CN111705053A - 一种快速提取细菌dna的试剂盒及提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种快速提取细菌DNA的试剂盒及提取方法。该试剂盒内的试剂包括裂解液，所述裂解液由TE缓冲液、SDS和NaCl溶液组成，所述裂解液中SDS的浓度为0.08‑0.12g/mL，所述NaCl的浓度为1.5‑2.5mol/L，所述裂解液对革兰氏阴性菌的处理时间为5‑8min。本发明的试剂盒和细菌DNA提取方法可实现细菌DNA的快速提取，尤其适用于革兰氏阴性菌DNA的提取。

Description

一种快速提取细菌DNA的试剂盒及提取方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种快速提取细菌DNA的试剂盒及提取方法。
背景技术
近年来，细菌的基因组研究取得了飞速的进展。通过基因组研究，将使人类从更高层次上掌握病原微生物的致病机制及其规律，从而得以发展新的诊断、预防及治疗微生物感染的制剂、疫苗及药品。而如何从固体或液体中的细菌样品中提取高质量的是基因检测及其他分子生物学研究的重要前提。
目前传统的提取方法操作步骤繁琐，工作量大，且提取效率低下，难以实现工业化应用。另外，传统方法大都使用大量的有机溶剂，不仅易造成环境污染，而且有损操作者健康。
中国专利文献CN101824450A公开了一种基于磁珠提取细菌基因组DNA的试剂盒，该试剂盒包括溶菌酶工作液、细菌重悬裂解液、RNA酶工作液、菌体蛋白沉淀液、磁珠、异丙醇、漂洗液和DNA洗脱液，其中细菌重悬裂解液为：10-20mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐、pH值7.0-8.0、1.4mmol/L螯合剂、50-100mmol/L Na盐、质量浓度2-4％的十二烷基硫酸钠和终浓度0.1-0.4mg/mL的蛋白酶K；溶菌酶工作液为：10-20mmol/L三羟基甲基氨基甲烷盐，pH值7.0-8.0、1-4mmol/L螯合剂、体积分数0.8-1.2％Trition-X-100，溶菌酶的终浓度为20-30mg/mL。当采用该试剂盒对革兰氏阳性菌的基因组DNA进行提取时，先用高效的溶菌酶工作液在37℃条件下对革兰氏阳性菌处理10-30min，之后再加入细菌重悬裂解液在65-70℃条件下处理10-20min；之后再加入RNA酶、菌体蛋白沉淀液、磁珠、异丙醇、漂洗液等进行纯化，可制备得到细菌基因组DNA溶液。采用该试剂盒对革兰氏阳性菌的基因组DNA进行提取时，虽然裂解所需的时间较短，但后续的步骤需要的时间较长且需要与特定的溶菌酶工作液配合使用，对革兰氏阴性菌的基因组DNA提取的适用性较差。
中国专利文献CN104975007A公开了一种磁珠法提取革兰氏阴性菌基因组的方法，该方法包括下述步骤：向菌体沉淀中加入0.5-1mL溶菌酶溶液(0.1-0.3mol/L氯化钠，0.1-0.2mol/LEDTA，10-20mg/ml溶菌酶，pH＝7-9)悬浮沉淀，37℃温浴2-4h；加入0.5-1mL十二烷基硫酸钠溶液(0.1-0.2mol/L氯化钠，0.1-1mol/L三羟甲基氨基甲烷，5-20％质量体积比的十二烷基硫酸钠，pH＝7-9)，反复颠倒混匀10-20min；之后再加入酚、氯仿和异戊醇混合液抽提；再采用磁珠法对基因组DNA进行提取。该磁珠法提取革兰氏阴性菌基因组的方法的提取时间长。
中国专利文献CN105132410B公开了一种微生物基因组DNA的提取方法，包括下述步骤：(1)向菌体中加入STES缓冲液(0.2M Tris-HCl、0.5M NaCl、0.01M EDTA和0.1wt％SDS)重悬，得到菌悬液；向菌悬液中加入玻璃珠，然后以TE缓冲液溶解，得到待提取菌液；(2)加入酚/氯仿溶液，震荡、离心，收集水相；(3)向收集得到的水相中加入氯仿/异戊醇溶液，震荡、离心，收集水相；(4)加入异丙醇或无水乙醇，室温下沉淀，离心，收集沉淀；(5)使用乙醇溶液洗涤，加入无菌水溶解DNA沉淀，磁珠纯化即得微生物基因组DNA。该方法虽可用于微生物基因组DNA的提取，但提取方法复杂，提取效率低。
