CN113388610B - 一种磁珠法快速提取细菌质粒dna的试剂盒及提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种磁珠法快速提取细菌质粒DNA的试剂盒及提取方法。所述试剂盒包括用于裂解细菌的裂解试剂组和用于提取质粒DNA的提取试剂组；所述提取试剂组由磁珠结合液、洗涤液、洗脱液组成。本发明提供的基于该试剂盒实现质粒DNA快速提取方法中，通过选用表面修饰有硅羟基或硅羧基的磁珠、0.15～0.45M的乙酸钠、1～3wt％的二硫苏糖醇和3～5M的异硫氰酸胍的混合液作为磁珠结合液复合体系，极大增强了质粒DNA和磁珠的结合能力，使得提取效率提高，提取速度加快，磁珠对DNA的吸附过程只需要1分钟，且提取出的DNA纯度高、片段完整；同时试剂均无毒性，对环境污染小，可用于替代市面上大部分同类产品。

Description

一种磁珠法快速提取细菌质粒DNA的试剂盒及提取方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种磁珠法快速提取细菌质粒DNA的试剂盒及提取方法。
背景技术
现有技术中，细菌质粒DNA的提取方法一般包括细菌裂解、DNA聚集沉淀、除杂、DNA纯化分离等步骤。传统提取方法主要包含柱式法和CTAB裂解法，这些方法操作繁琐，耗时较长，不利于大量提取，并且操作过程中可能会使用氯仿、苯酚等有机溶剂，污染较大。
磁珠法细菌质粒DNA提取试剂盒利用表面修饰后的磁珠和DNA分子的特异性吸附，采用磁性纳米分离技术，具有方便和重复性好的优点。但是现今报道的磁珠细菌质粒DNA提取法存在着磁珠对DNA的吸附不充分，导致所需提取时间长的问题。因此，有必要开发提取速度快、提取效率高的细菌质粒DNA高通量提取方法。
申请号为CN202110119628.3的发明专利公开了一种磁珠法提取质粒DNA的方法及提取质粒DNA的试剂盒。该试剂盒包括磁性分离介质和至少一种质粒提取试剂，其中所述磁性分离介质为粒径为50～1000nm的磁性纳米微球。所述质粒提取试剂包括细菌悬浮液R1、菌体裂解液R2和R3、吸附缓冲液R4、洗涤液R5和洗脱液R6。所述吸附缓冲液R4的组成为：2.5～4mol/L盐酸胍(pH为5.0)，200～300mmol/L氯化钠，15～50mmol/L醋酸钾，1～3％冰醋酸，12～18％异丙醇。
申请号为CN201810169271.8的发明专利公开了一种高纯度DNA或RNA的快速提取试剂盒及其提取方法。步骤为将生物样品加入裂解液中，搅拌混合均匀；接下来加入磁珠悬浮液，直接将裂解释放的DNA与磁珠搅拌均匀，制得磁珠-DNA悬浮液，用洗液I和洗液II进行先后洗涤，去除裂解液中的盐和细胞破裂释放的蛋白质，制得的新磁珠-DNA悬浮液，使用洗脱液将结合在磁珠表面的DNA洗脱下来，制得DNA样本。
但是，上述提取方法或者试剂盒中磁珠对DNA的结合能力欠佳，磁珠吸附DNA的过程耗时较长。
有鉴于此，有必要设计一种改进的磁珠法快速提取细菌质粒DNA的试剂盒及提取方法，以解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种磁珠法快速提取细菌质粒DNA的试剂盒及提取方法。
实现上述发明目的，本发明提供了一种磁珠法快速提取细菌质粒DNA的试剂盒，所述试剂盒包括用于裂解细菌的裂解试剂组和用于提取质粒DNA的提取试剂组；
