDTA)及其异构体，例如乙二胺-N,N’-二琥珀酸(EDDS)；环己烷-1,2-二胺四乙酸(CDTA)；亚氨基二琥珀酸(IDS)；聚天冬氨酸(PASA)；甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)；L-谷氨酸N,N-二乙酸,四钠盐(GLDA)及其组合。在某些非限定性的实施方式中，所述至少一种离子螯合剂IC1可选自EDTA及其异构体。在各个实施方式中，所述至少一种离子螯合剂IC1还可用作蛋白酶抑制剂。
所述至少一种缓冲化合物B1可以一定的浓度存在于悬浮缓冲液S1中，所述浓度例如在约10mM至约100mM的范围内，如约20mM至约90mM、约30mM至约80mM、约40mM至约70mM或约50mM至约60mM，包括其间所有范围和子范围。例如，B1浓度可为约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM或100mM，包括其间所有范围和子范围。根据各个实施方式，所述至少一种缓冲化合物B1可选自Tris、Tris-HCl、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)，及其组合。在某些非限定性的实施方式中，所述至少一种缓冲化合物B1可选自Tris(三羟甲基氨基甲烷)和Tris-HCl。
在各个实施方式中，所述至少一种缓冲化合物B1在约25℃下的pKa可以在约7至约9的范围内，例如约7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9，包括其间所有范围和子范围。所述至少一种缓冲化合物B1可包括在悬浮缓冲液S1中，其量足以将pH调节到约7至约10范围内的值，如约7.5至约9.5、约8.5至约9、约8至约8.3，包括其间所有范围和子范围。例如，S1的pH可以等于约7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10，包括其间所有范围和子范围。
悬浮后，可加入裂解缓冲液S2以形成来自悬浮样品的裂解液(参见例如图1中的步骤L)。在各个实施方式中，裂解缓冲液S2可包含至少一种去垢离液剂(DC)和至少一种缓冲化合物(B2)。悬浮液和裂解缓冲液S2可以本领域已知的任何方式结合，例如，可将裂解缓冲液S2加入到悬浮液中并且例如通过颠倒进行混合。在某些实施方式中，可以将混合物颠倒多次，如至少五次、至少十次或者更多次。通过颠倒结合可确保最佳的细胞裂解效率和/或最终的核酸产量。另外，悬浮液可任选地在裂解缓冲液S2中孵育足以裂解样品的一段时间。该时间段可在例如约30秒至约10分钟的范围内，例如约1分钟至约8分钟、约2分钟至约5分钟、或约3分钟至约4分钟，包括其间所有范围和子范围。
所述至少一种去垢离液剂DC可以一定浓度存在于裂解缓冲液S2中，所述浓度例如以重量计在约1％至约10％的范围内，如约2％至约9％、约3％至约8％、约4％至约7％或约5％至约6％，包括其间所有范围和子范围。例如，DC浓度以重量计可为约1％、1.25％、1.5％、1.75％、2％、2.25％、2.5％、2.75％、3％、3.25％、3.5％、3.75％、4％、4.25％、4.5％、4.75％、5％、5.25％、5.5％、5.75％、6％、6.25％、6.5％、6.75％、7％、7.25％、7.5％、7.75％、8％、8.25％、8.5％、8.75％、9％、9.25％、9.5％、9.75％或10％，包括其间所有范围和子范围。根据各个实施方式，所述至少一种去垢离液剂DC可选自阳离子、阴离子、非离子和两性离子去垢剂或表面活性剂，如十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基苯磺酸钠(SDBS)、月桂基硫酸铵(ALS)、十二烷基硫酸钾(PDS)、肉豆蔻醇聚醚硫酸钠、辛基酚乙氧基化物(例如TritonTMX-100或X-114)、聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酸酯(例如20、40或80)及其组合。在某些非限定性的实施方式中，所述至少一种去垢离液剂DC可选自SDS和SDBS。在各个实施方式中，所述至少一种去垢离液剂DC可用于破坏细胞膜和/或使样品中的脂质和/或蛋白质变性。
所述至少一种缓冲化合物B2可以大于或等于0.2M的浓度存在于裂解缓冲液S2中，所述浓度例如大于或等于约0.25M、0.3M、0.35M、0.4M、0.45M、0.5M、0.55M、0.6M、0.65M、0.7M、0.75M、0.8M、0.85M、0.9M、0.95M、1M或更高，包括其间所有范围和子范围。根据各个实施方式，所述至少一种缓冲化合物B2可选自氢氧化物，例如氢氧化钠(NaOH)、氢氧化锂(LiOH)、氢氧化钾(KOH)、氢氧化铷(RbOH)、氢氧化铯(CsOH)及其组合。在某些非限定性的实施方式中，所述至少一种缓冲化合物B2可为NaOH。
在各个实施方式中，所述至少一种缓冲化合物B2在约25℃下的pKb可以在约0.1至约2的范围内，例如约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2，包括其间所有范围和子范围。所述至少一种缓冲化合物B2可包括在悬浮缓冲液S2中，其量足以将pH调节到约10至约13范围内的值，如约10.5至约12.5或约11至约12，包括其间所有范围和子范围。例如，S2的pH可等于约10、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12、12.1、12.2、12.3、12.4、12.5、12.6、12.7、12.8、12.9或13，包括其间所有范围和子范围。