中国专利文献CN110551717A公开了一种快速提取细菌基因组DNA的方法，包括下述步骤：(1)破壁：将菌体浸于DNA提取液(150±20mM Tris、30±5mM EDTA、1％SDS，用盐酸调pH值为7.7-8.0)中，60-80℃条件下放置5-30min，破碎细胞；(2)沉淀：将步骤(1)处理的菌液离心或静置，转移上清液，并向上清液中加入异丙醇，离心，弃上清；(3)晾干，加入ddH2O溶解DNA即得含有细菌基因组DNA的溶液。该方法虽可提取得到细菌DNA，但提取得到的DNA的纯度较低。此外，当该方法用于提取大肠杆菌的基因组DNA时，需要采用DNA提取液对革兰氏阴性菌(大肠杆菌)的菌体处理10min以上，处理的时间较长。
发明内容
本发明提供一种快速提取细菌DNA的试剂盒，该试剂盒可实现细菌DNA的快速提取，尤其适用于革兰氏阴性菌DNA的提取。该试剂盒中的裂解液通过采用较高浓度的SDS和NaCl，可使革兰氏阴性菌的裂解在5-8min内完成。
本发明还提供了一种快速提取细菌DNA的方法，通过水浴裂解、去蛋白、异丙醇沉淀等步骤，直接裂解细胞壁，经过离心柱离心释放出细菌基因组DNA，过程中即使有使用有机溶剂，其量也是很少，减少了有毒试剂的危害。该方法操作简单,在微量的样本中也能高效提取全基因组。
本发明的快速提取细菌DNA的试剂盒采用如下技术方案：一种快速提取细菌DNA的试剂盒，所述试剂盒内的试剂包括裂解液，所述裂解液由TE缓冲液、SDS和NaCl溶液组成，所述裂解液中SDS的浓度为0.08-0.12g/mL，所述NaCl的浓度为1.5-2.5mol/L，所述裂解液对革兰氏阴性菌的处理时间为5-8min。
作为进一步优选的技术方案，所述试剂盒内的试剂还包括下述中的任意一种或几种的组合：溶菌酶溶液、蛋白酶K、BC buffer、PE solution、漂洗液和TE洗脱液，所述溶菌酶溶液的浓度为40-60mg/mL，所述BC buffer为体积比为酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1的混合液，所述PE solution为体积分数50％-70％异丙醇，所述漂洗液为65-80％乙醇；所述蛋白酶K的浓度为15-25mg/mL。
作为进一步优选的技术方案，所述裂解液中SDS的浓度为0.1g/mL，所述NaCl的浓度为2mol/L；所述所述PE solution为60％异丙醇，所述漂洗液为75％乙醇，所述蛋白酶K的浓度为20mg/mL，所述溶菌酶溶液的浓度为50mg/mL、通过将溶菌酶加入到Enzymatic lysisbuffer中配制得到，所述TE缓冲液为10mmol/L、pH＝8.0的Tris-HCl和1mmol/L的EDTA。
本发明的快速提取细菌DNA的方法采用如下技术方案：一种快速提取细菌DNA的方法，采用如上述任意一项所述的快速提取细菌DNA的试剂盒对细菌DNA进行提取。
作为进一步优选的技术方案，包括下述步骤：(1)向细菌菌体中加入裂解液震荡混匀，50-60℃水浴至细胞完全裂解；(2)加入BC Buffer，充分颠倒混匀；(3)加入的无水乙醇，充分颠倒混匀；(4)将离心柱放入收集管中，将步骤(3)所得溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入离心柱中，静置2min，再10000-15000rpm室温离心1min，倒掉收集管中的废液；(5)将离心柱放回收集管，加入PE Solution，8000-12000rpm离心1min，倒掉滤液；(6)将离心柱放回收集管，加入漂洗液，8000-12000rpm离心1min，倒掉滤液；(7)重复上述(6)步骤离去残留的漂洗液；(8)取出离心柱，放入一个新的离心管中，加入TE洗脱液静置1min，10000-15000rpm室温离心1min，洗脱DNA，收集即得DNA溶液。
