CN110964720A - 一种针对土壤样品的宏转录组样品提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了.一种针对土壤样品的宏转录组样品提取方法，通过在2g样品当中加入2.5ml缓冲液、0.25ml SR1溶液、0.8ml SR2溶液以及0.19‑0.21g PVPP干粉后涡旋混匀后分层和进一步的前处理后得到RNA沉淀进行后续测序。本发明可以有效解决获得的RNA存在DNA残留的问题，提升RNA前处理的处理精度。
Description
技术领域
本发明涉及宏转录样品前处理领域，具体涉及一种针对土壤样品的宏转录组样品提取方法。
背景技术
现有的样品前处理方法当中，并不能有效解决获得的RNA存在DNA残留的问题，而DNA残留会导致RNA的提取精度低，且容易对后续的测序造成影响。
因此如何有效解决DNA的残留问题，是如果有效提升RNA前处理的处理精度的关键所在。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种针对土壤样品的宏转录组样品提取方法。该方法能有效降低DNA残留。
为了实现本发明的目的，所采用的技术方案是：
一种针对土壤样品的宏转录组样品提取方法，包括如下步骤：
步骤一：在2g样品当中加入2.5ml缓冲液、0.25ml SR1溶液、0.8ml SR2 溶液以及0.19-0.21g PVPP干粉后涡旋混匀；
步骤二：加入3.5ml细胞裂解液后涡旋至分离层消失；
步骤三：以3100-3300rpm的转速涡旋震荡10-20min，后在室温条件下以2400-2600g的速度离心9-11min后转移第一次上层产物；
步骤四：加入1.5mlSR3溶液到所述第一次上层产物当中，涡旋混匀后4℃孵育8-12分钟，以去除蛋白质和细胞碎片后进一步在室温下以2400-2600g 的速度离心9-11min后转移第二次上层产物；
步骤五：加入5mlSR4溶液到所述第二次上层产物当中，混匀后，孵育25-35 分钟后以2400-2600g的速度离心9-11min后收集核酸沉淀；
步骤六：加入1mlSR5溶液到核酸沉淀的收集管中对核酸沉淀物进行重悬得RNA提取物；
步骤七：将所述RNA提取物进行洗脱和若干次重悬后得RNA沉淀。
在本发明的一个优选实施例中，所述细胞裂解液为酚、氯仿、异戊醇的混合溶液，所述混合溶液的pH范围为6.5-8.0。
在本发明的一个优选实施例中，所述SR4溶液为100％异丙醇。
本发明的有益效果在于：
本发明可以有效解决获得的RNA存在DNA残留的问题，提升RNA前处理的处理精度。
附图说明
图1为现有技术的提取示意图。
图2为本发明的提取示意图。
具体实施方式
本发明的设计思路在于：
土壤样品RNA提取难点之一是存在腐殖质污染。腐殖质会干扰酶促反应， PCR扩增，DNA-DNA的杂交，感受态细胞的转化，核酸的检测和定量，RNA的杂交和RT-PCR等。
因而从土壤RNA中去除腐殖质对分子分析来说十分重要。据报道，DNA与腐殖酸在酸性条件下发生不可逆的结合。因此，当预期将有大量腐殖质进入到提取液时，强烈建议在细胞破碎前就将腐殖质完全去除。PVPP(聚乙烯吡咯烷酮)呈白色或近白色，具有很强的膨胀性能和与多类物质的络合能力，被广泛报道用于核酸提取过程中腐殖质的去除。
优化的思路是：在细胞裂解前尽可能的通过PVPP去除土壤样品中的腐殖质，减少细胞裂解后DNA与腐殖质的结合，从而达到降低样品中DNA残留的目的。
实施例的方法如下：
1、加入2g土壤样品到一个珠管(Bead Tubes)中。注意：参考疑难点关于土样加样量问题。
2、加入2.5ml缓冲液、0.25ml SR1溶液、0.8ml SR2溶液以及0.20g PVPP 干粉到珠管(Bead Tubes)后涡旋混匀。
在第二步当中：缓冲液可分离微生物细胞与土壤成分。SR1溶液含有SDS 以及其它用于细胞裂解的试剂。SDS作为去垢剂能破坏细胞膜上的脂肪酸、脂质。SR2溶液为沉淀溶液可去除腐殖质、细胞碎片及蛋白质等非DNA的有机、无机成分。有机及无机成分的污染会影响到最终RNA的质量并抑制下游 RNA实验。涡旋振荡是样品均质化和细胞裂解的关键步骤。
3、加入3.5ml pH6.5-8.0的酚/氯仿/异戊醇溶液后涡旋混匀直至分离层消失。
加入酚氯仿可获得最佳裂解效率和得率，裂解的细胞组分留在了有机相，蛋白变性。
4、把珠管(Bead Tubes)固定在涡旋仪适配器上，最大转速3200rpm，涡旋连续振荡15min。
