CN113512546A - 一种快速质粒dna抽提纯化试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速质粒DNA抽提纯化试剂盒，该试剂盒包括如下试剂：重悬液、裂解液、中和液、清洗液、洗脱液；所述重悬液的配方如下：葡萄糖100mM，三羟甲基氨基甲烷盐酸10mM，乙二胺四乙酸10mM，核糖核酸酶5mg/ml；所述裂解液的配方如下：氢氧化钾或氢氧化钠100mM‑2M，十二烷基苯磺酸钠或十二烷基磺酸钠或十二烷基硫酸钠1g/100ml。所述中和液的配方如下：盐酸胍1M‑6M，醋酸钾或醋酸钠100mM‑1M，醋酸调节pH至2‑8。本发明可以克服现有方法中沉淀复合物较轻、沉淀不完全或去除过程需要高速离心机、对实验室设备要求较高、花费的时间也较长的问题，具有广阔的市场应用前景。
Description
技术领域
本发明涉属于实验试剂技术领域，具体涉及一种快速质粒DNA抽提纯化试剂盒及其应用。
背景技术
质粒是DNA重组的重要载体和工具，分离纯化质粒是现代分子生物技术必不可少的手段。现有质粒的分离使用最多也最为经典的方法仍为碱裂解法，具体包括以下步骤：收集菌体、重悬、碱裂解、中性化、长时间离心除杂质、DNA结合、洗净、洗脱等。这一方法抽提纯化质粒的时间大约需要30min，主要耗时在中性化后细胞碎片的离心去除步骤，大约需要耗时10-15min，且当离心时间和离心力不足时细胞碎片因悬浮无法有效去除，将对抽提质粒的质量造成很大的影响，如影响酶切、杂蛋白含量超标等，现市面上以碱裂解法原理的质粒小抽和大抽试剂多为钾盐、胍盐和SDS形成沉淀复合物，沉淀去除细胞碎片，由于形成的沉淀复合物较轻，去除过程需要高速离心机，对实验室设备要求较高，花费的时间也较长，所花成本也较高，不太适合大量样品的抽提，也限制了其自动化的进程。
发明内容
发明目的：本发明要解决的技术问题是提供一种快速高效纯化质粒的试剂盒，以解决质粒抽提纯化过程中细胞碎片离心时间长、细胞碎片去除效果差的问题。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
一种快速质粒DNA抽提纯化试剂盒，该试剂盒包括如下试剂：重悬液、裂解液、中和液、清洗液、洗脱液；
所述重悬液的配方如下：葡萄糖100mM，三羟甲基氨基甲烷盐酸10mM，乙二胺四乙酸10mM，核糖核酸酶5mg/ml；
所述裂解液的配方如下：氢氧化钾或氢氧化钠100mM-2M，十二烷基苯磺酸钠或十二烷基磺酸钠或十二烷基硫酸钠1g/100mL；
所述中和液的配方如下：盐酸胍1M-6M，醋酸钾或醋酸钠100mM-1M，醋酸调节pH至2-8。
优选地，所述清洗液的配方如下：三羟甲基氨基甲烷盐酸1-50mM，pH6.8，体积分数为乙醇70-85％。
优选地，所述洗脱液的配方如下：乙二胺四乙酸1-10mM，三羟甲基氨基甲烷盐酸8-12mM，pH8-9。
优选地，所述裂解液的配方优选为：十二烷基苯磺酸钠1g/100mL，氢氧化钠0.1M
优选地，所述中和液的配方优选为：盐酸胍5M，醋酸钠0.75M，醋酸调PH至5.0
上述快速质粒DNA抽提纯化试剂盒在质粒提取中的应用在本发明的保护范围之内。
进一步地，包括如下步骤：
(1)菌体重悬：取2mL过夜培养的细菌溶液，4000rpm离心2min，弃上清，在沉淀的菌体中加入250μL的所述的重悬液，充分震荡混匀；
(2)菌体裂解：将250μL所述的裂解液加到充分重悬的菌体中，轻柔混匀至菌液清亮；
(3)中和沉淀：将250μl所述的中和液加入步骤(2)裂解清亮的菌体中，上下翻倒离心小管5-10次，混合，4000rpm离心10min，弃除沉淀取上清液挂硅胶柱；
(4)清洗：将步骤(3)中结合质粒DNA的硅胶膜上加入所述的清洗液700μl，以4000rpm离心1min，弃除离心液
(5)洗脱：加入40μL所述的洗脱液于DNA结合柱中心，以4000rpm离心1min，即可得到高纯度质粒DNA。
步骤(3)中，离心的条件为：4000rpm离心10min。
有益效果：
本发明公开了一种细菌质粒抽提的裂解液和中和液配方改进试剂盒和方法，现有技术中裂解液配方中去污剂为十二烷基硫酸钠或十二烷基磺酸钠，本发明创新性的使用十二烷基苯磺酸钠，苯基团的加入极大的增加沉淀复合物的疏水性，同时配合优化比例的盐酸胍和醋酸钠中和液，使细胞碎片的沉淀和质粒的释放效果最大化。本发明对工业级别的质粒板抽和质粒大抽具有极大的应用前景。特别是对细胞碎片的沉淀效果非常优良，可以克服因设备离心力不足和离心时间短等因素导致的沉淀不完全问题，具有广阔的市场应用前景。
附图说明
图1：质粒小抽，中和沉淀细胞碎片在4000rpm低速离心下的效果图A、商品化试剂盒、B、本发明优选方法。
图2：高通量质粒板抽，中和沉淀在4000rpm低速离心下的效果图A、商品化试剂盒、B、本发明优选方法。
图3：质粒大抽，中和沉淀在4000rpm低速离心下的效果图A、商品化试剂盒、B、本发明优选方法。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
