CN114107288A - 一种磁珠法提取质粒dna的试剂盒及提取质粒dna的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种磁珠法提取质粒DNA的试剂盒，包括质粒提取试剂和羟基磁珠，质粒提取试剂包括溶液I、溶液II、溶液III、磁珠结合液、漂洗液和洗脱液。溶液I、溶液II、溶液III的混合比例为1：1：1.4。还提供了利用上述磁珠法提取质粒DNA的试剂盒来提取高纯度质粒DNA的方法。本发明所述的磁珠法提取质粒DNA的试剂盒及提取质粒DNA的方法，缩短了质粒提取时间，提取的质粒能够满足后续PCR、酶切、转化和转染等实验的大量需求，减少了时间和经济成本。

Description

一种磁珠法提取质粒DNA的试剂盒及提取质粒DNA的方法
技术领域
本发明涉及核酸纯化技术领域，尤其涉及一种磁珠法提取质粒DNA的试剂盒及提取质粒DNA的方法。
背景技术
质粒DNA是一种环状双链小分子DNA，能够独立复制并稳定遗传。质粒DNA是基因工程中常见的基因运载工具，可以携带目的基因进入细菌、植物细胞或动物细胞内进行扩增与表达。质粒DNA的提取与纯化关系到后续实验的成功与否，因此，高效地提取纯化大量高纯度质粒具有重要意义。
从原核生物中提取质粒DNA有3个基本步骤：菌体裂解、质粒分离、质粒纯化。目前常用的菌体裂解方法有碱裂解法、煮沸法、有机溶剂法和去污剂法等。前两种方法比较剧烈，容易造成质粒断裂，回收率低。有机溶剂法最常用的是酚/氯仿抽提法，能有效去除蛋白质污染，但容易产生内毒素污染，RNA和ssDNA也很难被去除。去污剂法比较温和，一般用于分离大质粒(>15kb)。目前实验室广泛使用的质粒分离的方法主要有硅基质膜吸附分离法和磁珠吸附法。硅基质膜吸附分离法提取的质粒纯度高，但质粒量少，如果需要回收大量核酸需要更多的柱子，耗费时间和经济成本。磁珠吸附法是以磁性纳米、微米材料为基础发展的分离纯化新技术，它可以高效吸附 DNA，操作简单快速，适合大规模提取DNA样本。
因此，亟需一种能够提取高纯度质粒DNA的试剂盒和提取质粒DNA的方法。
发明内容
本发明的目的一在于公开一种磁珠法提取质粒DNA的试剂盒，目的二在于提供利用上述磁珠法提取质粒DNA的试剂盒来提取高纯度质粒DNA的方法。
为实现上述目的一，本发明提供了一种磁珠法提取质粒DNA的试剂盒，包括质粒提取试剂和羟基磁珠，所述质粒提取试剂包括溶液I、溶液II、溶液III、磁珠结合液、漂洗液和洗脱液。所述溶液I、溶液II、溶液III的混合比例为1：1：1.4。
进一步地，溶液I由50mmol葡萄糖、25mmol Tris-HCl(pH 8.0)、10 mmol EDTA(pH8.0)、5μg/L-10μg/L RNase A和水组成。
进一步地，溶液II由0.25mol/L NaOH、1.5％SDS和水组成。
进一步地，溶液III由3.0mol/L-5.0mol/L盐酸胍、0.8mol/L-1.2mol/L 醋酸-醋酸钾缓冲液、1mmol/L-3mmol/L月桂酰基氨酸钠和水组成，所述溶液III的pH值为4.0-5.0。
进一步地，磁珠结合液为40％-60％异丙醇水溶液，所述漂洗液为70％ -80％乙醇水溶液，所述洗脱液为无菌去离子水或者10mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA，所述洗脱液的pH值为8.0。
为实现上述目的二，本发明还提供了一种利用上述磁珠法提取质粒DNA 的试剂盒来提取质粒DNA的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将5mL-15mL培养12h-16h的大肠杆菌菌液离心，4000rpm离心10min，收集菌体，弃培养基。
(2)向步骤(1)的菌体中加入500μL溶液I，涡旋振荡使其充分混匀，悬浮菌体沉淀。
(3)向步骤(2)的混合液中加入500μL溶液II，轻柔颠倒混匀几次，溶液呈清亮粘稠状。
(4)向步骤(3)的混合液中加入700μL溶液III，轻柔颠倒混匀几次，溶液出现白色絮状沉淀，12000rpm离心5min。