裂解后，可向裂解液中加入结合(或中和)缓冲液(S3)以形成溶液。结合缓冲液S3可包含至少一种离液剂(C1)、至少一种醇(A1)、任选至少一种盐(Z1)和至少一种缓冲化合物(B3)。裂解液和结合缓冲液S3可以本领域已知的任何方式结合，例如，可将裂解缓冲液S3加入到裂解液中并例如通过颠倒进行混合。在某些实施方式中，可以将混合物颠倒多次，如至少五次、至少十次或者更多次。任选地，裂解液可在结合缓冲液S3中孵育一段时间，所述一段时间足以中和样品和/或促进不需要的污染物的聚集形成(其可表现为云状颗粒)。该时间段可在例如约1分钟至约30分钟的范围内，如约2分钟至约25分钟、约3分钟至约20分钟、约4分钟至约15分钟或约5分钟至约10分钟，包括其间所有范围和子范围。
所述至少一种离液剂C1可以一定的浓度存在于结合缓冲液S3中，所述浓度例如在约4M至约6M的范围内，如约4.2M至约5.8M、约4.4M至约5.6M、约4.6M至约5.4M或约4.8M至约5.2M，包括其间所有范围和子范围。例如，C1浓度可为约4M、4.1M、4.2M、4.3M、4.4M、4.5M、4.6M、4.7M、4.8M、4.9M、5M、5.1M、5.2M、5.3M、5.4M、5.5M、5.6M、5.7M、5.8M、5.9M或6M，包括其间所有范围和子范围。根据各个实施方式，所述至少一种离液剂C1可选自盐酸胍(GuHCl)、硫氰酸胍(GuSCN)、脲及其组合。在某些非限定性的实施方式中，所述至少一种离液剂C1可选自GuHCl和GuSCN。在各个实施方式中，所述至少一种离液剂D1可用于破坏细胞膜和/或使样品中的脂质和/或蛋白质变性。
所述至少一种醇A1可以一定浓度存在于结合缓冲液S3中，所述浓度以体积计，在例如约1％至约5％的范围内，如以体积计约2％至约4％或约2.5％至约3％，包括其间所有范围和子范围。例如，A1浓度以体积计可为约1％、1.5％、2％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％，包括其间所有范围和子范围。根据各个实施方式，所述至少一种醇A1可选自异丙醇、乙醇、甲醇、丁醇及其组合。在某些非限定性的实施方式中，所述至少一种醇A1可为异丙醇。在各个实施方式中，所述至少一种醇A1可以是离液的，并且可以用于破坏细胞膜和/或使样品中的蛋白质变性。
如果存在所述至少一种盐Z1，则其可以一定的浓度存在于结合缓冲液S3中，所述浓度例如在约0.2M至约2M的范围内，如约0.4M至约1.8M、约0.6M至约1.6M、约0.8M至约1.4M或约1M至约1.2M，包括其间所有范围和子范围。例如，Z1浓度可为约0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1M、1.1M、1.2M、1.3M、1.4M、1.5M、1.6M、1.7M、1.8M、1.9M或2M，包括其间所有范围和子范围。根据各个实施方式，所述至少一种盐Z1可选自硫酸铵((NH4)2SO4)、乙酸铵(NH4Ac)、乙酸锂(LiAc)、乙酸钾(KAc)、乙酸钠(NaAc)、氯化钠(NaCl)及其组合。在某些非限定性的实施方式中，所述至少一种盐Z1可为硫酸铵。在各个实施方式中，可包括所述至少一种盐Z1以改进核酸纯化，或者，在其它实施方式中，可排除所述至少一种盐Z1，但这样会产生较低的产量。结合缓冲液S3中的盐浓度的升高能够例如促进核酸与磁性颗粒的结合和/或不需要的污染物聚集体的沉淀。
所述至少一种缓冲化合物B3可以一定浓度存在于结合缓冲液S3中，所述浓度以重量计在约0.25％至约3％的范围内，如约0.5％至约2.5％或如约1％至约1.5％，包括其间所有范围和子范围。例如，B3浓度以重量计可为约0.25％、0.5％、0.75％、1％、1.25％、1.5％、1.75％、2％、2.25％、2.5％、2.75％或3％，包括其间所有范围和子范围。根据各个实施方式，所述至少一种缓冲化合物B3可选自冰乙酸、盐酸及其组合。
在各个实施方式中，所述至少一种缓冲化合物B3在约25℃下的pKa可在约4至约7的范围内，例如约4、4.25、4.5、4.75、5、5.25、5.5、5.75、6、6.25、6.5、6.75或7，包括其间所有范围和子范围。所述至少一种缓冲化合物B3可包括在悬浮缓冲液S3中，其量足以将pH调节到约4至约9范围内的值，如约5至约8或约6至约7，包括其间所有范围和子范围。例如，S3的pH可等于约4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9，包括其间所有范围和子范围。
根据各个实施方式，通过例如加入裂解缓冲液S2所产生的碱性条件(例如pH>10)可用于使样品中存在的pDNA和基因组DNA变性。随后的用结合缓冲液S3中和可有助于所公开的方法的总效率，尤其是对于以各种方式纯化pDNA来说。例如，中和可造成基因组DNA以链内的方式形成碱基对，从而形成可从溶液中沉淀出来的不溶性聚集体。通过对比，认为圆形pDNA的共价闭合性质可促进链间重杂化，因而使pDNA保持在溶液中。另外，当结合缓冲液S3包含至少一种盐Z1(例如钾盐、钠盐或锂盐)时，这些盐可与溶液中的一种或多种组分反应形成另外的沉淀物。例如，SDS的钾盐是不溶性的。因此，蛋白质和去垢剂的沉淀和聚集均可有助于截留高分子量基因组DNA。然后，通过例如离心或其它已知方法(例如过滤)可将这些聚集体和任意大分子从溶液中除去(参见，例如图1中的步骤C)，这在下文中会进行更详细的讨论。
