CN108220284A - 一种磁珠法细菌基因组dna提取试剂盒及应用 - Google Patents
一种磁珠法细菌基因组dna提取试剂盒及应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种磁珠法细菌基因组DNA提取试剂盒及应用,属于分子生物学技术领域。该试剂盒包括以下六种组分:磁珠悬液A、缓冲液B、缓冲液C、缓冲液D、缓冲液E和洗脱液。该试剂盒提取方法包括以下四个步骤:细菌裂解、磁珠吸附、洗涤、洗脱。本发明试剂盒采用单分散、超顺磁性硅羟基纳米磁珠,配合独特的缓冲液系统,提取出来的细菌基因组DNA浓度大、纯度高、完整性好。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域,涉及一种DNA提取试剂盒。
背景技术
基因组DNA的提取是分了生物学研究的一个重要环节,是进行几乎所有核酸检测的基础。传统的细菌基因组DNA提取方法有酚—氯仿抽提法、盐析法和离心柱法等。这些方法均存在一些缺点,例如:酚—氯仿抽提法要使用到酚和氯仿等有毒物质,对人体有害,且容易造成环境污染;盐析法提取的DNA纯度低。硅胶膜吸附柱法提取的DNA浓度低。
传统细菌基因组DNA提取方法同时提取过程需要反复换管、离心、分液,步骤繁琐,提取工作效率低下,并且会造成样本的丢失与污染。此外。传统的方法实现自动化困难、单位时间通量低、既费时又繁琐,远远不适用于核酸自动化检测。近年来,基于纳米材料的基因组DNA分离技术得到了快速发展,而纳米磁珠由于具有分散性好、易于功能化、易于自动化的优点使之成为非常合适的基因组DNA制备载体。应用表面修饰了功能基团的纳米磁珠和合适的缓冲液系统,能够快速、高效地从细菌中提取基因组DNA。具有自动化升级的潜力,使得核酸提取的大规模集成化,均一化成为可能。
由于细菌中存在大量的蛋白质和RNA,现有的磁珠法提取的细菌基因组DNA由于没有去除蛋白质和RNA等杂质的步骤,提取到的基因组DNA得率低、纯度低。
发明内容
为了解决现有技术的不足,本发明提供了一种磁珠法细菌基因组DNA提取试剂盒,利用该试剂盒提取的细菌基因组DNA片段完整,纯度高,无蛋白质和RNA污染,并且得率高。
为了实现上述目的,本发明采取以下技术方案。
本发明所述的一种磁珠法细菌基因组DNA提取试剂盒,包括磁珠悬液A、缓冲液B、缓冲液C、缓冲液D、缓冲液E、洗脱液六种组分。
所述磁珠悬液A中使用的磁珠为单分散、超顺磁性硅羟基纳米磁珠,磁珠粒径300-500nm,浓度100mg/mL,磁珠悬浮在20%的乙醇中。
所述缓冲液B终浓度组成为:2-5mol/L盐酸胍、1-2%月桂酰肌氨酸钠、200-500µg/mL核糖核酸酶A(RNase A)、0.05-0.1mol/L柠檬酸钠,溶剂为无菌去离子水,缓冲液B pH为6.5-8.0。核糖核酸酶A可以快速有效的降解体系中的RNA,去除RNA污染,同时增加磁珠对DNA的吸附量。
所述缓冲液C终浓度组成为:1-2mol/L异硫氰酸胍、60-80%异丙醇、1-5%聚乙二醇、0.02-0.05mol/L柠檬酸钠,溶剂为无菌去离子水,缓冲液C pH为5.5-7.5。缓冲液C为清洗液,其中的异硫氰酸胍能够使体系中的蛋白质迅速变性而与DNA分离,达到清除蛋白质的目的。
所述缓冲液D终浓度组成为:1-2mol/L醋酸钠、5-8%聚乙二醇,溶剂为无菌去离子水,缓冲液D pH为5.0-6.0。
所述缓冲液E终浓度组成为:0.05-0.1mol/L氯化钠、60-80%乙醇、10mmol/L三羟甲基氨基甲烷,溶剂为无菌去离子水,缓冲液D pH为7.0-7.5。
所述洗脱液为:无菌去离子水或10mmol/L三羟甲基氨基甲烷,洗脱液pH为7.0-8.0。
本发明所述的试剂盒提取细菌基因组DNA包括细菌裂解、磁珠吸附、洗涤、洗脱步骤,具体如下。
步骤一,向离心管中加入100-500μL细菌培养液,然后加入初始菌液相同体积的缓冲液B,混匀,裂解15分钟。