(5)将步骤(4)的上清转移至新的2mL无菌离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，加入2.5mg羟基磁珠，颠倒混匀一分钟。
(6)将步骤(5)中的离心管放在磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，小心吸去液体。
(7)将步骤(6)中的离心管从将离心管从磁力架上取下，加入600μL 漂洗液，振荡混匀2min。
(8)重复一次步骤(7)，通过重复步骤(7)，进一步的去除杂质。
(9)将步骤(8)中的离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，小心吸去液体，室温晾干10min-15min。
(10)将步骤(9)中的离心管从磁力架上取下，加入100μL-500μL 洗脱液或无菌水，振荡混匀，置于56℃水浴锅孵育5min。
(11)将步骤(10)中的离心管放置于磁力架上静置2min，磁珠完全吸附后，小心将质粒DNA溶液转移至一个新离心管中，于-20℃保存。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明提供的磁珠法提取质粒DNA的试剂盒中的提取试剂是基于传统碱裂解法的菌体裂解液进行了优化，提高了提取试剂中的盐浓度，降低了蛋白质、基因组DNA以及RNA的污染，离心后，质粒DNA存在于上清溶液中。再结合磁珠吸附法，高效的吸附质粒DNA，后续不需要离心，分离速度快，缩短了质粒提取时间。
2、利用本发明的提取方法可以对质粒DNA进行快速提取，操作简单，并且得到的质粒DNA纯度高，得率高，对于常规培养16h的大肠杆菌菌液的高拷贝质粒，1mg羟基磁珠可吸附20-100μg质粒DNA，满足后续PCR、酶切、转化和转染等实验的大量需求，减少了时间和经济成本，易于实验室自动化操作。
附图说明
图1为本发明实施例1至3试剂盒提取的菌质粒DNA的琼脂糖电泳图；
图2为对比例与本发明实施例1试剂盒提取的菌质粒DNA的琼脂糖电泳图。
具体实施方式
下面结合各实施方式对本发明进行详细说明，但应当说明的是，这些实施方式并非对本发明的限制，本领域普通技术人员根据这些实施方式所作的功能、方法、或者结构上的等效变换或替代，均属于本发明的保护范围之内。
实施例1
本实施例提供了一种磁珠法提取质粒DNA的试剂盒及提取质粒DNA的方法。
上述方法包括以下步骤：
(1)取培养过夜的含有pcDNA3.1的质粒的15mL大肠杆菌菌液， 4000rpm离心10min，收集菌体，弃培养基。
(2)向步骤(1)的菌体中加入500μL溶液I，涡旋振荡使其充分混匀，悬浮菌体沉淀。
(3)向步骤(2)的混合液中加入500μL溶液II，轻柔颠倒混匀几次，溶液呈清亮粘稠状。
(4)向步骤(3)的混合液中加入700μL溶液III，轻柔颠倒混匀几次，溶液出现白色絮状沉淀，12000rpm离心5min。
(5)将步骤(4)的上清转移至新的2mL无菌离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，加入2.5mg200nm羟基磁珠，颠倒混匀一分钟。
(6)将步骤(5)中的离心管放在磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，小心吸去液体。
(7)将步骤(6)中的离心管从将离心管从磁力架上取下，加入600μL 漂洗液，振荡混匀2min。
(8)重复一次步骤(7)。
(9)将步骤(8)中的离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，小心吸去液体，室温晾干10min。
(10)将步骤(9)中的离心管从磁力架上取下，加入500μL洗脱液或无菌水，振荡混匀，置于56℃水浴锅孵育5min。
(11)将步骤(10)中的离心管放置于磁力架上静置2min，磁珠完全吸附后，小心将质粒DNA溶液转移至一个新离心管中。
通过1％琼脂糖凝胶电泳(图1)和紫外分光仪检测质粒DNA浓度和含量(表1)。
琼脂糖凝胶电泳检测：对提取得到的质粒DNA样品，分别取2μL上样，进行1％琼脂糖凝胶电泳，得图1。图1中泳道1、4、7为本实施例试剂盒和方法提取的质粒DNA。