所述提取试剂组由磁珠结合液、洗涤液、洗脱液组成；所述磁珠结合液由乙酸钠、二硫苏糖醇、异硫氰酸胍和磁珠混悬液组成；所述磁珠结合液中，乙酸钠浓度为0.15～0.45M，二硫苏糖醇含量为1～3wt％，异硫氰酸胍浓度为3～5M。
作为本发明的进一步改进，所述磁珠结合液中，乙酸钠浓度为0.2M，二硫苏糖醇含量为1wt％，异硫氰酸胍浓度为3M。
作为本发明的进一步改进，所述磁珠混悬液中的磁珠表面修饰有硅羟基或硅羧基。
作为本发明的进一步改进，所述磁珠的粒径为0.5～1μm。
作为本发明的进一步改进，在所述磁珠结合液中，磁珠混悬液为磁珠与异丙醇按照质量比1：(5～20)混合配置而成；所述磁珠结合液的pH值为7.5～8.5。
作为本发明的进一步改进，所述裂解试剂组由菌体重悬液、裂解液、中和液组成；
菌体重悬液为包含10～20mM乙二胺四乙酸和25～35mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的水溶液，pH值为7.0～8.0。
作为本发明的进一步改进，所述裂解液为包含0.2～0.4M氢氧化钠和质量分数1～3％十二烷基硫酸钠的水溶液；所述中和液为包含3～5M乙酸钾和2～4M乙酸的水溶液，pH值为4.0～6.0。
作为本发明的进一步改进，所述洗涤液为体积分数75～85％的异丙醇水溶液或乙醇水溶液；洗脱液为蒸馏水、去离子水、超纯水中的一种。
实现上述发明目的，本发明还提供了一种磁细菌质粒DNA的快速提取方法，采用上述磁珠法快速提取细菌质粒DNA的试剂盒进行提取，包括如下步骤：
步骤(1)：取1～4mL新鲜过夜培养的细菌培养液至离心管中，10000～12000转/分钟离心1～5分钟，弃上清，加入100～200μL菌体重悬液，涡旋10～15秒，混匀菌液；
步骤(2)：向步骤(1)得到的菌液中加入100～200μL裂解液，轻轻上下颠倒5～8次，再加入150～250μL中和液，再次轻轻的上下颠倒5～8次后，立即10000～12000转/分钟离心3～5分钟，然后取上清100～300μL至新离心管中；
步骤(3)：向步骤(2)新离心管中加入50～200μL磁珠结合液，涡旋10～15秒后静置1～3分钟，然后用磁力架进行磁分离，吸弃液体；
步骤(4)：向步骤(3)离心管中加入200～700μL洗涤液，涡旋10～15秒后静置10～30秒，然后用磁力架进行磁分离，吸弃液体，开盖室温静置5～10分钟；
步骤(5)：向步骤(4)离心管中加入40～160μL洗脱液，涡旋10～15秒后静置1～3分钟，然后用磁力架进行磁分离，吸取上清液体至新离心管中，提取得到细菌质粒DNA。
作为本发明的进一步改进，步骤(2)中，加入裂解液并颠倒数次后，溶液变粘稠；加入中和液并颠倒数次后，溶液变成白色絮状；吸取液体时应保持离心管在磁力架上。
本发明的有益效果是：
1、常规DNA的提取过程中大多会经过65℃以上的高温处理，高温处理时细菌内的金属离子或核酸酶等物质会被破坏变性，有利于后续的核酸提取，减少了最终提取时的核酸损失。然而质粒DNA提取过程不经过高温处理，其内部蛋白质、金属离子和核酸酶等物质一起被释放出来，增加了后续洗涤的难度，同时质粒DNA的提取过程中还需要避免基因组DNA的污染，因此更为复杂。本发明提供的磁珠法快速提取细菌质粒DNA的试剂盒，采用硅羟基或硅羧基磁珠、0.15～0.45M的乙酸钠、1～3wt％的二硫苏糖醇和3～5M的异硫氰酸胍的混合液作为磁珠结合液复配体系，利用本发明的提取方法进行细菌质粒DNA的快速提取，可以有效增强质粒DNA和磁珠之间的结合能力，磁珠对DNA的吸附过程只需要1分钟，即可有效提取细菌质粒DNA，且纯度高、片段完整，步骤简单；同时试剂均无毒性，对环境污染小，可用于替代市面上大部分同类产品。