加入结合缓冲液后，可将溶液与至少一种磁性颗粒结合以生成合并溶液(参见例如图1中的步骤B)。如在本文中所使用的，术语“磁性颗粒”及其变化形式旨在表示具有磁性(例如顺磁性或超顺磁性)核，且该磁性核被至少一种材料包被的颗粒，所述颗粒具有可与核酸可逆性结合的表面。合适的磁性颗粒可包括，例如，羧基包被的顺磁性颗粒、基于二氧化硅的顺磁性颗粒等。在一些实施方式中，基于二氧化硅的磁性颗粒可包括用硅质氧化物包被的顺磁性核，从而提供了可与核酸结合的含水硅质氧化物吸附性表面(例如，包含硅烷醇基团的表面)。在另外的实施方式中，可对磁性颗粒进行表面修饰以生成官能化的表面，举例来说，例如带弱或强正电荷的表面、带弱或强负电荷的表面或疏水表面。
可商购的磁性颗粒的非限定性实例包括磁量生技有限公司(MagQu Co.Ltd)的Q珠(Qbeads)、格雷斯公司(W.R.Grace&Co.)的格雷斯珠(Grace beads)等。磁性颗粒可具有适于结合核酸的任何尺寸，包括可商购的尺寸，如直径在约0.3μm至约10μm范围内，例如直径为约0.3、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10μm，包括其间所有范围和子范围。例如，Q珠的平均直径可在约4μm至约5μm的范围内，格雷斯珠的平均直径可在约5μm至约10μm的范围内。
在一些实施方式中，可将磁性颗粒加入溶液中作为至少一种介质中的悬浮液。所述介质可选自例如水和/或离液剂。在某些实施方式中，磁性颗粒可为悬浮在水中的Q珠或者悬浮在离液剂(例如GuSCN)中的格雷斯珠。悬浮液中珠的浓度可根据需要变化并且可在例如约10μg/ml至约100μg/ml的范围内，如约20μg/ml至约90μg/ml、约30μg/ml至约80μg/ml、约40μg/ml至约70μg/ml或约50μg/ml至约60μg/ml，包括其间所有范围和子范围。如果使用离液剂，则悬浮液中离液剂的浓度也可根据需要变化并且可以在例如约1M至约8M的范围内，如约2M至约6M或约4M至约5M，包括其间所有范围和子范围。包含磁性珠的溶液的pH可在例如约4至约9的范围内，如约5至约8或者约6至约7，包括其间所有范围和子范围。
不希望囿于理论，认为由结合缓冲液S3导入的相对高浓度的离液剂和/或盐可增强核酸(如pDNA)可逆(例如非共价)结合至磁性颗粒表面(如二氧化硅表面)的能力。然后，可将由此而修饰的磁性颗粒，例如包含可逆结合的核酸的磁性颗粒与未结合的污染物相分离。例如，可将磁体放置于接近修饰的磁性颗粒的位置并用于使颗粒聚拢，例如形成聚集体或丸。在某些实施方式中，可将含有包含修饰的磁性颗粒的合并溶液的容器(如管)置于磁力架上，所述磁力架能够收集并稍微固定颗粒，同时移除剩余溶液。
在核酸与磁性颗粒结合后，以及在使用例如磁体分离经修饰的磁性颗粒后，接着可用一种或多种洗涤缓冲液结合、清洗或洗涤颗粒(参见例如图1中的步骤W)。第一洗涤缓冲液(W1)可包含例如至少一种离液剂(C2)、至少一种离子螯合剂(IC2)、至少一种醇(A2)和至少一种缓冲化合物(B4)。
所述至少一种离液剂C2可以一定的浓度存在于第一洗涤缓冲液W1中，所述浓度例如在约4M至约6M的范围内，如约4.2M至约5.8M、约4.4M至约5.6M、约4.6M至约5.4M或约4.8M至约5M，包括其间所有范围和子范围。例如，C2浓度可为约4M、4.1M、4.2M、4.3M、4.4M、4.5M、4.6M、4.7M、4.8M、4.9M、5M、5.1M、5.2M、5.3M、5.4M、5.5M、5.6M、5.7M、5.8M、5.9M或6M，包括其间所有范围和子范围。根据各个实施方式，所述至少一种离液剂C2可选自盐酸胍(GuHCl)、硫氰酸胍(GuSCN)、脲及其组合。在某些非限定性的实施方式中，所述至少一种离液剂C2可选自GuHCl和GuSCN。在各个实施方式中，所述至少一种离液剂C2可用于促进核酸结合至磁性颗粒表面。
所述至少一种离子螯合剂IC2可以一定的浓度存在于第一洗涤缓冲液W1中，所述浓度例如在约1mM至约10mM的范围内，如约2mM至约9mM、约3mM至约8mM、约4mM至约7mM或约5mM至约6mM，包括其间所用范围和子范围。例如，IC2浓度可为约1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、5mM、5.5mM、6mM、6.5mM、7mM、7.5mM、8mM、8.5mM、9mM、9.5mM或10mM，包括其间所有范围和子范围。根据各个实施方式，所述至少一种离子螯合剂IC2可选自：乙二胺四乙酸(EDTA)及其异构体，例如乙二胺-N,N’-二琥珀酸(EDDS)；环己烷-1,2-二胺四乙酸(CDTA)；亚氨基二琥珀酸(IDS)；聚天冬氨酸(PASA)；甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)；L-谷氨酸N,N-二乙酸,四钠盐(GLDA)及其组合。在某些非限定性的实施方式中，所述至少一种离子螯合剂IC2可选自EDTA及其异构体。在各个实施方式中，所述至少一种离子螯合剂IC2可以用于减少氧化损伤和/或污染核酸酶活性和/或螯合金属离子(如镁)。
所述至少一种醇A2可以一定浓度存在于第一洗涤缓冲液W1中，所述浓度例如以体积计在约30％至约50％的范围内，如以体积计约35％至约45％，包括其间所有范围和子范围。例如，A2浓度可为约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％或50％，包括其间所有范围和子范围。根据各个实施方式，所述至少一种醇A2可选自异丙醇、乙醇、甲醇、丁醇及其组合。在某些非限定性的实施方式中，所述至少一种醇A2可为异丙醇。