利用紫外分光仪检测按照实施例1提取的质粒DNA的浓度和含量，结果如表1所示。
表1：实施例1提取的质粒DNA的浓度和含量
Figure RE-GDA0003479454690000041
实施例2
本实施例与实施例1的不同之处在于，羟基磁珠的粒径大小为1μm，其他均与实施例1相同，在此不再赘述。
琼脂糖凝胶电泳检测：对提取得到的质粒DNA样品，分别取2μL上样，进行1％琼脂糖凝胶电泳，图1中泳道2、5、8为本实施例试剂盒和方法提取的质粒DNA。
利用紫外分光仪检测按照实施例1提取的质粒DNA的浓度和含量，结果如表2所示。
表2：实施例2提取的质粒DNA的浓度和含量
Figure RE-GDA0003479454690000042
实施例3
本实施例与实施例1不同之处在于，羟基磁珠的粒径大小为2μm，其他均与实施例1相同，在此不再赘述。
琼脂糖凝胶电泳检测：对提取得到的质粒DNA样品，分别取2μL上样，进行1％琼脂糖凝胶电泳，图1中泳道3、6、9为本发明试剂盒和方法提取的质粒DNA。
利用紫外分光仪检测按照实施例1提取的质粒DNA的浓度和含量，结果如表3所示。
表3：实施例3提取的质粒DNA的浓度和含量
Figure RE-GDA0003479454690000051
对比例
本对比例提取质粒DNA的试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司质粒小提中量试剂盒(产品型号：DP106-02)使用该试剂盒中的Buffer P1、 Buffer P2、Buffer P3、BufferPW和RNase A(10mg/mL)作为提取质粒DNA 试剂的对照，磁珠、磁珠结合液和洗脱液均使用本试剂盒中的磁珠、磁珠结合液和洗脱液。包括以下步骤：
(1)取培养过夜的含有pABm质粒的10mL大肠杆菌菌液，4000rpm离心10min，收集菌体，弃培养基。
(2)向步骤(1)的菌体中分别加入500μL溶液I和商品试剂盒Buffer P1，涡旋振荡使其充分混匀，悬浮菌体沉淀。
(3)向步骤(2)的混合液中分别加入500μL溶液II和商品试剂盒Buffer P2，轻柔颠倒混匀几次，溶液呈清亮粘稠状。
(4)向步骤(3)的混合液中分别加入700μL溶液III和商品试剂盒 Buffer P3，轻柔颠倒混匀几次，溶液出现白色絮状沉淀，12000rpm离心5min。
(5)将步骤(4)的上清分别转移至新的2mL无菌离心管中，分别加入等体积异丙醇，混匀，加入2.5mg200nm羟基磁珠，颠倒混匀一分钟。
(6)将步骤(5)中的离心管放在磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，小心吸去液体。
(7)将步骤(6)中的离心管从将离心管从磁力架上取下，分别加入600 μL漂洗液，振荡混匀2min。
(8)重复一次步骤(7)。
(9)将步骤(8)中的离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，小心吸去液体，室温晾干10min。
(10)将步骤(9)中的离心管从磁力架上取下，分别加入500μL洗脱液或无菌水，振荡混匀，置于56℃水浴锅孵育5min。
(11)将步骤(10)中的离心管放置于磁力架上静置2min，磁珠完全吸附后，小心将质粒DNA溶液转移至一个新离心管中。
通过1％琼脂糖凝胶电泳(图2)和紫外分光仪检测质粒DNA浓度和含量(表4)。
琼脂糖凝胶电泳检测：对提取得到的质粒DNA样品，分别取2μL上样，进行1％琼脂糖凝胶电泳，得图2。图2中泳道M为DL5000 DNA Maker，泳道1、2为本发明试剂盒提取的质粒DNA。图2中泳道3、4为国内知名企业质粒小提中量试剂盒提取的质粒DNA。
紫外分光仪检测质粒DNA浓度和含量：
表4：对比例中紫外分光仪浓度测定质粒DNA含量结果(pABm-T1、 pABm-T2为对比例中商品试剂盒提取；pABm-A1、pABm-A2为本发明实施例1的试剂盒提取)。
Figure RE-GDA0003479454690000061
图1以及表1-3的结果表明，粒径为2μm的羟基磁珠吸附质粒DNA的总量最高，但根据实施例的具体操作情况，2μm的羟基磁珠进行磁分离需要2分钟，200nm的羟基磁珠进行磁分离只需要30sec，而1μm的羟基磁珠容易吸附部分降解的RNA，因此使用本发明试剂盒及方法提取质粒DNA优选200nm的羟基磁珠作为磁性分离介质。