2、本发明提供的磁珠法快速提取细菌质粒DNA的试剂盒，在磁珠结合液复配体系中，无机盐乙酸钠的作用为：钠离子中和DNA分子上的负电荷，减少负电性DNA分子间的排斥力，促进DNA的聚集沉淀，增加磁珠对DNA的吸附量。同时，乙酸根吸附于磁珠表面，可以有效地保护磁珠表面的硅羟基或硅羧基基团活性，有利于细菌质粒DNA在磁珠表面的牢固吸附。
二硫苏糖醇的作用为：在一定程度上防止磁珠被氧化而导致磁珠磁性减弱，保证核酸的有效磁分离。
异硫氰酸胍的作用为：作为强力的蛋白质变性剂，迅速破碎细菌释放核酸，同时抑制细胞释放核酸酶，在快速提取质粒DNA的同时保持核酸结构的完整性。
表面修饰有硅羟基或硅羧基的磁珠的作用为：利用羟基或羧基磁珠表面的负电性，在盐离子的存在下和负电性的核酸三者形成“阴离子-阳离子-阴离子”的盐桥结构，特异性提取核酸。
该磁珠结合液复配体系中，各原料组分之间缺一不可，经过对上述各原料组分进行不断的实验探索和合理复配，使得各原料之间发挥协同作用，得到磁珠结合液复配体系的最佳比例实现稳固结合和快速提取的双重功效，该磁珠结合液复配体系对细菌质粒DNA具备稳固的结合力和快速的提取能力。该稳固结合和快速提取双重功效的协同机理如下：细菌被裂解后，细菌中的蛋白质、金属离子和核酸酶等物质一起被释放出来，异硫氰酸胍作为强力的蛋白质变性剂，可迅速破坏细菌释放出核酸，大大增加提取速度；同时乙酸根吸附于磁珠表面可有效保护磁珠表面的硅羟基或硅羧基基团的活性，有利于细菌质粒DNA在磁珠表面的牢固吸附；二硫苏糖醇也可有效防止磁珠被氧化而磁性减弱，有效保证质粒DNA的磁分离过程，进一步缩短提取时间。此协同机理使得磁珠对质粒DNA的吸附过程只需要1分钟，且时间可控性较强，而常规提取方法中此吸附过程最少需要5分钟；因此有效避免了现有技术中由于磁珠与DNA的结合力弱而导致吸附过程冗长、影响DNA吸附效率和稳定性的技术缺陷。
附图说明
图1为实施例1及对比例1至2提供的试剂盒提取的大肠杆菌质粒DNA的琼脂糖电泳图(其中所有实施例及对比例中磁珠对质粒DNA的吸附时间均为1分钟；M泳道是Marker条带；1、2、3泳道为本发明实施例1的试剂盒提取的细菌质粒DNA条带；4、5、6泳道为对比例1提供的市售海狸试剂盒提取的细菌质粒DNA条带；7、8、9泳道为对比例2提供的市售生工试剂盒提取的细菌质粒DNA条带)。
图2为实施例1至3及对比例3至5提供的试剂盒提取的大肠杆菌质粒DNA的琼脂糖电泳图(其中实施例1至3中磁珠对质粒DNA的吸附时间为1分钟，对比例3至5中磁珠对质粒DNA的吸附时间为5分钟；M泳道是Marker条带；1、2、3泳道分别为实施例1、2、3的试剂盒提取的细菌质粒DNA条带；4、5、6泳道分别为对比例3、4、5的试剂盒提取的细菌质粒DNA条带)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述。
在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明，在附图中仅仅示出了与本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了与本发明关系不大的其他细节。