步骤二,向离心管中加入10μL 磁珠悬液A和2倍初始菌液体积的缓冲液C,混匀,室温放置3分钟。
步骤三,将离心管置于磁力架上15秒,待磁珠完全吸至孔壁上之后,吸弃上清,从磁力架上取出离心管。
步骤四,加入500μL 缓冲液D,混匀,将离心管置于磁力架上15秒,待磁珠完全吸至管壁上后,吸弃上清,然后从磁力架上取出离心管。
步骤五,加入500μL 缓冲液E,混匀,将离心管置于磁力架上15秒,待磁珠完全吸至管壁上后,吸弃上清,然后从磁力架上取出离心管。
步骤六,重复步骤五1次。
步骤七,将离心管置于55℃恒温箱中干燥5-7 分钟至离心管内无液体残留。
步骤八,加入50-100μL洗脱液,充分悬浮磁珠5分钟。
步骤九,取出离心管并置于磁力架上15秒,待磁珠完全吸至管壁上后,小心吸取上清至新的离心管,即获得DNA产物。
本发明所述的磁珠悬液A、缓冲液B、缓冲液C、缓冲液D、缓冲液E,为便于区分表述不同步骤所用缓冲液不同而命名,字母A、B、C、D、E本身没有含义。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:本发明提供的磁珠法细菌基因组DNA提取试剂盒,是一种有效的、高质量的核酸提取试剂盒。试剂盒中的单分散纳米磁珠,配以独特的缓冲系统,使得本发明试剂盒提取出来的细菌基因组DNA片段完整、纯度高、得率高,满足后续实验要求,大大提高了DNA的质量。
附图说明
图1是本发明试剂盒提取的大肠杆菌DH10B和金黄色葡萄球菌基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图,泳道M:DNA分子量DL15000,泳道1:本试剂盒提取的大肠杆菌DH10B基因组DNA,泳道2:本试剂盒提取的金黄色葡萄球菌基因组DNA。
图2是三种不同方法提取的大肠杆菌DH10B基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图,泳道M:DNA分子量DL15000,泳道1:本发明试剂盒提取的大肠杆菌DH10B基因组DNA,泳道2:酚—氯仿抽提法提取的大肠杆菌DH10B基因组DNA,离心柱法提取的大肠杆菌DH10B基因组DNA。
具体实施方式
本发明将通过以下实施例作进一步说明。
实施例1。
磁珠法细菌基因组DNA提取试剂盒的制备。按照以下组分浓度配置相应的缓冲液:
磁珠悬液A:100mg/mL纳米磁珠、20%乙醇。
缓冲液B:3mol/L盐酸胍、2%月桂酰肌氨酸钠、400µg/mL RNase A、0.05mol/L柠檬酸钠,pH为7.5。
缓冲液C:1.5mol/L异硫氰酸胍、70%异丙醇、5%聚乙二醇、0.02mol/L柠檬酸钠, pH为5.5。
缓冲液D:1.5mol/L醋酸钠、5%聚乙二醇,pH为5.5。
缓冲液E:0.05mol/L氯化钠、75%乙醇、10mmol/L三羟甲基氨基甲烷,pH为7.0。
洗脱液:无菌去离子水,pH为7.2
实施例2。
用上述实施例1制备的磁珠法细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取大肠杆菌DH10B和金黄色葡萄球菌基因组DNA,步骤如下:
步骤一,向离心管中加入200μL大肠杆菌DH10B或金黄色葡萄球菌过夜培养液,然后加入200μL缓冲液B,混匀,裂解15分钟。
步骤二,向离心管中加入10μL磁珠悬液A和400μL缓冲液C,混匀,室温放置3分钟。
步骤三,将离心管置于磁力架上15秒,待磁珠完全吸至孔壁上之后,吸弃上清,从磁力架上取出离心管。
步骤四,加入500μL 缓冲液D,混匀,将离心管置于磁力架上15秒,待磁珠完全吸至管壁上后,吸弃上清,然后从磁力架上取出离心管。
步骤五,加入500μL 缓冲液E,混匀,将离心管置于磁力架上15秒,待磁珠完全吸至管壁上后,吸弃上清,然后从磁力架上取出离心管。
步骤六,重复步骤五1次。