所述至少一种缓冲化合物B4可以一定的浓度存在于第一洗涤缓冲液W1中，所述浓度例如在约10mM至约100mM的范围内，如约20mM至约90mM、约30mM至约80mM、约40mM至约70mM或约50mM至约60mM，包括其间所有范围和子范围。例如，B4浓度可为约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM或100mM，包括其间所有范围和子范围。根据各个实施方式，所述至少一种缓冲化合物B4可选自Tris、Tris-HCl、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)，及其组合。在某些非限定性的实施方式中，所述至少一种缓冲化合物B4可选自Tris和Tris-HCl。
在各个实施方式中，所述至少一种缓冲化合物B4在约25℃下的pKa可以在约7至约9的范围内，例如约7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9，包括其间所有范围和子范围。所述至少一种缓冲化合物B4可包括在第一洗涤缓冲液W1中，其量足以将pH调节到约6至约8范围内的值，如约6.5至约7.5或约6.8至约7.2，包括其间所有范围和子范围。例如，W1的pH可等于约6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8，包括其间所有范围和子范围。
还可用第二洗涤缓冲液(W2)结合、清洗或洗涤经修饰的磁性颗粒，所述第二洗涤缓冲液(W2)可以包含至少一种醇(A3)和任选的至少一种盐(Z2)。所述至少一种醇A3可以一定浓度存在于第二洗涤缓冲液W2中，所述浓度以体积计，在例如约70％至约100％的范围内，如以体积计约75％至约95％或约80％至约90％，包括其间所有范围和子范围。例如，A3浓度可为约70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％，包括其间所有范围和子范围。根据各个实施方式，所述至少一种醇A3可选自异丙醇、乙醇、甲醇、丁醇及其组合。在某些非限定性的实施方式中，所述至少一种醇A3可为乙醇。
如果存在所述至少一种盐Z2，则其可以一定的浓度存在于第二洗涤缓冲液W2中，所述浓度例如在约10mM至约100mM的范围内，如约20mM至约90mM、约30mM至约80mM、约40mM至约70mM或约50mM至约60mM，包括其间所有范围和子范围。例如，Z2浓度可为约10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM或100mM，包括其间所有范围和子范围。根据各个实施方式，所述至少一种盐Z2可选自硫酸铵((NH4)2SO4)、乙酸铵(NH4Ac)、乙酸锂(LiAc)、乙酸钾(KAc)、乙酸钠(NaAc)、氯化钠(NaCl)及其组合。在某些非限定性的实施方式中，所述至少一种盐Z2可选自NaAC和NH4AC。
根据各个实施方式，第二洗涤缓冲液W2的pH可在例如约6至约8的范围内，如约6.2至约7.5、约6.5至约7或约6.4至约6.8，包括其间所有范围和子范围。第二洗涤缓冲液W2的pH可通过改变醇和/或盐的量调节，或者可使用如本文公开的一种或多种缓冲化合物(如冰乙酸或NaOH)调节。
加入和移除洗涤缓冲液W1和W2后，可提供表面上可逆结合有核酸的修饰的磁性颗粒，其可不含或基本不含污染物(如细胞碎片、脂质、蛋白质和/或不需要的核酸)。根据各个实施方式，接着可将由此形成的经修饰的磁性颗粒与洗脱缓冲液(E1)结合以释放结合的核酸并且将结合的核酸与磁性颗粒分离(参见例如图1中的步骤E)。经修饰的磁性颗粒可在洗脱缓冲液E1中孵育足以释放核酸的一段时间，如约30秒至约10分钟，例如，约45秒至约9分钟、约1分钟至约8分钟、约2分钟至约7分钟、约3分钟至约6分钟或约4分钟至约5分钟，包括其间所有范围和子范围。
洗脱缓冲液E1可包含例如水或相对低的盐溶液，所述相对低的盐溶液包含例如至少一种缓冲化合物(如Tris等)、至少一种盐和/或至少一种离子螯合剂(如EDTA等)。在某些实施方式中，洗脱缓冲液E1可包含约10mM至约100mM的至少一种缓冲化合物和约0.1mM至约10mM的至少一种离子螯合剂。根据一个非限定性的实施方式，洗脱缓冲液E1可包含10mMTris和1mM EDTA。
随后，可从溶液中除去(不再与核酸结合的)磁性颗粒，例如使用磁体分离，从而生成作为终产物的溶液中的纯化的核酸(参见例如图1中的步骤P)。例如，本文公开的方法和试剂盒可用于提供纯化的pDNA产物。根据各个实施方式，本文公开的方法和试剂盒可用于在短时间内有效地生产转染级别的pDNA。例如，在非限定性的实施方式中，本文公开的方法可在小于约30分钟的时间段内进行，如在小于约20分钟的时间段内进行。在某些实施方式中，本文公开的方法可在约20分钟内从1ml过夜细菌培养物(O.D.600≈1)中产生平均10μg的pDNA。
应理解，在一些实施方式中，各种缓冲溶液的组分可互换使用，例如可以是彼此相同的或不同的。例如，离液剂C1和C2可以是相同的或不同的。类似地，离子螯合剂IC1和IC2；盐Z1和Z2；醇A1、A2和A3；以及缓冲液B1、B2、B3和B4；分别可以是相同的或不同的。类似地，这些组分的浓度可以变化，且在一些情况下，取决于所需应用，这些组分的浓度可以是相同的或相似的。