另外，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
本发明还提供了一种磁细菌质粒DNA的快速提取方法，采用本发明提供的磁珠法快速提取细菌质粒DNA的试剂盒进行提取，包括如下步骤：
步骤(1)：取1～4mL新鲜过夜培养的细菌培养液至离心管中，10000～12000转/分钟离心1～5分钟，弃上清，加入100～200μL菌体重悬液，涡旋10～15秒，混匀菌液；
步骤(2)：向步骤(1)得到的菌液中加入100～200μL裂解液，轻轻上下颠倒5～8次，再加入150～250μL中和液，再次轻轻的上下颠倒5～8次后，立即10000～12000转/分钟离心3～5分钟，然后取上清100～300μL至新离心管中；
步骤(3)：向步骤(2)新离心管中加入50～200μL磁珠结合液，涡旋10～15秒后静置1分钟，然后用磁力架进行磁分离，吸弃液体；
步骤(4)：向步骤(3)离心管中加入200～700μL洗涤液，涡旋10～15秒后静置10～30秒，然后用磁力架进行磁分离，吸弃液体，开盖室温静置5～10分钟；
步骤(5)：向步骤(4)离心管中加入40～160μL洗脱液，涡旋10～15秒后静置1～3分钟，然后用磁力架进行磁分离，吸取上清液体至新离心管中，提取得到细菌质粒DNA。
优选的，步骤(2)中，加入裂解液并颠倒数次后，溶液变粘稠；加入中和液并颠倒数次后，溶液变成白色絮状；吸取液体时应保持离心管在磁力架上。
实施例1
实施例1提供了一种磁珠法快速提取细菌质粒DNA的试剂盒，所述试剂盒包括用于裂解细菌的裂解试剂组和用于提取质粒DNA的提取试剂组；
所述裂解试剂组由菌体重悬液、裂解液、中和液组成。重悬液为包含15mM乙二胺四乙酸和20mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的水溶液，pH为7.5；裂解液为包含0.3M氢氧化钠和质量分数2％十二烷基硫酸钠的水溶液；中和液为包含4M乙酸钾和3M乙酸的水溶液，pH为5.0；
所述提取试剂组由磁珠结合液、洗涤液、洗脱液组成。洗涤液为体积分数80％的异丙醇水溶液或乙醇水溶液；洗脱液为蒸馏水。
磁珠结合液为包含0.2M乙酸钠、1wt％二硫苏糖醇、3M异硫氰酸胍和3mL尺寸为500nm的硅羟基磁珠混悬液组成的混合磁珠溶液，其中磁珠混悬液为磁珠与异丙醇按照质量比1：10混合配置而成，溶液pH为7.5。
按照以下步骤进行大肠杆菌质粒DNA的提取：
步骤(1)：取2mL新鲜过夜培养的细菌培养液至离心管中，10000r/分钟离心1分钟，弃上清，加入150μL重悬液，涡旋15秒，混匀菌液；
步骤(2)：向步骤(1)得到的菌液中加入150μL裂解液，轻轻的上下颠倒8次，再加入200μL中和液，再次轻轻的上下颠倒8次后，立即12000转/分钟离心1分钟，然后取上清300μL至新离心管中；
步骤(3)：向步骤(2)新离心管中加入50μL磁珠溶液，涡旋15秒后静置1分钟，然后用磁力架进行磁分离，吸弃液体；
步骤(4)：向步骤(3)离心管中加入700μL洗涤液，涡旋15秒后静置30秒，然后用磁力架进行磁分离，吸弃液体，开盖室温静置3分钟；
步骤(5)：向步骤(4)离心管中加入100μL洗脱液，涡旋15秒后静置2分钟，然后用磁力架进行磁分离，吸取上清液体至新离心管中，即得细菌质粒DNA。
实施例2