重悬液的配方为：葡萄糖100mM，三羟甲基氨基甲烷10mM，乙二胺四乙酸10mM，核糖核酸酶5mg/ml，每个样品取250ul重悬菌体；
菌体裂解液的配方为：十二烷基苯磺酸钠1g/100mL，氢氧化钠0.1M，做每个样品取250μL裂解菌体；
中和液的配方为：盐酸胍4.5M，醋酸钠100mM，醋酸调PH至5.0，做每个样品取250μL中和裂解液；
清洗液的配方为：三羟甲基氨基甲烷盐酸10mM PH6.8，再加入无水乙醇，使无水乙醇占清洗液总体积的80％，做每个样品取700μl放入结合柱中。
使用本试剂盒，进行质粒抽提纯化的步骤如下：
(1)菌体重悬：2ml过夜培养TOP10菌液4000rpm离心2min，弃上清，在沉淀的菌体中加入250ul的重悬液充分震荡混匀；
(2)菌体裂解：将250μl裂解液加到充分重悬的菌体中，轻柔混匀至菌液清亮；
(3)中和沉淀：将250μl中和液加入裂解清亮的菌体中，上下翻倒离心小管5-10次，混合，以4000rpm离心10min去除沉淀后取上清挂硅胶柱；
(4)清洗：结合质粒DNA的硅胶膜上加入清洗溶液700μl，以4000rpm离心1min，弃除离心液；
(5)洗脱：加入40μl洗脱液于DNA结合柱中心，以4000rpm离心1min，即可得到高纯度质粒DNA；
(6)经使用分光光度计对抽提纯化所得质粒DNA进行检测，A260/A280值为1.8-2.0之间。
实施例2：
重悬液的配方为：葡萄糖100mM，三羟甲基氨基甲烷10mM，乙二胺四乙酸10mM，核糖核酸酶5mg/ml，每个样品取250ul重悬菌体；
菌体裂解液的配方为：十二烷基苯磺酸钠1g/100mL，氢氧化钠0.1M，每个样品取250μl裂解菌体；
中和液的配方为：盐酸胍4.5M，醋酸钠0.75M，醋酸调PH至5.0，每个样品取250μL中和裂解液；
清洗液的配方为：三羟甲基氨基甲烷盐酸10mM PH6.8，再加入无水乙醇，使无水乙醇占清洗液总体积的80％，每个样品取700μl放入结合柱中。
使用本试剂盒，进行质粒抽提纯化的步骤如下：
(1)菌体重悬：2ml过夜培养TOP10菌液4000rpm离心2min，弃上清，在沉淀的菌体中加入250μL的重悬液充分震荡混匀；
(2)菌体裂解：将250μL裂解液加到充分重悬的菌体中，轻柔混匀至菌液清亮；
中和沉淀：将250μl中和液加入裂解清亮的菌体中，上下翻倒离心小管5-10次，混合，以4000rpm离心10min，去除沉淀后取上清挂硅胶柱。
(3)清洗：结合质粒DNA的硅胶膜上加入清洗溶液700μL，以4000rpm离心1min，弃除离心液。
(4)洗脱：加入40μL洗脱液于DNA结合柱中心，以4000rpm离心1min，即可得到高纯度质粒DNA。
(5)经使用分光光度计对抽提纯化所得质粒DNA进行检测，A260/A280值为1.8-2.0之间。
实施例3
重悬液的配方为：葡萄糖100mM，三羟甲基氨基甲烷10mM，乙二胺四乙酸10mM，核糖核酸酶5mg/ml，每个样品取250μL重悬菌体；
菌体裂解液的配方为：十二烷基苯磺酸钠1g/100mL，氢氧化钠0.1M，每个样品取250μl裂解菌体；
中和液的配方为：盐酸胍5M，醋酸钠0.75M，醋酸调PH至5.0，做每个样品取250μL中和裂解液；
清洗液的配方为：三羟甲基氨基甲烷盐酸10mM pH6.8，再加入无水乙醇，使无水乙醇占清洗液总体积的80％，做每个样品取700μL放入结合柱中。
使用本试剂盒，进行质粒抽提纯化的步骤如下：
(1)菌体重悬：2ml过夜培养TOP10菌液4000rpm离心2min，弃上清，在沉淀的菌体中加入250ul的重悬液充分震荡混匀；
(2)菌体裂解：将250μL裂解液加到充分重悬的菌体中，轻柔混匀至菌液清亮；
(3)中和沉淀：将250μL中和液加入裂解清亮的菌体中，上下翻倒离心小管5-10次，混合，以4000rpm离心10min，去除沉淀后取上清挂硅胶柱；
(4)清洗：结合质粒DNA的硅胶膜上加入清洗溶液700μL，以4000rpm离心1min，弃除离心液。
(5)洗脱：加入40μL洗脱液于DNA结合柱中心，以4000rpm离心1min，即可得到高纯度质粒DNA。
(6)经使用分光光度计对抽提纯化所得质粒DNA进行检测，A260/A280值为1.8-2.0之间。
对比例：
采用商品化质粒抽提试剂盒做为对照，大抽和板式抽提TOP10菌株的质粒DNA，抽提过程采用低速离心(4000rpm)，抽提后用琼脂糖凝胶电泳和分光光度计测定质粒DNA。
Claims (10)
1.一种快速质粒DNA抽提纯化试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括如下试剂：重悬液、裂解液、中和液、清洗液、洗脱液；
所述裂解液的配方如下：氢氧化钾或氢氧化钠100mM-2M，十二烷基苯磺酸钠或十二烷基磺酸钠或十二烷基硫酸钠1g/100ml；