作为进一步优选的技术方案，采用所述快速提取细菌DNA的方法提取革兰氏阳性菌的DNA时，在加入所述裂解液之前还包括向菌体中加入TE缓冲液和溶菌酶溶液重悬菌体，37℃水浴10-60min的步骤。
作为进一步优选的技术方案，所述TE缓冲液和溶菌酶溶液的体积比为1:1，所述溶菌酶溶液与所述裂解液的体积比为10:25。
作为进一步优选的技术方案，提取革兰氏阴性细菌的基因组DNA时，所述步骤(1)的保温时间为5-8min；提取革兰氏阳性细菌的基因组DNA时，所述步骤(1)的保温时间为30-60min。
作为进一步优选的技术方案，所述裂解液、蛋白酶K溶液、BC Buffer、无水乙醇、PESolution、漂洗液和TE洗脱液的体积比为25:2:20:20:50:50:6。
本发明的有益效果是：本发明的试剂盒可实现细菌DNA的快速提取，尤其适用于革兰氏阴性菌DNA的提取。该试剂盒中的裂解液通过采用较高浓度的SDS和NaCl，可使革兰氏阴性菌的裂解在5-8min内完成。
本发明试剂盒的操作方法步骤简单，可以有效提升细菌中基因组的提取效率，提取的产物纯度高，重复性好。另外，该试剂盒所需试剂均为常规试剂，成本低，适用于高通量实验。
本发明的快速提取细菌DNA的方法，通过水浴裂解、去蛋白、异丙醇沉淀等步骤，直接裂解细胞壁，经过离心柱离心释放出细菌基因组DNA，过程中即使有使用有机溶剂，其量也是很少，减少了有毒试剂的危害。该方法操作简单，在微量的样本中也能高效提取全基因组。
本发明的快速提取细菌DNA的方法所需时间短(本领域常用离心柱法提取革兰氏阴性菌DNA需要2小时左右)、可有效减少提取过程中核酸的损失，增加提取效率，可快速提取样品中细菌基因组DNA，且提取的DNA的电泳条带清晰完整，重复性好，可用于分子生物学检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为采用本发明的试剂盒和方法提取的大肠杆菌基因组的琼脂糖凝胶电泳条带。
图2为本发明的试剂盒和方法提取的单增李斯特菌基因组的琼脂糖凝胶电泳条带。
具体实施方式
下面将结合具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。若未特别指明，实例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1细菌基因组提取试剂盒中试剂的配制：
1.裂解液由TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl(pH＝8.0)，1mmol/L EDTA)，10％SDS，2mol/LNaCl组成，且每种成分单独配置。
(1)TE缓冲液具体配置方法为：首先1mol/L Tris-HCl(pH 8.0)的配制：称取6.06gTris，加超纯水40mL溶解，滴加浓HCl调pH至8.0，定容至50mL；
其次0.5mol/L EDTA(pH 8.0)的配制：称取9.306g EDTA-Na2·2H2O，加超纯水35mL，剧烈搅拌，用约NaOH颗粒调pH至8.0，定容至50mL；
最后TE缓冲液配置：取1mL1mol/L Tris-HCl(pH 8.0)和0.2mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，用超纯水定容至100mL。
(2)10％SDS配置：取1g SDS粉末，用超纯水溶解定容至10mL。
(3)2mol/L NaCl配置：称取1.17g固体NaCl，用超纯水溶解定容至10mL
2.BC buffer的配置：取10mL酚：氯仿(25:24)与0.2mL异戊醇即可。
3.PE solution的配置：体积分数为60％的异丙醇，即量取60mL异丙醇与40mL超纯水，混合均匀。
4.漂洗液的配置：体积分数为75％的乙醇，即量取75mL无水乙醇与25mL超纯水，混合均匀。
5.TE洗脱液即TE缓冲液的配置在上述裂解液的配置中已描述。
实施例2
使用实施例1中的试剂盒提取5份大肠杆菌样品基因组。