还应理解，本文公开的方法还可包括本领域已知的额外步骤，如离心、过滤等。作为非限定性的实例，在加入结合缓冲液S3后，可对形成的溶液进行离心或过滤以除去不需要的聚集体或大分子。根据各个实施方式，还可任选地对样品和/或磁性颗粒进行离心。在这样的情况下，离心可在以下范围内的加速度下进行：约10,000g至约18,000g，如约12,000g至约16,000g或约14,000g至约5,000g，包括其间所有范围和子范围。在各个实施方式中，离心可进行的时间段在约30秒至约15分钟的范围内，例如，约1分钟至约14分钟、约2分钟至约13分钟、约3分钟至约12分钟、约4分钟至约11分钟、约5分钟至约10分钟、约6分钟至约9分钟或约7分钟至约8分钟，包括其间所有范围和子范围。
在其他非限定性的实施方式中，本文公开的方法不包括任何离心步骤，这可以增强使过程自动化的能力。其它任选的步骤可包括空气干燥，例如，在用洗涤缓冲液W1和W2清洗经修饰的磁性颗粒后，可以将颗粒干燥一段时间，所述一段时间在约1分钟至约10分钟的范围内，如约2分钟至约9分钟、约3分钟至约8分钟、约4分钟至约7分钟或约5分钟至约6分钟，包括其间所有范围和子范围。按照所需或所必要的，在本文公开的方法期间还可将各种样品、溶液或者样品或溶液的部分移除到和/或转移到新的容器(如管)中。
试剂盒
本公开还涉及用于核酸纯化的试剂盒，所述试剂盒包括悬浮缓冲液、裂解缓冲液、结合/中和缓冲液、至少一种磁性颗粒、第一洗涤缓冲液、第二洗涤缓冲液和任选的洗脱缓冲液。在各个实施方式中，参照纯化方法，缓冲液可对应于上文公开的缓冲液S1、S2、S3、B1、W1、W2和E1。应理解，上文讨论的关于每种缓冲液的各个实施方式可以任何方法结合并且不限于形成本文公开的试剂盒。
根据各个实施方式，在试剂盒中可以用于即用的各组分的预定浓度提供各缓冲液。或者，可提供一种或多种浓缩溶液，其由终端用户用合适类型及合适量的溶剂稀释成即用的缓冲液。例如，在某些实施方式中，可提供浓缩的洗涤缓冲液W2，其可由用户用醇(如乙醇)稀释至70％或更高的终浓度，以乙醇的体积计。
在一些实施方式中，试剂盒还可包括针对终端用户的关于纯化实验方案和/或任何稀释说明的说明书。根据其它实施方式，试剂盒还可包含各种另外的组分或设备，如磁力架、管、离心机、用于细菌培养的培养基和/或抗生素、溶剂和/或RNA酶。
应理解，各个公开的实施方式可以涉及与特定实施方式一起描述的特定特征、元素或步骤。还应理解，虽然以涉及某一特定实施方式的形式描述，但特定特征、元素或步骤可以多种未说明的组合或排列方式与替代性的实施方式互换或组合。
还应理解的是，本文所用术语“该”、“一个”或“一种”表示“至少一个(一种)”，并且不应局限为“仅一个(一种)”，除非明确有相反的说明。因此，例如，提到的“一种缓冲液”包括具有两种或更多种这类“缓冲液”的实例，除非文中另行明确指明。
本文中，范围可以表示为从“约”一个具体值开始和/或至“约”另一个具体值终止。当表述这种范围时，实例包括自某一具体值始和/或至另一具体值止。类似地，当使用先行词“约”表示数值为近似值时，应理解，具体数值构成了另一个方面。还应理解的是，每个范围的端点值在与另一个端点值相结合以及独立于另一个端点值的情况下都是有意义的。
与实施例中不同，无论是否说明，本文所用的所有数值应解释为包括“约”，除非另有明确指明。然而，还应当理解的是，所述的每个数值也可以考虑其精确值，无论其是否在该数值前存在“约”。因此，高于“大于2M的浓度”和“大于约2M的浓度”都包括“大于约2M的浓度”以及“大于2M的浓度”的实施方式。
除非另有表述，否则都不旨在将本文所述的任意方法理解为需要使其步骤以具体顺序进行。因此，当方法权利要求实际上没有陈述为其步骤遵循一定的顺序或者其没有在权利要求书或说明书中以任意其他方式具体表示步骤限于具体的顺序，都不旨在暗示该任意特定顺序。
虽然会用过渡语“包含”来公开特定实施方式的各种特征、元素或步骤，但是应理解的是，这暗示了包括可采用过渡语“由……构成”或“基本上由……构成”描述在内的替代实施方式。因此，例如，包含A+B+C的缓冲液的暗示替代实施方式包括其中缓冲液由A+B+C组成的实施方式以及其中缓冲液基本上由A+B+C组成的实施方式。
对本领域的技术人员而言，显而易见的是，可以在不偏离本公开的范围和精神的情况下对本公开进行各种修改和变动。因为本领域的技术人员可以想到融合了本公开的精神和实质的所公开的实施方式的各种改良组合、子项组合和变化，因此，应认为本公开包括所附权利要求书范围内的全部内容及其等同内容。
以下的实施例旨在仅为非限制性的和说明性的，本发明的范围通过权利要求来限定。
实施例
示例性的纯化方案
仅用于讨论目的，下文提供了一种用于从细菌培养物中纯化pDNA的示例性方案。当然，该方案不旨在限制，并且不应被理解为是对所附权利要求的限制。
a)制备细菌培养物样品：使用合适的培养基和抗生素制备5ml的过夜细菌培养物，O.D.600≈1；
b)制备悬浮缓冲液：向悬浮缓冲液S1中加入RNA酶直至终浓度为100μg/ml；
c)悬浮样品：将1ml的过夜细菌培养物转移至1.5微量离心管中并通过12,000g离心1分钟收获细胞，随后除去培养介质并使用250μl制备好的S1缓冲液重悬；
d)裂解样品：向悬浮液中加入250μl的裂解缓冲液S2并通过颠倒最少10次进行混合；
e)准备结合：向细胞裂解液中加入350μl的结合缓冲液S3并通过颠倒最少10次进行混合，或直至可见到云状颗粒；
f)澄清细胞裂解液：将溶液在12,000g下离心10分钟并将澄清的裂解液转移至新的微量离心管中；
g)制备磁性颗粒：使用前在水或离液剂中涡旋磁性颗粒的悬浮液至少1分钟；
h)结合pDNA：向澄清的裂解液中加入50μl磁性颗粒溶液并通过颠倒混合，随后在室温下孵育5分钟；
i)分离结合了pDNA的磁性颗粒：使用磁力架，将磁性颗粒与可逆结合的pDNA磁性分离1分钟并除去剩余的裂解液；
j)洗涤结合了pDNA的磁性颗粒：对包含可逆结合的pDNA的磁性颗粒，使用500μl的洗涤缓冲液W1洗涤一次并使用700μl的洗涤缓冲液W2洗涤一次；