所述中和液的配方如下：盐酸胍1M-6M，醋酸钾或醋酸钠100mM-1M，醋酸调节pH至2-8。
2.根据权利要求1所述的快速质粒DNA抽提纯化试剂盒，其特征在于，所述重悬液的配方如下：葡萄糖100mM，三羟甲基氨基甲烷盐酸10mM，乙二胺四乙酸10mM，核糖核酸酶5mg/ml。
3.根据权利要求1所述的快速质粒DNA抽提纯化试剂盒，其特征在于，所述清洗液的配方如下：三羟甲基氨基甲烷盐酸1-50mM，pH6.8，体积分数为乙醇70-85％。
4.根据权利要求1所述的快速质粒DNA抽提纯化试剂盒，其特征在于，所述洗脱液的配方如下：乙二胺四乙酸1-10mM，三羟甲基氨基甲烷盐酸8-12mM，pH8-9。
5.根据权利要求1所述的快速质粒DNA抽提纯化试剂盒，其特征在于，所述裂解液的配方如下：十二烷基苯磺酸钠1g/100mL，氢氧化钠0.1M。
6.根据权利要求1所述的快速质粒DNA抽提纯化试剂盒，其特征在于，所述中和液的配方如下：盐酸胍5M，醋酸钠0.75M，醋酸调PH至5.0。
7.权利要求1所述快速质粒DNA抽提纯化试剂盒在质粒提取中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)菌体重悬：取2mL过夜培养的细菌溶液，4000rpm离心2min，弃上清，在沉淀的菌体中加入所述的重悬液的重悬液，充分震荡混匀；
(2)菌体裂解：将所述的裂解液加到充分重悬的菌体中，轻柔混匀至菌液清亮；
(3)中和沉淀：将所述的中和液加入步骤(2)裂解清亮的菌体中，上下翻倒离心小管5-10次，混合后出现沉淀，离心，弃沉淀，取上清挂硅胶柱；
(4)清洗：将步骤(3)结合质粒DNA的硅胶膜上加入所述的清洗液700μl，以4000rpm离心1min，弃除离心液。
(5)洗脱：加入40μL所述的洗脱液于DNA结合柱中心，以4000rpm离心1min，即可得到高纯度质粒DNA。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(3)中，所述离心的条件为：4000rpm离心10min。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述重悬液的加入量为250μL；步骤(2)中，所述裂解液的加入量为250μL；步骤(3)中，所述中和液的加入量为250μL。
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| CN202110372248.0A Pending CN113512546A (zh) | 2021-04-07 | 2021-04-07 | 一种快速质粒dna抽提纯化试剂盒及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113512546A (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1654660A (zh) * | 2004-12-31 | 2005-08-17 | 李乐攻 | 一种快速质粒抽提纯化试剂盒及其应用 |
| CN106929505A (zh) * | 2017-01-26 | 2017-07-07 | 内蒙古大学 | 质粒提取试剂盒及提取质粒的方法 |
| CN107208089A (zh) * | 2014-12-09 | 2017-09-26 | 康宁股份有限公司 | 用于纯化质粒dna的方法和试剂盒 |
| CN112322612A (zh) * | 2020-10-29 | 2021-02-05 | 江苏凯基生物技术股份有限公司 | 一种质粒提取试剂盒及提取方法 |
-
2021
- 2021-04-07 CN CN202110372248.0A patent/CN113512546A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1654660A (zh) * | 2004-12-31 | 2005-08-17 | 李乐攻 | 一种快速质粒抽提纯化试剂盒及其应用 |
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| CN106929505A (zh) * | 2017-01-26 | 2017-07-07 | 内蒙古大学 | 质粒提取试剂盒及提取质粒的方法 |
| CN112322612A (zh) * | 2020-10-29 | 2021-02-05 | 江苏凯基生物技术股份有限公司 | 一种质粒提取试剂盒及提取方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 王彦芹: "《现代分子生物学实验指导》", 31 March 2017, 西安交通大学出版社 * |
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