(1)分别取1mL过夜培养的大肠杆菌菌液，加入1.5mL离心管中，室温8000rpm离心1min，弃上清，收集菌体。加入100μL TE，50μL 2mol/L NaCl，100μL 10％SDS，20μL 20mg/mL蛋白酶K溶液)震荡混匀。57℃水浴5min至细胞完全裂解。
(2)加入200μl BC Buffer，充分颠倒混匀。
(3)加入200μL的无水乙醇，充分颠倒混匀。
(4)将离心柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入离心柱中，静置2min，再12000rpm室温离心1min，倒掉收集管中的废液。
(5)将离心柱放回收集管，加入500μL PE Solution，10000rpm离心1min，倒掉滤液。
(6)将离心柱放回收集管，加入500μL漂洗液，10000rpm离心1min，倒掉滤液。
(7)重复上述(6)步骤离去残留的漂洗液。
(8)取出离心柱，放入一个新的离心管中，加入60μL TE洗脱液静置1min，12000rpm室温离心1min，洗脱DNA，收集DNA溶液。
(9)琼脂糖凝胶电泳检测：对所得5份回收产物，分别取上样，进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示所获得全基因组产物平行性好，条带清晰，无拖尾和杂带，表明提取的基因组完整性好，且无其它污染。
实施例3
使用实施例1中的试剂盒提取5份单增李斯特样品基因组。
(1)分别取1mL过夜培养的单增李斯特菌液，加入1.5mL离心管中，室温8000rpm离心1min，弃上清，收集菌体。加入100μL TE，100μL溶菌酶溶液(使用前将相应的溶解酶加入到Enzymatic lysis buffer中，配置成50mg/mL的溶解酶溶液)重悬菌液，37℃水浴10min。再加入50μL 2mol/L NaCl，100μL 10％SDS，20μL 20mg/mL蛋白酶K溶液，震荡混匀。57℃水浴0.5-1h至细胞完全裂解。
(2)加入200μL BC Buffer，充分颠倒混匀。
(3)加入200μL的无水乙醇，充分颠倒混匀。
(4)将离心柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入离心柱中，静置2min，再12000rpm室温离心1min，倒掉收集管中的废液。
(5)将离心柱放回收集管，加入500μL PE Solution，10000rpm离心1min，倒掉滤液。
(6)将离心柱放回收集管，加入500μL漂洗液，10000rpm离心1min，倒掉滤液。
(7)重复上述(6)步骤离去残留的漂洗液。
(8)取出离心柱，放入一个新的离心管中，加入60μL TE洗脱液静置1min，12000rpm室温离心1min，洗脱DNA，收集DNA溶液。
(9)琼脂糖凝胶电泳检测：对所得5份回收产物，分别取上样，进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示所获得全基因组产物平行性好，条带清晰，无拖尾和杂带，表明提取的基因组完整性好，且无其它污染。
实施例4
4.1试剂盒中的试剂
1.裂解液由TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl(pH＝8.0)，1mmol/L EDTA)，8％SDS(取0.8g SDS粉末，用超纯水溶解定容至10mL)，1.5mol/L NaCl组成，且每种成分单独配置。
2.BC buffer的配置：取10mL酚：氯仿(25:24)与0.2mL异戊醇即可。
3.PE solution的配置：体积分数为50％的异丙醇，即量取50mL异丙醇与50mL超纯水，混合均匀。
4.漂洗液的配置：体积分数为65％的乙醇，即量取65mL无水乙醇与35mL超纯水，混合均匀。
5.TE洗脱液即10mmol/L Tris-HCl(pH＝8.0)，1mmol/L EDTA。