k)除去洗涤缓冲液：除去洗涤缓冲液W1和W2并将具有可逆结合的pDNA的磁性颗粒在磁力架上倒置，空气干燥5分钟；
l)洗脱pDNA：从磁力架上取下管并加入100μl水(或50μl以生成更加浓缩的样品)并在室温下孵育1分钟；
m)纯化pDNA：将管置于磁力架上1分钟以除去磁性颗粒并将洗脱的pDNA转移至新的微量离心管中。
对比实施例1
使用上述实验方案用1000μg Q珠或5000μg格雷斯珠从细菌培养物中纯化pDNA。还使用普洛麦格公司(Promega)的Wizard MagneSil TfxTM系统纯化相同的细菌培养物。对每种方法的平均总pDNA产量进行定量并示于图2。使用Q珠的本发明方法从1ml细菌培养物样品(O.D.600≈1)中得到的平均总pDNA产量为10.0μg。使用格雷斯珠的本发明方法的平均pDNA产量为9.2μg，而对比的普洛麦格方法产生10.7μg pDNA。
然后通过将编码eGFP的质粒pEGFP-C1转染至Hela细胞中来确定每种pDNA样品的转染效率。用4％多聚甲醛对转染的细胞固定15分钟，并且用DAPI染色以使细胞核可视化。使用合适滤光器获取GFP和细胞核的荧光图像，随后通过首先转换二色图像(黑和白)和用于对GFP阳性细胞和总细胞(细胞核)进行计数的计数标准，使用ImageJ进行图像分析。通过用视野中GFP阳性细胞除以总细胞数确定转染效率。每种方法的转染效率示于图3，其中误差条代表至少8张图像的标准偏差。对于使用Q珠、格雷斯珠和普洛麦格试剂盒的方法来说，转染效率分别为39.0％、39.6％和40.4％。
因此，图2-3证明了与基准对比性普洛麦格试剂盒相比，在约20分钟内进行的本发明方法提供了相当的pDNA产量和质量。
对比实施例2
使用上述实验方案用含SDS或SDBS的裂解缓冲液S2从细菌培养物中纯化pDNA。还使用普洛麦格公司的Wizard MagneSil TfxTM系统纯化相同的细菌培养物。对每种方法的平均总pDNA产量进行定量并示于图4。使用SDS在其中的裂解缓冲液S2的本发明方法从1ml细菌培养物样品(O.D.600≈1)中得到的平均总pDNA产量为7.3μg。使用SDBS在其中的裂解缓冲液S2的本发明方法的平均pDNA产量为9.8μg，而对比的普洛麦格方法产生6.4μg pDNA。
进行下游应用(如限制性消化和转染)以确定每种方法所产生的纯化的pDNA的质量。对于限制性消化，使用限制性酶EcoRI对pDNA进行线性化。图5示出了对于三种不同方法，pDNA样品(未切割的A或者用EcoRI切割的B)的琼脂糖凝胶电泳分析。如图5所示，可通过限制性酶EcoRI消化每种方法所产生的pDNA。
然后通过将编码eGFP的质粒pEGFP-C1转染至Hela细胞中来确定每种pDNA样品的转染效率。用4％多聚甲醛对转染的细胞固定15分钟，并且用DAPI染色以使细胞核可视化。使用合适滤光器获取GFP和细胞核的荧光图像，随后通过首先转换二色图像(黑和白)和用于对GFP阳性细胞和总细胞(细胞核)进行计数的计数标准，使用ImageJ进行图像分析。通过用视野中GFP阳性细胞除以总细胞数确定转染效率。每种方法的转染效率示于图6，其中误差条代表至少8张图像的标准偏差。对于使用SDS裂解缓冲液、SDBS裂解缓冲液和普洛麦格试剂盒的方法来说，转染效率分别为38.0％、45.4％和52.9％。
因此，图4-6证明了与基准对比性普洛麦格试剂盒相比，在约20分钟内进行的本发明方法提供了改善的或相当的pDNA产量和/或质量。

Claims (20)

1.一种用于核酸纯化的方法，所述方法包括：
(a)将包含至少一种核酸的样品与悬浮缓冲液结合以形成悬浮液；
(b)将所述悬浮液与裂解缓冲液结合以形成裂解液；
(c)将所述裂解液与结合缓冲液结合以形成溶液；
(d)将所述溶液与至少一种磁性颗粒结合以形成合并溶液，所述合并溶液包含至少一种修饰的磁性颗粒，其中，所述至少一种修饰的磁性颗粒与至少一种核酸可逆结合；
(e)从所述合并溶液中分离所述至少一种修饰的磁性颗粒；
(f)用第一洗涤缓冲液和第二洗涤缓冲液洗涤所述至少一种修饰的磁性颗粒；以及
(g)将所述至少一种修饰的磁性颗粒与洗脱缓冲液结合；
其中：
所述悬浮缓冲液包含至少一种第一离子螯合剂，其存在的浓度范围为约1mM至约10mM；和至少一种第一缓冲化合物，其存在的浓度范围为约10mM至约100mM；
所述裂解缓冲液包含至少一种去垢离液剂，其存在的浓度范围为，以重量计，约1％至约10％；和至少一种第二缓冲化合物，其存在的浓度为大于或等于约0.2M；
所述结合缓冲液包含至少一种第一离液剂，其存在的浓度范围为约4M至约6M；任选地，至少一种第一盐，其存在的浓度范围为约0.1M至约2M；至少一种第一醇，其存在的浓度范围为，以体积计，约1％至约5％和至少一种第三缓冲化合物，其存在的浓度范围为，以重量计，约0.25％至约3％；
所述第一洗涤缓冲液包含至少一种第二离液剂，其存在的浓度范围为约4M至约6M；至少一种第二离子螯合剂，其存在的浓度范围为约1mM至约10mM；至少一种第二醇，其存在的浓度范围为，以体积计，约30％至约50％和至少一种第四缓冲化合物，其存在的浓度范围为约10mM至约100mM；并且
所述第二洗涤缓冲液包含至少一种第三醇和任选的至少一种第二盐。
2.如权利要求1所述的方法，其中，包含所述至少一种核酸的样品为包含质粒DNA的至少一种细菌细胞。
3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述至少一种第一离子螯合剂选自：乙二胺四乙酸(EDTA)；乙二胺-N,N’-二琥珀酸(EDDS)；环己烷-1,2-二胺四乙酸(CDTA)；亚氨基二琥珀酸(IDS)；聚天冬氨酸(PASA)；甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)；L-谷氨酸N,N-二乙酸,四钠盐(GLDA)及其组合，并且