步骤七,将离心管置于55℃恒温箱中干燥5-7分钟至离心管内无液体残留。
步骤八,加入100μL洗脱液,充分悬浮磁珠5分钟。
步骤九,取出离心管并置于磁力架上15秒,待磁珠完全吸至管壁上后,小心吸取上清至新的离心管,即获得DNA产物。
提取的基因组DNA经NanoDrop 2000C超微量分光光度计检测浓度和纯度,结果如表1所示。可以看出,本试剂盒提取得到的基因组DNA纯度高,能够满足实验要求,且基因组DNA提取效率较高,可从200μL菌液获得大于80μg DNA。取5μL的基因组DNA,于质量浓度1%的琼脂糖凝胶上,在100v电压下电泳30min,用紫外凝胶成像系统进行照相,可见基因组DNA完整性好,且没有RNA污染(图1所示)。
表1 本试剂盒细菌基因组DNA提取结果
细菌类型 | DNA浓度(ng/μL) | OD260/280 | OD230/260 |
大肠杆菌DH10B | 450.6 | 1.88 | 1.92 |
金黄色葡萄球菌 | 401.2 | 1.86 | 1.93 |
对比例1。
分别用酚—氯仿抽提法和离心柱法提取细菌基因组DNA,步骤分别按照各自的说明书进行,提取的基因组DNA经NanoDrop 2000C超微量分光光度计检测浓度和纯度,结果如表2所示。可以看出,本发明试剂盒提取得到的基因组DNA与其他两种方法相比,纯度高、浓度大,没有盐离子污染,基因组完整性好(图2所示)。
表2 三种方法对DH10B基因组DNA提取结果
方 法 | DNA浓度(ng/μL) | OD260/280 | OD230/260 |
本发明试剂盒 | 443.3 | 1.87 | 1.91 |
酚—氯仿抽提法 | 215.4 | 1.78 | 1.92 |
离心柱法 | 358.9 | 1.66 | 1.93 |
Claims (2)
1.一种磁珠法细菌基因组DNA提取试剂盒,其特征是包括磁珠悬液A、缓冲液B、缓冲液C、缓冲液D、缓冲液E、洗脱液六种组分;
所述磁珠悬液A中使用的磁珠为单分散、超顺磁性硅羟基纳米磁珠,磁珠粒径300-500nm,浓度100mg/mL,磁珠悬浮在20%的乙醇中;
所述缓冲液B终浓度组成为:2-5mol/L盐酸胍、1-2%月桂酰肌氨酸钠、200-500µg/mL核糖核酸酶A、0.05-0.1mol/L柠檬酸钠,溶剂为无菌去离子水,缓冲液B pH为6.5-8.0;
所述缓冲液C终浓度组成为:1-2mol/L异硫氰酸胍、60-80%异丙醇、1-5%聚乙二醇、0.02-0.05mol/L柠檬酸钠,溶剂为无菌去离子水,缓冲液C pH为5.5-7.5;
所述缓冲液D终浓度组成为:1-2mol/L醋酸钠、5-8%聚乙二醇,溶剂为无菌去离子水,缓冲液D pH为5.0-6.0;
所述缓冲液E终浓度组成为:0.05-0.1mol/L氯化钠、60-80%乙醇、10mmol/L三羟甲基氨基甲烷,溶剂为无菌去离子水,缓冲液D pH为7.0-7.5;
所述洗脱液为:无菌去离子水或10mmol/L三羟甲基氨基甲烷,洗脱液pH为7.0-8.0。
2.权利要求1所述的磁珠法细菌基因组DNA提取试剂盒的应用,其特征是按如下步骤:
步骤一,向离心管中加入100-500μL细菌培养液,然后加入初始菌液相同体积的缓冲液B,混匀,裂解15分钟;
步骤二,向离心管中加入10μL 磁珠悬液A和2倍初始菌液体积的缓冲液C,混匀,室温放置3分钟;
步骤三,将离心管置于磁力架上15秒,待磁珠完全吸至孔壁上之后,吸弃上清,从磁力架上取出离心管;
步骤四,加入500μL 缓冲液D,混匀,将离心管置于磁力架上15秒,待磁珠完全吸至管壁上后,吸弃上清,然后从磁力架上取出离心管;
步骤五,加入500μL 缓冲液E,混匀,将离心管置于磁力架上15秒,待磁珠完全吸至管壁上后,吸弃上清,然后从磁力架上取出离心管;
步骤六,重复步骤五1次;
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