4.2使用上述4.1中的试剂盒提取5份大肠杆菌样品基因组。
(1)分别取1mL过夜培养的大肠杆菌菌液，加入1.5mL离心管中，室温8000rpm离心1min，弃上清，收集菌体。加入100μL TE，50μL 1.5mol/L NaCl，100μL 8％SDS，20μL 15mg/mL蛋白酶K溶液)震荡混匀。57℃水浴5min至细胞完全裂解。
(2)加入200μl BC Buffer，充分颠倒混匀。
(3)加入200μL的无水乙醇，充分颠倒混匀。
(4)将离心柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入离心柱中，静置2min，再12000rpm室温离心1min，倒掉收集管中的废液。
(5)将离心柱放回收集管，加入500μL PE Solution，10000rpm离心1min，倒掉滤液。
(6)将离心柱放回收集管，加入500μL漂洗液，10000rpm离心1min，倒掉滤液。
(7)重复上述(6)步骤离去残留的漂洗液。
(8)取出离心柱，放入一个新的离心管中，加入60μL TE洗脱液静置1min，12000rpm室温离心1min，洗脱DNA，收集DNA溶液。
(9)琼脂糖凝胶电泳检测：对所得5份回收产物，分别取上样，进行琼脂糖凝胶电泳(电泳图谱与图1无明显实质性差异)，结果显示所获得全基因组产物平行性好，条带清晰，无拖尾和杂带，表明提取的基因组完整性好，且无其它污染。
实施例5
5.1试剂盒中的试剂
1.裂解液由TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl(pH＝8.0)，1mmol/L EDTA)，12％SDS(取1.2g SDS粉末，用超纯水溶解定容至10mL)，2.5mol/L NaCl组成，且每种成分单独配置。
2.BC buffer的配置：取10mL酚：氯仿(25:24)与0.2mL异戊醇即可。
3.PE solution的配置：体积分数为70％的异丙醇，即量取70mL异丙醇与30mL超纯水，混合均匀。
4.漂洗液的配置：体积分数为80％的乙醇，即量取80mL无水乙醇与20mL超纯水，混合均匀。
5.TE洗脱液即10mmol/L Tris-HCl(pH＝8.0)，1mmol/L EDTA。
5.2使用上述4.1中的试剂盒提取5份大肠杆菌样品基因组。
(1)分别取1mL过夜培养的大肠杆菌菌液，加入1.5mL离心管中，室温8000rpm离心1min，弃上清，收集菌体。加入100μL TE，50μL 2.5mol/L NaCl，100μL 12％SDS，20μL 25mg/mL蛋白酶K溶液)震荡混匀。57℃水浴5min至细胞完全裂解。
(2)加入200μl BC Buffer，充分颠倒混匀。
(3)加入200μL的无水乙醇，充分颠倒混匀。
(4)将离心柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入离心柱中，静置2min，再12000rpm室温离心1min，倒掉收集管中的废液。
(5)将离心柱放回收集管，加入500μL PE Solution，10000rpm离心1min，倒掉滤液。
(6)将离心柱放回收集管，加入500μL漂洗液，10000rpm离心1min，倒掉滤液。
(7)重复上述(6)步骤离去残留的漂洗液。
(8)取出离心柱，放入一个新的离心管中，加入60μL TE洗脱液静置1min，12000rpm室温离心1min，洗脱DNA，收集DNA溶液。
(9)琼脂糖凝胶电泳检测：对所得5份回收产物，分别取上样，进行琼脂糖凝胶电泳(电泳图谱与图1无明显实质性差异)，结果显示所获得全基因组产物平行性好，条带清晰，无拖尾和杂带，表明提取的基因组完整性好，且无其它污染。
实施例6
对实施例2-5提取得到的DNA的纯度和总量进行测定，测定结果详见下表1
表1
样品 OD260/280 提取得到的DNA总量
实施例2 1.82 19μg
实施例3 1.81 17μg
实施例4 1.86 16μg