其中，所述至少一种第一缓冲化合物选自Tris、Tris-HCl、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)及其组合。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种去垢离液剂选自十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基苯磺酸钠(SDBS)、月桂基硫酸铵(ALS)、十二烷基硫酸钾(PDS)、肉豆蔻醇聚醚硫酸钠、辛基酚乙氧基化物、聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酸酯及其组合，并且
其中，所述至少一种第二缓冲化合物选自氢氧化钠(NaOH)、氢氧化锂(LiOH)、氢氧化钾(KOH)、氢氧化铷(RbOH)、氢氧化铯(CsOH)及其组合。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述至少一种第一离液剂选自盐酸胍(GuHCl)、硫氰酸胍(GuSCN)、脲及其组合，
其中，所述至少一种第一盐选自硫酸铵((NH4)2SO4)、乙酸铵(NH4Ac)、乙酸锂(LiAc)、乙酸钾(KAc)、乙酸钠(NaAc)、氯化钠(NaCl)及其组合，
其中，所述至少一种第一醇选自异丙醇、乙醇、甲醇、丁醇及其组合，并且
其中，所述至少一种第三缓冲化合物选自冰乙酸、盐酸及其组合。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述至少一种第二离液剂选自盐酸胍(GuHCl)、硫氰酸胍(GuSCN)、脲及其组合，
其中，所述至少一种第二离子螯合剂选自：乙二胺四乙酸(EDTA)；乙二胺-N,N’-二琥珀酸(EDDS)；环己烷-1,2-二胺四乙酸(CDTA)；亚氨基二琥珀酸(IDS)；聚天冬氨酸(PASA)；甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)；L-谷氨酸N,N-二乙酸,四钠盐(GLDA)及其组合，
其中，所述至少一种第二醇选自异丙醇、乙醇、甲醇、丁醇及其组合，并且
其中，所述至少一种第四缓冲化合物选自Tris、Tris-HCl、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)及其组合。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述至少一种第三醇选自异丙醇、乙醇、甲醇、丁醇及其组合，并且
其中，所述至少一种第二盐选自硫酸铵((NH4)2SO4)、乙酸铵(NH4Ac)、乙酸锂(LiAc)、乙酸钾(KAc)、乙酸钠(NaAc)、氯化钠(NaCl)及其组合。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述至少一种磁性颗粒选自羧基包被的顺磁性颗粒、基于二氧化硅的顺磁性颗粒及其组合。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括在(d)将所述溶液与至少一种磁性颗粒结合之前，先离心所述溶液以除去至少一种聚集体或大分子。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括用洗脱缓冲液对至少一种修饰的磁性缓冲液孵育一个时间段，所述时间段足以使所述至少一种核酸与所述至少一种修饰的磁性颗粒分开，并且其中，所述洗脱缓冲液选自水和包含至少一种缓冲化合物和/或至少一种离子螯合剂的溶液。
11.一种用于核酸纯化的试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)一种悬浮缓冲液，所述悬浮缓冲液包含至少一种第一离子螯合剂，其存在的浓度范围为约1mM至约10mM；和至少一种第一缓冲化合物，其存在的浓度范围为约10mM至约100mM；
(b)一种裂解缓冲液，所述裂解缓冲液包含至少一种去垢离液剂，其存在的范围为，以重量计，约1％至约10％；和至少一种第二缓冲化合物，其存在的浓度为大于或等于约0.2M；
(c)一种结合缓冲液，所述结合缓冲液包含至少一种第一离液剂，其存在的浓度范围为约4M至约6M；任选地，至少一种第一盐，其存在的浓度范围为约0.1M至约2M；至少一种第一醇，其存在的浓度范围为，以体积计，约1％至约5％和至少一种第三缓冲化合物，其存在的浓度范围为，以重量计，约0.25％至约3％；
(d)第一洗涤缓冲液，所述第一洗涤缓冲液包含至少一种第二离液剂，其存在的浓度范围为约4.5M至约6M；至少一种第二离子螯合剂，其存在的浓度范围为约1mM至约10mM；至少一种第二醇，其存在的浓度范围为，以体积计，约30％至约50％和至少一种第四缓冲化合物，其存在的浓度范围为约10mM至约100mM；
(e)第二洗涤缓冲液，所述第二洗涤缓冲液包含至少一种第三醇和任选的至少一种第二盐；和
(f)至少一种磁性颗粒。
12.如权利要求11所述的试剂盒，其中，包含所述至少一种核酸的样品为包含质粒DNA的至少一种细菌细胞。
13.如权利要求11或12中任一项所述的试剂盒，其中，所述至少一种第一离子螯合剂选自：乙二胺四乙酸(EDTA)；乙二胺-N,N’-二琥珀酸(EDDS)；环己烷-1,2-二胺四乙酸(CDTA)；亚氨基二琥珀酸(IDS)；聚天冬氨酸(PASA)；甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)；L-谷氨酸N,N-二乙酸,四钠盐(GLDA)及其组合，并且