微生物细胞在1-3步化学裂解缓冲液和机械涡旋振荡力共同作用下崩解。
5、取下珠管(Bead Tubes)在室温下2500g离心10min。
离心使得相位分离，最终可见三个分离层。最下层含有蛋白、细胞碎片，中间层含有腐殖质及其他有机无机成分，最上层含有总核酸。
6、小心地把珠管(Bead Tubes)从离心机取下，转移上分离层。
含有总核酸的上分离层被转移到了一个新的管中。留下细胞碎片、蛋白质和其它有机成分。
7、加入1.5mlSR3溶液到水相分离层，涡旋混匀。4℃孵育10分钟。
第二次使用沉淀剂进一步去除蛋白质、细胞碎片。
8、室温2500g离心10min。避开沉淀小球，转移上清到一个干净的15ml 收集管中。
含有核酸的上层溶液转移到了一个新的15ml收集管中。剩下非核酸成分。
9、加入5mlSR4溶液到含有上清液的收集管中，上下颠倒数次或轻轻涡旋混匀。孵育30min。
10、室温2500g离心30min。
11、轻轻倒掉上清把15ml收集管倒扣于一张吸水纸上，后停留5分钟。
SR4为100％异丙醇。核酸形成沉淀后，弃去异丙醇。
12、SR5使用前先摇匀，加入1mlSR5溶液到15ml收集管中，进行充分重悬沉淀。
SR5的盐溶液可重悬步骤14沉淀下来的核酸，同时平衡RNA纯化柱(RNA capturecolumn)滤膜，为步骤16的冲洗和步骤20的洗脱做准备。
13、每个RNA样品制备一个RNA纯化柱(RNA capture column)。
14、把步骤12获得的RNA提取物加到RNA纯化柱(RNA capture column) 中，让其自然流下，收集在15ml收集管中。
15、再加入1mlSR5溶液，冲洗RNA纯化柱(RNA capture column)，让其自然流下，收集在15ml收集管中。
加到RNA纯化柱(RNA capture column)中的核酸选择性吸附柱子的滤膜上。再加1mlSR5为了冲洗未被吸附的杂质，准备RNA洗脱。
16、把RNA纯化柱(RNA capture column)转移到一个新的15ml收集管中。
SR6使用前摇匀。加1mlSR6溶液到RNA纯化柱(RNA capture column) 中洗脱RNA。让SR6自然流下收集在15ml收集管中。
SR6洗脱缓冲液为盐溶液，可选择性地把RNA从column滤膜上洗脱下来留下DNA、残留的细胞碎片及抑制因子等。
17、把洗脱下来的RNA转移到一个2.2ml收集管中，加入1mlSR4溶液。至少上下颠倒一次混匀。-20℃孵育10min。
18、室温13000g离心15mi，沉淀RNA。
19、弃去上清，把2.2ml收集管倒扣在吸水纸上晾干10min。
SR4为100％异丙醇。洗脱的RNA沉淀、离心、晾干然后重悬浓缩。
20、使用100μlSR7溶液重悬RNA沉淀物。
SR7为RNase/DNase-Free水，用于重悬沉淀的RNA，SR7不含EDTA。
为了延长RNA的保存时间，可用10mM Tris pH8.0来代替SR7重悬RNA。
对比例方法如下：
1、加入2g土壤样品到一个珠管(Bead Tubes)中。
2、加入2.5ml缓冲液、0.25ml SR1溶液、0.8ml SR2溶液到珠管(Bead Tubes)涡旋混匀。
在第二步当中：缓冲液可分离微生物细胞与土壤成分。SR1溶液含有SDS 以及其它用于细胞裂解的试剂。SDS作为去垢剂能破坏细胞膜上的脂肪酸、脂质。SR2溶液为沉淀溶液可去除腐殖质、细胞碎片及蛋白质等非DNA的有机、无机成分。有机及无机成分的污染会影响到最终RNA的质量并抑制下游 RNA实验。涡旋振荡是样品均质化和细胞裂解的关键步骤。
3、加入3.5ml pH6.5-8.0的酚/氯仿/异戊醇溶液后涡旋混匀直至分离层消失。
加入酚氯仿可获得最佳裂解效率和得率，裂解的细胞组分留在了有机相，蛋白变性。
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微生物细胞在1-3步化学裂解缓冲液和机械涡旋振荡力共同作用下崩解。
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离心使得相位分离，最终可见三个分离层。最下层含有蛋白、细胞碎片，中间层含有腐殖质及其他有机无机成分，最上层含有总核酸。
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含有总核酸的上分离层被转移到了一个新的管中。留下细胞碎片、蛋白质和其它有机成分。