图2以及表4的结果表明，使用本发明试剂盒及方法提取的质粒DNA，其纯度及提取总量不亚于国内一流企业的商品化质粒提取试剂盒。
实施例4
为了验证本发明所述试剂盒及方法提取的质粒DNA满足后续实验的要求，我们使用本试剂盒及方法提取的质粒DNA进行了细胞转染并表达蛋白的实验。使用pABm载体连接某基因的500μg质粒转染进500mL 293F细胞中，最终获得表达蛋白6.93mg；使用pcDNA3.1载体连接某基因的200μg 质粒转染进200mL 293F细胞中，最终获得表达蛋白9.91mg。本试剂盒及方法提取的质粒DNA已在本实验室进行的大量细胞转染实验中得到验证，满足实验需求。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (6)

1.一种磁珠法提取质粒DNA的试剂盒，其特征在于，包括质粒提取试剂和羟基磁珠，所述质粒提取试剂包括溶液I、溶液II、溶液III、磁珠结合液、漂洗液和洗脱液，所述溶液I、溶液II、溶液III的混合比例为1：1：1.4。
2.根据权利要求1所述的磁珠法提取质粒DNA的试剂盒，其特征在于，所述溶液I由50mmol葡萄糖、25mmol Tris-HCl(pH 8.0)、10mmol EDTA(pH 8.0)、5μg/L-10μg/L RNase A和水组成。
3.根据权利要求2所述的磁珠法提取质粒DNA的试剂盒，其特征在于，所述溶液II由0.25mol/L NaOH、1.5％SDS和水组成。
4.根据权利要求3所述的磁珠法提取质粒DNA的试剂盒，其特征在于，所述溶液III由3.0mol/L-5.0mol/L盐酸胍、0.8mol/L-1.2mol/L醋酸-醋酸钾缓冲液、1mmol/L-3mmol/L月桂酰基氨酸钠和水组成，所述溶液III的pH值为4.0-5.0。
5.根据权利要求4所述的磁珠法提取质粒DNA的试剂盒，其特征在于，所述磁珠结合液为40％-60％异丙醇水溶液，所述漂洗液为70％-80％乙醇水溶液，所述洗脱液为无菌去离子水或者10mmol/L Tris-HCl、1mmol/L EDTA，所述洗脱液的pH值为8.0。
6.一种利用权利要求1-5任一项所述磁珠法提取质粒DNA的试剂盒来提取质粒DNA的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将5mL-15mL培养12h-16h的大肠杆菌菌液离心，4000rpm离心10min，收集菌体，弃培养基；
(2)向步骤(1)的菌体中加入500μL溶液I，涡旋振荡使其充分混匀，悬浮菌体沉淀；
(3)向步骤(2)的混合液中加入500μL溶液II，轻柔颠倒混匀几次，溶液呈清亮粘稠状；
(4)向步骤(3)的混合液中加入700μL溶液III，轻柔颠倒混匀几次，溶液出现白色絮状沉淀，12000rpm离心5min；
(5)将步骤(4)的上清转移至新的2mL无菌离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，加入2.5mg羟基磁珠，颠倒混匀一分钟；
(6)将步骤(5)中的离心管放在磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，小心吸去液体；
(7)将步骤(6)中的离心管从将离心管从磁力架上取下，加入600μL漂洗液，振荡混匀2min；
(8)重复一次步骤(7)；
(9)将步骤(8)中的离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，小心吸去液体，室温晾干10min-15min；
(10)将步骤(9)中的离心管从磁力架上取下，加入100μL-500μL洗脱液或无菌水，振荡混匀，置于56℃水浴锅孵育5min；
(11)将步骤(10)中的离心管放置于磁力架上静置2min，磁珠完全吸附后，小心将质粒DNA溶液转移至一个新离心管中，于-20℃保存。
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