与实施例1的不同之处在于：磁珠结合液的配制比例不同，其他均与实施例1相同，在此不再赘述。
在本实施方式中，磁珠结合液为包含0.15M乙酸钠、2wt％二硫苏糖醇、3M异硫氰酸胍和3mL尺寸为700nm的硅羟基磁珠混悬液组成的混合磁珠溶液，其中磁珠混悬液为磁珠与异丙醇按照质量比1：20混合配置而成，溶液pH为7.5。
实施例3
与实施例1的不同之处在于：磁珠结合液的配制比例不同，其他均与实施例1相同，在此不再赘述。
在本实施方式中，磁珠结合液为包含0.3乙酸钠、3wt％二硫苏糖醇、3M异硫氰酸胍和3mL尺寸为1000nm的硅羧基磁珠混悬液组成的混合磁珠溶液，其中磁珠混悬液为磁珠与异丙醇按照质量比1：10混合配置而成，溶液pH为8.5。
对比例1
对比例1采用市售苏州海狸生物医学工程有限公司的质粒DNA小量抽提试剂盒(MN-P96-1G)进行细菌质粒DNA的提取。
对比例1设置了三组平行例，分别为对比例1-1、对比例1-2和对比例1-3。
对比例2
对比例2采用市售生工生物工程(上海)股份有限公司的磁珠法质粒DNA小量抽提试剂盒(B518791)进行细菌质粒DNA的提取。
对比例2设置了三组平行例，分别为对比例2-1、对比例2-2和对比例2-3。
从图1中可以看出，在固定磁珠对质粒DNA的吸附时间为1分钟的情况下，本发明实施例1至3的试剂盒提取的质粒DNA在总量方面要显著优于对比例1至2提供的普通商品化试剂盒提取的质粒DNA的总量；本发明实施例1至3的试剂盒在片段完整性和纯度方面与对比例1至2提供的普通商品化质粒DNA提取试剂盒相比不相上下。
对比例3
与实施例1的区别在于：无机盐采用常规的氯化钠。其他均与实施例1相同，在此不再赘述。
对比例4
与实施例1的区别在于：还原剂采用常规的巯基乙醇。其他均与实施例1相同，在此不再赘述。
对比例5
与实施例1的区别在于：核酸酶抑制剂采用常规的蛋白酶K。其他均与实施例1相同，在此不再赘述。
对实施例1至3及对比例3至5提取的细菌质粒DNA的快速提取性能进行测试(其中实施例1至3中磁珠对质粒DNA的吸附时间为1分钟，对比例3至5中磁珠对质粒DNA的吸附时间为5分钟)，请参阅图2所示，结果表明：本试剂盒提取的细菌质粒DNA总量多(亮度亮)、纯度高(无拖尾)，这说明本试剂盒具有快速提取细菌质粒DNA的能力。上述测试结果表明，本发明提供的基于硅羟基或硅羧基磁珠、0.15～0.45M的乙酸钠、1～3wt％的二硫苏糖醇和3～5M的异硫氰酸胍混合而成的磁珠结合液复配体系中，各原料组分之间缺一不可，各原料之间发挥协同作用，对细菌质粒DNA具备稳固的结合力和快速的提取能力。
综上所述，本发明提供了一种磁珠法快速提取细菌质粒DNA的试剂盒及提取方法。所述试剂盒包括用于裂解细菌的裂解试剂组和用于提取质粒DNA的提取试剂组；所述提取试剂组由磁珠结合液、洗涤液、洗脱液组成。本发明提供的基于该试剂盒实现质粒DNA快速提取方法中，通过选用表面修饰有硅羟基或硅羧基的磁珠、0.15～0.45M的乙酸钠、1～3wt％的二硫苏糖醇和3～5M的异硫氰酸胍的混合液作为磁珠结合液复合体系，极大增强了质粒DNA和磁珠的结合能力，使得提取效率提高，提取速度加快，磁珠对DNA的吸附过程只需要1分钟，且提取出的DNA纯度高、片段完整；同时试剂均无毒性，对环境污染小，可用于替代市面上大部分同类产品。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (6)