7、加入1.5mlSR3溶液到水相分离层，涡旋混匀。4℃孵育10分钟。
第二次使用沉淀剂进一步去除蛋白质、细胞碎片。
8、室温2500g离心10min。避开沉淀小球，转移上清到一个干净的15ml 收集管中。
含有核酸的上层溶液转移到了一个新的15ml收集管中。剩下非核酸成分。
9、加入5mlSR4溶液到含有上清液的收集管中，上下颠倒数次或轻轻涡旋混匀。孵育30min。
10、室温2500g离心30min。
11、轻轻倒掉上清把15ml收集管倒扣于一张吸水纸上，后停留5分钟。
SR4为100％异丙醇。核酸形成沉淀后，弃去异丙醇。
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SR4为100％异丙醇。洗脱的RNA沉淀、离心、晾干然后重悬浓缩。
20、使用100μlSR7溶液重悬RNA沉淀物。
SR7为RNase/DNase-Free水，用于重悬沉淀的RNA，SR7不含EDTA。
为了延长RNA的保存时间，可用10mM Tris pH8.0来代替SR7重悬RNA。
而本发明为了解决RNA残留的问题，主要是通过提取的第2步加入约0.2g 的PVPP干粉后，DNA残留的情况得到明显改善。
RNA提取检测结果见表1。
表1
如表1所示：
产量(ug/g)指每g样品能够提取出的核酸总量(ug)；260/280 260/230 比值代表核酸的纯度，A260nm，是核酸最高吸收峰的吸收波长；A280nm，是蛋白最高吸收峰的吸收波长，A230nm，是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长。纯净的RNA260/280比值为2.0，260/230也在2.5；优化前的提取结果，样品 260/280比值在1.8左右表明有轻微蛋白污染，260/230比值<1，表明有糖类或盐类污染；优化后的提取结果显示两个指标得到改善。
由对比例的结果示意图和本发明的凝胶电泳结果示意图对比可见：
对比例的RNA当中由于存在DNA的残留较多，出现了明显的拖尾现象，而采用了本发明的方法后，拖尾现象明显改善。
其中，图1是优化前的提取结果，当中的1号样品是C1M2R5,2号样品是 C1M2R6。图2是优化后的提取结果，当中的1号样品是C1M2R5,2号样品是 C1M2R6。
Claims (3)
1.一种针对土壤样品的宏转录组样品提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：在2g样品当中加入2.5ml缓冲液、0.25mlSR1溶液、0.8mlSR2溶液以及0.19-0.21g PVPP干粉后涡旋混匀；
步骤二：加入3.5ml细胞裂解液后涡旋至分离层消失；
步骤三：以3100-3300rpm的转速涡旋震荡10-20min，后在室温条件下以2400-2600g的速度离心9-11min后转移第一次上层产物；
步骤四：加入1.5mlSR3溶液到所述第一次上层产物当中，涡旋混匀后4℃孵育8-12分钟，以去除蛋白质和细胞碎片后进一步在室温下以2400-2600g的速度离心9-11min后转移第二次上层产物；
步骤五：加入5mlSR4溶液到所述第二次上层产物当中，混匀后，孵育25-35分钟后以2400-2600g的速度离心9-11min后收集核酸沉淀；
步骤六：加入1mlSR5溶液到核酸沉淀的收集管中对核酸沉淀物进行重悬得RNA提取物；
步骤七：将所述RNA提取物进行洗脱和若干次重悬后得RNA沉淀。
2.如权利要求1所述的一种针对土壤样品的宏转录组样品提取方法，其特征在于，所述细胞裂解液为酚、氯仿、异戊醇的混合溶液，所述混合溶液的pH范围为6.5-8.0。
3.如权利要求1所述的一种针对土壤样品的宏转录组样品提取方法，其特征在于，所述SR4溶液为100％异丙醇。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109929862A (zh) * | 2019-03-14 | 2019-06-25 | 云南农业大学 | 一种从反刍动物瘤胃宏转录组数据筛选纤维素酶基因进行克隆的方法 |
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-
2019
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