实施例5 1.84 18μg
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种快速提取细菌DNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内的试剂包括裂解液，所述裂解液由TE缓冲液、SDS和NaCl溶液组成，所述裂解液中SDS的浓度为0.08-0.12g/mL，所述NaCl的浓度为1.5-2.5mol/L，所述裂解液对革兰氏阴性菌的处理时间为5-8min。
2.根据权利要求1所述的快速提取细菌DNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内的试剂还包括下述中的任意一种或几种的组合：溶菌酶溶液、蛋白酶K、BC buffer、PEsolution、漂洗液和TE洗脱液，所述溶菌酶溶液的浓度为40-60mg/mL，所述BC buffer为体积比为酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1的混合液，所述PE solution为体积分数50％-70％异丙醇，所述漂洗液为65-80％乙醇；所述蛋白酶K的浓度为15-25mg/mL。
3.根据权利要求2所述的快速提取细菌DNA的试剂盒，其特征在于，所述裂解液中SDS的浓度为0.1g/mL，所述NaCl的浓度为2mol/L；所述PE solution为60％异丙醇，所述漂洗液为75％乙醇，所述蛋白酶K的浓度为20mg/mL，所述溶菌酶溶液的浓度为50mg/mL、通过将溶菌酶加入到Enzymatic lysis buffer中配制得到，所述TE缓冲液为10mmol/L、pH＝8.0的Tris-HCl和1mmol/L的EDTA。
4.一种快速提取细菌DNA的方法，其特征在于，采用如权利要求1-3中任意一项所述的快速提取细菌DNA的试剂盒对细菌DNA进行提取。
5.根据权利要求4所述的快速提取细菌DNA的方法，其特征在于，包括下述步骤：(1)向细菌菌体中加入裂解液震荡混匀，50-60℃水浴至细胞完全裂解；(2)加入BC Buffer，充分颠倒混匀；(3)加入无水乙醇，充分颠倒混匀；(4)将离心柱放入收集管中，将步骤(3)所得溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入离心柱中，静置2min，再10000-15000rpm室温离心1min，倒掉收集管中的废液；(5)将离心柱放回收集管，加入PE Solution，8000-12000rpm离心1min，倒掉滤液；(6)将离心柱放回收集管，加入漂洗液，8000-12000rpm离心1min，倒掉滤液；(7)重复上述(6)步骤离去残留的漂洗液；(8)取出离心柱，放入一个新的离心管中，加入TE洗脱液静置1min，10000-15000rpm室温离心1min，洗脱DNA，收集即得DNA溶液。
6.根据权利要求5所述的快速提取细菌DNA的方法，其特征在于，采用所述快速提取细菌DNA的方法提取革兰氏阳性菌的DNA时，在加入所述裂解液之前还包括向菌体中加入TE缓冲液和溶菌酶溶液重悬菌体，37℃水浴10-60min的步骤。
7.根据权利要求6所述的快速提取细菌DNA的方法，其特征在于，所述TE缓冲液和溶菌酶溶液的体积比为1:1，所述溶菌酶溶液与所述裂解液的体积比为10:25。
8.根据权利要求5所述的快速提取细菌DNA的方法，其特征在于，提取革兰氏阴性细菌的基因组DNA时，所述步骤(1)的保温时间为5-8min；提取革兰氏阳性细菌的基因组DNA时，所述步骤(1)的保温时间为30-60min。
9.根据权利要求4-8中任意一项所述的快速提取细菌DNA的方法，其特征在于，所述裂解液、蛋白酶K、BC Buffer、无水乙醇、PE Solution、漂洗液和TE洗脱液的体积比为25:2:20:20:50:50:6。
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