1.一种磁珠法快速提取细菌质粒DNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于裂解细菌的裂解试剂组和用于提取质粒DNA的提取试剂组；
所述提取试剂组由磁珠结合液、洗涤液、洗脱液组成；所述磁珠结合液由乙酸钠、二硫苏糖醇、异硫氰酸胍和磁珠混悬液组成；所述磁珠结合液中，乙酸钠浓度为 0.2 M，二硫苏糖醇含量为1 wt%，异硫氰酸胍浓度为3 M；
所述磁珠混悬液中的磁珠表面修饰有硅羟基或硅羧基；
所述磁珠的粒径为0.5~1μm；
在所述磁珠结合液中，磁珠混悬液为磁珠与异丙醇按照质量比1：（5~20）混合配置而成；所述磁珠结合液的pH值为7.5~8.5；
采用硅羟基或硅羧基磁珠、0.2 M的乙酸钠、1wt%的二硫苏糖醇和3 M的异硫氰酸胍的混合液作为磁珠结合液复配体系，磁珠对DNA的吸附过程只需要1分钟，即可有效提取细菌质粒DNA。
2.根据权利要求1所述的一种磁珠法快速提取细菌质粒DNA的试剂盒，其特征在于：所述裂解试剂组由菌体重悬液、裂解液、中和液组成；
菌体重悬液为包含10~20mM乙二胺四乙酸和25~35mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的水溶液，pH值为7.0~8.0。
3.根据权利要求2所述的一种磁珠法快速提取细菌质粒DNA的试剂盒，其特征在于：所述裂解液为包含0.2~0.4 M氢氧化钠和质量分数1~3%十二烷基硫酸钠的水溶液；所述中和液为包含3~5 M乙酸钾和2~4 M乙酸的水溶液，pH值为4.0~6.0。
4.根据权利要求1所述的一种磁珠法快速提取细菌质粒DNA的试剂盒，其特征在于：所述洗涤液为体积分数75~85 %的异丙醇水溶液或乙醇水溶液；洗脱液为蒸馏水、去离子水、超纯水中的一种。
5.一种细菌质粒DNA的快速提取方法，其特征在于：采用权利要求1至4中任一项权利要求所述的一种磁珠法快速提取细菌质粒DNA的试剂盒进行提取，包括如下步骤：
步骤（1）：取1~4 mL新鲜过夜培养的细菌培养液至离心管中，10000~12000 转/分钟离心1~5分钟，弃上清，加入100~200μL菌体重悬液，涡旋10~15秒，混匀菌液；
步骤（2）：向步骤（1）得到的菌液中加入100~200μL裂解液，轻轻上下颠倒5~8次，再加入150~250μL中和液，再次轻轻的上下颠倒5~8次后，立即10000~12000转/分钟离心3~5分钟，然后取上清100~300μL至新离心管中；
步骤（3）：向步骤（2）新离心管中加入50~200μL磁珠结合液，涡旋10~15秒后静置1分钟，然后用磁力架进行磁分离，吸弃液体；
步骤（4）：向步骤（3）离心管中加入200~700μL洗涤液，涡旋10~15秒后静置10~30秒，然后用磁力架进行磁分离，吸弃液体，开盖室温静置5~10分钟；
步骤（5）：向步骤（4）离心管中加入40~160μL洗脱液，涡旋10~15秒后静置1~3分钟，然后用磁力架进行磁分离，吸取上清液体至新离心管中，提取得到细菌质粒DNA。
6.根据权利要求5所述的细菌质粒DNA的快速提取方法，其特征在于：步骤（2）中，加入裂解液并颠倒数次后，溶液变粘稠；加入中和液并颠倒数次后，溶液变成白色絮状；吸取液体时应保持离心管在磁力架上。
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