其中，所述至少一种第一缓冲化合物选自Tris、Tris-HCl、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)及其组合。
14.如权利要求11-13中任一项所述的试剂盒，其中，所述至少一种去垢离液剂选自十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基苯磺酸钠(SDBS)、月桂基硫酸铵(ALS)、十二烷基硫酸钾(PDS)、肉豆蔻醇聚醚硫酸钠、辛基酚乙氧基化物、聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酸酯及其组合，并且
其中，所述至少一种第二缓冲化合物选自氢氧化钠(NaOH)、氢氧化锂(LiOH)、氢氧化钾(KOH)、氢氧化铷(RbOH)、氢氧化铯(CsOH)及其组合。
15.如权利要求11-14中任一项所述的试剂盒，其中，所述至少一种第一离液剂选自盐酸胍(GuHCl)、硫氰酸胍(GuSCN)、脲及其组合，
其中，所述至少一种第一盐选自硫酸铵((NH4)2SO4)、乙酸铵(NH4Ac)、乙酸锂(LiAc)、乙酸钾(KAc)、乙酸钠(NaAc)、氯化钠(NaCl)及其组合，
其中，所述至少一种第一醇选自异丙醇、乙醇、甲醇、丁醇及其组合，并且
其中，所述至少一种第三缓冲化合物选自冰乙酸、盐酸及其组合。
16.如权利要求11-15中任一项所述的试剂盒，其中，所述至少一种第二离液剂选自盐酸胍(GuHCl)、硫氰酸胍(GuSCN)、脲及其组合，
其中，所述至少一种第二离子螯合剂选自：乙二胺四乙酸(EDTA)；乙二胺-N,N’-二琥珀酸(EDDS)；环己烷-1,2-二胺四乙酸(CDTA)；亚氨基二琥珀酸(IDS)；聚天冬氨酸(PASA)；甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)；L-谷氨酸N,N-二乙酸,四钠盐(GLDA)及其组合，
其中，所述至少一种第二醇选自异丙醇、乙醇、甲醇、丁醇及其组合，并且
其中，所述至少一种第四缓冲化合物选自Tris、Tris-HCl、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)及其组合。
17.如权利要求11-16中任一项所述的试剂盒，其中，所述至少一种第三醇选自异丙醇、乙醇、甲醇、丁醇及其组合，并且
其中，所述至少一种第二盐选自硫酸铵((NH4)2SO4)、乙酸铵(NH4Ac)、乙酸锂(LiAc)、乙酸钾(KAc)、乙酸钠(NaAc)、氯化钠(NaCl)及其组合。
18.如权利要求11-17中任一项所述的试剂盒，其中，所述至少一种磁性颗粒选自羧基包被的顺磁性颗粒、基于二氧化硅的顺磁性颗粒及其组合。
19.如权利要求11-18中任一项所述的试剂盒，其还包括(g)一种洗脱缓冲液，所述洗脱缓冲液选自水和包含至少一种缓冲化合物和/或至少一种离子螯合剂的溶液。
20.一种用于核酸纯化的试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)一种悬浮缓冲液，所述悬浮缓冲液包含至少一种第一离子螯合剂，所述至少一种第一离子螯合剂选自EDTA、其异构体及其组合，所述至少一种第一离子螯合剂存在的浓度范围为约8mM至约10mM；和至少一种第一缓冲化合物，所述至少一种第一缓冲化合物选自Tris、Tris-HCl及其组合，所述至少一种第一缓冲化合物存在的浓度范围为约10mM至约40mM；
(b)一种裂解缓冲液，所述裂解缓冲液包含至少一种去垢离液剂，所述至少一种去垢离液剂选自SDS、SDBS及其组合，所述至少一种去垢离液剂存在的浓度范围为，以重量计，约1％至约3％；和至少一种第二缓冲化合物，所述至少一种第二缓冲化合物选自碱性氢氧化物及其组合，所述至少一种第二缓冲化合物存在的浓度为大于或等于约0.2M；
(c)一种结合缓冲液，所述结合缓冲液包含至少一种第一离液剂，所述至少一种第一离液剂选自GuHCl、GuSCN及其组合，所述至少一种第一离液剂存在的浓度范围为约4M至约4.5M；至少一种第一盐，所述至少一种第一盐选自硫酸铵、乙酸铵、乙酸钠及其组合，所述至少一种第一盐存在的浓度范围为约0.3M至约1.5M；以体积计，约1％至约2％的异丙醇和至少一种第三缓冲化合物，所述至少一种第三缓冲化合物选自冰乙酸、盐酸及其组合，所述至少一种第三缓冲化合物存在的浓度范围为，以重量计，约1％至约3％；
(d)第一洗涤缓冲液，所述第一洗涤缓冲液包含至少一种第二离液剂，所述至少一种第二离液剂选自GuHCl、GuSCN及其组合，所述至少一种第二离液剂存在的浓度范围为约4.5M至约5M；至少一种第二离子螯合剂，所述至少一种第二离子螯合剂选自EDTA、其异构体及其组合，所述至少一种第二离子螯合剂存在的浓度范围为约1mM至约3mM；以体积计，约30％至约40％的异丙醇和至少一种第四缓冲化合物，所述至少一种第四缓冲化合物选自Tris、Tris-HCl及其组合，所述至少一种第四缓冲化合物存在的浓度范围为约20mM至约50mM；
(e)第二洗涤缓冲液，其包含以体积计至少约70％的乙醇和至少一种第二盐，所述至少一种第二盐选自硫酸铵、乙酸铵、乙酸钠及其组合，所述至少一种第二盐存在的浓度范围为约80mM至约100mM；和
(f)至少一种基于二氧化硅的磁性颗粒。
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